CN107205994A - 脂肪酸半胱胺缀合物和它们作为自噬的活化剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及(i)6元杂芳基取代的脂肪酸胱胺缀合物，其组合物，用这个化合物治疗涉及自噬调节异常的疾病，诸如囊性纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、神经变性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染和免疫疾病的方法，或(ii)一种治疗特发性肺纤维化、线粒体疾病、Leigh氏综合征、糖尿病和耳聋(DAD)、利伯氏遗传性视神经病变、神经病变‑共济失调‑色素性视网膜炎和下垂症(NARP)、肌神经源性胃肠脑病变(MNG1E)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、或线粒体肌病变‑脑肌病变‑乳酸酸中毒中风样症状(MELAS)的方法，其包括向患者施用脂肪酸半胱胺缀合物(4Z,7Z.10Z,13Z,16Z,19Z)‑N‑(2‑巯基乙基)二十二碳‑4,7,10,13,16,19‑六烯酰胺或(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)‑N‑(2‑巯基乙基)二十碳‑5,8,11,14,17‑五烯酰胺。

Description

脂肪酸半胱胺缀合物和它们作为自噬的活化剂的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年11月26日提交的美国临时专利申请号62/084,754的权益和优先权，所述美国临时专利申请的整个公开内容以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及脂肪酸半胱胺缀合物、包含脂肪酸半胱胺缀合物的组合物和使用所述缀合物和组合物来治疗疾病诸如由自噬调节异常引起的疾病的方法。
背景
自噬是一种用以实质上自我消化一些细胞组分的在进化上保守的溶酶体降解途径(参见Levine和Kroemer(2008)CELL,132,第27-42页)。这个自我消化过程帮助细胞移除外来或受损细胞器、缺陷性或错误折叠蛋白质以及甚至侵袭性微生物。已推测在许多疾病例如囊性纤维化中，自噬被下调(Luciani等(2011)AUTOPHAGY,7,第104-106页)。
囊性纤维化(CF)已被描述为一种在白种人群体中最常见的使寿命缩短的常染色体隐性遗传性疾病。它是一种在美国影响约30,000名儿童和成人(全世界70,000名)的罕见疾病；并且每年有约1,000例新病例被诊断。所述疾病的特征在于囊性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)中具有突变，此导致由肺、胰腺、肝和肠中各种分泌和吸收上皮细胞转运氯离子的能力丧失或受损(参见例如Derichs(2013)EUR.RESP.REV,22,第58-65页)。所引起的阴离子转运降低和流体体内平衡失调在肺中产生稠密和粘稠粘液，粘液可阻塞气道，从而导致慢性炎症和感染。这导致进行性肺功能衰退以及患有更重度形式的所述疾病的患者的预期寿命受限。
CFTR是一种cAMP活化的ATP门控离子通道，由约1,480个氨基酸组成。所述蛋白质由5个结构域组成：两个跨膜结构域，各自含有6次跨越的α螺旋。各跨膜结构域连接于核苷酸结合结构域(NBD)。第一NBD通过调节性“R”结构域连接于第二跨膜结构域。编码CFTR的基因在1989年被报道(参见Rommens等(1989)SCIENCE,245,第1059-1065页)。从那时起，已鉴定CFTR基因的超过1900种序列变化形式，其中大多数属于以下6个类别中的一个：I类突变由使CFTR的量降低的无义和框移突变所致；II类突变具有导致过早降解的折叠缺陷；III类突变导致通道门控受限；IV类突变具有传导缺陷；V类突变具有导致所产生的CFTR的量降低的转录缺陷；VI类突变具有在通道表面处的CFTR高周转(参见例如Rowntree和Harris(2003)ANN.HUM.GENET.,67,第471-485页；Zielenski(2000)RESPIRATION,67,第117-133页；以及MacDonald等(2007)PAEDIATRIC DRUGS,9,第1-10页)。
为显现致衰弱性CF疾病，个体遗传得到两个缺陷性CFTR等位基因，单个等位基因来自各亲代。在CFTR的已被鉴定的超过1900种序列变化形式之中，以下4种突变各自具有约1-3％的全世界普遍率：G551D、W1282X、G542X和N1303K。具有在全世界约90％的等位基因频率的最普遍的CFTR突变是ΔF508突变(II类突变，导致蛋白质错误折叠和过早降解的苯丙氨酸缺失)。ΔF508缺失突变可以纯合或杂合形式显现。
关于治疗干预的研究已鉴定适用于控制CF的某些致衰弱性症状的若干消炎和抗感染疗法(参见例如Nichols等(2008)CLINIC REV.ALLERG.IMMUNOL.,35,第135-153页)。更新近地，已引入疾病改进疗法来处理缺陷性CFTR。CFTR“增效剂”被设计以增加在膜处可用但具有门控(III类)和传导(IV类)突变的CFTR通道的开放概率。依伐卡托(Ivacaftor)(VX-770)是一种受到FDA核准用于治疗具有包括G551D、G178R、S549N、S549R、G551S、G124E、S1251N、S1255P和G1349D的门控突变的CF患者的CFTR增效剂(参见例如Van Goor等(2009)PNAS,106,第18825-18830页)。然而，具有这些门控突变的患者仅占全世界CF患者的较小百分比。
除CFTR增效剂之外，已报道评估CFTR“校正剂”增加可向细胞膜递送的CFTR的量的潜力的临床开发。VX-809(鲁玛卡托(Lumacaftor))是一种新近已由FDA核准，当与依伐卡托组合使用时，在具有纯合ΔF508突变的CF患者中使用的CFTR校正剂(参见例如Van Goor等(2011)PNAS,108,第18843-18848页；以及Ren等(2013)MOL.BIOL.CELL,24,第3016-3024页)。
尽管迄今为止作出各种努力，但仍然对用于治疗与自噬调节异常相关的病症(例如CF，并且特别是难以使用现有疗法治疗的与突变相关的某些形式的CF)的另外的组合物和方法存在持续需要。
概述
本发明提供用于活化自噬和治疗与自噬调节异常相关的各种医学疾病的方法和组合物，所述疾病特别是其中自噬的水平相对于不患有病症的受试者被降低的病症。本发明部分地基于发现脂肪酸半胱胺缀合物适用于活化自噬，并且脂肪酸半胱胺缀合物可用于治疗多种人疾病诸如CF。本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物具有不能通过单独施用半胱胺或脂肪酸或施用个别组分的组合来实现的治疗作用。半胱胺和脂肪酸例如ω-3脂肪酸的共价连接允许向细胞内位置同时递送两种组分，据此个别组分通过裂解(例如酶促裂解)而在所述位置处并且在相同时间得以释放。
本发明的一个益处是相比于可通过个别施用组分来实现的自噬活化水平，施用脂肪酸半胱胺缀合物导致所述水平更高。此外，相比于单独或与未缀合脂肪酸组合施用的半胱胺，施用脂肪酸半胱胺缀合物可在低得多的浓度下导致协同性炎症减轻。因此，脂肪酸半胱胺缀合物提供不能通过分开施用被缀合以产生脂肪酸半胱胺缀合物的个别组分(单独或共同施用)来实现的多个益处。
本文使用通用化学式和特定化学式描述示例性脂肪酸半胱胺缀合物。举例来说，本发明提供一族由式I包括的脂肪酸半胱胺缀合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中变量如以下详细描述中所定义。
类似地，本发明提供一族由式IA包括的脂肪酸半胱胺缀合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中变量如以下详细描述中所定义。
类似地，本发明提供一族由式IB包括的脂肪酸半胱胺缀合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中变量如以下详细描述中所定义。
类似地，本发明提供一族由式III包括的脂肪酸半胱胺缀合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中变量如以下详细描述中所定义。
类似地，本发明提供一族由式IV包括的脂肪酸半胱胺缀合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中变量如以下详细描述中所定义。
另外的通式和特定脂肪酸胱胺缀合物描述于详细描述和实施例中。
本发明的另一方面提供一种治疗本文所述的疾病的方法，所述疾病诸如CF、特发性肺纤维化(IPF)、神经变性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染、线粒体疾病或免疫疾病。方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物诸如式I化合物以治疗疾病。示例性神经变性疾病包括亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)和传染性海绵状脑病变。在某些实施方案中，待治疗的疾病是CF。在某些实施方案中，待治疗的疾病是IPF。
本发明的另一方面提供一种在受试者中活化自噬的方法。方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物诸如式I、式I-A、式I-B、式II、式III或式IV化合物以在所述受试者中活化自噬。在某些实施方案中，受试者罹患CF、神经变性疾病或炎性疾病。
提供包含脂肪酸半胱胺缀合物(例如式I、式I-A、式I-B、式II、式III、式IV缀合物)和药学上可接受的载体的药物组合物。组合物适用于通过活化自噬来治疗疾病。
以下更详细描述本发明的各个方面和实施方案。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明，但现时描述说明性方法和材料。本发明的其它特征、目标和优势将根据描述和权利要求而显而易知。在说明书和随附权利要求中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数形式。
附图简述
图1A是当用化合物II-2处理时，Huh-7细胞的免疫印迹。图1B是显示当用化合物II-2在25μM的浓度下处理Huh-7细胞时，LC3-II/LC3-I的比率的柱状图。
图2A是在暴露于胱胺、二十碳五烯酸(“EPA”)、胱胺和EPA的组合、或化合物II-2 2小时之后，Huh-7细胞的免疫印迹。图2B是显示当用胱胺、EPA、胱胺和EPA的组合、或化合物II-2处理Huh-7细胞时，LC3-II/LC3-I的比率的柱状图。图2C是显示当使HT-29细胞与媒介物或化合物II-3一起孵育24小时时，根据LC3-II/LC3-I的比率得出的自噬增加的柱状图。图2D是显示当使HT-29细胞与媒介物或化合物II-3一起孵育24小时时，相应细胞表面CFTR增加的柱状图。图2E是显示当使HT-29细胞与媒介物、IV-1或IV-1一起孵育24小时时，相应细胞表面CFTR增加的柱状图。
图3A是免疫印迹，并且图3B是显示当用胱胺(250μM)、EPA(250μM)、胱胺和EPA(各自250μM)的组合或化合物II-2(50μM)处理Huh-7细胞时，LC3-II/LC3-I的比率的柱状图。
图4是显示当用：(1)媒介物对照组；(2)化合物II-3(25μM)；(3)胱胺(25μM)；(4)DHA(25μM)；(5)胱胺(25μM)和DHA的组合；(6)胱胺(250μM)；(7)DHA(250μM)；和(8)胱胺(250μM)和DHA(250μM)的组合处理HT-29细胞24小时时，LC3-II/LC3-I的比率的柱状图。
图5A是显示在与：1)媒介物+VX-770(100nM)；2)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；3)化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；4)化合物II-3(10μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合一起孵育24小时之后，原代CF细胞(ΔF508纯合性)的CFTR条带C数据的柱状图。
图5B是显示在与(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；(3)化合物I-1(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；和(4)化合物I-1(10μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合一起孵育24小时之后，原代CF细胞(ΔF508纯合性)的CFTR条带C数据的柱状图。
图5C是显示当原代CF细胞(纯合ΔF508)在与：(1)媒介物对照组；(2)胱胺(25μM)；(3)DHA(25μM)；(4)胱胺(25μM)和DHA(25μM)的组合；(5)胱胺(250μM)；(6)DHA(250μM)；(7)胱胺(250μM)和DHA(250μM)的组合；和(8)化合物II-3(25μM)一起孵育24小时之后时，LC3-II/LC3-I的比率的柱状图。
图5D是显示当原代CF细胞(纯合ΔF508)在与：(1)媒介物对照组；(2)胱胺(25μM)；(3)DHA(25μM)；(4)胱胺(25μM)和DHA(25μM)的组合；(5)胱胺(250μM)；(6)DHA(250μM)；(7)胱胺(250μM)和DHA(250μM)的组合；和(8)化合物I-1(25μM)一起孵育24小时之后时，CFTR条带C/肌动蛋白的比率的柱状图。
图5E是显示当用：(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)化合物II-3(25μM)+VX-770(100nM)；(3)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；和(4)化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)处理原代CF细胞(纯合ΔF508)时，LC3-II/LC3-I的比率的柱状图。
图5F是显示当用：(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)化合物II-3(25μM)+VX-770(100nM)；(3)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；和(4)化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)处理原代CF细胞(纯合ΔF508)时，自噬蛋白-1/肌动蛋白的比率的柱状图。
图5G是显示当用：(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)化合物II-3(25μM)+VX-770(100nM)；(3)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；和(4)化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)处理原代CF细胞(纯合ΔF508)时，p62/肌动蛋白的比率的柱状图。
图5H是显示当用：(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)化合物II-3(25μM)+VX-770(100nM)；(3)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；和(4)化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)处理原代CF细胞(纯合ΔF508)时，CFTR条带C数据的柱状图。
图6是显示当用10μM化合物II-2处理细胞4小时(用3μMVX-809作为阳性对照)时，Fisher大鼠甲状腺(FRT)/ΔF508CFTR上皮响应的图。
图7A是显示当用：(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)化合物II-3(10μM)+VX-770(100nM)；(3)阳性对照组，VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；和(4)化合物II-3(10μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)处理FRT细胞24小时时产生的短路电流(IISC)迹线的图。在尤斯室(Ussing chamber)测定中产生短路电流。
图7B是显示对图7A中所示的迹线的在添加毛喉素(Forskolin)后的稳态响应的定量的柱状图，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量；图7C是显示对图7A中所示的迹线的在添加毛喉素后的稳态响应的定量的柱状图，表示为对照％；
图7D是显示对图7A中所示的迹线的在添加CFTRinh-172后的稳态响应的定量的柱状图，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量；
图7E是显示对图7A中所示的迹线的在添加CFTRinh-172后的稳态响应的定量的柱状图，表示为对照％。
图8A是显示当使原代CF细胞(纯合ΔF508)与：(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)阳性对照组，VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；和(3)化合物II-3(1μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)一起孵育24小时时产生的短路电流(IISC)迹线的图。在尤斯室测定中产生短路电流。
图8B是显示对图8A中所示的迹线的在毛喉素添加后的稳态响应的定量的柱状图，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量；并且
图8C是显示对图8A中所示的迹线的总响应的定量的柱状图，如通过曲线下面积(AUC)所测量，表示为对照％。
图9A是显示当使原代CF细胞(纯合ΔF508)与：(1)媒介物+VX-770(100nM)；(2)阳性对照组，VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；(3)化合物I-1(1μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)一起孵育24小时时产生的短路电流(IISC)迹线的图。在尤斯室测定中产生短路电流。
图9B是显示对图9A中所示的迹线的在毛喉素添加后的稳态响应的定量的柱状图，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量；图9C是显示对图9A中所示的迹线的总响应的定量的柱状图，如通过曲线下面积(AUC)所测量，表示为对照％。
图10是显示当在用铜绿假单胞菌(Pseudomona aeruginosa)感染之前用化合物II-3(25μM)预处理人支气管上皮细胞时，细胞内细菌水平(以菌落形成单位(“CFU”)/mL计)降低的柱状图。阳性对照是细胞内抗生素细胞松弛素-D(Cytochalasin-D)。
图11A是显示在0、0.5、1和2小时之后，大鼠或小鼠血浆中在孵育之后剩余的母体化合物II-2％的柱状图；图11B是显示在0、0.5、1和2小时之后，大鼠或小鼠血浆中在孵育之后剩余的母体化合物II-3％的柱状图。
图12是显示当用化合物II-3治疗天然BALB/c小鼠3.5天(100mg/kg，每日两次，口服)时，肺组织中自噬活化水平(增加22％)的柱状图。
图13A是显示当在PBS或TGFβ刺激下用化合物II-3(25μM)或I-1(25μM)处理正常人肺纤维母细胞(NLF)或特发性肺纤维化细胞(LL29和LL79A)时，胶原蛋白1a1(COL1a1)的mRNA水平的柱状图；图13B是显示当在PBS或TGFβ刺激下用化合物II-3(25μM)或I-1(25μM)处理正常人肺纤维母细胞(NLF)或特发性肺纤维化细胞(LL29和LL79A)时，纤维结合蛋白1(Fibronectin 1，FN1)的mRNA水平的柱状图；并且图13C是显示当在PBS或TGFβ刺激下用化合物II-3(25μM)或I-1(25μM)处理正常人肺纤维母细胞(NLF)或特发性肺纤维化细胞(LL29和LL79A)时，TIMP-2的mRNA水平的柱状图。
图14A是显示当用媒介物或化合物II-3(25μM)处理NLF、LL29或LL97A细胞时，TIMP-2的基础水平(PBS处理)的柱状图；并且图14B是显示当在TGFβ刺激下用媒介物或化合物II-3(25μM)处理NLF、LL29或LL97A细胞时，TIMP-2的水平的柱状图。
图15A是显示当用媒介物或化合物II-3(25μM)处理NLF、LL29或LL97A细胞时，MMP-2的基础水平(PBS处理)的柱状图；并且图15B是显示当在TGFβ刺激下用媒介物或化合物II-3(25μM)处理NLF、LL29或LL97A细胞时，MMP-2的水平的柱状图。
图16A是显示当用媒介物或化合物II-3(25μM)处理THP-1细胞时，TNF-αmRNA水平的柱状图；图16B是显示当用媒介物或化合物II-3(25μM)处理THP-1细胞时，IL-1βmRNA水平的柱状图；并且图16C是显示当用媒介物或化合物II-3(25μM)处理THP-1细胞时，CCL2mRNA水平的柱状图。
图17是显示当用媒介物或各自25μM的化合物II-2和II-3处理原代CF细胞时，CFTR条带C/肌动蛋白的比率的柱状图。
详述
本发明提供用于活化自噬和治疗各种医学疾病的方法和组合物，所述疾病特别是与自噬调节异常相关的疾病。本发明部分地基于发现脂肪酸半胱胺缀合物适用于活化自噬，并且可用于治疗或预防多种人疾病例如CF。本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物具有不能通过单独施用半胱胺或脂肪酸或以个别组分的组合形式进行施用来实现的治疗作用。半胱胺和ω-3脂肪酸的共价连接允许向某一位置同时递送两种组分，据此个别组分通过裂解(例如酶促裂解)而在所述位置处并且在相同时间得以释放。本发明的益处是相比于可通过个别施用组分来实现的自噬活化水平，施用脂肪酸半胱胺缀合物导致所述水平更高。此外，相比于单独或与未缀合脂肪酸组合施用的半胱胺，施用脂肪酸半胱胺缀合物可在低得多的浓度下导致协同性炎症减轻。因此，脂肪酸半胱胺缀合物提供不能通过分开施用被缀合以产生脂肪酸半胱胺缀合物的个别组分(单独或共同施用)来实现的多个益处。预期本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物和治疗方法在治疗CF方面具有特定优势。
CF是一种在美国影响大约30,000名患者的罕见疾病。它是一种与导致缺陷性CFTR(即跨越上皮细胞膜转运氯离子的离子通道)的遗传突变相关的致衰弱性疾病。已显示CF患者具有缺陷性和降低的自噬水平，所述自噬是一种有助于细胞移除外来或受损细胞器、缺陷性或错误折叠蛋白质以及甚至侵袭性微生物的在进化上保守的溶酶体降解途径。已显示使自噬活化潜在适用于使缺陷性CFTR恢复功能。
预期使自噬活化也适用于治疗除CF以外的多种疾病，例如与细胞、组织、细胞器、器官中的自噬降低相关的疾病。所述疾病包括例如特发性肺纤维化(IPF)、肺高血压(PH)、神经变性疾病、肝病、肌肉疾病、心脏疾病、代谢疾病、感染、免疫和炎性疾病。肺高血压包括肺动脉高血压(WHO I组，特发性、可遗传和药物/毒素诱发的PH)、归因于收缩或舒张功能异常瓣膜性心脏病的肺高血压(WHO II组)和其它类别(包括来自WHO III-V组的那些)的肺高血压。肝病包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH肝硬化和肝细胞癌(HCC)。可用脂肪酸半胱胺缀合物治疗的代谢疾病的实例包括通常在CF患者之中观察到的2型糖尿病。神经变性疾病包括亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和传染性海绵状脑病变。自噬恢复疗法也可适用于诸如维西综合征(Vici syndrome)、肌肉减少症和肌营养不良的疾病。存在多种形式的肌营养不良，并且这些形式包括最常见的杜兴肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)。其它形式的肌营养不良包括贝克尔肌营养不良、肢带肌营养不良、先天性肌营养不良、面肩胛肱型肌营养不良、肌强直性肌营养不良、眼咽性肌营养不良、远端性肌营养不良和艾梅-德莱富斯(Emery-Dreifuss)肌营养不良。具有缺陷性自噬的其它疾病包括年龄相关的黄斑变性、Danon病、X连锁性肌病变、婴儿自噬空泡肌病变、成人发作型空泡肌病变、蓬佩病(Pompe disease)、偶发性包涵体肌炎、2B型肢带肌营养不良和三好氏肌病变(Miyoshi myopathy)。脂肪酸半胱胺缀合物也可适用于治疗线粒体疾病，诸如Leigh氏综合征、糖尿病和耳聋(DAD)、利伯氏遗传性视神经病变(Leber’shereditary optic neuropathy)、神经病变-共济失调-色素性视网膜炎和下垂症(NARP)、肌神经源性胃肠脑病变(MNGIE)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)和线粒体肌病变-脑肌病变-乳酸酸中毒-中风样症状(MELAS)。因为半胱胺在细胞内释放，所以本发明化合物也可用于治疗溶酶体病症肾病变性胱氨酸贮积症。
除非另外指示，否则本发明的实施采用常规有机化学、细胞生物学、生物化学、药理学、配制和药物递送技术。为明晰起见，以下在各章节中阐述本发明的各个方面；然而，应了解一个特定章节中所述的本发明的方面将不限于任何特定章节。
I.定义
为有助于理解本发明，以下定义许多术语和短语。
冠词“一(a/an)”在本公开中用于指代冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象，除非所述情形不适当。举例来说，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
除非另外指示，否则术语“和/或”在本公开中用于意指“和”或“或”。
如本文所用的术语“烷基”是指饱和直链或支链烃，诸如具有1-12、1-10或1-6个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别称为C1-C12烷基、C1-C10烷基和C1-C6烷基。示例性烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
术语“C1-C3烷基”是指含有1-3个碳原子的直链或支链饱和烃。C1-C3烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基和异丙基。术语“C1-C4烷基”是指含有1-4个碳原子的直链或支链饱和烃。C1-C4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基和叔丁基。术语“C1-C5烷基”是指含有1-5个碳原子的直链或支链饱和烃。C1-C5烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基以及叔丁基、异戊基和新戊基。术语“C1-C6烷基”是指含有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃。C1-C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基和新戊基。
术语“环烷基”是指环状饱和烃，诸如含有3-6个碳原子的环状饱和烃。环烷基可含有3-12、3-8、4-8或4-6个环碳原子，在本文中例如称为“C4-8环烷基”。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。除非另外指定，否则应了解环烷基上任何可取代氢都可被卤素基团、C1-C3烷基、羟基、烷氧基和氰基取代。在某些实施方案中，环烷基未被取代。
除非另外指示，否则术语“芳基”是指具有1至2个芳族环的碳环芳族烃基团，包括单环或双环基团，诸如苯基、联苯或萘基。当含有两个芳族环(双环等)时，芳基的芳族环可在单个点处连接(例如联苯)，或可加以稠合(例如萘基)。芳基可任选在任何连接点处被一个或多个取代基例如1至5个取代基取代，所述取代基包括例如卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰氨基、羧酸、-C(O)烷基、-CO2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、磺酰胺、酮、醛、酯、杂环基、芳基或杂芳基部分、-CF3、-CN等。在某些其它实施方案中，芳族环未被取代，即它是未取代的。在某些实施方案中，芳基是6-10元环结构。在某些实施方案中，芳基是6-10元碳环结构。
术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。
术语“杂环基”和“杂环基团”是本领域公知的，并且是指其环结构包括1至4个杂原子诸如氮、氧和硫的饱和、部分不饱和或芳族3至10元环结构，或者3至7元环。杂环基中环原子的数目可使用Cx-Cx命名法来指定，其中x是指定环原子的数目的整数。举例来说，C3-C7杂环基是指含有1至4个杂原子诸如氮、氧和硫的饱和或部分不饱和3至7元环结构。标号“C3-C7”指示杂环含有总计3至7个环原子，包括占据环原子位置的任何杂原子。C3杂环基的一个实例是氮杂环丙烯基。杂环也可为单环、双环或其它多环系统。杂环可稠合于一个或多个芳基部分不饱和或饱和环。杂环基包括例如生物素基、色烯基、二氢呋喃基、二氢吲哚基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二噻唑基、高哌啶基、咪唑烷基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、氧杂环戊烷基、噁唑烷基、吩呫吨基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯烷-2-酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢喹啉基、噻唑烷基、硫杂环戊烷基、硫代吗啉基、噻喃基、呫吨基、内酯、内酰胺诸如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺内酯等。除非另外指定、否则杂环任选在一个或多个位置处被取代基取代，所述取代基诸如烷酰基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、酰氨基、脒基、氨基、芳基、芳基烷基、叠氮基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基、羧基、氰基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤素、卤代烷基、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基、酮、硝基、氧代、磷酸酯基、膦酸根、次膦酸根、硫酸酯基、硫化物、亚磺酰氨基、磺酰基和硫代羰基。在某些实施方案中，杂环基未被取代，即它是未取代的。
术语“杂芳基”是本领域公知的，并且是指包括至少一个环杂原子的芳族基团。在某些情况下，杂芳基含有1、2、3或4个环杂原子。杂芳基的代表性实例包括吡咯基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基和嘧啶基等。除非另外指定，否则杂芳基环可在一个或多个环位置处被例如卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰氨基、羧酸、-C(O)烷基、-CO2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、磺酰胺、酮、醛、酯、杂环基、芳基或杂芳基部分、-CF3、-CN等取代。术语“杂芳基”也包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳为两个邻接环(所述环是“稠环”)所共有，其中至少一个环是杂芳族，例如其它环可为环烷基、环烯基、环炔基和/或芳基。在某些实施方案中，杂芳基环在一个或多个环位置处被卤素、烷基、羟基或烷氧基取代。在某些其它实施方案中，杂芳基环未被取代，即它是未取代的。在某些实施方案中，杂芳基是其环结构包括1、2、3或4个杂原子诸如氮、氧和硫的5至10元环结构，或者5至6元环结构。
如本文所用的术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃，诸如具有2-12、2-10或2-6个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别称为C2-C12烯基、C2-C10烯基和C2-C6烯基。示例性烯基包括乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。
如本文所用的术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和直链或支链烃，诸如具有2-12、2-10或2-6个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别称为C2-C12炔基、C2-C10炔基和C2-C6炔基。示例性炔基包括乙炔基、丙-1-炔-1-基和丁-1-炔-1-基。
术语“胺”和“氨基”是本领域公知的，并且是指未取代的胺与取代的胺两者，例如由通式–N(R50)(R51)表示的部分，其中R50和R51各自独立地表示氢、烷基、环烷基、杂环基、烯基、芳基、芳烷基或-(CH2)m-R61；或R50和R51连同它们所连接的N原子一起完成在环结构中具有4至8个原子的杂环；R61表示芳基、环烷基、环烯基、杂环或多环；并且m是零或在1至8的范围内的整数。在某些实施方案中，R50和R51各自独立地表示氢、烷基、烯基或-(CH2)m-R61。
术语“烷氧基(alkoxyl/alkoxy)”是本领域公知的，并且是指具有与其连接的氧基团的如上定义的烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙基氧基、叔丁氧基等。“醚”是两个通过氧共价连接的烃。因此，烷基的致使那个烷基成为醚的取代基是烷氧基或类似于烷氧基，诸如可由-O-烷基、-O-烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R61中的一个表示，其中m和R61如上所述。
如本文所用的术语“氨基甲酸酯基”是指具有形式-RgOC(O)N(Rh)-、-RgOC(O)N(Rh)Ri-或-OC(O)NRhRi的基团，其中Rg、Rh和Ri各自独立地是烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、羧基、氰基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤素、卤代烷基、杂芳基、杂环基、羟基、酮、硝基、硫化物、磺酰基或磺酰胺。示例性氨基甲酸酯基包括芳基氨基甲酸酯基和杂芳基氨基甲酸酯基，例如其中Rg、Rh和Ri中的至少一个独立地是芳基或杂芳基诸如苯基和吡啶基。
符号指示连接点。
本公开化合物可含有一个或多个手性中心和/或双键，并且因此以诸如几何异构体、对映异构体或非对映异构体的立体异构体形式存在。当在本文中使用时，术语“立体异构体”由所有几何异构体、对映异构体或非对映异构体组成。视围绕立体碳原子的取代基的构型而定，这些化合物可由符号“R”或“S”指定。本发明涵盖这些化合物的各种立体异构体及其混合物。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体。对映异构体或非对映异构体的混合物可在命名时指定为“(±)”，但熟练技术人员将认识到结构可隐含地指示手性中心。应了解除非另外指示，否则对化学结构例如通用化学结构的图示描绘涵盖指定化合物的所有立体异构形式。
本发明化合物的个别立体异构体可由可商购获得的含有不对称或立体中心的起始物质合成制备，或通过制备外消旋混合物，随后采用为本领域普通技术人员所熟知的拆分方法来制备。这些拆分方法由(1)使对映异构体的混合物连接于手性助剂，通过重结晶或色谱法来分离所得非对映异构体混合物，以及使光学纯产物从助剂释放，(2)采用光学活性拆分剂形成盐，或(3)在手性色谱柱上直接分离光学对映异构体的混合物例示。也可通过熟知方法来将立体异构混合物拆分成它们的组成立体异构体，所述方法诸如手性相气相色谱法、手性相高效液相色谱法、使化合物以手性盐络合物形式结晶、或使化合物在手性溶剂中结晶。此外，可通过熟知不对称合成方法来从立体异构纯中间体、试剂和催化剂获得立体异构体。
几何异构体也可存在于本发明化合物中。符号表示可为如本文所述的单键、双键或三键的键。本发明涵盖由取代基围绕碳-碳双键排列或取代基围绕碳环排列产生的各种几何异构体及其混合物。围绕碳-碳双键的取代基被指定为呈“Z”或“E”构型，其中术语“Z”和“E”根据IUPAC标准加以使用。除非另外规定，否则描绘双键的结构涵盖“E”异构体与“Z”异构体两者。
或者，围绕碳-碳双键的取代基可被称为“顺式”或“反式”，其中“顺式”表示取代基在双键的同侧，而“反式”表示取代基在双键的对侧。取代基围绕碳环排列被指定为“顺式”或“反式”。术语“顺式”表示取代基在环平面的同侧，而术语“反式”表示取代基在环平面的对侧。其中取代基安置在环平面的同侧与对侧两者上的化合物的混合物被指定为“顺式/反式”。
本发明也包括同位素标记的本发明化合物，其与本文叙述的那些化合物相同，例外之处是一个或多个原子被原子质量或质量数不同于通常在自然界中所见的原子质量或质量数的原子替换。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，诸如分别是2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。
某些同位素标记的公开化合物(例如用3H和14C标记的化合物)适用于化合物和/或基质组织分布测定中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素由于它们容易制备和可检测而是特别优选的。此外，用诸如氘(即2H)的重同位素取代可提供某些由较大代谢稳定性所致的治疗优势(例如体内半衰期增加或剂量需求降低)，并且因此在一些情况下可为优选的。同位素标记的本发明化合物可通常通过遵循与例如本文实施例中公开的程序类似的程序，用同位素标记的试剂替代非同位素标记的试剂来制备。
术语“脂肪酸半胱胺衍生物”和“脂肪酸半胱胺缀合物”包括本文所述的脂肪酸胱胺衍生物和脂肪酸半胱胺缀合物的任何和所有可能异构体、立体异构体、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物。
术语“天然存在的氨基酸的任何侧链”是指任一以下氨基酸的侧链：异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、组氨酸和酪氨酸。
如本文所用的术语“脂肪酸”意指ω-3脂肪酸和在体内代谢成ω-3脂肪酸的脂肪酸。脂肪酸的非限制性实例是全顺式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亚麻酸(ALA或全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、十八碳四烯酸(STD或全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ETE或全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(ETA或全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(EPA或全顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)、二十二碳五烯酸(DPA、鰶鱼酸(clupanodonic acid)或全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(DHA或全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十二碳六烯酸)或二十四碳六烯酸(尼生酸或全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四碳烯酸)。
术语“半胱胺”是指具有式的分子(也称为2-氨基乙烷-1-硫醇)，其可由胱胺获得。胱胺是含硫醇化合物半胱胺(也称为2-氨基乙烷-1-硫醇)的二硫化物形式。当二硫化物形式胱胺在细胞内部被摄取时，它通过硫醇还原酶的作用而被还原成硫醇化合物半胱胺(参见Arunachalam等(2000)PNAS,97,第745-750页)。硫醇化合物半胱胺被视为细胞中胱胺的活性组分。可在细胞内部递送活性硫醇化合物半胱胺的胱胺分子的非限制性实例列于以下流程A中。
流程A
术语“囊性纤维化”或“CF”是指涉及缺陷性CFTR的病症、疾病和综合征。存在超过1900种可导致CF的突变。这些突变被进一步分成6个不同类别(I-VI类)。CF可涉及可存在于6个不同类别中的任一个中的任何可能突变。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指待通过本发明方法来治疗的生物体。所述生物体优选是哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、母牛、猪或非人灵长类动物诸如猴、黑猩猩、狒狒、恒河猴等)，并且更优选是人。
如本文所用，术语“有效量”是指化合物(例如本发明化合物)足以实现对受试者有益或为受试者所需的结果的量。有效量可以一次或多次施用、施加或剂量加以施用，并且不意图限于特定制剂或施用途径。
如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与使得组合物尤其适于体内或离体诊断或治疗用途的惰性或活性载体的组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如像油/水或水/油乳液)和各种类型的湿润剂。组合物也可包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见Martin,Remington'sPharmaceutical Sciences,第15版,Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐(例如酸盐或碱盐)，其在向受试者施用后能够提供本发明化合物或其活性代谢物或残余物。如本领域技术人员所知，本发明化合物的“盐”可由无机或有机酸和碱获得。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、丁二酸、甲苯对磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。诸如草酸的其它酸尽管本身不是药学上可接受的，但可用于制备在获得本发明化合物和它们的药学上可接受的酸加成盐时适用作中间体的盐。
碱的实例包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和其中W是C1-4烷基的式NW4 +化合物等。
盐的实例包括但不限于：乙盐酸、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、反丁烯二酸盐、果糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(palmoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其它实例包括本发明化合物的阴离子与适合阳离子诸如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是C1-4烷基)等化合。对于治疗用途，预期本发明化合物的盐是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可例如适用于制备或纯化药学上可接受的化合物。
术语“载体”是指赋形剂和稀释剂，并且意指向受试者施用药物制剂或将药物制剂从受试者的一个器官或身体部分运载或运送至另一器官或身体部分中涉及的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封物质。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating)”包括导致病状、疾病、病症等的改善，或改善其症状的任何作用，例如减轻、减弱、调节、改善或消除。治疗可为治愈、改善或至少部分改善病症。在某些实施方案中，治疗是治愈疾病。
术语“病症”是指术语疾病、病状或毛病，并且可与所述术语互换使用。
术语“前药”是指可在体内通过代谢手段(例如通过水解)转化成脂肪酸半胱胺缀合物的化合物。
以下缩写在本文中使用，并且具有所指示定义：Boc和BOC是叔丁氧基羰基，Boc2O是二碳酸二叔丁酯，BSA是牛血清白蛋白，CDI是1,1'-羰基二咪唑，DCC是N,N'-二环己基碳二亚胺，DIEA是N,N-二异丙基乙胺，DMAP是4-二甲基氨基吡啶，DMEM是杜贝卡氏改良依格培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)，DMF是N,N-二甲基甲酰胺，DOSS是丁二酸二辛酯磺酸钠，EDC和EDCI是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，ELISA是酶联免疫吸附测定，EtOAc是乙酸乙酯，FBS是胎牛血清，hr是小时，HATU是2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐，HIV是人免疫缺陷病毒，HPMC是羟丙基甲基纤维素，oxone是过氧单硫酸钾，Pd/C是钯碳，TFA是三氟乙酸，TGPS是生育酚丙二醇丁二酸酯，并且THF是四氢呋喃。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。
在整个描述中，当将组合物和试剂盒描述为具有、包括或包含特定组分时，或当将过程和方法描述为具有、包括或包含特定步骤时，预期另外存在基本上由所述组分组成或由所述组分组成的本发明的组合物和试剂盒，以及存在基本上由所述处理步骤组成或由所述处理步骤组成的本发明的过程和方法。
一般来说，除非另外规定，否则列举百分比的组成以重量计。此外，如果变量未附有定义，那么以所述变量的先前定义为准。
II.脂肪酸半胱胺缀合物
以下描述用于治疗应用和药物组合物中的示例性脂肪酸半胱胺缀合物。
式I
本发明的一个方面提供由以下表示的式I化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中：
RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基、烷氧基、卤素和酰基；
n*和m*独立地是1、2或3；
Z*是其中：
R1和R2独立地是氢、C1-C4烷基或卤素；
r是2、3或7；
s是3、5或6；
t是0或1；并且
v是1、2或6。
以上式I中的变量的定义涵盖多个化学基团。本申请涵盖以下实施方案，其中例如i)变量的定义是选自以上阐述的那些化学基团的单个化学基团，ii)定义是两个或更多个选自以上阐述的那些化学基团的化学基团的集合，和iii)化合物通过变量的组合来定义，其中所述变量通过(i)或(ii)来定义。
在某些实施方案中，化合物是式I化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或甲基。在某些实施方案中，RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6是氢。
在某些实施方案中，RI-2和RI-3各自独立地是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，RI-4和RI-5各自独立地是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，n*是2。在某些实施方案中，m*是2。在某些实施方案中，n*是2，并且m*是2。在某些实施方案中，n*和m*独立地是2或3。
在某些实施方案中，键合于相同碳原子的RI-2与RI-3两者各自是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，n*是2，并且至少一对键合于相同碳原子的RI-2和RI-3各自是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，键合于相同碳原子的RI-4与RI-5两者各自是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，m*是2，并且至少一对键合于相同碳原子的RI-4和RI-5各自是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的吡啶基：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是吡啶基。在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是
在某些实施方案中，Z*是其中R1和R2是氢或甲基。在某些实施方案中，R1和R2是氢。在某些实施方案中，Z*是以下中的一个：
以上描述是描述与式I化合物相关的多个实施方案。本专利申请明确涵盖所述实施方案的所有组合。
式I-A
本发明的一个方面提供由以下表示的式I-A化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中：
RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基、烷氧基、卤素和酰基；
n*和m*独立地是2或3；
Z*是其中：
R1和R2独立地是氢、C1-C4烷基或卤素；
r是2、3或7；
s是3、5或6；
t是0或1；并且
v是1、2或6；
前提是当Z是时，那么RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5或RI-6中的至少一个是C1-C3烷基，n*或m*中的至少一个是1或3，或YI-1不同于3-吡啶基。
以上式I-A中的变量的定义涵盖多个化学基团。本申请涵盖以下实施方案，其中例如i)变量的定义是选自以上阐述的那些化学基团的单个化学基团，ii)定义是两个或更多个选自以上阐述的那些化学基团的化学基团的集合，和iii)化合物通过变量的组合来定义，其中所述变量通过(i)或(ii)来定义。
在某些实施方案中，化合物是式I-A化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或甲基。在某些实施方案中，RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6是氢。
在某些实施方案中，RI-2和RI-3各自独立地是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，RI-4和RI-5各自独立地是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，n*是2。在某些实施方案中，m*是2。在某些实施方案中，n*是2，并且m*是2。
在某些实施方案中，键合于相同碳原子的RI-2与RI-3两者各自是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，n*是2，并且至少一对键合于相同碳原子的RI-2和RI-3各自是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，键合于相同碳原子的RI-4与RI-5两者各自是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，m*是2，并且至少一对键合于相同碳原子的RI-4和RI-5各自是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的吡啶基：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是吡啶基。在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是
在某些实施方案中，Z*是其中R1和R2是氢或甲基。在某些实施方案中，R1和R2是氢。在某些实施方案中，Z*是以下中的一个：
以上描述是描述与式I-A化合物相关的多个实施方案。本专利申请明确涵盖前述实施方案的所有组合。
式I-B
本发明的另一方面提供由以下表示的式I-B化合物：
或其药学上可接受的盐；其中：
RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基、烷氧基、卤素和酰基；
s是3、5或6；并且
v是1或2。
以上式I-B中的变量的定义涵盖多个化学基团。本申请涵盖以下实施方案，其中例如i)变量的定义是选自以上阐述的那些化学基团的单个化学基团，ii)定义是两个或更多个选自以上阐述的那些化学基团的化学基团的集合，和iii)化合物通过变量的组合来定义，其中所述变量通过(i)或(ii)来定义。在某些实施方案中，化合物是式I-B化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或甲基。在某些实施方案中，RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6是氢。
在某些实施方案中，键合于相同碳原子的RI-2与RI-3两者各自是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，n*是2，并且至少一对键合于相同碳原子的RI-2和RI-3各自是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，键合于相同碳原子的RI-4与RI-5两者各自是C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，m*是2，并且至少一对键合于相同碳原子的RI-4和RI-5各自是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的吡啶基：烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是吡啶基。在某些实施方案中，YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的烷基、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，YI-1是
以上描述是描述与式I-B化合物相关的多个实施方案。本专利申请明确涵盖前述实施方案的所有组合。
另外的脂肪酸半胱胺缀合物
本发明的另一方面提供一种包含半胱胺通过接头共价连接于脂肪酸的分子缀合物，其中所述脂肪酸选自由ω-3脂肪酸和在体内代谢成ω-3脂肪酸的脂肪酸组成的组。缀合物能够细胞内水解以产生游离半胱胺和游离脂肪酸。
在某些实施方案中，脂肪酸选自由以下组成的组：全顺式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十四碳五烯酸和二十四碳六烯酸。在其它实施方案中，脂肪酸选自二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在其它实施方案中，脂肪酸选自二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在一些实施方案中，脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)。在其它实施方案中，脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。在一些实施方案中，水解是酶促水解。
式II
本发明的另一方面提供式II化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中：
Z是
其中
各t独立地是0或1；
各r独立地是2、3或7；
各s独立地是3、5或6；
各v独立地是1、2或6；
R1和R2独立地选自由以下组成的组：-H、-D、-C1-C4烷基、-卤素、-OH、-C(O)C1-C4烷基、-O-芳基、-O-苯甲基、-OC(O)C1-C4烷基、-C2-C3烯基、-C2-C3炔基、-C(O)C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、SH、-S(C1-C3烷基)、-S(O)C1-C3烷基和-S(O)2C1-C3烷基；
R3和R4独立地是H或 前提是R3和R4中的至少一个是
各R独立地是任选被1、2、3、4或5个选自以下的基团取代的杂芳基：OH、CN、卤素、-CO2R6、-CONHR6、-CONR6R6、-S(O)2NR6R6、-NR6R6、-NR6COR6或-(OCH2CH2)m-OCH3；
各R6独立地是-H、C1-C3烷基、或任选被OH或卤素取代的直链或支链C1-C4烷基；并且
m是1或2。
在式II中，也应了解甲基取代基可被C1-C6烷基取代。
在某些实施方案中，Z是
其中r是2，并且s是6。
在某些实施方案中，Z是
其中r是3，并且s是5。
在某些实施方案中，Z是
其中r是7，并且s是3。
在某些实施方案中，Z是
其中t是1，并且
r是3，并且s是5，或
r是2，并且s是6，或
r是7，并且s是3。
在某些实施方案中，Z是
其中v是1，并且s是6。
在某些实施方案中，Z是
其中v是2，并且s是5。
在某些实施方案中，Z是
其中v是6，并且s是3。
在某些实施方案中，Z通过一个以上实施方案来定义，其中R1和R2是氢。
式III
本发明的另一方面提供式III化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中
W1和W2独立地是NR；
各R独立地是H、-C1-C3烷基、苯基、苯甲基、-CH2CO2R3、-CH2CONR3R3或任选被OH或卤素取代的直链或支链C1-C4烷基；
R5独立地选自由以下组成的组：-H、-D、-Cl、-F、-CN、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-C(O)H、-C(O)C1-C3烷基、-C(O)OC1-C3烷基、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-C1-C3烷基、-O-C1-C3烷基、-S(O)C1-C3烷基和-S(O)2C1-C3烷基；
各a、b、c和d独立地是H、-D、-CH3、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)OR或苯甲基，或a、b、c和d中的两个可连同它们所结合的单个碳一起形成环烷基或杂环；
各n、o、p和q独立地是0或1；
各Z独立地是
各r独立地是2、3或7；
各s独立地是3、5或6；
各t独立地是0或1；
各v独立地是1、2或6；
R1和R2各自独立地是H、D、-C1-C4烷基、-卤素、-OH、-C(O)C1-C4烷基、-O-芳基、-O-苯甲基、-OC(O)C1-C4烷基、-C2-C3烯基、-C2-C3炔基、-C(O)C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-SH、-S(C1-C3烷基)、-S(O)C1-C3烷基、-S(O)2C1-C3烷基；
各R3独立地是H或C1-C6烷基，或两个R3基团在连同它们所连接的氮一起时可形成杂环；前提是当Z是
时，那么a、b、c或d中的至少一个是C1-C3烷基，(i)n和o的总数或(ii)p和q的总数中的至少一个是1或3，或含N杂环不同于3-吡啶基。
式III-A
本发明的另一方面提供式III-A化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中
W1和W2独立地是NR；
各R独立地是H、-C1-C3烷基、苯基、苯甲基、-CH2CO2R3、-CH2CONR3R3或任选被OH或卤素取代的直链或支链C1-C4烷基；
R5独立地选自由以下组成的组：-H、-D、-Cl、-F、-CN、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-C(O)H、-C(O)C1-C3烷基、-C(O)OC1-C3烷基、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-C1-C3烷基、-O-C1-C3烷基、-S(O)C1-C3烷基和-S(O)2C1-C3烷基；
各a、b、c和d独立地是H、-D、-CH3、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)OR或苯甲基，或a、b、c和d中的两个可连同它们所结合的单个碳一起形成环烷基或杂环；
各n、o、p和q独立地是0或1；
各Z独立地是
各r独立地是2、3或7；
各s独立地是3、5或6；
各t独立地是0或1；
各v独立地是1、2或6；
R1和R2各自独立地是H、D、-C1-C4烷基、-卤素、-OH、-C(O)C1-C4烷基、-O-芳基、-O-苯甲基、-OC(O)C1-C4烷基、-C2-C3烯基、-C2-C3炔基、-C(O)C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-SH、-S(C1-C3烷基)、-S(O)C1-C3烷基、-S(O)2C1-C3烷基；
各R3独立地是H或C1-C6烷基，或两个R3基团在连同它们所连接的氮一起时可形成杂环。
以上式III或式III-A中的变量的定义涵盖多个化学基团。本申请涵盖以下实施方案，其中例如i)变量的定义是选自以上阐述的那些化学基团的单个化学基团，ii)定义是两个或更多个选自以上阐述的那些化学基团的化学基团的集合，和ii i)化合物通过变量的组合来定义，其中所述变量通过(i)或(ii)来定义。对于各式III和式III-A化合物，各以下实施方案都同等适用。
在某些实施方案中，至少一个R5是Cl或F。在某些实施方案中，各R5独立地是-H。
在某些实施方案中，W1的R是H或C1-C4烷基。
在某一实施方案中，W2的R是H或C1-C4烷基。
在某些实施方案中，a和c各自独立地是H、CH3、-OCH3、-OCH2CH3或C(O)OR。
在某些实施方案中，n、o、p和q各自是1。在某些实施方案中，n、o、p和q中的两个各自是1。在某些实施方案中，n、o、p和q中的三个各自是1。
在某些实施方案中，Z是
其中r是2，并且s是5。
在某些实施方案中，Z是
其中r是3，并且s是5。
在某些实施方案中，Z是
其中r是7，并且s是3。在某些实施方案中，Z是
其中t是1，并且
r是3，并且s是5，或
r是2，并且s是6，或
r是7，并且s是3。
在某些实施方案中，Z是
其中v是1，并且s是6。
在某些实施方案中，Z是
其中v是2，并且s是5。在某些实施方案中，Z是
其中v是6，并且s是3。
式IV
本发明的另一方面提供式IV化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中
W1是NR；
R独立地是H、-C1-C3烷基、苯基、苯甲基、-CH2CO2R3、-CH2CONR3R3或任选被OH或卤素取代的直链或支链C1-C4烷基；
R5独立地选自由以下组成的组：-H、-D、-Cl、-F、-CN、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-C(O)H、-C(O)C1-C3烷基、-C(O)OC1-C3烷基、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-C1-C3烷基、-O-C1-C3烷基、-S(O)C1-C3烷基和-S(O)2C1-C3烷基；
RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
Z*是其中：
R1和R2独立地是氢、C1-C4烷基或卤素；
r是2、3或7；
s是3、5或6；
t是0或1；并且
v是1、2或6；
m*是2或3；
o*是1或2；
p*是1或2；
RI-7和RI-8各自独立地是H或
任选地，前提是当Z是时，那么RI-2、RI-3、RI-4、RI-5或RI-6中的至少一个是C1-C3烷基，或RI-7和RI-8不是氢，或(i)m*或(ii)o*和p*的总数中的至少一个是1或3，或含N杂环不同于3-吡啶基。在例如与本文涵盖的用途关联的某些情况下，前述前提是不必要的。
以上式IV中的变量的定义涵盖多个化学基团。本申请涵盖以下实施方案，其中例如i)变量的定义是选自以上阐述的那些化学基团的单个化学基团，ii)定义是两个或更多个选自以上阐述的那些化学基团的化学基团的集合，和i ii)化合物通过变量的组合来定义，其中所述变量通过(i)或(ii)来定义。
在某些实施方案中，至少一个R5是Cl或F。在某些实施方案中，各R5独立地是-H。
在某些实施方案中，W1的R是氢或C1-C4烷基。
在某些实施方案中，RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或甲基。在某些实施方案中，RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6是氢。
在某些实施方案中，m*是2。在某些实施方案中，p*是2，并且o*是0。在某些实施方案中，p*是1，并且o*是1。
在某些实施方案中，键合于相同碳原子的RI-2与RI-3两者各自是C1-C3烷基，例如甲基。在某一实施方案中，p*是1或2，并且至少一对键合于相同碳原子的RI-2和RI-3各自是C1-C3烷基，例如甲基。
在某些实施方案中，Z是
其中r是2，并且s是6。
在某些实施方案中，Z是
其中r是3，并且s是5。在某些实施方案中，Z是
其中r是7，并且s是3。在某些实施方案中，Z是
其中t是1，并且
r是3，并且s是5，或
r是2，并且s是6，或
r是7，并且s是3。
在某些实施方案中，Z是
其中v是1，并且s是6。
在某些实施方案中，Z是
其中v是2，并且s是5。
在某些实施方案中，Z是
其中v是6，并且s是3。
在各式I、IA、IB、II、III、III-A或IV中，任何一个或多个H原子都可被氘取代。
示例性特定化合物
在某些实施方案中，化合物是以下中的一个或其药学上可接受的盐：
N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-2)，
N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-3)，
N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-4)，
N-(2-((1-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-5)，
N-(2-((1-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-6)，
N-((R)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-1)，
N-((R)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-2)，
((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁基)氨基甲酸(S)-2,3-二羟基丙酯(IV-3)，
((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁基)氨基甲酸1,3-二羟基丙烷-2-基酯(IV-4)，
((R)-2,3-二羟基丙基)氨基甲酸(R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁酯(IV-5)，
(1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基甲酸(R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁酯(IV-6)，
N-((R)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺(IV-7)，
N-((R)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺(IV-8)，
N-((R)-1-((S)-2,3-二羟基丙氧基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺(IV-9)，
N-((R)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)oxy)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺(IV-10)，
N-((R)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-11)，
N-((R)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-12)，
((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基甲基)丁基)氨基甲酸(S)-2,3-二羟基丙酯(IV-13)，
((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基甲基)丁基)氨基甲酸1,3-二羟基丙烷-2-基酯(IV-14)，
N-((R)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-4-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-4-甲基-1-氧代戊烷-3-基)烟酰胺(IV-15)，
N-((R)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-4-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-4-甲基-1-氧代戊烷-3-基)烟酰胺(IV-16)，
N-((S)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-17)，
N-((S)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-18)，
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(I-1)，和
(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-(2-巯基乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺(I-2)。
在某些实施方案中，化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-1)。
在某些实施方案中，化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-2)。
在某些实施方案中，化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-3)。
在某些实施方案中，化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-4)。
在某些实施方案中，化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
N-(2-((1-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-5)。
在某些实施方案中，化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
N-(2-((1-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-6)。
在某些实施方案中，化合物是：
N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-1)。
在某些实施方案中，化合物是：
N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-2)。
在某些实施方案中，化合物是：
N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-3)。
在某些实施方案中，化合物是：
N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-4)。
在某些实施方案中，化合物是：
N-(2-((1-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-5)。
在某些实施方案中，化合物是：
N-(2-((1-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-6)。
如上所指示，本发明提供一种包含本文所述的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
应了解本发明的脂肪酸半胱胺缀合物可通过一般性程序诸如实施例中所述的那些来合成。
III.脂肪酸半胱胺缀合物的治疗应用
如上所指示，本发明部分地基于脂肪酸半胱胺缀合物适用于活化自噬的发现。本发明的脂肪酸半胱胺缀合物具有不能通过单独或组合施用半胱胺或脂肪酸来实现的治疗作用，并且提供一种以不能通过施用个别组分或个别组分的组合来重现的方式使自噬活化以治疗或预防CF的优异方式。半胱胺和ω-3脂肪酸的共价连接允许向某一位置同时递送两种组分，据此个别组分通过裂解例如酶促裂解而在所述位置处并且在相同时间得以释放。以下描述示例性治疗方法和治疗应用的另外的特征。
示例性治疗方法
本发明的一个方面提供一种治疗本文所述的疾病(例如选自由以下组成的组的疾病：CF、神经变性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染和免疫疾病)的方法。方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物，诸如式I、IA、IB、II、III、III-A或IV化合物以治疗疾病。
在某些实施方案中，疾病是CF。在某些实施方案中，疾病是神经变性疾病(例如亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病或帕金森氏病)。在某些实施方案中，疾病是炎性疾病。在某些实施方案中，疾病是神经变性疾病、肝病、肌肉疾病、感染、免疫或炎性疾病。神经变性疾病包括亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和传染性海绵状脑病变。在某些实施方案中，疾病是特发性肺纤维化。在某些实施方案中，疾病是年龄相关的黄斑变性。在其它实施方案中，疾病是心脏疾病。
在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用式I化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用式I-A化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用式I-B化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用式III化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用式III-A化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用式IV化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。
预期使用本文所述的方法治疗的另外的疾病包括例如被理解为具有缺陷性自噬的以下疾病，包括不限于Danon病、X连锁性肌病变、婴儿自噬空泡肌病变、成人发作型空泡肌病变、蓬佩病、偶发性包涵体肌炎、2B型肢带肌营养不良和三好氏肌病变。
本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物也可适用于治疗线粒体疾病，包括不限于Leigh氏综合征、糖尿病和耳聋(DAD)、利伯氏遗传性视神经病变、神经病变-共济失调-色素性视网膜炎和下垂症(NARP)、肌神经源性胃肠脑病变(MNGIE)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、和线粒体肌病变-脑肌病变-乳酸酸中毒-中风样症状(MELAS)、克亚姆-塞尔综合征(Keam-Sayre syndrome)、亚急性坏死性脑病变(Leigh氏综合征)以及线粒体心肌病变和归因于多种线粒体DNA缺失的其它综合征。另外的线粒体疾病包括不限于神经源性肌无力、进行性眼外肌麻痹(PEO)、以及与OXPHOS复合物的功能异常相关的复合物I疾病、复合物II疾病、复合物III疾病、复合物IV疾病和复合物V疾病、和MEGDEL综合征(IV型3-甲基戊烯二酸尿症伴感觉神经性耳聋、脑病变和利样综合征。
在某些实施方案中，患者是人。
本发明的另一方面提供在受试者中活化自噬的方法。方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物诸如式I-A、式III、式III-A或式IV化合物以在所述受试者中活化自噬。在某些实施方案中，受试者罹患CF、神经变性疾病或炎性疾病。在某些实施方案中，受试者是人。
在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用例如式IA的化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用例如式III的化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用例如式III-A的化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。在某些实施方案中，在治疗疾病的方法中，施用例如式IV的化合物使受试者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。
在某些实施方案中，自噬的活化可根据某些生物标志物的量的变化来表征。一种示例性生物标志物是微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)，其是一种具有约17kDa的分子质量，遍及许多哺乳动物组织和培养细胞存在的可溶性蛋白质。在细胞中，胞质形式的LC3(LC3-I)变得缀合于磷脂酰乙醇胺以形成LC3-磷脂酰乙醇胺缀合物(LC3-II)。参见例如Tanida等(2008)METHODS MOL.BIOL.,第445卷,第77-88页。LC3-II相对于LC3-I的量可用于分析自噬的量的变化。因此，在某些实施方案中，施用一种或多种前述化合物使受试者中LC3-II与LC3-I的比率增加，诸如受试者中LC3-II与LC3-I的比率增加至少约10％、25％、50％、75％或100％。
另一示例性生物标志物是p62蛋白，也称为隔离体1(SQSTM1)，其是一种已被报道与泛素化蛋白质聚集物共定位的泛素结合骨架蛋白质。参见例如Bjorkoy等(2009)METHODSENZYMOL.,第452卷,第181-197页。因此，在某些实施方案中，施用一种或多种前述化合物使受试者中p62蛋白的量降低，诸如受试者中p62蛋白的量降低至少约1％、5％、10％、15％、25％、50％、75％或90％w/w。
在某些实施方案中，在用于增加自噬的方法中，受试者已被诊断为患有CF。在某些实施方案中，在用于增加自噬的方法中，受试者已被诊断为患有神经变性疾病。
此外，并且更一般地，本发明的另一方面提供一种增加自噬的方法，其中所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的分子缀合物，所述分子缀合物包含通过接头与脂肪酸共价连接的半胱胺，其中所述脂肪酸选自由ω-3脂肪酸和在体内代谢成ω-3脂肪酸的脂肪酸组成的组。
此外，本发明提供治疗患者的疾病的方法，所述疾病选自患者中由以下组成的组：特发性肺纤维化、线粒体疾病、Leigh氏综合征、糖尿病和耳聋(DAD)、利伯氏遗传性视神经病变、神经病变-共济失调-色素性视网膜炎和下垂症(NARP)、肌神经源性胃肠脑病变(MNGIE)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、和线粒体肌病变-脑肌病变-乳酸酸中毒-中风样症状(MELAS)。方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的：
(i)化合物
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(I-1)；
(ii)化合物
(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-(2-巯基乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺(I-2)；或
(iii)化合物(i)或(ii)的组合，由此以治疗疾病。在一个实施方案中，疾病是特发性肺纤维化。
自噬、半胱胺和缀合物的另外的特征
自噬是一种用以实质上自我消化一些细胞组分的在进化上保守的溶酶体降解途径(参见Levine和Kroemer(2008)CELL,132,第27-42页)。这个自我消化过程充当帮助细胞移除外来或受损细胞器、缺陷性或错误折叠蛋白质以及甚至侵袭性微生物的手段。已知自噬在CF患者中下调(Luciani等(2011)AUTOPHAGY,7,第104-106页)。自噬也代表一种用于从受感染组织诸如肺移除病原体诸如铜绿假单胞菌的重要细胞机制。自噬的活化可潜在帮助CF患者从他们的长期受感染的肺清除铜绿假单胞菌(Junkins等(2013)PLOS ONE,8,e72263)。
在CF中，缺陷性CFTR导致活性氧物质上调，这使作为促进蛋白质之间的交联的酶的组织转谷氨酰胺酶(TG2)的活性增加。TG2活性增加诱导作为调节自噬的关键蛋白质的自噬蛋白-1(自噬蛋白-1)的交联。自噬蛋白-1的交联过程使它从内质网转移，下调自噬，并且因此导致p62(也称为SQSTM1)的积累。增加的p62可将错误折叠的CFTR隔离到聚集体中，其接着被蛋白酶体靶向以达成降解。已观察到当用高浓度的胱胺(250μM)处理来自具有纯合ΔF508突变的CF患者的人上皮细胞时，存在自噬上调和CFTR恢复至质膜(Luciani等(2012)AUTOPHAGY,8,第1657-1672页；Luciani等(2010)NAT.CELLBIOL.,12,第863-875页)。基本原理是胱胺可抑制TG2活性，此使BECN1的交联降低。这个过程导致p62水平降低，这接着使错误折叠的CFTR逃脱被隔离到聚集体中，并且定位在高尔基体(Golgi)中以向膜运送。尽管有希望，但使缺陷性CFTR恢复活性的这个方法具有一个主要缺点，即诱导各种上皮细胞系中自噬需要高浓度的胱胺(250μM)。预期这个高浓度的胱胺将需要可不切实际以及对于患者来说可能是非顺应的人剂量，因为已知胱胺/半胱胺在高剂量下可诱导显著水平的胃肠不适(Kan等(1984)BRIT.J.EXP.PATHOLOGY,65,第759-765页)。
脂肪酸半胱胺缀合物已被设计以使半胱胺类似物和ω-3脂肪酸集合成单个分子缀合物。脂肪酸半胱胺缀合物的活性实质上大于分子缀合物的个别组分的总和，表明由脂肪酸胱胺缀合物诱导的活性具有协同性。本发明的脂肪酸半胱胺缀合物的另一益处是它们显示极低或不显示外周毒性。
IV.药物组合物
本发明提供包含脂肪酸半胱胺缀合物诸如式I、I-A、I-B、II、III、III-A或IV化合物的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物优选包含治疗有效量的一种或多种连同一种或多种药学上可接受的载体一起配制的上述脂肪酸半胱胺缀合物。如以下所详述，本发明的药物组合物可以固体或液体形式特别配制以进行施用，包括适合于以下的那些形式：(1)口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂(例如为达成经颊、舌下和/或全身性吸收目标的片剂)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于向舌部施加的糊剂；(2)通过例如以例如无菌溶液或混悬液或持续释放制剂形式皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射进行的胃肠外施用；(3)表面施加，例如以乳膏剂、软膏剂或控制释放贴片或喷雾剂形式向皮肤施加；(4)阴道内或直肠内，例如以阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂形式；(5)舌下；(6)经眼；(7)经皮；或(8)经鼻。
短语“药学上可接受”在本文中用于指代在合理医学判断的范围内适用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
本发明制剂包括适于口服、经鼻、经表面(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或胃肠外施用的制剂。制剂可合宜地以单位剂型呈现，并且可通过制药领域中熟知的任何方法制备。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗宿主、特定施用模式而变化。
本发明的药物组合物的片剂和其它固体剂型诸如糖衣片、胶囊、丸剂和颗粒剂可任选加以刻痕或制备有包衣和壳体，诸如肠溶包衣和药物配制领域中熟知的其它包衣。它们也可使用例如用以提供所需释放概况的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球体来配制以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放。它们可被配制以达成快速释放，例如冷冻干燥。它们可通过例如经细菌截留过滤器过滤，或通过并有可在使用之前即刻溶解于无菌水或某一其它无菌可注射介质中的呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌。这些组合物也可任选含有遮光剂，并且可具有它们仅或优先在胃肠道的某一部分中任选以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分也可呈微囊封形式，适当时，连同一种或多种上述赋形剂一起。
用于口服施用本发明化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除活性成分之外，液体剂型可含有通常用于本领域中的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂；增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙脂、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇以及脱水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。
可通过任何适于治疗剂的施用模式来实现脂肪酸半胱胺缀合物的施用。这些模式包括全身性或局部施用，诸如口服、经鼻、胃肠外、经皮、皮下、经阴道、经颊、经直肠或经表面施用模式。
视预定施用模式而定，组合物可呈固体、半固体或液体剂型，诸如可注射剂、片剂、栓剂、丸剂、定时释放胶囊、酏剂、酊剂、乳液、糖浆、粉剂、液体、混悬液等，有时呈单位剂量形式并且符合常规药物规范。同样，它们也可以静脉内(团注与输注两者)、腹膜内、皮下或肌肉内形式施用，所述形式全都使用为药物领域技术人员熟知的形式。
说明性药物组合物是包含脂肪酸半胱胺缀合物和药学上可接受的载体的片剂和明胶胶囊，所述载体诸如：a)稀释剂，例如纯化水、甘油三酯油，诸如氢化或部分氢化植物油或其混合物、玉米油、橄榄油、葵花油、红花油、鱼油诸如EPA或DHA、或它们的酯或甘油三酯或其混合物；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、它的镁盐或钙盐、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠和/或聚乙二醇；对于片剂，也包含c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、碳酸镁、天然糖诸如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、蜡和/或聚乙烯吡咯烷酮；必要时，包含d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、甲基纤维素、膨润土、黄原胶、海藻酸或它的钠盐、或泡腾混合物；e)吸附剂、着色剂、调味剂和甜味剂；f)乳化剂或分散剂，诸如吐温80(Tween 80)、Labrasol、HPMC、DOSS、caproyl 909、labrafac、labrafil、peceol、transcutol、capmul MCM、capmul PG-12、captex 355、gelucire、维生素E TGPS或其它可接受的乳化剂；和/或g)增强化合物的吸收的试剂，诸如环糊精、羟丙基–环糊精、PEG400、PEG200。
液体(特别是可注射)组合物可例如通过溶解、分散等来制备。举例来说，将脂肪酸半胱胺缀合物溶解于药学上可接受的溶剂中或与所述溶剂混合以由此形成可注射等张溶液或混悬液，所述溶剂诸如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等。诸如白蛋白、乳糜微粒或血清蛋白质的蛋白质可用于使脂肪酸半胱胺缀合物溶解。
也可使用聚亚烷基二醇诸如丙二醇作为载体，将脂肪酸半胱胺缀合物配制成可由脂肪乳液或混悬液制备的栓剂。
也可以诸如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的脂质体递送系统的形式施用脂肪酸半胱胺缀合物。脂质体可由多种含有胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱的磷脂形成。在一些实施方案中，脂质组分的薄膜用药物水溶液水合以形成囊封药物的脂质层，如美国专利号5,262,564中所述。
胃肠外可注射施用通常用于皮下、肌肉内或静脉内注射和输注。可注射剂可以常规形式制备成液体溶液或混悬液，或适于在注射之前溶解于液体中的固体形式。
组合物可分别根据常规混合、粒化或包覆方法制备，并且以重量或体积计，本发明药物组合物可含有约0.1％至约80％、约5％至约60％、或约1％至约20％的脂肪酸半胱胺缀合物。
根据多种因素选择利用脂肪酸半胱胺缀合物的剂量方案，所述因素包括患者的类型、物种、年龄、重量、性别和医学状况；待治疗的病状的严重性；施用途径；患者的肾功能或肝功能；采用的特定脂肪酸半胱胺缀合物。本领域普通技术医师或兽医可易于确定并指定用于防止、对抗或遏止病状进展所需的药物的有效量。
当用于达成所指示作用时，本发明的有效剂量在每天约20mg至约5,000mg的脂肪酸半胱胺缀合物的范围内。用于体内或体外使用的组合物可含有约20、50、75、100、150、250、500、750、1,000、1,250、2,500、3,500或5,000mg的脂肪酸半胱胺缀合物。脂肪酸半胱胺缀合物的有效血浆水平可在每天约5ng/mL至5000ng/mL的范围内。脂肪酸半胱胺缀合物的适当剂量可如Goodman,L.S.；Gilman,A.(1975)THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,第5版；MacMillan:New York,第201-226页中所阐述来确定。脂肪酸半胱胺缀合物可以单次每日剂量施用，或总体每日剂量可以每日两次、三次或四次分次剂量施用。
组合疗法
脂肪酸半胱胺缀合物也可与其它治疗剂诸如CFTR调节剂、上皮钠通道(ENaC)抑制剂、消炎剂、抗纤维化剂和抗细菌剂一起施用。在一些实施方案中，其它治疗剂是CFTR调节剂。CFTR调节剂的非限制性实例包括依伐卡托(VX-770)、鲁玛卡托(VX-809)、VX-661、奥卡比(Orkambi)(VX-770和VX-809的组合)、VX-152、VX-440、VX-661和VX-770的组合、VX-152/VX-809和VX-770的组合、VX-440/VX-809和VX-770的组合、P-1037、利奥西呱(Riociguat)、N91115、QBW251、QR-010、GLPG1837、GLPG2222、GLP2665、染料木黄酮(genistein)、黄岑黄素(baicalein)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、三甲基当归根素(trimethylangelicin)和阿塔鲁任(Ataluren)。
在一些实施方案中，其它治疗剂是消炎剂。消炎剂的非限制性实例包括布洛芬(ibuprofen)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、倍氯米松(beclometasone)、布地缩松(budesonide)、氟替卡松(fluticasone)、莫米松(mometasone)、施立泰(Seretide)(氟替卡松加沙美特罗(salmeterol))、Symbicort(布地缩松加福莫特罗(formoterol))和N91115。
在一些实施方案中，其它治疗剂是抗细菌剂。抗细菌剂的非限制性实例包括阿奇霉素(azithromycin)、妥布霉素(tobramycin)、赖氨酸氨曲南(aztreonam lysine)、粘菌素(colistin)、氨基糖苷(aminoglycoside)、万古霉素(vancomycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)和磺酰胺(sulfonamide)。
在一些实施方案中，其它治疗剂是上皮钠通道(ENaC)抑制剂。ENaC抑制剂的非限制性实例包括阿米洛利(amiloride)、BA-39-9437、GS-9411和P-1037。
在一些实施方案中，其它治疗剂是抗纤维化剂。抗纤维化剂的非限制性实例包括吡非尼酮(pirfenidone)、尼达尼布(nintedanib)、INT-767、STX-100、AM152、己酮可可碱(pentoxyphilline)、FG-3019、CNTO 888、曲洛奇单抗(Tralokinumab)、SAR156597、GS-6624、BMS-986020、勒比奇单抗(Lebrikizumab)、GSK2126458、ACT-064992、维莫德吉(vismodegib)、PRM-151、IW001和弗利索利木单抗(Fresolimumab)。
V.用于医学应用中的试剂盒
本发明的另一方面提供一种用于治疗病症的试剂盒。所述试剂盒包括：i)治疗医学病症诸如CF的说明书；和ii)本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物。试剂盒可包括一个或多个含有一定量的本文所述的脂肪酸半胱胺缀合物的单位剂型。
以上描述是描述本发明的多个方面和实施方案，包括脂肪酸半胱胺缀合物、包含脂肪酸半胱胺缀合物的组合物、使用脂肪酸半胱胺缀合物的方法以及试剂盒。本专利申请明确涵盖各个方面和实施方案的所有组合和排列。
实施例
本公开进一步通过以下实施例来说明，所述实施例不应解释为在范围或精神方面将本公开限于本文所述的特定程序。应了解提供实施例以说明某些实施方案，并且不意图由此限制本公开的范围。
实施例1
制备N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-2)：
在典型操作中，将(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-(2-((2-氨基乙基)二硫烷基)乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺(1mmol，根据WO2012/115695中概述的程序制备)连同烟酸(1mmol)、HATU(1.1mmol)和Et3N(1.5mmol)一起溶解于25mL CH2Cl2中。在室温下搅拌所得反应混合物8小时，并且用饱和NH4Cl水溶液稀释。分离两层，并且有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(95％CH2Cl2，5％MeOH)纯化以提供N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)烟酰胺。MS(EI)：C30H43N3O2S2的计算值：541.28；实测值：542[M+H]+。
实施例2
制备N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-3)：
在室温下逐滴添加于MeOH(200mL)中含有1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷(26g，0.227mmol)的溶液至于MeOH(200mL)中含有半胱胺(50g，0.227mmol)的溶液中。在室温下在惰性氮气氛围下搅拌所得反应混合物2小时，接着在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH＝10/1)纯化以提供2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙烷-1-胺(39g，92％产率)。将含有2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙烷-1-胺(5g，26.8mmol)、DHA(9.2g，26.8mmol)和HATU(10.2g，26.8mmol)的混合物溶解于CH2Cl2(100mL)中，并且在室温下搅拌。接着在室温下逐滴添加三乙胺(18mL，40.3mmol)。在室温下搅拌所得反应混合物18小时，其接着用水稀释并用CH2Cl2萃取。合并的有机层用水(3×100mL)、盐水(100mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(戊烷/EtOAc)纯化以提供呈浅棕色油状的(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(10g，75％产率)。
在室温下逐滴添加1-氨基-2-甲基丙烷-2-硫醇(1.14g，8mmol)至于1:1MeOH/DMF混合物(10mL)中含有(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(4g，8mmol)的溶液中。在室温下搅拌所得反应混合物18小时，其接着用水稀释并用EtOAc萃取。合并的有机层用水(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(戊烷/EtOAc)纯化以提供呈浅棕色油状的(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-((1-氨基-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(3.2g，81％产率)。
将(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-((1-氨基-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(3.2g，6.5mmol)和烟酰氯(1.8g，13mmol)溶解于CH2Cl2(30mL)中。在0℃下逐滴添加三乙胺(3mL，19.5mmol)。在室温下搅拌所得混合物18小时，其接着用水稀释并用CH2Cl2萃取。合并的有机层用水(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(戊烷/EtOAc)纯化以提供呈浅棕色油状的N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(2.2g，57％产率)。MS：C34H49N3O2S2的计算值：595.3；实测值：596.3[M+H]+。
实施例3
制备N-(2-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺(II-4)：
使用实施例2中N-(2-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)烟酰胺的制备中概述的程序，用EPA替代DHA来制备这个化合物。MS：C32H47N3O2S2的计算值：569.3；实测值：570[M+H]+。
实施例4
制备N-(2-((1-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(II-6)：
在室温下搅拌于DMF(100mL)中含有2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙烷-1-胺(8g，40mmol，1当量)和烟酸(5.3g，40mmol)的混合物。接着添加HATU(18.3g，48mmol，1.2当量)和Et3N(4.58g，48mmol)。在室温下搅拌所得反应混合物18小时，其接着用EtOAc稀释并用水和盐水洗涤。干燥(Na2SO4)有机层并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH)纯化以提供呈黄色油状的N-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)烟酰胺(5.5g，45％产率)。在室温下搅拌于NaOH/H2O(1.5g/15mL)中含有N-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)烟酰胺(5.5g，0.019mol)的混合物直至物质被溶解。接着添加1-氨基-2-甲基丙烷-2-硫醇(2.1g，0.019mol)，随后添加另一份NaOH/H2O(1.5g/15mL)。在室温下搅拌所得反应混合物2小时，接着用EtOAc稀释。有机层用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得粗制固体不经进一步纯化即直接用于下一步骤中。在室温下搅拌于DMF(40mL)中含有N-(2-((1-氨基-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(2.5g，8.77mmol)和EPA(2.65g，8.77mmol)的混合物。接着添加HATU(4g，10.5mmol)和Et3N(1.065mg，10.5mmol)。在室温下搅拌所得反应混合物18小时，接着用EtOAc稀释。有机层用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(MeOH/CH2Cl2＝15/1)纯化以提供呈黄色油状的N-(2-((1-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)烟酰胺(1.6g，33％产率)。MS：C32H47N3O2S2的计算值：569.3；实测值：570.3[M+H]+。
实施例5
制备N-((S)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-17)：
逐滴添加于甲醇(100mL)中含有半胱胺盐酸盐(7.87g，69.3mmol)的溶液至2,2’-二硫代吡啶(25.0g，113.6mmol)于甲醇(300mL)中的溶液中。在室温下搅拌所得反应混合物18小时。缓慢添加二碳酸二叔丁酯(15.1g，69.3mmol)和氢氧化钠水溶液(5M，30mL)。在室温下再搅拌反应混合物4小时。混合物接着用乙酸乙酯(300mL×2)萃取。合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(己烷/乙酸乙酯＝10:1至5:1)纯化以提供呈黄色油状的2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基氨基甲酸叔丁酯(8.3g，42.3％产率)。
将2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基氨基甲酸叔丁酯(5.8g，25.6mmol)溶解于1,4-二噁烷(30mL)中，并且冷却溶液至0℃。接着逐滴添加HCl于1,4-二噁烷中的溶液(5M，20mL)。搅拌所得反应混合物2小时，接着在减压下浓缩以提供2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺(5.6g，100％产率，盐酸盐)。
冷却2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺(12.0g，64.5mmol)、DHA(51.6mmol)和HATU(29.3g，77mmol)于DCM(150mL)中的混合物至0℃，并且添加许尼希氏碱(Hunig’s base)(25g，190mmol)。使所得反应混合物升温至室温，并且搅拌18小时。添加饱和NH4Cl水溶液(200mL)以淬灭反应，并且用CH2Cl2(300mL×2)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(甲醇/CH2Cl2＝0.5％至2.0％)纯化以提供呈黄色油状的(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺。
在室温下搅拌(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(4.8g，9.6mmol)和(S)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸(1.44g，9.6mol)于MeOH(100mL)中的混合物18小时。接着添加二碳酸二叔丁酯(2.1g，9.6mmol)，随后缓慢添加3M氢氧化钠水溶液(30mL)。在室温下搅拌所得反应混合物4小时，接着用EtOAc(100mL×2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(甲醇/CH2Cl2＝0％至1.5％)纯化以提供呈黄色油状的(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸(5.4g，88.2％产率)。
冷却(R)-3-氨基丙烷-1,2-二醇(0.17g，1.9mmol)、(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸(1.2g，1.9mmol)和HATU(0.86g，2.2mmol)于CH2Cl2(20mL)中的混合物至0℃，并且添加许尼希氏碱(0.73g，5.6mmol)。使反应混合物升温至室温，并且搅拌18小时。添加饱和NH4Cl水溶液(20mL)，并且用CH2Cl2(50mL×2)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(甲醇/DCM＝0.5％至2.5％)纯化以提供呈黄色油状的((R)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.9g，67.7％产率)。
冷却于1,4-二噁烷(5mL)中含有((R)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.05g，1.48mmol)的混合物至0℃，并且逐滴添加于1,4-二噁烷中含有5M HCl的溶液(8mL)。搅拌所得反应2小时，接着在减压下浓缩以提供(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(((R)-3-氨基-4-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的盐酸盐。
冷却(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(((R)-3-氨基-4-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(盐酸盐，0.95g，1.47mmol)、烟酸(0.18g，1.5mmol)和HATU(0.67g,1.76mmol)于CH2Cl2(20mL)中的混合物至0℃，并且添加许尼希氏碱(0.76g，5.9mmol)。使反应混合物升温至室温，并且搅拌18小时。添加饱和NH4Cl水溶液(30mL)，并且用CH2Cl2(80mL×2)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(甲醇/CH2Cl2＝1.0％至3.5％)纯化以提供呈黄色固体状的N-((S)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(0.28g，26.9％产率)。MS(EI)：C38H56N4O5S2的计算值：712.37；实测值：713.15[M+H]+。
实施例6
制备N-((S)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-18)：
使用化合物IV-17(实施例5)的制备中概述的相同实验程序，例外之处是用2-氨基丙烷-1,3-二醇替代(R)-3-氨基丙烷-1,2-二醇。MS(EI)：C38H56N4O5S2的计算值：712.37；实测值：713.15[M+H]+。
实施例7
制备(1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基甲酸(R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁酯(IV-6)：
根据实施例5中概述的程序，使用(R)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸作为适当起始物质来制备(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸。将(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸(8.0g，12.6mmol)溶解于THF(100ml)中，并且接着冷却溶液至-15℃，同时依次添加N-甲基吗啉(1.3g，13mmol)和氯甲酸异丁酯(1.8g，13mmol)。搅拌所得反应混合物30分钟。接着使它升温至室温并过滤。冷却滤液至-20℃，小心添加硼氢化钠(0.96g，25mmol)于水(2mL)中的混悬液。搅拌所得反应混合物2小时，接着用水(200mL)淬灭。用CH2Cl2(200mL×4)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(甲醇/CH2Cl2＝0.5％至1.2％)纯化以提供呈黄色油状的((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(5.6g，71.8％产率)。将这个物质(5.6g，9.03mmol)溶解于1,4-二噁烷(10mL)中，并且冷却溶液至0℃，同时逐滴添加5MHCl/1,4-二噁烷(15mL)。在室温下搅拌所得反应混合物30分钟，接着在减压下浓缩以提供(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(((R)-3-氨基-4-羟基-2-甲基丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的盐酸盐。
将(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(((R)-3-氨基-4-羟基-2-甲基丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的盐酸盐(1mmol)连同烟酸(1mmol)、HATU(1.1mmol)和许尼希氏碱(1.5mmol)一起溶解于CH2Cl2(10mL)中。在室温下搅拌所得反应混合物4小时，并且用饱和NH4Cl水溶液稀释。分离两层，并且有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。通过色谱法(CH2Cl2/MeOH 9:1)纯化提供N-((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺。将这个物质(0.5mmol)溶解于THF(5mL)中，并且接着冷却溶液至0℃，同时添加吡啶(1.5mmol，3当量)和氯甲酸4-硝基苯酯(0.6mmol)。使所得反应混合物升温至室温，并且搅拌18小时。接着将它用饱和NH4Cl水溶液稀释，并且用CH2Cl2萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(MeOH/CH2Cl2＝0.5％至1.2％)纯化以提供(1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基甲酸(R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁酯。冷却2-氨基丙烷-1,3-二醇(0.5mmol)、(1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基甲酸(R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁酯(0.5mmol)于DMF(5mL)中的混合物至0℃，并且添加许尼希氏碱(1mmol)。使反应混合物升温至室温，并且搅拌18小时。添加饱和NH4Cl水溶液(20mL)，并且用CH2Cl2萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(MeOH/CH2Cl2＝1.0％至3.5％)纯化以提供(1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基甲酸(R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁酯。
实施例8
制备N-((R)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺(IV-8)：
将N-((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺(3.0mmol；可如实施例7中所述制备)溶解于CH2Cl2(50mL)中，接着冷却溶液至0℃，同时添加戴斯-马丁(Dess-Martin)过碘烷(1.9g，4.5mmol)。使所得反应混合物升温至室温，并且搅拌2小时。接着将它用盐水稀释，并且用CH2Cl2(2×80mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩以提供N-((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺。将所得物质(1mmol)连同2-氨基丙烷-1,3-二醇(1.2mmol)一起溶解于10mL CH2Cl2中，接着添加氰基硼氢化钠(1.5mmol)。在室温下搅拌所得反应混合物18小时，接着在减压下浓缩。可通过硅胶色谱法纯化N-((R)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺。
实施例9
制备((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁基)氨基甲酸1,3-二羟基丙烷-2-基酯(IV-14)：
冷却于THF(50mL)中含有N-((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺(3.6mmol；可如实施例7中所述制备)、邻苯二甲酰亚胺(5.3mmol)和三苯基膦(5.3mmol)的混合物至0℃，并且添加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，17mmol)。使反应混合物升温至室温，并且搅拌2小时。添加饱和NH4Cl(20mL)，并且用CH2Cl2(2×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH)纯化以提供相应邻苯二甲酰亚胺。
将这个邻苯二甲酰亚胺(2.5mmol)溶解于乙醇(20mL)中，并且添加NH2-NH2.H2O(85％，6mL)。搅拌所得反应混合物30分钟。所得反应混合物用水(60mL)淬灭，并且用CH2Cl2(2×50mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶(甲醇/CH2Cl2)纯化以提供N-((R)-1-氨基-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺。
将2-苯基-1,3-二噁烷-5-醇(0.5g，2.7mmol)溶解于THF(50mL)中，并且冷却至0℃，同时添加吡啶(0.44g，5.4mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(0.84g，4.1mmol)。使所得反应混合物升温至室温，并且搅拌2小时。用EtOAc(2×30mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(己烷/EtOAc)纯化以提供(2-苯基-1,3-二噁烷-5-基)碳酸4-硝基苯酯。将这个物质(1.0mmol)和N-((R)-1-氨基-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)烟酰胺)(1.0mmol)溶解于DMF(20mL)中。冷却混合物至0℃，并且添加许尼希氏碱(2.0mmol)。使所得反应混合物升温至室温，并且搅拌18小时。添加饱和NH4Cl水溶液(20mL)，并且用CH2Cl2(2×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下浓缩。在室温下用3N HCl-二噁烷(5mL)和MeOH(1mL)处理所得残余物2小时，接着在减压下浓缩。所得残余物通过硅胶色谱法(MeOH/CH2Cl2)纯化以提供((R)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(烟酰氨基)丁基)氨基甲酸1,3-二羟基丙烷-2-基酯。
实施例10
制备(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(I-1)：
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺易经受氧化以获得相应二硫醚形式，并且出于测定目的加以新鲜制备。根据WO 2012/115695中概述的程序制备4Z,4'Z,7Z,7'Z,10Z,10'Z,13Z,13'Z,16Z,16'Z,19Z,19'Z)-N,N'-(二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺。将这个物质(125mg，0.162mmol)溶解于EtOH(1.75mL)中。随后添加外消旋二硫苏糖醇(30mg，0.194mmol)至这个乙醇溶液中，继之以添加250μL 1N NaOH以使反应混合物的pH达到约8.5-9.0。在室温下搅拌所得反应混合物40分钟。此时，LC/MS分析显示完全还原成所需产物，即(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺。此后，添加4.5mL DMSO至溶液中以形成50mM(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的DMSO储备溶液。对于在24小时内使用，在-20℃下储存这个50mM DMSO储备溶液。多达5天的较长限期储存需要在-80℃下储存储备溶液。
实施例11
脂肪酸半胱胺缀合物对Huh-7或HT-29细胞中自噬和细胞表面CFTR的作用。
化合物制备：首先将测试化合物溶解于100％DMSO中成为50mM溶液，接着在FBS中稀释100倍成为500μM 10X储备溶液。
免疫印迹：将Huh-7细胞接种于10％FBS DMEM中过夜。用在DMEM中稀释10倍的药物(在10％FBS DMEM中的终浓度是50μm)替换细胞培养基。在药物添加之后4小时，在RIPA缓冲液中溶解细胞。通过用抗LC3A/B抗体(Cell signaling 12741)进行免疫印迹来分析细胞溶解产物。将数据呈现为相较于媒介物处理样品的LC3-II/LC3-I比率。
共焦显微术：将Huh-7细胞接种于盖玻片上过夜。细胞用GFP-LC3 BacMan(LifeTechnology)感染24小时，并且用化合物II-2处理。4小时后，将细胞固定在2％多聚甲醛中，并且用具有DAPI的抗褪色剂(Life Technology)封固。用Zeiss LSM 510，以40X镜头获取图像。对于本领域技术人员来说，GFP-LC3(绿色荧光)点状染色增强是自噬活化的特征。
细胞表面生物素化：在10mm2板中将HT-29细胞以2.0X106个细胞接种于10％FBSDMEM中过夜。用在DMEM中稀释10倍的药物(在10％FBS DMEM中的终浓度是50μm)替换细胞培养基。在药物添加之后24小时，使用Pierce细胞表面蛋白分离试剂盒(Thermo Scientific89881)处理细胞以测定细胞表面生物素化。简要来说，用冷PBS将细胞洗涤一次并与磺基-NHS-SS-生物素一起在4℃下孵育30分钟，并且通过添加淬灭溶液来终止反应。刮取细胞并溶解，并且在10,000x g下离心。使细胞混悬液与中和亲和素琼脂糖一起在室温下孵育60分钟。在RIPA缓冲液中溶解细胞集结块(细胞内)。通过含有50mM DTT的SDS-PAGE样品缓冲液来洗脱结合于中和亲和素琼脂糖的蛋白质(细胞表面)。细胞表面部分与细胞内部分两者均通过用抗CFTR抗体进行免疫印迹来分析。
结果
在Huh细胞中，在脂肪酸半胱胺衍生物II-2的两种测试浓度即25和50μM下，用化合物II-2处理均导致自噬标志物LC3-II(下部条带)水平增加(参见图1A)。在25μM的较低浓度下定量分析揭示用化合物II-2处理使LC3-II与LC3-I的比率增加(图1B)，从而指示LC3-I向作为自噬形成的分子标志物的LC3-II的转化增加。如Levine和Kroemer(2008)CELL,132,第27-42页中所指示，LC3-II/LC3-I的比率增加指示自噬已被活化。在HT-29细胞的情况下用化合物II-3进行相同孵育实验。如图2C中所示，当使HT-29细胞与化合物II-3(50μM)一起孵育时，自噬被活化，如由当相较于媒介物对照组时，LC3-II与LC3-I的比率增加所反映。随着这些HT-29细胞中的自噬被活化，当相较于媒介物对照组时，细胞表面CFTR存在相应增加(图2D)。图2E概述当使HT-29细胞与50μM的化合物IV-11和IV-12一起孵育时的结果。因为自噬被活化，所以对于含有化合物IV-11或IV-12的处理组，细胞表面CFTR存在相应增加。
实施例12
脂肪酸半胱胺缀合物在Huh-7或HT-29细胞的情况下的协同性质
使用实施例11中详述的相同实验程序，例外之处是在药物添加之后2小时，在RIPA缓冲液中溶解细胞，而非先前所述的4小时。再次通过用抗LC3A/B抗体(Cell SignalingTechnology 12741)进行免疫印迹来分析细胞溶解产物。将数据呈现为相较于媒介物处理样品的LC3-II/LC3-I比率。如图2A中所示，当相较于用胱胺(50μM)、EPA(50μM)或胱胺(50μM)和EPA(50μM)的组合进行的类似处理时，用化合物II-2在50μM下处理导致自噬标志物LC3-II(下部条带)协同增加。定量分析揭示当相较于媒介物对照时，LC3-II与LC3-I的比率增加两倍(图2B)。这证明LC3-I向作为自噬活化的已知分子标志物的LC3-II的转化增加。化合物II-2显示协同自噬活化；所述自噬活化是一种当使用个别组分或个别组分的组合(即胱胺和EPA)时实现的作用。
在Huh-7细胞的情况下，在用化合物II-2以及较高浓度的个别组分(各自250μM的胱胺、EPA或胱胺和EPA的组合)处理4小时之后重复这个相同协同实验。结果概述于图3A和3B中。再次，用50μM的化合物II-2处理细胞导致协同以及较高程度的自噬活化，如由LC3-II与LC3-I的较大比率所指示。即使用高得多的浓度的胱胺(250μM)、EPA(250μM)或胱胺和EPA的组合(各自250μM)，也未实现这个自噬活化程度。
使用HT-29细胞，用化合物II-3重复这个相同协同实验。在这个实验中，使HT-29细胞与各以下处理组一起孵育24小时：1)媒介物对照组；2)胱胺(25μM)；3)DHA(25μM)；4)胱胺(25μM)和DHA的组合；5)胱胺(250μM)；6)DHA(250μM)；7)胱胺(250μM)和DHA(250μM)的组合；8)化合物II-3(25μM)。结果概述于图4中。所示结果代表三个单独测量结果的平均值。当相较于媒介物对照组时，用25μM的化合物II-3处理的HT-29细胞显示协同以及较高程度的自噬活化，如由LC3-II与LC3-I的较大比率所指示。这个自噬活化程度未以任何以下处理组实现：1)媒介物对照组；2)胱胺(25μM)；3)DHA(25μM)；4)胱胺(25μM)和DHA的组合；5)胱胺(250μM)；6)DHA(250μM)；7)胱胺(250μM)和DHA(250μM)的组合。如图4中所示，与化合物II-3相关的自噬活化活性不可用个别组分(即25μM或250μM的胱胺和DHA)或个别组分的组合处理这些原代CF细胞来重现。
实施例13
脂肪酸半胱胺缀合物对ΔF508CFTR缺失突变纯合性原代CF人支气管上皮细胞的作用：免疫印迹分析和免疫沉淀
预期本发明化合物由于它们活化自噬的能力而可适用于治疗CF。在以下细胞测定中评估本发明化合物以确定它们将缺陷性突变CFTR拯救至细胞膜的能力。
从Asterand Bioscience(Detroit,MI)或作为隶属于Charles River的公司的ChanTest(Cleveland,OH)获得来自纯合ΔF508CF患者的原代细胞。接着在各种浓度下处理细胞以确定化合物恢复缺陷性CFTR的能力。如Derichs(2013)EUR.RESP.REV.,22,第58-65页中所综述，通过免疫印迹成功检测到突变CFTR条带C指示缺陷性CFTR可被拯救至细胞膜。
化合物制备
首先将本发明化合物溶解于100％DMSO中成为50mM溶液，接着在FBS中稀释100倍成为500μM 10X储备溶液。
免疫印迹
制备原代CF细胞(纯合ΔF508，来源：ChanTest，KKCFFT004I)，并且根据Amaral,M.D.和Kunzelmann,K.(编)CYSTIC FIBROSIS,METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,741,DOI 10.1007/978-1-61779-117-8_4Springer Science+Business Media,LLC 2011)中概述的程序使所述原代CF细胞在SnapwellTM过滤插件上生长。将原代CF细胞保持在由以下组成的分化培养基中：杜贝卡氏MEM(DMEM)/F12、Ultroser-G(2.0％；Pall，目录号15950-017)、胚胎克隆II(2％)、胰岛素(2.5μg/ml)、牛脑提取物(0.25％；Lonza，试剂盒编号CC-4133，组分编号CC-4092C)、氢化可的松(20nM)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)(500nM)、转铁蛋白(transferrin)(2.5μg/ml：Invitrogen，目录号0030124SA)、乙醇胺(250nM)、肾上腺素(1.5μM)、磷酸乙醇胺(250nM)和视黄酸(10nM)。接着在37℃下将根据以上概述的程序溶解于FBS中并稀释至所需浓度的测试化合物于分化培养基中添加至个别SnapwellTM过滤插件中。在药物添加之后24小时，快速冷冻细胞，并且稍后在RIPA缓冲液中溶解。通过Bio-Rad蛋白质测定来测定蛋白质的量。通过用抗CFTR抗体、抗自噬蛋白-1抗体、抗p62抗体和抗LC3抗体进行免疫印迹来分析50μg总细胞溶解产物。用肌动蛋白(actin)作为上样对照来使免疫活性标准化。将数据呈现为相较于媒介物处理样品的CFTR-条带-C/肌动蛋白、自噬蛋白-1/肌动蛋白、p62/肌动蛋白和LC3-II/LC3-I比率。针对CFTR的抗体克隆M3A7(Cell SignalingTechnology，2269)、LC3A/B抗体(Cell signaling，12741)、自噬蛋白-1抗体(CellSignaling Technology，3495)、p62抗体(Cell Signaling Technology，5114)和β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling Technology，4970)用作初级抗体。
使化合物II-3在这些原代CF细胞的情况下孵育24小时，并且通过免疫印迹来定量在功能上被拯救的CFTR条带C的量。图5A概述当使这些原代CF细胞(ΔF508纯合性，ChanTest，KKCFFT004I)与以下处理组一起孵育24小时时的结果：1)媒介物+VX-770(100nM)；2)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；3)化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；4)化合物II-3(10μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合。用组合VX-809+VX-770处理原代CF细胞导致CFTR条带C的量增加。如图5A中所示，化合物II-3与VX-809和VX-770的组合产生CFTR条带C的量更显著增加。所述作用也具有剂量依赖性。所示结果代表三个单独测量结果的平均值。
也使化合物I-1在这些原代CF细胞的情况下孵育24小时，并且通过免疫印迹来定量在功能上被拯救的CFTR条带C的量。图5B概述当使这些原代CF细胞(ΔF508纯合性，ChanTest，KKCFFT0041)与以下处理组一起孵育24小时时的结果：1)媒介物+VX-770(100nM)；2)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；3)化合物I-1(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合；4)化合物I-1(10μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合。如图5B中所示，化合物I-1与VX-809和VX-770的组合产生CFTR条带C的量更显著增加。所述作用也具有剂量依赖性。所示结果代表三个单独测量结果的平均值。
使用这些原代CF细胞，如实施例12中进行相同类型的协同实验。图5C概述当使原代CF细胞(纯合ΔF508，来源：ChanTest，KKCFFT004I)与以下处理组一起孵育24小时时的结果：1)媒介物对照组；2)胱胺(25μM)；3)DHA(25μM)；4)胱胺(25μM)和DHA(25μM)的组合；5)胱胺(250μM)；6)DHA(250μM)；7)胱胺(250μM)和DHA(250μM)的组合；8)化合物II-3(25μM)。如图5C中所示，化合物II-3(在25μM下)活化原代CF细胞中的自噬，如由相较于媒介物对照组，LC3-II与LC3-I的比率增加所指示。这个自噬活化水平不可通过用个别组分(即25μM或250μM的胱胺和DHA)或个别组分的组合处理这些原代CF细胞来重现。所示结果代表三个单独测量结果的平均值。
在原代CF细胞的情况下进行的协同实验也可用于评估可在功能上被拯救的CFTR条带C的水平。图5D概述当使原代CF细胞(纯合ΔF508，来源：ChanTest，KKCFFT004I)与以下处理组一起孵育24小时时的结果：1)媒介物对照组；2)胱胺(25μM)；3)DHA(25μM)；4)胱胺(25μM)和DHA(25μM)的组合；5)胱胺(250μM)；6)DHA(250μM)；7)胱胺(250μM)和DHA(250μM)的组合；8)化合物I-1(25μM)。如图5D中所示，当用25μM的化合物I-1处理原代CF细胞时，CFTR条带C的量存在显著增加。这个作用不可通过用个别组分(即25μM或250μM的胱胺和DHA)或个别组分的组合处理这些原代CF细胞来重现。所示结果代表三个单独测量结果的平均值。
图5E、5F、5G和5H概述使用原代CF细胞(纯合ΔF508)对化合物II-3的作用机理研究的结果。所示结果代表三个单独测量结果的平均值。在CF中，自噬被阻抑。随着用作为自噬活化剂的化合物II-3使自噬恢复，应观察到相应自噬蛋白-1增加、p62的量降低以及最终CFTR条带C的量增加。用以下处理组处理原代CF细胞(纯合ΔF508)24小时：1)媒介物+VX-770(100nM)；2)化合物II-3(25μM)+VX-770(100nM)；3)VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；4)化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)。图5E显示随着自噬被恢复，包括化合物II-3的2个处理组显示LC3-II与LC3-I的比率的预期增加。因为自噬被增加，所以在包括化合物II-3的2个处理组的情况下存在相应自噬蛋白-1的水平增加(图5F)和p62的水平降低(图5G)。p62的水平降低使一些错误折叠的ΔF508CFTR逃脱在内质网中隔离，并且被运送至细胞表面。这反映在CFTR条带C增加。如图5H中所示，当相较于VX-809(3μM)+VX-770(100nM)组合时，化合物II-3(25μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)的组合显示显著累加作用。
实施例14
通过尤斯室在Fisher大鼠甲状腺上皮细胞的情况下评估化合物对CFTR离子通道活性的功能性拯救。
CF跨膜传导调节子(CFTR)氯离子通道的最普遍致病突变是CFTR的一级序列中在位置508处的苯丙氨酸的缺失(ΔF508-CFTR)。这个突变导致运输缺陷，从而导致细胞表面处ΔF508-CFTR蛋白严重降低。运输缺陷可通过在低温下孵育(27℃过夜)，或在药理学上通过小分子和CFTR校正剂来校正。将监测在SnapwellTM过滤插件上生长的单细胞层中过度表达ΔF508-CFTR的Fisher大鼠甲状腺(FRT)上皮细胞的氯离子转运功能，因为CFTR激动剂激起尤斯上皮电压钳装置的短路(ISC)电流输出。这个研究的目标在于测量测试化合物使FRT上皮细胞单层中缺陷性ΔF508-CFTR恢复功能的能力。
将校正剂功效的测量分成两个阶段。初始阶段是使上皮与测试化合物一起在37℃孵育器中孵育一段时期(可在2小时至1或2天的范围内)，并且第二阶段是用上皮电压钳(尤斯测定)测量上皮ΔF508-CFTR氯离子通道电流。在短路条件(0mV跨上皮电位)下测量短路电流(ISC)。ISC大小是校正剂功效的指标，并且将其与媒介物和阳性对照进行比较。
使低温保存的用ΔF508-CFTR cDNA稳定转染的FRT细胞(Pedemonte等(2005)J.CLIN.INVEST.,115,第2564-2571页)扩增，并且涂铺在SnapwellTM过滤器上以在尤斯装置(Physiologic Instruments,Inc.,Sand Diego,CA)中测量短路电流。使细胞在汉姆氏F-12培养基(Ham’s F-12media)的补充以泽奥辛(zeocin)和G-418的库恩氏改良形式(Coon’smodification)中生长。
为进行测定，如下溶解本发明化合物：
1)在100％DMSO中制备25mM储备溶液。
2)在1.20mL FBS中稀释12μL 25mM储备溶液以制备250μM中间稀释10X储备物(1％DMSO，99％FBS)。温和涡旋所有溶液直至溶液变澄清。
3)通过添加400μL 10X储备物和600μL 10X载体(1％DMSO，99％FBS)至9000μL库恩氏培养基中来制备于10mL库恩氏培养基中10μM的每孔最终稀释液(4个孔x2mL(每个孔底部)+0.2mL(每个插件顶部)＝8.8mL，并且有1.2mL后备物以防止处理损失)。
对于这个实施例，使测试化合物溶解，并且添加至尤斯室的适当插件中(对于各测试化合物，n＝4，最终测试浓度是10μM)。也使用DMSO媒介物对照和阳性对照(在3μM下的VX-809)。对于这个特定实施例，使包括阳性对照的所有测试物品都与细胞一起孵育4小时的时期。将在SnapwellTM过滤插件上生长的FRT细胞单层转移至Physiologic Instruments尤斯记录室(Physiologic Instruments,Inc.,San Diego,CA)中，并且用HB-PS在底侧上以及78CF-PS在顶侧上浇注。接着组合使用一个或多个6通道或8通道Physiologic InstrumentsVCC MC6或VCC MC8上皮电压钳以记录整个操作期间的短路电流(ISC)。为开始ISC测量，添加两性霉素(amphotericin)(100μM)至SnapwellTM过滤插件的底侧以对上皮细胞进行可渗透化处理15分钟。在以下孵育时期(分别是15分钟、20分钟、10分钟、15分钟和15分钟)之后依序添加毛喉素(10μM)、IBMX(100μM)、染料木黄酮(20μM)和CFTRinh-172(20μM)。使用iWorx数据采集硬件和Labscribe 2软件(iWorx,Dover,NH)进行数据采集和分析。依次用单因素ANOVA以及邓奈特氏多重比较检验(Dunnett’s multiple comparison test)和史都登氏t检验(Student’s t-test)(当适当时)获得在校正剂阳性对照、阴性对照和测试物品处理的上皮之间由激动剂激起的ISC的比较。将显著校正规定为处于P<0.05的水平下。
在这个测定中，当依序用毛喉素、IBMX和CFTR增效剂染料木黄酮处理细胞时，阳性对照VX-809能够在测试条件下在功能上拯救缺陷性CFTR。为测试CFTR特异性，在接近操作完成时添加可商购获得的抑制剂CFTRinh-172(其具有化学名称(E)-4-((4-氧代-2-硫代-3-(3-(三氟甲基)苯基)噻唑烷-5-亚基)甲基)苯甲酸(CAS号307510-92-5))以使短路电流下降至基线。使用这个测定方案，在FRT细胞尤斯室中评估化合物II-2(10μM)。接着从这个类型的实验获得短路电流(ISC)随时间(分钟)的迹线，并且将此显示于图6中。化合物II-2能够在功能上拯救CFTR功能，因为当相较于媒介物对照组时，短路电流存在增加。
这个测定的替代性方案涉及将本发明化合物连同VX-770或VX-809和VX-770的组合一起长期预孵育。在这个方案的情况下，使用以上概述的相同方案，使本发明化合物与VX-770或VX-770和VX-809的组合一起预孵育24小时。首先添加两性霉素(100μM)以对细胞膜进行可渗透化处理。在添加两性霉素之后15分钟，添加毛喉素(20μM)。在添加毛喉素之后20分钟，添加可商购获得的抑制剂CFTRinh-172。接着在添加CFTRinh-172之后15分钟终止反应。接着从这个类型的实验获得短路电流的代表性迹线。当在媒介物组与阳性对照组之间进行比较时，评估本发明化合物的功能活性。对于所有尤斯室实验，阳性对照都是CFTR校正剂VX-809(3μM)和CFTR增效剂VX-770(100nM)的组合。对短路电流进行定量以测定在两个不同时间点的ΔISC，第一时间点是在添加毛喉素后，并且稍后时间点是在添加CFTRinh-172后(对于测定的更详尽描述，请参阅Van Goor等(2011)PNAS,108,第46期,第18843-18848页)。图7A、7B、7C、7D和7E概述当使FRT细胞与以下处理组一起孵育24小时时的数据：1)媒介物+VX-770(100nM)；2)化合物II-3(10μM)+VX-770(100nM)；3)阳性对照组，VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；4)化合物II-3(10μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)。用4个单独插件评估各处理组。如图7A中所示，在这个测定中，化合物II-3具有功能活性，如由短路电流增加所指示；所述作用在II-3(10μM)+VX-809+VX-770的组合的情况下最显著。图7B显示对在添加毛喉素后的稳态响应的定量，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量；而图7C显示表示为对照％的相同响应(将阳性对照VX-809+VX-770表示为100％)。当相较于媒介物+VX-770组时，II-3(10μM)+VX-770的组合产生适度响应。由II-3(10μM)+VX-809+VX-770组成的组合产生相比于阳性对照的显著143.6％增加。图7D显示对在添加CFTRinh-172后的稳态响应的定量，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量；而图7E显示表示为对照％的相同响应(将阳性对照VX-809+VX-770表示为100％)。再次，在这个时间点，由II-3(10μM)+VX-809+VX-770组成的组合产生相比于阳性对照组的显著144.0％增加。
实施例15
通过尤斯室在原代CF支气管上皮细胞(纯合ΔF508)的情况下评估化合物对CFTR离子通道活性的功能性拯救。
制备原代CF细胞(纯合ΔF508，来源：ChanTest，KKCFFT004I)，并且根据Amaral,M.D.和Kunzelmann,K.(编)Cystic Fibrosis,Methods in Molecular Biology 741,DOI10.1007/978-1-61779-117-8_4Springer Science+Business Media,LLC 2011)中概述的程序使其在SnapwellTM过滤插件上生长。将原代CF细胞保持在由以下组成的分化培养基中：杜贝卡氏MEM(DMEM)/F12、Ultroser-G(2.0％；Pall，目录号15950-017)、胚胎克隆II(2％)、胰岛素(2.5μg/ml)、牛脑提取物(0.25％；Lonza，试剂盒编号CC-4133，组分编号CC-4092C)、氢化可的松(20nM)、三碘甲腺原氨酸(500nM)、转铁蛋白(2.5μg/ml：Invitrogen，目录号0030124SA)、乙醇胺(250nM)、肾上腺素(1.5μM)、磷酸乙醇胺(250nM)和视黄酸(10nM)。
如下在FBS中溶解测试化合物：在离心管中在10.0mL FBS中稀释100μL 25mM测试化合物DMSO储备溶液以制备中间250μM中间稀释10×储备物(1％DMSO，99％FBS)。使这个溶液在离心管中在室温下搁置1小时，接着丢弃；然后在所述经调节离心管中制备新的250μM10×储备物。这个10×储备溶液用于制备随后测试物品浓度。举例来说，通过添加1000μL10×储备溶液至9000μL分化培养基中来制备于10mL分化培养基中25μM浓度。使这个25μM溶液在离心管中在室温下搁置1小时，接着丢弃；并且然后在所述经调节离心管中制备新的25μM溶液。通过添加400μL 10×储备溶液至9000μL分化培养基和600μL的1％DMSO、99％FBS溶液中来制备于10mL分化培养基中10μM浓度。通过添加适当体积的10×储备溶液至分化培养基以及1％DMSO、99％FBS溶液中来以相同方式制备于10mL分化培养基中随后3和1μM浓度。上述相同调节步骤用于所有稀释步骤中。
为进行尤斯室测定，接着在37℃下将根据以上概述的程序溶解于FBS中并稀释至所需浓度的测试化合物于分化培养基中添加至个别SnapwellTM过滤插件中。在药物添加之后24小时，将插件转移至Physiologic Instruments尤斯记录室(PhysiologicInstruments,Inc.；San Diego,CA)中，并且用HEPES缓冲生理盐水(HB-PS)维持在顶端室与底侧室两者中，所述HEPES缓冲生理盐水具有以下组成(以mM计)：NaCl，137；KCl，4.0；CaCl2，1.8；MgCl2，1；HEPES，10；葡萄糖，10；用NaOH调整pH至7.4。接着组合使用一个或多个6通道或8通道Physiologic Instruments VCC MC6或VCC MC8上皮电压钳以记录整个操作期间的短路电流(ISC)。在27℃下进行短路ISC测量。为开始操作，添加阿米洛利(30μM)至SnapwellTM过滤插件的顶侧以阻断上皮Na通道(ENaC)。15分钟后，添加毛喉素(10μM)以活化CFTR。60分钟后，通过添加CFTRinh-172(20μM)来终止实验。使用iWorx数据采集硬件和Labscribe 2软件(iWorx,Dover,NH)进行数据采集和分析。依次用单因素ANOVA以及邓奈特氏多重比较检验和史都登氏t检验(当适当时)获得在校正剂阳性对照、阴性对照和测试物品处理的上皮之间由激动剂激起的ISC的比较。将显著校正规定为处于P<0.05的水平下。
图8A、8B和8C概述当使原代CF细胞与以下处理组一起孵育24小时时的数据：1)媒介物+VX-770(100nM)；2)阳性对照组，VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；3)化合物II-3(1μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)。图8A显示在测定期间测量的短路电流(ISC)的迹线。对于本领域技术人员，图8A中所示的迹线指示相比于阳性对照，即由VX-809+VX-770组成的组合，由化合物II-3(1μM)+VX-809+VX-770组成的组合在功能上更具活性。图8B显示对在毛喉素添加后的稳态响应的定量，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量。相比于阳性对照组(即VX-809+VX-770)，由II-3(1μM)+VX-809+VX-770组成的组合在功能上更具活性，如由ΔISC增加更多所指示。图8C显示对总响应的定量，如通过曲线下面积(AUC)所测量，并且表示为对照％(其中将阳性对照表示为100％)。如图8C中所示，当相较于阳性对照(即VX-809+VX-770)时，由II-3(1μM)+VX-809+VX-770组成的组合显示137.8％AUC增加。
图9A、9B和9C概述当使原代CF细胞与以下处理组一起孵育24小时时的数据：1)媒介物+VX-770(100nM)；2)阳性对照组，VX-809(3μM)+VX-770(100nM)；3)化合物I-1(1μM)+VX-809(3μM)+VX-770(100nM)。图9A显示在测定期间测量的短路电流(ISC)的迹线。对于本领域技术人员，图9A中所示的迹线指示相比于阳性对照，即由VX-809+VX-770组成的组合，由化合物I-1(1μM)+VX-809+VX-770组成的组合在功能上更具活性。图9B显示对在毛喉素添加后的稳态响应的定量，如通过ΔISC(μA/cm2)所测量。相比于阳性对照组(即VX-809+VX-770)，由I-1(1μM)+VX-809+VX-770组成的组合在功能上更具活性，如由ΔISC增加更多所指示。图9C显示对总响应的定量，如通过曲线下面积(AUC)所测量，并且表示为对照％(其中将阳性对照表示为100％)。如图9C中所示，当相较于阳性对照(即VX-809+VX-770)时，由I-1(1μM)+VX-809+VX-770组成的组合显示130.8％AUC增加。
实施例16
使用人支气管上皮细胞进行的体外细菌清除测定。
在这个测定中，培养正常16HBE细胞，并且使用48孔板，以每孔2×105个细胞加以接种。在37℃下在5％CO2下孵育所得板直至约90％汇合。然后用化合物II-3处理细胞24小时，接着用铜绿假单胞菌菌株Xen05在1:50的感染复数(MOI)(即细胞:细菌的比率)下感染2小时。接着使细胞与500μL由非可渗透性抗生素(各自50U/mL青霉素和链霉素与200μg/mL庆大霉素混合)组成的混合物一起孵育3小时以移除细胞外细菌。之后，使细胞溶解，并且进行细菌计数以测定剩余细胞内细菌载量。如图10中所示，在25μM的测试浓度下，化合物II-3诱导有效细胞内铜绿假单胞菌清除。细胞内细菌杀灭作用与通过阳性对照细胞松弛素-D(即一种细胞可渗透性抗生素)观察的杀灭作用类似。
实施例17
用以评估脂肪酸半胱胺缀合物的血浆稳定性的测定
研究测试化合物在人、小鼠、比格犬(beagle)和大鼠血浆(血浆购自Bioreclamation)中的体外稳定性。用PBS(pH 7.4)将血浆稀释至50％。将测试化合物在DMSO中溶解至10mM的终浓度，接着在MeOH中稀释至1mM。在5μM的测试化合物浓度和2.5％的最终DMSO浓度下进行孵育。添加血浆(198μL)至96孔板中，并且在37℃下孵育30分钟，随后添加2μL测试化合物。接着在37℃下孵育所得混合物2小时。在适当时间间隔(0、30、60和120分钟)下，移除等分试样(50μL)，并且通过添加200μL具有内部标准物的乙腈来终止反应。同时，通过添加200μL乙腈内部标准物来终止含有苯氟雷司(Benflourex)或普鲁卡因(Procaine)(对照化合物)的血浆样品。在4℃下在3500rpm下离心样品板45分钟，并且将上清液转移至新板中以通过LC/MS-MS(Agilent型号：HPLC：1200，MS：6410)来分析。用Phenomenex C6-苯基(5u)柱实现色谱分离。由含0.1％甲酸的水和含0.1％甲酸的甲醇组成的二元梯度用于分析物洗脱。
在这个测定中评估化合物II-2和化合物II-3。图11A和11B概述两种化合物在小鼠和大鼠血浆中的血浆稳定性。在小鼠血浆与大鼠血浆两者中，化合物II-2均不稳定，如由在0.5、1和2小时时间点母体化合物损失所指示(图11A)。相比之下，并且出乎意料地，在0.5、1和2小时时间点，紧接于二硫键具有孪位甲基的化合物II-3显示完全血浆稳定性(图11B)。
实施例18
在口服插管大鼠PK研究中评估脂肪酸半胱胺缀合物
将本发明化合物溶解于由40％吐温、50％Peceol、10％PEG400组成的赋形剂的混合物中，并且用水稀释以形成自乳化水性混合物以向动物口服施用。对于这个研究，使用已通过手术用置留性颈静脉导管(JVC)和门静脉导管(PVC)植入的Sprague Dawley大鼠(Agilux,Worcester,MA)。使用双插管大鼠的这个方法允许测量在门静脉中递送的药物浓度以及存在于外周中的药物浓度。对于PK研究，在以下时间点在门静脉与颈静脉两者处进行连续血液收集：给药后10、20、40分钟以及1、2、4和6小时。PK研究的生物分析部分使用LC/MS/MS系统(Agilent型号：HPLC：1200，MS：6410)进行，并且用适当软件(WinNonlin Phoenix64 6.3.0 395)分析。
在这个口服插管大鼠PK实验中评估化合物II-2和II-3。对于化合物II-2，因为它在大鼠血浆中不稳定，所以在口服给药后大量母体化合物被降解。化合物II-2的门静脉Cmax是20.8±9.45ng/mL，伴随12.5±6.5Hr*ng/mL的AUClast。在全身性循环中，化合物II-2的外周Cmax是0.889±0.33ng/mL，伴随0.443±0.221Hr*ng/mL的AUClast。对于化合物II-3，门静脉Cmax是331±120ng/mL，伴随679±226Hr*ng/mL的AUClast。存在于化合物II-3中的孪位甲基也致使它对首过代谢更具有抗性。相较于化合物II-2，在全身性循环中，显著更高比例的母体化合物II-3是口服生物可用的。化合物II-3的相应外周Cmax是102±16.9ng/mL，伴随300±103Hr*ng/mL的AUClast。母体化合物II-3的外周Cmax比母体化合物II-2的相应外周Cmax高100倍。
实施例19
体内测定自噬活化
为评估体内自噬活化，用化合物II-3对天然雄性C57BL/6小鼠口服给药(100mg/kg，每日两次，3.5天)。在末次剂量之后1小时，收集肺组织和血浆以分析药物浓度和自噬生物标志。如较早实施例中所讨论，LC3-II与LC3-I的比率用作自噬生物标志。当用化合物II-3口服给药时，在血浆与肺组织两者中均检测到母体化合物(即II-3)和主要代谢物(即化合物I-1)。在末次剂量之后1小时，母体化合物II-3的血浆浓度是143.0±52.35ng/mL，并且相应代谢物I-1是741.37±170.2ng/mL。在这个时间点，小鼠肺组织母体化合物II-3浓度是536.48±24.01ng/g。也在肺组织中检测到代谢物I-1，处于411.48±164.0ng/g的浓度下。在100mg/kg的给定剂量下，化合物II-3能够诱导自噬，并且经分离肺组织中LC3-II与LC3-I的比率增加22％具有统计显著性(p＝0.04，图12)。
实施例20
在鼠肺铜绿假单胞菌感染模型中评估脂肪酸半胱胺缀合物
在这个鼠肺铜绿假单胞菌感染模型的情况下，以每笼10个动物的5组使6-7周龄的雌性BALB/c小鼠适应1周。从在感染之前3.5天开始，用化合物II-3(如上所述加以配制)在100mg/kg下每日两次口服治疗动物；接着在整个研究时期内使动物继续进行相同II-3治疗。在这个研究中使用4个其它治疗组，包括媒介物对照和阳性对照组：组1)媒介物，口服(从第-3.5天开始每日两次)和皮下(从感染后8小时开始每日两次)；组2)化合物II-3口服(每日两次，从第-3.5天开始100mg/kg)加媒介物皮下(从感染后8小时开始每日两次)；组3)环丙沙星，阳性对照，次有效剂量，1mg/kg皮下(从感染后8小时开始每日两次)，加媒介物口服(从第-3.5天开始每日两次)；组4)环丙沙星，1mg/kg皮下(从感染后8小时开始每日两次)，加化合物II-3口服(每日两次，100mg/kg，从第-3.5天开始)；组5)环丙沙星，阳性对照，20mg/kg皮下(从感染后8小时开始每日两次)。
在治疗之前以及此后每日将动物称重直至终止研究。一旦用铜绿假单胞菌感染，即定期观察动物的健康不佳征象，并且监测体温。终止达到人道终点的动物，并且记录死亡时间。在终止时，即感染后24/48小时，移除肺，并且对宏观病理学的征象评分并拍照。移除肺、脾和肾，称重并转移至PBS中，均质化，并且涂铺连续稀释液以测定细菌载量。
实施例21
在基于细胞的测定中评估抗纤维化和消炎活性
细胞制备
在补充以15％胎牛血清(FBS)(Gibco 10437-028)加青霉素-链霉素(1％)(Gibco15140-122)的DMEM F12(Gibco 10565)中维持正常人肺纤维母细胞(ScienCell ResearchLaboratory 3420)、来自特发性肺纤维化(IPF)患者的肺纤维母细胞LL29(AnHa)(ATCC)和LL97A(ALMy)(ATCC)。每3至4天拆分细胞，每次以1:2/1:3稀释度。在实验之前一天，使用胰蛋白酶-EDTA(0.05％)(Gibco 25300-054)对细胞进行胰蛋白酶处理，并且以每孔1×105个细胞涂铺在24孔盘上。
THP-1细胞从TIB202获得。在补充以10％胎牛血清的RPMI1640(RPMI1640)中维持THP-1细胞。DMEM(#11095)和胎牛血清(低内毒素等级)(#10437)从Invitrogen获得。
药物处理
首先将化合物II-3和I-1溶解于100％DMSO中成为50mM溶液，接着在1％BSA中稀释200倍成为250μm 10X储备溶液，并且根据需要进行连续储备物稀释(稀释2倍)。添加10X储备溶液至细胞培养基中，并且在37℃下孵育细胞24小时。对于在THP-1细胞的情况下的LPS刺激，添加化合物至细胞培养基中持续6小时，并且在4小时结束时，添加50μg/ml终浓度的LPS(Sigma L3024)，并且孵育细胞2小时。使正常人肺纤维母细胞(NLF)或特发性肺纤维化细胞(LL29和LL79A细胞，ATCC)与化合物II-3(25μM)和I-1(25μM)一起在TGFβ(Abcamab50036，50ng/mL)存在下或在不存在TGFβ下(被称为PBS处理组)孵育24小时。在添加TGFβ之前30分钟添加测试化合物至细胞中。收集总RNA，并且通过RT-PCR，用HPRT作为内部对照来评估相对mRNA表达水平。将数据表示为平均ΔmRNA/HPRT，误差棒表示平均值标准误差(SEM)。通过史都登氏t检验来确定相较于对照的显著性。
ELISA
在实验结束时收集条件培养基。根据制造商说明书测量基质金属蛋白酶2(MMP-2)(R&D System MMP200)和人金属蛋白酶2组织抑制剂(TIMP-2)(R&D System DTM200)的水平。在这些测定中使用100倍稀释度的条件培养基。在Victor X5多标记板读取器(PerkinElmer)上在450nm的吸收下测量ELISA，其中在550nm下进行本底校正。产生标准曲线，并且根据标准曲线计算TIMP-2和MMP-2的水平。收集条件培养基，并且测定基质金属蛋白酶2(MMP-2)和人金属蛋白酶2组织抑制剂(TIMP-2)的水平。将数据表示为相比于对照的平均倍数变化，并且误差棒表示平均值标准误差(SEM)。通过史都登氏t检验来确定相较于对照的显著性。
RT-PCR
使用RNeasy Plus小型试剂盒(Qiagen#74136)收集总RNA，并且遵循制造商方案，使用SuperScriptIII(Invitrogen#18080-044)，用随机六聚体产生cDNA。使用TaqMan探针(Applied Biosystems，使用推荐的最佳引物对)，用HPRT(次黄嘌呤磷酰基转移酶)作为内部对照来测定相对mRNA表达水平。所有PCR探针都购自Invitrogen。TNFα(HS 01113624)，IL1β(HS 01555410)，CCL2(HS 00234140)，胶原蛋白1a1(HS 00164004)，FN1(纤维结合蛋白1，HS 00365052)，TIMP-2(HS 00234278)，MMP-2(HS 01548727)。胶原蛋白1a1(COL1a1)、FN1、TIMP-2和MMP-2是熟知纤维化标志物(参见Selman等(2000)AM.J.PHYS.LUNG CELLMOL.PHYSIOL.,279,L562-L574)。
结果：
在正常人肺纤维母细胞(NLF)与来自特发性肺纤维化(IPF)患者的肺纤维母细胞(LL29和LL97A)两者的情况下评估化合物II-3和I-1。结果概述于图13A-C、14A-D和15A-D中。图13A显示当在PBS或TGFβ刺激下用化合物II-3或I-1处理这3种不同类型的细胞时，胶原蛋白1a1(COL1a1)的mRNA水平。已用TGFβ处理的细胞，即正常肺纤维母细胞(NLF)或IPF细胞(LL29或LL97A)，显示胶原蛋白1a1的水平显著增强，此在用化合物II-3(25μM)或I-1(25μM)处理后得以抑制。图13B和13C显示当在PBS或TGFβ刺激下用化合物II-3(25μM)或I-1(25μM)处理这3种不同类型的细胞时，纤维结合蛋白1(FN1)和TIMP-2的相应mRNA水平。已用TGFβ处理的NLF、LL29或LL97A细胞显示FN1和TIMP-2的水平显著增强，此在用化合物II-3(25μM)或I-1(25μM)处理后得以抑制。COL1a1、FN1和TIMP-2是熟知纤维化标志物；并且这些标志物受抑制指示化合物II-3和I-1具有抗纤维化活性。
也评估条件培养基中作为一种已知基质降解介体的MMP-2和它的天然抑制剂TIMP-2的水平。如图14A-B和图15A-B中所示，当相较于正常肺时，疾病肺纤维母细胞中MMP2和TIMP-2的水平均升高。已报道MMP-2与TIMP-2之间的这个不平衡导致在纤维发生时细胞外基质(ECM)积累(参见Selman等(2000)AM.J.PHYS.LUNG CELL MOL.PHYSIOL.,279,L562-L574)。因此，报道在IPF肺组织中，TIMP-2的水平增加大于MMP-2的水平增加，并且这种不平衡将有利于增强ECM蛋白沉积。图14A显示当用媒介物或化合物II-3(25μM)处理NLF、LL29或LL97A细胞时，TIMP-2的基础水平(PBS处理)。图14B显示当在TGFβ刺激下用媒介物或化合物II-3(25μM)处理NLF、LL29或LL97A细胞时，TIMP-2的水平。在TGFβ存在下，用化合物II-3处理导致TIMP-2水平显著降低。图15A和15B显示NLF、LL29和LL97A细胞在用媒介物或化合物II-3处理后，MMP-2的相应基础水平(PBS处理)和TGFβ刺激水平。再次，在TGFβ存在下，用化合物II-3处理导致MMP-2水平显著降低。
在THP-1细胞的情况下评估化合物II-3的消炎活性。图16A、16B和16B概述通常使用的炎症标志物的数据：TNF-α、IL-1β和CCL2。LPS刺激导致CCL2、IL-1β和TNF-α的mRNA表达惯常增加。如图16A-C中所示，在LPS刺激下用25μM化合物II-3处理导致所有三种炎症标志物都显著降低。
实施例22
在博莱霉素小鼠纤维化模型中评估脂肪酸半胱胺缀合物
特定无病原体7周龄雌性C57BL/6J小鼠用于实验。在第0天，通过使用(Penn-Century,USA)在3mg/kg的剂量下单次气管内施用含硫酸博莱霉素(BLM)的盐水来诱导40只小鼠显现肺纤维化。接着基于在开始治疗之前一天的体重来将动物随机分入4组(每组10只小鼠)中。在研究的持续时间期间，将每日测量个体体重。每日监测小鼠的存活、临床征象和行为。使用较早实施例中所述的制剂口服施用本发明化合物。研究的4个治疗组由以下组成：组1)媒介物；组2)测试化合物，从第0天至第20天每日在30mg/kg下每日两次口服给药；组3)测试化合物，从第0天至第20天每日在100mg/kg下每日两次口服给药；组4)地塞米松对照组，在0.25mg/kg下口服给药。在第21天，终止所有组中的小鼠。对于生物化学分析，可通过水解方法来定量肺羟基脯氨酸。对于肺切片的组织学分析，可使用已知方案进行马森氏三色染色(Masson’s Trichome staining)和阿什克罗夫特(Ashcroft)评分估计(参见Schaefer等(2011)EUR.RESP.REV.,20:120,第85-97页)。可使用邦弗伦尼多重比较检验进行统计检验。P值<0.05被视为统计显著。
实施例23
在化合物II-2与II-3之间比较
当与作为不具有双孪位甲基的类似物的化合物II-2比较时，存在于化合物II-3中的双孪位甲基提供若干优势。举例来说，化合物II-3比化合物II-2显示更好血浆稳定性(参见实施例17)。化合物II-3在大鼠中也具有更好口腔暴露，如实施例18中所说明。母体化合物II-2的外周AUClast是0.889ng/mL。相比之下，化合物II-3的外周AUClast是102ng/mL；即当向大鼠口服给药时，AUC增加100倍。与归因于双孪位甲基的更大稳定性一致，在细胞测定中，化合物II-3也比化合物II-2更有效。先前在实施例11中，在HT-29细胞的情况下，在50μM下4小时短暂孵育时期之后评估化合物II-2。为更直接比较，在25μM的较低浓度下，历经24小时的较长孵育时期评估两种化合物。24小时孵育时期也是为在尤斯室测定中获得出自CFTR校正剂诸如VX-809的最大活性所需的时间。使用先前在实施例13中概述的相同方案，用以下各组处理原代CF细胞(纯合ΔF508)24小时：1)媒介物；2)化合物II-2(25μM)；3)化合物II-3(25μM)。如图17中所示，在25μM的较低浓度下，在24小时孵育时期下，在运输错误折叠的ΔF508CFTR方面，化合物II-3比化合物II-2更有效。
以引用的方式并入
本文提及的专利文件和科学文件各自的整个公开内容出于所有目的以引用的方式并入本文。
等效物
本发明可以其它特定形式体现而不脱离其精神或主要特征。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为说明而非限制本文所述的本发明。因此，本发明的范围由随附权利要求而非由先前描述所指示，并且落入权利要求的等效含义和范围内的所有变化都意图包括在其中。

Claims (83)

1.一种治疗受试者的选自由囊性纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、神经变性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染和免疫疾病组成的组的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的式I化合物以治疗所述疾病，其中式I由以下表示：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中：
RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基、烷氧基、卤素和酰基；
n*和m*独立地是1、2或3；
Z*是其中：
R1和R2独立地是氢、C1-C4烷基或卤素；
r是2、3或7；
s是3、5或6；
t是0或1；并且
v是1、2或6。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病是囊性纤维化。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病是特发性肺纤维化(IPF)。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病是神经变性疾病。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述神经变性疾病是亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
7.一种在受试者中活化自噬的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的式I-A化合物以在所述受试者中活化自噬，其中式I-A由以下表示：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中：
RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基、烷氧基、卤素和酰基；
n*和m*独立地是2或3；
Z*是其中：
R1和R2独立地是氢、C1-C4烷基或卤素；
r是2、3或7；
s是3、5或6；
t是0或1；并且
v是1、2或6；
前提是当Z是时，那么RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5或RI-6中的至少一个是C1-C3烷基，n*或m*中的至少一个是1或3，或YI-1不同于3-吡啶基。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述施用使所述受试者中轻链3-II(LC3-II)与轻链3-I(LC3-I)的比率增加至少10％。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述施用使所述受试者中p62蛋白的量降低至少1％w/w。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有囊性纤维化或特发性肺纤维化或神经变性疾病。
11.如权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
12.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述化合物是式I化合物或其药学上可接受的盐。
13.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述化合物是式I-A化合物或其药学上可接受的盐。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或甲基。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6是氢。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中n*是2。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中m*是2。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基和烷氧基。
19.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中YI-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：烷基、羟基和烷氧基。
20.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的吡啶基：烷基、羟基和烷氧基。
21.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中YI-1是吡啶基。
22.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的烷基、羟基和烷氧基。
23.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中YI-1是
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中Z*是其中R1和R2是氢或甲基。
25.如权利要求24所述的方法，其中R1和R2是氢。
26.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中Z*是以下中的一个：
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中至少一对键合于相同碳原子的RI-2和RI-3独立地是C1-C3烷基。
28.如权利要求27所述的方法，其中各C1-C3烷基是甲基。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中至少一对键合于相同碳原子的RI-4和RI-5独立地是C1-C3烷基。
30.如权利要求29所述的方法，其中各C1-C3烷基是甲基。
31.如权利要求18至30中任一项所述的方法，其中n*是2。
32.如权利要求18至31中任一项所述的方法，其中m*是2。
33.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述化合物由式I-B表示：
或其药学上可接受的盐；其中：
RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基、烷氧基、卤素和酰基；
s是3、5或6；并且
v是1或2。
34.如权利要求27所述的方法，其中RI-1和RI-6是氢，并且YI-1是
35.一种治疗受试者的选自由囊性纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、神经变性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染和免疫疾病组成的组的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的式III化合物以治疗所述疾病，其中式III由以下表示：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中
W1和W2独立地是NR；
各R独立地是H、-C1-C3烷基、苯基、苯甲基、-CH2CO2R3、-CH2CONR3R3或任选被OH或卤素取代的直链或支链C1-C4烷基；
R5独立地选自由以下组成的组：-H、-D、-Cl、-F、-CN、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-C(O)H、-C(O)C1-C3烷基、-C(O)OC1-C3烷基、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-C1-C3烷基、-O-C1-C3烷基、-S(O)C1-C3烷基和-S(O)2C1-C3烷基；
各a、b、c和d独立地是H、-D、-CH3、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)OR或苯甲基，或a、b、c和d中的两个可连同它们所结合的单个碳一起形成环烷基或杂环；
各n、o、p和q独立地是0或1；
各Z独立地是
各r独立地是2、3或7；
各s独立地是3、5或6；
各t独立地是0或1；
各v独立地是1、2或6；
R1和R2各自独立地是H、D、-C1-C4烷基、-卤素、-OH、-C(O)C1-C4烷基、-O-芳基、-O-苯甲基、-OC(O)C1-C4烷基、-C2-C3烯基、-C2-C3炔基、-C(O)C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-SH、-S(C1-C3烷基)、-S(O)C1-C3烷基、-S(O)2C1-C3烷基；
各R3独立地是H或C1-C6烷基，或两个R3基团在连同它们所连接的氮一起时可形成杂环。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述疾病是囊性纤维化。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述疾病是特发性肺纤维化(IPF)。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述疾病是神经变性疾病。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述神经变性疾病是亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。
40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
41.如权利要求35至40中任一项所述的方法，其中当键合于相同碳原子时，a和a、b和b、c和c、d和d中的至少一对是C1-C3烷基。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述C1-C3烷基是甲基。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述化合物是以下中的一个或其药学上可接受的盐：
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
45.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述化合物是：
46.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
47.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述化合物是：
48.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
49.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述化合物是：
50.一种式I-A化合物
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中：
RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基、烷氧基、卤素和酰基；
n*和m*独立地是2或3；
Z*是其中：
R1和R2独立地是氢、C1-C4烷基或卤素；
r是2、3或7；
s是3、5或6；
t是0或1；并且
v是1、2或6；
前提是当Z是时，那么RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5或RI-6中的至少一个是C1-C3烷基，或n*或m*中的至少一个是1或3，或YI-1不同于3-吡啶基。
51.如权利要求50所述的化合物，其中RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或甲基。
52.如权利要求50所述的化合物，其中RI-1、RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6是氢。
53.如权利要求50至52中任一项所述的化合物，其中n*是2。
54.如权利要求50至53中任一项所述的化合物，其中m*是2。
55.如权利要求50至54中任一项所述的化合物，其中YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的6元杂芳基：烷基、羟基和烷氧基。
56.如权利要求50至54中任一项所述的化合物，其中YI-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：烷基、羟基和烷氧基。
57.如权利要求50至54中任一项所述的化合物，其中YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的吡啶基：烷基、羟基和烷氧基。
58.如权利要求50至54中任一项所述的化合物，其中YI-1是吡啶基。
59.如权利要求50至54中任一项所述的化合物，其中YI-1是任选被1、2或3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的烷基、羟基和烷氧基。
60.如权利要求50至54中任一项所述的化合物，其中YI-1是
61.如权利要求50至60中任一项所述的化合物，其中Z*是其中R1和R2是氢或甲基。
62.如权利要求61所述的化合物，其中R1和R2是氢。
63.如权利要求50至60中任一项所述的化合物，其中Z*是以下中的一个：
64.如权利要求50至63中任一项所述的化合物，其中至少一对键合于相同碳原子的RI-2和RI-3独立地是C1-C3烷基。
65.如权利要求64所述的化合物，其中各C1-C3烷基是甲基。
66.如权利要求50至65中任一项所述的化合物，其中至少一对键合于相同碳原子的RI-4和RI-5独立地是C1-C3烷基。
67.如权利要求66所述的化合物，其中各C1-C3烷基是甲基。
68.如权利要求55至67中任一项所述的化合物，其中n*是2。
69.如权利要求55至68中任一项所述的化合物，其中m*是2。
70.如权利要求50至69中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
及其药学上可接受的盐。
71.如权利要求70所述的化合物，其中所述化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
72.如权利要求70所述的化合物，其中所述化合物是
73.如权利要求70所述的化合物，其中所述化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
74.如权利要求70所述的化合物，其中所述化合物是
75.一种药物组合物，其包含如权利要求50至74中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
76.一种式IV化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中
W1独立地是NR；
R独立地是H、-C1-C3烷基、苯基、苯甲基、-CH2CO2R3、-CH2CONR3R3或任选被OH或卤素取代的直链或支链C1-C4烷基；
R5独立地选自由以下组成的组：-H、-D、-Cl、-F、-CN、-NH2、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2、-NH(C(O)C1-C3烷基)、-N(C(O)C1-C3烷基)2、-C(O)H、-C(O)C1-C3烷基、-C(O)OC1-C3烷基、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-C1-C3烷基、-O-C1-C3烷基、-S(O)C1-C3烷基和-S(O)2C1-C3烷基；
RI-2、RI-3、RI-4、RI-5和RI-6对于每次出现各自独立地表示氢或C1-C3烷基；
Z*是其中：
R1和R2独立地是氢、C1-C4烷基或卤素；
r是2、3或7；
s是3、5或6；
t是0或1；并且
v是1、2或6；
m*是2或3；
p*是1或2；
o*是1或2；
RI-7和RI-8各自独立地是H、
前提是当Z是时，那么RI-2、RI-3、RI-4、RI-5或RI-6中的至少一个是C1-C3烷基，或RI-7和RI-8不是氢，或(i)m*或(ii)o*和p*的总数中的至少一个是1或3，或含N杂环不同于3-吡啶基。
77.如权利要求76所述的化合物，其中所述化合物是以下中的一个或其药学上可接受的盐：
N-((S)-1-(((R)-2,3-二羟基丙基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-17)；和
N-((S)-1-((1,3-二羟基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)烟酰胺(IV-18)。
78.一种药物组合物，其包含如权利要求76或77所述的化合物以及药学上可接受的载体。
79.一种治疗受试者的选自由囊性纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、神经变性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染和免疫疾病组成的组的疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求50至78中任一项所述的化合物。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述疾病是囊性纤维化。
81.如权利要求1至49、79或80中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用选自由以下组成的组的第二治疗剂：依伐卡托(VX-770)、鲁玛卡托(VX-809)、VX-661、奥卡比(VX-770和VX-809的组合)以及VX-661和VX-770的组合。
82.一种治疗患者的选自由特发性肺纤维化、线粒体疾病、Leigh氏综合征、糖尿病和耳聋(DAD)、利伯氏遗传性视神经病变、神经病变-共济失调-色素性视网膜炎和下垂症(NARP)、肌神经源性胃肠脑病变(MNGIE)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、和线粒体肌病变-脑肌病变-乳酸酸中毒-中风样症状(MELAS)组成的组的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的
(i)化合物
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(I-1)，
(ii)化合物
(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-(2-巯基乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺(I-2)，或
(iii)化合物(i)或(ii)的组合，由此以治疗所述疾病。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述疾病是特发性肺纤维化。
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