CN104825763A - 一种中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，本发明根据中医药理论，采用辨证论治的理论进行中药组方筛选，各药味配比科学合理，并对中药复方的临床功效进行深入研究，开发其新的临床功效。实验结果表明，本发明提供的中药组合物对结肠腺癌Caco-2细胞中P-糖蛋白（P-gp）具有明显的抑制作用，表现出很好的抗肿瘤多药耐药的功效。并且临床实验结果证实，本发明提供的中药组合物可有效治疗产生多药耐药的肿瘤疾病。

Description

一种中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种中药组合物在制备逆转治疗肿瘤多药耐药药物中的应用。

背景技术

肿瘤已成为21世纪威胁人类生存的头号杀手，平均每年有600多万人死于各种肿瘤疾病。中国为世界癌症高发国家之一，每年新增200多万名癌症患者，占全球总数达20％，并且每年呈快速增长趋势。临床上目前治疗肿瘤的药物主要有化学药品，但由于化疗药物毒性大，在杀死肿瘤细胞的同时也无选择性的杀死白细胞、淋巴细胞等人体自身免疫细胞，导致病人常常由于因自身免疫能力低下并发感染，患者使用不良反应大，且疗程长，费用高，在临床使用中有较大的局限性。并且随着长期服用抗肿瘤药物，易产生多药耐药性，导致抗肿瘤效果降低。

中医药在治疗肿瘤方面具有独特的优势，以中药为代表的天然类药物具有毒副作用小、作用靶点多样、耐受性好等特点，在治疗肿瘤方面愈来愈受到重视。由于新药的研发风险高，投入大，周期长，近年来鲜有抗肿瘤中成药的问世，目前西药占肿瘤用药市场的75％，而中成药仅占25％，并且目前报道的抗肿瘤多药耐药中成药较少。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种配比科学合理，疗效确切，临床使用安全，不良反应低，具有明显的抗肿瘤多药耐药功效的中药组合物及其应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，所述的中药组合物由以下重量份的原料制得：西洋参40～50份、蟾酥0.25～0.30份、天门冬140～160份、土贝母180～200份、倒卵叶五加550～650份、猕猴桃根800～1000份、沙棘果300～330份、佛手140～160份。

作为优选方案，以上所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，所述的中药组合物由以下重量份的原料制得：西洋参50g、蟾酥0.25g、天冬167g、土贝母200g、倒卵叶五加599g、猕猴桃根1000g、沙棘果333g、佛手167g。

作为优选方案，以上所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，所述的肿瘤为结肠癌，肺癌，乳腺癌，肝癌，宫颈癌。

作为优选方案，以上所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，所述的肿瘤为结肠腺癌。

本发明所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，所述的药物为口服制剂。

作为优选方案，本发明所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，其特征在于，所述的口服制剂是口服液、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂或片剂。

口服液制备方法：按重量份数取西洋参、蟾酥、天冬、土贝母、倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果、佛手药材。取沙棘果榨取果汁，离心去除上层油状物后，减压浓缩至相对密度为1.2～1.23(70℃热测)时，加乙醇使含醇量达70％，静置，滤过；取西洋参加70％乙醇4倍量回流提取五次，每次2小时，合并提取液，静置，滤过；取佛手、天冬、土贝母加80％乙醇5倍量加热提取三次，每次1.5小时，合并提取液，滤过；取猕猴桃根加水煎煮三次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.10(70℃)时，调PH4～5，加入5％明胶溶液至不再出现沉淀为止，加乙醇至含醇量达80％，静置，滤过；取倒卵叶五加加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20(70℃)时，加乙醇至含醇量达70％，静置，滤过，蟾酥加乙醇(15倍量)提取六次，每次1.5小时，合并提取液，滤过。合并上述滤液，调节PH值至7，回收乙醇至无醇味，再继续浓缩至相对密度1.25～1.30(70℃)时，加8倍量水，搅匀，静置，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15～1.20(70℃)时，加乙醇是含量达70％，静置，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约530ml时，加入75％糖浆400ml，调PH值7.5～8.5，加水至1000ml，搅匀，静置，滤过，分装，灭菌，即得。

有益效果：本发明提供的中药组合物在治疗肿瘤多药耐药中的新用途和现有技术相比具有以下优点：

本发明根据中医药理论，采用辨证论治的理论进行中药组方筛选，给药味配比科学合理，并对中药复方的临床功效进行深入研究，，开发其新的临床功效。实验结果表明，本发明提供的中药组合物对结肠腺癌Caco-2细胞中P-糖蛋白(P-gp)具有明显的抑制作用。P-糖蛋白是一种170Kd大小的多药耐药基因(MDR1)调控的外排蛋白，主要功能是外排各种外来异物，保护机体不受外来异物的侵扰。本实验结果表明，本发明提供的中药组合物对Caco-2细胞上P-gp具有明显的抑制作用，从而发挥出很好的抗肿瘤多药耐药的功效。并且临床实验结果证实，本发明提供的中药组合物可有效治疗产生多药耐药的肿瘤疾病。

具体实施方式：

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施列1

1.材料与方法

1.1材料

中药组合物(组成为西洋参50g、蟾酥0.25g、天冬167g、土贝母200g、倒卵叶五加599g、猕猴桃根1000g、沙棘果333g、佛手167g，按上述口服液制备方法制成口服制剂)由常熟雷允上制药有限公司提供(天佛参口服液)，批准文号：国药准字Z20090947。

CACO-2细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，细胞所传代数为40-50代。

奎尼丁购自Sigma-aldrich公司，货号：Q0750-5G，批号:119K0046V

酮康唑购自Sigma-aldrich公司，货号：K1003，批号:100M1091V

华法林购自Sigma-aldrich公司，货号：45706-250MGR，批号:SZB8200XV

二甲基亚砜购自Solarbio公司，货号：D8371，批号：410B0211

HBSS缓冲液购自GIBCO公司，货号：14175-095，批号：1087507

胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，货号：SV30087.02，批号：NZE1145

MEM培养基，购自GIBCO公司货号：11095-080，批号：1616033

磷酸盐缓冲液：北京赛林泰医药技术有限公司生物部，批号:C00213-60

乙腈为色谱纯，购自J.T.Baker公司，货号：9017-03，批号：0000000732

24孔板，购自康宁公司，货号：3524

Tanswell插件，购自密理博公司，货号：PIHP01250

225cm²组织培养瓶，购自康宁公司，货号：431082

移液器，购自艾本德中国有限公司，货号：1778159(100-1000μL)、

1964699(20-200μL)、2329678(2-20μL)、3925209(0.5-10μL)

移液器枪头购自Axygen公司，型号：100-1000μL、20-200μL、0.5-10μL

倒置显微镜，购自奥特光学仪器有限责任公司，型号：13DS5200

CO₂孵育箱，购自三洋电器有限公司，型号：MCO-15AC

生物安全柜，购自Thermo公司，型号：1389

1.5mL离心管，购自美国Axygen公司

15mL、50mL离心管，购自美国康宁公司。

1.2Caco-2细胞培养方法

细胞培养在T-225小瓶内(225cm²组织培养瓶中)，隔日更换培养液，培养3天用含EDTA(1mM)的胰蛋白酶(0.25％)溶液消化后分散成细胞悬液，随后接种于24孔板内放置的Transwell小室内(0.7cm²/well，0.4μM孔径，Millipore)。0.8×10⁵细胞培养在0.2mL 10％胎牛血清(FBS)MEM培养基中(含有0.1mM的非必需氨基酸、2mM的L-谷氨酰胺、4.5g/L的葡萄糖)。下部接收池添加1mL10％FBS MEM培养基。24孔板中的Transwell小室培养在37℃含有5％CO₂和90％湿度的细胞培养箱中。用含有10％FBS的MEM培养基隔日换液。

CACO-2细胞培养7-8天左右汇合成细胞单层。通过跨膜电阻仪(CT)检测TEER值(细胞电阻值)，随着细胞上皮电阻值逐渐增加，细胞形成紧密连接。为确保有一个完整的肠上皮细胞样细胞的分化层，培养约21-25天细胞单层形成(代数20-40)，TEER值超过300Ω·cm²即可用于实验。

1.3Caco-2细胞实验步骤

Caco-2细胞的实验是在带有Transwell插件的24孔板内进行的。小室内为绒毛侧(apicalside，AP)小室外为基底侧(basolateral side，BL)。

实验1：用37℃的HBSS缓冲液预平衡30分钟后，再用37℃缓冲液洗净细胞单层(AP和BL侧)。AP侧添加500μL空白缓冲液或含药缓冲液(含底物奎尼丁0.05μM，中药组合物待测品0％或0.1％或1％或酮康唑1.2μM，n＝3)，BL侧添加750μL的含药缓冲液(含底物奎尼丁0.05μM，待测品0％或0.1％或1％或酮康唑1.2μM，n＝3)或空白缓冲液。孵育120分钟后于接收池中取100μL缓冲液样品加入10μL乙腈和200μL内标液(含0.1μM华法林的冷乙腈)终止反应。

实验2：用含有待测物(中药组合物口服制剂)的培养液培养细胞72小时，用37℃的HBSS缓冲液换去含有待测物的培养液，预平衡30分钟后，再用37℃缓冲液洗净细胞单层(AP和BL侧)。AP侧添加500μL空白缓冲液或含药缓冲液(含底物奎尼丁0.05μM，待测品0％或0.1％或1％或酮康唑1.2μM，n＝3)，BL侧添加750μL的含药缓冲液(含底物奎尼丁0.05μM，中药组合物口服制剂0％或0.1％或1％或酮康唑1.2μM，n＝3)或空白缓冲液。孵育120分钟后于接收池中取100μL缓冲液样品加入10μL乙腈和200μL内标液(0.1μM华法林的冷乙腈)终止反应。

实验1和实验2的标取样品均取100μL空白缓冲液加入10μL标取工作液(奎尼丁浓度为0、0.1、0.2、0.4、1、2、4和10μM的乙腈溶液)和200μL内标液(0.1μM华法林的冷乙腈)。所有样品涡旋混合后于3600rpm离心5分钟。取上清150μL加入96孔板。分析色谱柱为C181.7μm 2.1×50mm Column(Waters)和三重四极杆质谱(API4000，AB公司)进样检测，进样体积为5μL。计算分析柱流出的分析物和内标的峰面积。分析条件详见附录。

2.数据分析

用下面的计算公式计算表观渗透系数Papp和Ratio，并比较空白和0.1％或1％中药组合物口服液时的Ratio。如果0.1％或1％中药组合物口服液(待测品)的Ratio比空白的Ratio低20％以上，证明中药组合物口服液(待测品)具有抑制P-gp作用。如果0.1％或1％中药组合物口服液(待测品)的Ratio比空白的Ratio低20％以内，则表明中药组合物口服液(待测品)不是P-gp抑制剂或是很弱的抑制剂。

计算公式：

Papp＝(C*V/t)/(A*C0)

Ratio＝Papp BL-to-AP/Papp AP-to–BL

C＝样品浓度

V＝接收池缓冲液的体积

A＝膜表面积(cm2，在我们的研究中A＝0.70cm2)

C0＝初始孵育浓度

Papp＝表观渗透系数，表示为cm/sec*10-6

Papp AP→BL＝计算AP为加药池,BL为接收池的Papp值

Papp BL→AP＝计算AP为接收池,BL为加药池的Papp值。

3.结果与讨论

实验1中底物奎尼丁在各实验样品的接收池缓冲液中的浓度值详见表1。实验2中经不同天佛参口服液样品孵育3天后底物奎尼丁在各实验样品的接收池缓冲液中的浓度值详见表2。实验1中天佛参口服液及阳性对照酮康唑的Ratio和与空白Ratio之差总结于表3。实验2中经不同天佛参口服液样品孵育3天后底物奎尼丁在各实验样品的接收池缓冲液中的浓度总结于表4。

表1 实验1中底物奎尼丁在各实验样品的接收池缓冲液中的浓度

表2 实验2中经不同样品孵育3天后底物奎尼丁在各实验样品的接收池缓冲液中的浓度

表3 实验1中天佛参口服液及阳性对照酮康唑的Ratio和与空白Ratio之差

表4 实验2中经不同样品孵育3天后天佛参口服液及阳性对照酮康唑的Ratio和与空白Ratio之差

由实验1结果显示：0.1％的中药组合物(天佛参口服液)对P-gp具有明显抑制作用(比空白Ratio降低44.5％)；1％中药组合物(天佛参口服液)对P-gp的抑制作用更强(比空白Ratio降低53％)。实验2结果显示：经过三天的0.1％中药组合物(天佛参口服液)孵育，0.1％和1％的中药组合物(天佛参口服液)对P-gp的抑制作用比实验1只孵育2小时明显增强(分别比空白Ratio降低58.6％和68.6％)。

本发明利用建立的Caco-2细胞模型评价中药组合物(天佛参口服液)对P-gp的抑制作用。实结果表明：0.1％的中药组合物(天佛参口服液)对P-gp有明显抑制作用；经过三天的0.1％天佛参口服液孵育后，中药组合物(天佛参口服液)对P-gp的抑制作用明显增强,表明本发明提供的中药组合物具有抗肿瘤多药耐药的功效。

实施例2中药组合物在逆转耐药临床试验

取本发明提供的中药组合物(组成为西洋参50g、蟾酥0.25g、天冬167g、土贝母200g、倒卵叶五加599g、猕猴桃根1000g、沙棘果333g、佛手167g制成的口服制剂；天佛参口服液，常熟雷允上制药有限公司生产，国药准字Z20090947)，观察对多药耐药的肺癌放化疗患者40例的治疗效果。

40例多药耐药的肺癌放化疗患者服用本发明所提供的天佛参口服液，经2个月临床观察，服用天佛参口服液肺癌放化疗患者，38例多药耐药的肺癌放化疗患者临床症状得到明显改善，生活质量得到提高，且化疗引起的毒副反应明显减轻，显效率为95％。表明本发明所提供的天佛参口服液在逆转肿瘤多药耐药中具有很好的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料制得：西洋参40~50份、蟾酥0.25~0.30份、天门冬140~160份、土贝母180~200份、倒卵叶五加550~650份、猕猴桃根800~1000份、沙棘果300~330份、佛手140~160份。

2.     根据权利要求1所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料制得：西洋参50g、蟾酥0.25g、天冬167g、土贝母200g、倒卵叶五加599g、猕猴桃根1000g、沙棘果333g、佛手167g。

3.     根据权利要求1所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为结肠癌，肺癌，乳腺癌，肝癌或宫颈癌。

4.根据权利要求1至3任一项所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，其特征在于，所述的药物为口服制剂。

5.    根据权利要求4所述的中药组合物在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用，其特征在于，所述的口服制剂是口服液、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂或片剂。