CN107189023A - 一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107189023A
CN107189023A CN201710352554.1A CN201710352554A CN107189023A CN 107189023 A CN107189023 A CN 107189023A CN 201710352554 A CN201710352554 A CN 201710352554A CN 107189023 A CN107189023 A CN 107189023A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gma
nipam
ida
preparation
bromelain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710352554.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王丽
韩娟
王赟
蔡云凤
李程
唐旭
倪良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN201710352554.1A priority Critical patent/CN107189023A/zh
Publication of CN107189023A publication Critical patent/CN107189023A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F292/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to inorganic materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/02—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor with moving adsorbents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/12—Powdering or granulating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2351/00—Characterised by the use of graft polymers in which the grafted component is obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Derivatives of such polymers
    • C08J2351/10—Characterised by the use of graft polymers in which the grafted component is obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Derivatives of such polymers grafted on to inorganic materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用，属于天然产物有效成分的分离纯化技术领域；本发明首先制备磁性温敏聚合物Fe3O4@P(GMA‑co‑NIPAM)，将该聚合物分散于亚氨基二乙酸和氢氧化钠的混合水溶液中，剧烈搅拌反应；磁分离后用乙醇和水洗涤；真空干燥至恒重后将产物分散于NiCl2溶液中，室温搅拌后磁分离产物，用去离子水洗涤后真空干燥至恒重得到核壳式磁性复合微球；本发明中制备的磁性微球Fe3O4@P(GMA‑co‑NIPAM)/IDA/Ni2+粒径大约为200 nm，比表面积大，对菠萝蛋白酶的吸附量高达117 mg/g。

Description

一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用，具体涉及一种具有温敏特性的核壳式磁性复合微球的合成及其在分离纯化菠萝蛋白酶中的应用，属于天然产物有效成分的分离纯化技术领域。
背景技术
菠萝蛋白酶是分离于菠萝的茎和果实中的一类纯天然植物蛋白酶，具有较强的分解蛋白质的能力，且具有酰胺键和酯键的特性，被广泛应用于医药，食品、饲料和美容保健等行业。在医药领域，其能够有效抑制血小板聚集，增进药物吸收和抗癌，在各种组织中治疗炎症和水肿等多种功效；在食品工业方面，菠萝蛋白酶被用作肉类嫰化剂，使得食物更容易被人体吸收；在饲料方面，将菠萝蛋白酶加入饲料配方中可预防动物腹泻尤其是仔猪的腹泻。
目前，工业上菠萝蛋白酶的提取方法主要有高岭土吸附法，单宁沉淀法和超滤浓缩法，但这些方法都各自存在一些不足之处，如生产工艺和操作复杂，酶活回收率低，污染环境，对技术要求较高，涉及到超滤膜的使用，生产成本高等。因此，寻求一种新的分离、提纯菠萝蛋白酶的方法是有必要的。
聚合物大分子修饰的磁性微球，不仅具有纳米材料所特有的如小尺寸效应、表面积效应、量子效应等，又具有良好的磁导向性、超顺磁性和生物相容性，且聚合物大分子修饰后的磁性纳米材料能够更大程度的防止粒子之间相互聚集，增强其分散性和稳定性，便于保存和应用。不同功能化的聚合物大分子可赋予磁性微球不同的作用功能，这种特定功能化的聚合物复合微球可以实现从复杂的样品中快速分离出目标物，且操作简便，可实现循环利用，节约成本。
本发明采用蒸馏沉淀聚合反应将温敏单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）与带环氧基单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）共聚在四氧化三铁表面，相比较传统的沉淀聚合方法，在此反应中无须加入稳定剂、分散剂，整个反应时间小于两个小时，大大缩短了反应周期，提高反应效率。最后将该材料运用于从实际菠萝皮粗提取液中提取菠萝蛋白酶，通过SDS-PAGE凝胶电泳证明分离纯化得到的菠萝蛋白酶已达到了电泳纯。
发明内容
本发明的主要目的是克服现有技术中存在的生产工艺和操作复杂，酶活回收率低，污染环境，对技术要求较高，，生产成本高等技术缺陷，提供一种新型的聚合物大分子共聚修饰的磁性微球及其合成方法，并将该磁性微球应用于分离纯化菠萝蛋白酶，同时实现对菠萝蛋白酶的热保护作用。
本发明采取的技术手段如下：
本发明首先提供一种核壳式磁性复合微球，即一种新型的聚合物大分子共聚修饰的磁性微球，所述微球记为Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+，所述微球比表面积大，粒径大小均一，都保持在200 nm左右。
本发明还提供该磁性微球的制备方法，具体步骤如下：
（1）磁性温敏聚合物Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)的合成：
MPS修饰Fe3O4，使得Fe3O4表面修饰了双键，得到复合材料Fe3O4/MPS；
取Fe3O4/MPS于三口烧瓶中，加入乙腈超声分散5 min，加入N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）混合均匀后，安装分馏柱，冷凝管，接收器；机械搅拌并通氮气，油浴加热烧瓶蒸馏得到部分乙腈，停止反应；得到的产物用磁铁分离，并用乙醇和水反复洗涤后放入真空干燥箱内干燥。
其中，所述Fe3O4/MPS的合成方法参考文献（Yuting Zhang, Dian Li, Meng Yu,et al. Fe3O4/PVIM-Ni2+ Magnetic Composite Microspheres for Highly SpecificSeparation of Histidine-Rich Proteins [J]. ACS applied materials &interfaces, 2014, 6(11): 8836-8844.）
其中，所述Fe3O4/MPS与乙腈用量比例为50-100 mg：40-80 mL，优选用量比为50 mg：40mL。
所述N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）的用量为50-150 mg，优选NIPAM用量为100 mg；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）的用量为0.05-0.15 mL，优选GMA用量为0.1 mL；所述交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）的用量为100-200 mg，优选MBA用量120 mg；所述引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）用量为4-10 mg，优选AIBN用量为6.4 mg。
所述加热条件为30 min内从室温加热到沸腾，再蒸馏1 h。
所述蒸出乙腈的量为20-40 mL。
（2）核壳式磁性复合微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的合成：
将磁性温敏聚合物Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)分散于一定pH值的亚氨基二乙酸（IDA）和氢氧化钠（NaOH）的混合水溶液中，剧烈搅拌反应；磁分离上述步骤所得产物，用乙醇和水洗涤上述上述磁分离产物几遍；在50℃真空干燥箱内干燥至恒重；后将所得产物分散于NiCl2溶液中，室温搅拌2 h；磁分离产物，用去离子水洗涤几遍，真空干燥至恒重。
其中，所述磁性温敏聚合物Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)与IDA和NaOH混合水溶液的用量比为50mg：20mL；所述IDA与NaOH的用量比为0.33 g：0.2 g。所述混合水溶液的pH值为8-11。所述剧烈搅拌反应的条件是80℃反应12-36 h。所述NiCl2溶液用量为10 mL, 浓度为0.1 M。
本发明中所制备的核壳式磁性复合微球与现有技术中其他技术制备的相比较，粒径大小均一，都保持在200 nm左右，这样的粒径既具有大的比表面积，又能防止粒径过小而发生磁性微粒的聚集，从而影响单个微球在实际应用中发挥作用。另外，所制备的磁性微球密度大，看起来美观大方、“厚实”。
本发明所制备的核壳式磁性复合微球用于菠萝蛋白酶的分离纯化，本发明优化了该新型磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+用于分离纯化菠萝蛋白酶的吸附条件，具体内容如下：
将浓度为0.1-1.0 mg/mL的菠萝蛋白酶溶液与0.2 mg Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球混合，调节pH为4-8，NaCl浓度为0-1.5 M，在15-40℃的恒温震荡箱内震荡10-50min，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值。
与现有技术相比较，本发明具有如下优点：
（1）本发明中制备的磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+粒径大约为200 nm，比表面积大，对菠萝蛋白酶的吸附量高达117 mg/g，而已报道的其他相似材料的吸附量为只有103 mg/g。
（2）本发明中制备的磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+中含有温敏聚合物PNIPAM，在温度高于其低临界溶解温度（LCST）时，PNIPAM链塌缩，显示疏水性，当温度低于LCST时，PNIPAM链舒展，呈现亲水性，对菠萝蛋白酶的酶活具有一定的热保护作用。具体的酶活保护效果如下：在70℃变性10 min条件下，结合Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的菠萝蛋白酶在室温复性2 h后酶活恢复为原来的40%，而游离酶酶活基本没有恢复，仅为原来的8%。
（3）本发明制备合成的聚合物大分子共聚修饰的磁性微球在分离纯化菠萝蛋白酶的应用中，只需改变溶液的pH和温度就能够将菠萝蛋白酶从微球上洗脱下来，无需引入咪唑溶液洗脱从而造成酶溶液中存在杂质。
（4）本发明中制备的磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+具有超顺磁性，在外加磁性条件下，可在10 s内被回收，外界磁场消失时，又可均匀的分散在溶液中。
（5）本发明中制备的磁性材料具有很好的重复利用性，在循环使用6次后，菠萝蛋白酶的吸附量仍然能够保持为原来的90%。
附图说明
图1为按照实施例1和3制备的Fe3O4（a）和Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)（b）的TEM图。
图2为按实施例1和实施例4制得的Fe3O4（a）、Fe3O4/MPS（b）和Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)（c）的红外谱图。
图3为按实施例1和实施例3制得的Fe3O4（a）、Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)（b）和Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+（c）的VSM图。
图4为磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的实际应用流程示意图。
图5为实施例6制得的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的循环利用结果图。
图6为实施例8制得的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶热保护酶活恢复效果图。
图7为实施例8制得的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶热保护效果图。
图8为磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶酶活热保
护示意图；其中，N-天然状态；D-变性过程；I-失活过程。
具体实施方式
下面通过实例进一步描述本发明，并结合附图说明使得本技术方案更加清晰易懂，显然，所列举的实施例并不是全部的实施例，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进替换或变型均属于本发明的保护范围。
实施例1：Fe3O4/MPS的合成
将1.350 g六水合氯化铁、3.854 g乙酸铵和0.4 g柠檬酸三钠溶于70 mL乙二醇中，油浴温度170℃下搅拌1 h至溶液成黑色均匀体系，转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中加热至200℃并保持16 h。取出后冷却至室温，磁分离产物，用乙醇洗涤至上清液透明，放在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
取0.3 g上述制备的Fe3O4分散于40 mL乙醇、10 mL去离子水和1.5 mL氨水中，加入0.6 g MPS，70℃剧烈搅拌24 h。磁分离产物，用乙醇洗涤去除多余的MPS，放在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
实施例2：Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+的合成
（1）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)的合成：
取50 mg上述实施例1中Fe3O4/MPS于三口烧瓶中，加入40 mL乙腈超声分散5 min，加入50 mg NIPAM，0.05 mL GMA，100 mg交联剂MBA，4 mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器，机械搅拌并通氮气。将反应烧瓶从室温30 min内加热到沸腾，再经过一个小时蒸馏得到20 mL乙腈，停止反应。磁分离产物，并用乙醇和水反复洗涤，放在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+的合成：
将50 mg Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)微球分散于预先调节pH为8的20 mL亚氨基二乙酸（IDA）和氢氧化钠（NaOH）混合水溶液中，80℃剧烈搅拌12 h。磁分离产物，用乙醇和水洗涤几遍，在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。后将所得产物分散于10 mL, 0.1 M NiCl2溶液中，室温搅拌2 h；磁分离产物，用去离子水洗涤几遍，真空干燥至恒重。
实施例3：Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+的合成
（1）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)的合成：
取75 mg上述实施例1中Fe3O4/MPS于三口烧瓶中，加入60 mL乙腈超声分散5 min，加入100 mg NIPAM，0.1 mL GMA，120 mg交联剂MBA，6.4 mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器，机械搅拌并通氮气。将反应烧瓶从室温30 min内加热到沸腾，再经过一个小时蒸馏得到20 mL乙腈，停止反应。磁分离产物，并用乙醇和水反复洗涤，放在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+的合成：
将50 mg Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)微球分散于预先调节pH为11的20 mL亚氨基二乙酸（IDA）和氢氧化钠（NaOH）混合水溶液中，80℃剧烈搅拌24 h。磁分离产物，用乙醇和水洗涤几遍，在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。后将所得产物分散于10 mL, 0.1 M NiCl2溶液中，室温搅拌2 h；磁分离产物，用去离子水洗涤几遍，真空干燥至恒重。
图1是按照实施例1和3制备的Fe3O4（a）和Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)（b）的TEM图。由图可以看出，所制备的Fe3O4颗粒大小均一，粒径大约为200 nm，修饰双键包覆聚合物以后，粒径增加了约20 nm，呈现核壳结构。
图3是按照实施例1和实施例3制得的Fe3O4（a）、Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)（b）和Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+（c）的VSM图。通过测定所制备的Fe3O4、Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)和Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的饱和磁化强度值（Ms）分别是56.85、 12.84、11.45 emu/g，且所合成的磁球在室温时几乎没有明显的剩磁，表明均是超顺磁性的。尽管在包覆聚合物以后微球的饱和磁化强度值大幅度下降，但从图3中的插图照片中可以看出，Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+能够分散在菠萝蛋白酶水溶液中，形成均匀的浅棕色悬浮液，而在外加磁场的作用下，Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+又能够迅速的从蛋白酶溶液中分离出来，发挥其在实际应用中的优势。
实施例4：Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+的合成
（1）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)的合成：
取100 mg上述实施例1中Fe3O4/MPS于三口烧瓶中，加入80 mL乙腈超声分散5 min，加入150 mg NIPAM，0.15 mL GMA，200 mg交联剂MBA，10 mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器，机械搅拌并通氮气。将反应烧瓶从室温30 min内加热到沸腾，再经过一个小时蒸馏得到40 mL乙腈，停止反应。磁分离产物，并用乙醇和水反复洗涤，放在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+的合成：
将50 mg Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)微球分散于预先调节pH为11的20 mL亚氨基二乙酸（IDA）和氢氧化钠（NaOH）混合水溶液中，80℃剧烈搅拌36 h。磁分离产物，用乙醇和水洗涤几遍，在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。后将所得产物分散于10 mL, 0.1 M NiCl2溶液中，室温搅拌2 h；磁分离产物，用去离子水洗涤几遍，真空干燥至恒重。
图2是按照按实施例1和实施例4制得的Fe3O4（a）、Fe3O4/MPS（b）和Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)（c）的红外谱图。如图所示，在3条谱带600 cm-1处均出现了Fe3O4中Fe-O的振动峰，修饰双键后，图2（b）中1632 cm-1处出现了双键的特征峰，证明MPS成功的修饰在Fe3O4表面；包覆P(GMA-Co-NIPAM)壳层后，图2（c）908 cm-1处为GMA中环氧基的典型特征峰，1521 cm-1and 2949 cm-1分别是NIPAM单体中N-H振动峰和亚甲基的伸缩振动峰，证明聚合物壳层的修饰成功。
实施例5：磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+用于分离纯化菠萝蛋白酶
（1）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+吸附量考察：
将300 μL浓度为0.1 mg/mL的菠萝蛋白酶溶液与0.2 mg本发明中实施例3
制备的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球混合，调节pH为4，NaCl浓度为0 M，在15℃的恒温震荡箱内震荡10 min，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，然后测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值，计算出吸附量为73 mg/g。
该实施例中吸附条件是pH为4，温度为15℃，且吸附时间只有10 min，在低pH的条件下，氢键和疏水基的作用会使得菠萝蛋白酶分子很难从溶液中扩散到磁性微球表面，且吸附温度低，分子运动比较慢，而吸附时间只有10min，吸附量并未达到饱和，所以吸附量会稍微低点。
（2）洗脱前后菠萝蛋白酶酶活测定：
将0.2 mg结合菠萝蛋白酶的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球分散
于200 μL洗脱液（PBS, 0.2 M; pH=4; NaCl, 1.0 M）中，40℃恒温震荡30 min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测得上清液中菠萝蛋白酶酶活为洗脱前的95.3%；说明该分离纯化过程对酶活的影响不大，虽然吸附量小，但并不会影响酶活。
实施例6：磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+用于分离纯化菠萝蛋白酶
（1）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+吸附量考察：
将300 μL浓度为1 mg/mL的菠萝蛋白酶溶液与0.2 mg本发明中实施例3制备的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球混合，调节pH为6，NaCl浓度为0.1 M，在30℃的恒温震荡箱内震荡30 min，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值，计算出吸附量为117 mg/g；该实施例中的吸附条件是磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+吸附菠萝蛋白酶的最佳吸附条件。
（2）洗脱前后菠萝蛋白酶酶活测定：
将0.2 mg结合菠萝蛋白酶的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球分散于200 μL洗脱液（PBS, 0.2 M; pH=4; NaCl, 1.0 M）中，40℃恒温震荡30 min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测得上清液中菠萝蛋白酶酶活为洗脱前的96%；说明该分离纯化过程对酶活几乎没有什么影响。
方便本领域技术人员更好理解本发明的技术方案，图4为磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的实际应用流程示意图，采用示意图的方式展示该材料的循环利用过程，具体操作流程如下：将0.2 mg 磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+加入到300 μL菠萝皮粗提取液中，30℃恒温震荡30 min后，磁分离产物，然后按照实施例5（2）部分，将结合在微球上的菠萝蛋白酶洗脱下来，将原液、上清液及洗脱液保留，做凝胶电泳（SDS-PAGE），而洗脱过后的磁性微球则进入下一次循环利用。
其中菠萝皮粗提取液的制备方法：购买常规市售新鲜的菲律宾进口菠萝，用蒸馏水洗净、晾干、削皮后，将菠萝皮放在4℃冰箱预冷12 h，然后以菠萝皮和PBS (pH=6; EDTA,5 mmol/L)1:1的比例进行榨汁，将榨好的菠萝皮汁用四层纱布过滤，然后将滤液在4℃的离心机8000 rmp/min 转速下离心20 min，上清液即为菠萝皮粗提取液。
图5为实施例6制得的磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的循环利用结果图。可以看出，材料在经过6次循环后（每次循环使用的菠萝蛋白酶溶液都是新配制的），对菠萝蛋白酶的吸附量仍然能够保持为原来的90%，对降低生产成本具有重要意义。
实施例7：磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+用于分离纯化菠萝蛋白酶
（1）Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+吸附量考察：
将300 μL浓度为0.5 mg/mL的菠萝蛋白酶溶液与0.2 mg本发明中实施例3
制备的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球混合，调节pH为8，NaCl浓度为1 M，在40℃的恒温震荡箱内震荡50 min，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值，计算出吸附量为96 mg/g。
该实施例中NaCl浓度为1 M，相比于实施例5和6，盐离子浓度偏高，使得菠萝蛋白酶分子处于更多的离子氛围中，与磁性微球结合的空间障碍和静电斥力会增大，导致吸附量减少。
（2）洗脱前后菠萝蛋白酶酶活测定：
将0.2 mg结合菠萝蛋白酶Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球分散于200 uL洗脱液（PBS, 0.2 M; pH=4; NaCl, 1.0 M）中，40℃恒温震荡30 min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测得上清液中菠萝蛋白酶酶活为洗脱前的95.7%；说明该吸附-洗脱过程并没有对菠萝蛋白酶的酶活造成影响。
实施例8：磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM) /IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶的热保护作用
将300 μL浓度为1 mg/mL的菠萝蛋白酶溶液与0.2 mg本发明中实施例3制备的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+微球混合，调节pH为6，NaCl浓度为0.1 M，在30℃的恒温震荡箱内震荡30 min后，将温度升至70℃保持10 min，然后室温保持2 h复性菠萝蛋白酶。磁分离产物，将产物分散于200 uL洗脱液（PBS, 0.2 M; pH=4; NaCl, 1.0 M）中，40℃恒温震荡30min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测得上清液中菠萝蛋白酶酶活为洗脱前的40%。
图6为实施例8中的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶热保护酶活恢复效果图。由图可得，在70℃变性10 min条件下，结合Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的菠萝蛋白酶在室温复性2 h后酶活恢复为原来的40%，而游离酶酶活基本没有恢复，仅为原来的8%，可以得出Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶酶活有一定的热保护作用。为了进一步验证温敏单体NIPAM是所合磁性微球具有热保护作用的关键，将没有聚合温敏单体的磁性微球Fe3O4@PGMA/IDA/Ni2+作用于菠萝蛋白酶，保持与上述内容条件一致，与游离酶作对比，发现其酶活恢复效果和游离酶基本一致，几乎没有酶活恢复。
图7为实施例8中的Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶热保护效果图。将结合Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的菠萝蛋白酶与游离菠萝蛋白酶均在65，70，75，80℃条件下保持10 min后测酶活，可以明显看出游离酶酶活损失的更多，说明该材料对菠萝蛋白酶酶活有一定的热保护作用。
图8为磁性微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+对菠萝蛋白酶酶活热保护示意图。菠萝蛋白酶属于单亚基酶，单亚基酶活性的失去一般分为两步，变性过程和失活过程，变性过程是可逆的，而失活过程是不可逆的。如图8所示，当温度高于PNIPAM的LCST时，温敏单体塌缩，呈现疏水性。温度继续升高，菠萝蛋白酶发生变性过程，暴露出疏水部位，正好与PNIPAM通过疏水作用相结合，阻止了酶分子的相互聚集而失活。降低温度，PNIPAM链伸展，呈现亲水性，释放出菠萝蛋白酶分子，酶分子可通过折叠恢复其原来构象，从而使酶活恢复。

Claims (10)

1.一种核壳式磁性复合微球，其特征在于，所述微球为一种新型的聚合物大分子共聚修饰的磁性微球，所述微球记为Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+，所述微球比表面积大，密度大，粒径大小均一，都保持在200 nm左右。
2.权利要求1所述的一种核壳式磁性复合微球的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行制备：
（1）磁性温敏聚合物Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)的合成：
取Fe3O4/MPS于三口烧瓶中，加入乙腈超声分散均匀，加入N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯、交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂偶氮二异丁腈混合均匀后，安装分馏柱，冷凝管，接收器；机械搅拌并通氮气，油浴加热烧瓶蒸馏得到部分乙腈，停止反应；得到的产物用磁铁分离，并用乙醇和水反复洗涤后放入真空干燥箱内干燥；
（2）核壳式磁性复合微球Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni2+的合成：
将磁性温敏聚合物Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)分散于一定pH值的亚氨基二乙酸和氢氧化钠的混合水溶液中，剧烈搅拌反应；磁分离所得产物，再用乙醇和水洗涤，真空干燥箱内干燥至恒重后将所得产物分散于NiCl2溶液中，室温搅拌；磁分离产物，用去离子水洗涤，真空干燥至恒重。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述Fe3O4/MPS与乙腈用量比例为50-100 mg：40-80 mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述Fe3O4/MPS与乙腈用量比例为50 mg：40 mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述N-异丙基丙烯酰胺的用量为50-150 mg；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量为0.05-0.15 mL；所述交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为100-200 mg；所述引发剂偶氮二异丁腈用量为4-10 mg。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述N-异丙基丙烯酰胺的用量为100 mg；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯用量为0.1 mL；所述交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺用量120 mg；所述引发剂偶氮二异丁腈用量为6.4 mg。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述油浴加热条件为30min内从室温加热到沸腾，再蒸馏1 h；所述蒸出乙腈的量为20-40 mL。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述磁性温敏聚合物Fe3O4@P(GMA-co-NIPAM)与IDA和NaOH混合水溶液的用量比为50mg：20mL；其中所述IDA与NaOH的用量比为0.33 g：0.2 g；所述混合水溶液的pH值为8-11。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述剧烈搅拌反应的条件是80℃反应12-36 h；所述NiCl2溶液用量为10 mL, 浓度为0.1 M。
10.权利要求2所述方法制备的核壳式磁性复合微球在菠萝蛋白酶的分离纯化中的应用。
CN201710352554.1A 2017-05-18 2017-05-18 一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用 Pending CN107189023A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710352554.1A CN107189023A (zh) 2017-05-18 2017-05-18 一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710352554.1A CN107189023A (zh) 2017-05-18 2017-05-18 一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107189023A true CN107189023A (zh) 2017-09-22

Family

ID=59875245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710352554.1A Pending CN107189023A (zh) 2017-05-18 2017-05-18 一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107189023A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109225175A (zh) * 2018-08-21 2019-01-18 江苏大学 一种磁性复合微球及其制备方法和应用
CN110491544A (zh) * 2019-08-01 2019-11-22 嘉兴辰昊新材料科技有限公司 一种具有核壳结构的复合微球及其制备方法
CN114800778A (zh) * 2022-06-30 2022-07-29 山东科扬机械有限公司 一种利用铸造型砂制备加气混凝土砌块的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102492089A (zh) * 2011-11-17 2012-06-13 西北工业大学 磁性温敏核壳复合微球的制备方法
CN103601847A (zh) * 2013-10-24 2014-02-26 江苏大学 一种核壳式磁性表面印迹纳米复合材料的制备方法
CN103665278A (zh) * 2012-09-16 2014-03-26 上海遥科生物科技发展有限公司 一种分离纯化重组蛋白的核壳式磁性复合微球及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102492089A (zh) * 2011-11-17 2012-06-13 西北工业大学 磁性温敏核壳复合微球的制备方法
CN103665278A (zh) * 2012-09-16 2014-03-26 上海遥科生物科技发展有限公司 一种分离纯化重组蛋白的核壳式磁性复合微球及其制备方法
CN103601847A (zh) * 2013-10-24 2014-02-26 江苏大学 一种核壳式磁性表面印迹纳米复合材料的制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109225175A (zh) * 2018-08-21 2019-01-18 江苏大学 一种磁性复合微球及其制备方法和应用
CN110491544A (zh) * 2019-08-01 2019-11-22 嘉兴辰昊新材料科技有限公司 一种具有核壳结构的复合微球及其制备方法
CN114800778A (zh) * 2022-06-30 2022-07-29 山东科扬机械有限公司 一种利用铸造型砂制备加气混凝土砌块的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107189023A (zh) 一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用
Li et al. Affinity adsorption of lysozyme with Reactive Red 120 modified magnetic chitosan microspheres
CA1069843A (en) Method of separating proteins by ion exchange
JP2016501274A (ja) 高純度の組換えヒト血清アルブミンを単離、精製するクロマトグラフ法
CN106916228B (zh) 可穿透血脑屏障的自组装串联穿膜肽纳米颗粒抗菌剂及其制备方法与应用
CN107362777A (zh) 一种磁性秸秆纤维素重金属离子吸附剂的制备方法
KR20120041763A (ko) 합성 마이코톡신 흡착제 및 이의 제조 및 활용 방법
JP2014501251A (ja) トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを精製する方法
CN104888691A (zh) 具有抗菌功能的凹凸棒石玉米赤霉烯酮吸附剂的制备方法
CN106496358A (zh) 双亲性壳聚糖季铵盐衍生物及其制备和应用
CN103864922A (zh) 一种亲和层析纯化乌司他丁的方法
JPS58201794A (ja) ヒトインターフェロンβの濃縮精製法
CN107041874A (zh) 一种岩藻黄素微胶囊及其制备工艺
CN104497133A (zh) 一种吸附柱层析纯化乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物
CN101845089B (zh) 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法
CN102311486B (zh) 使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法
US3925152A (en) Virus separation
CN108588153A (zh) 一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法
CN104327175B (zh) 一种分离抗菌肽的方法
CN104513308A (zh) 一种树脂再生提高柱效纯化乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物
CN104109204A (zh) 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法
CN101670116A (zh) 一种共轭亚油酸与抗肿瘤药物连接的前体药物及其制备方法
CN103408625B (zh) 一种纯化dna的方法
CN105779540A (zh) 蓝莓小分子肽组合物、其提取方法及应用
CN104497135A (zh) 一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170922