CN107045057A - 一种牛源肌酸激酶同工酶胶体金免疫层析快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牛源肌酸激酶同工酶(CK‑BB)胶体金免疫层析快速检测试纸条及方法，其包括：背衬、设置在试剂背衬上的样品垫、金标结合垫、层析膜和吸收垫，其中设置在背衬一端的样品垫、一端与样品垫抵靠接触的金标结合垫、一端与金标结合垫另一端抵靠接触的层析膜、以及与层析膜另一端接触的吸收垫，其中金标结合垫上包含胶体金纳米颗粒标记的鼠抗牛源肌酸同工酶的第一抗体，而层析膜上分布了不重合的检测线和质控线，其中检测线上包含了鼠抗牛源肌酸同工酶的第二抗体，质控线上包含了抗第一抗体的第三抗体。本发明建立奶牛子宫内膜炎早期快速诊断新方法，做到不需要专业仪器，通过简单操作，实现在田间进行奶牛子宫内膜炎现场快速检测和辅助临床检查做出早期快速诊断。

Description

一种牛源肌酸激酶同工酶胶体金免疫层析快速检测试纸条

技术领域

本发明涉及胶体金免疫层析快速检测领域，具体涉及一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)胶体金免疫层析快速检测试纸条及方法。

背景技术

近年来我国奶牛业发展十分迅速，然而不孕症对奶牛养殖业的发展有着重要的影响。大量资料表明，不孕症占奶牛疾病的20％～30％，子宫内膜炎占不孕症的40％～60％。引起奶牛子宫内膜炎的病因较多，但主要原因是产后的早期感染所致，有研究表明奶牛产后的早期阶段有93％的牛发生子宫感染细菌，到46-60天时感染率降低到39％。

奶牛子宫内膜炎使受精卵不能着床或胚胎早期死亡，延迟了产犊间隔，严重影响奶牛的繁殖和生产能力及效率，给奶牛生产造成极大的经济损失。据资料报道，美国每年有12.19％的奶牛由于不孕症或繁殖疾病而被淘汰，占淘汰母牛的52.37％，每年因不孕症损失高达2.7亿美元；北京农业大学对北京、南京、上海等16个城市调查，子宫内膜炎占不孕奶牛的68.34％，国内每年淘汰的不孕奶牛占淘汰总数的60％-70％。

肌酸激酶(Creatine Kinase,CK；EC 2.7.3.2)分子量81000～82000Da，是由两个亚基(M和B)组成的二聚体，可逆催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，在肌酸和磷酸肌酸的转化反应中起着重要的作用。比如在能量代谢最旺盛的肌肉组织和脑组织中，CK的活性是最高的。在内脏器官中，子宫是CK第三活跃的器官，头两位是骨骼肌和心肌。根据其同工酶亚基和分布位置的不同，在牛中存在有三种CK同功酶，其中：CK-MM(特异存在于骨骼肌)、CK-MB(特异存在于心肌)和CK-BB(从牛脑中获得)。以上这些同功酶都存在于细胞质中，Galitzer和Oehme(1985)对牛所有器官的CK进行检测发现，内脏器官中含有的CK要远远少于骨骼肌和心肌，并且大部分的CK属于同功酶CK-BB。健康牛血清中的CK组成几乎全部由CK-MM构成，但研究发现在怀孕中和产后妇女、怀孕豚鼠的血清中还存在有可检测到的CK-BB(脑源或平滑肌源)和CK-MB(Clark et al.,1994)。造成以上现象的原因很有可能是在怀孕后期对能量(新陈代谢)更高的需求(Clark et al.,1994)，即子宫组织在分娩前后对其机械性和新陈代谢有更高的要求(Abramov et al.,1996)。

我们研究表明子宫内膜感染发炎后血清肌酸激酶活性显著增高，据研究结果其可作为奶牛子宫内膜炎的重要诊断指标。目前，奶牛子宫内膜炎的诊断主要依靠视诊、触诊和子宫探针为主的传统方法，存在早期诊断确诊率低和导致植入性病原菌二次感染的问题。因此，迫切需要研究建立一种适用于奶牛子宫内膜炎早期排查的快速、灵敏、经济适用、操作简便的现场快速检测方法。

免疫胶体金技术是一种应用较广的免疫学方法，该技术是一种将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质标记形成免疫金复合物的技术。使用免疫金标技术制备的标记物作为检测系统中的指示试剂，应用在检测传染病、环境污染物、毒品、早孕以及兽医等领域，这种技术的应用很大程度上提高了体外诊断技术的简便性和快速性。

在层析材料上发生的免疫反应，具备免疫反应的高特异性、高效率性、高亲合性的特点。具体的过程是，含有待测物的样品溶液通过纤维层析材料的毛细作用沿着层析材料上移，与固定在层析材料上的针对待测物的受体(抗原或抗体)结合发生特性性免疫反应，在些过程中抗原抗体复合物不断的被积累富集，通过酶反应标记物或直观可视标记物(如胶体金)使之显色，从而达到检测目的物质的目的。

发明内容

本发明根据奶牛子宫内膜炎与血清肌酸激酶活性的正相关性，通过重组表达牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)，制备筛选鼠源单克隆抗体，进一步利用胶体金包被和免疫层析原理研制了一种快速检测牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的试纸条，用于田间监测奶牛肌酸激酶同工酶(CK-BB)的变化。

本发明的目的是提供一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)胶体金免疫层析快速检测试纸条及方法，由此快速即时检测子宫内膜炎，通过胶体金免疫层析定量检测的方法，检测牛血清中肌酸激酶同工酶(CK-BB)的浓度，从而用于评估奶牛子宫内膜炎情况，准确，快速，灵敏度高，无需专业人员操作，成本较低，便于推广使用。

双抗体夹心法的工作原理如下：待测物的两个不同抗原位点分别针对单克隆金标抗体和检测线单克隆抗体。例如一个阳性样本，待测物可同时与金标单抗和检测线单抗结合成一个双抗体夹心待测物的大分子，这个巨型分子由于固定在检测线的单抗而在检测线(T)聚集，当聚集足够多的胶体金时可被肉眼观察。随着待测物的增多多余的金标抗体继续层析，质控线包被的是金标抗体的二抗，当多余的金标抗体层析到质控线(C)时，与C线上的二抗结合并不断积累直到显色。所呈现的阳性结果为：T线、C线双显色；阴性结果为：T线消失，C线显色。检测线和质控线均不显色则为失效。

为达到上述目的，本发明采用第一技术方案：一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于其包括：背衬、设置在试剂背衬上的样品垫、金标结合垫、层析膜和吸收垫，其中设置在背衬一端的样品垫、一端与样品垫抵靠接触的金标结合垫、一端与金标结合垫另一端抵靠接触的层析膜、以及与层析膜另一端接触的吸收垫，其中金标结合垫上包含胶体金纳米颗粒标记的鼠抗牛源肌酸同工酶的第一抗体，而层析膜上分布了不重合的检测线和质控线，其中检测线上包含了鼠抗牛源肌酸同工酶的第二抗体，质控线上包含了抗第一抗体的第三抗体。

在第一技术方案的基础上，进一步包括如下附属技术方案：

所述第二抗体为只有在有CK-BB存在的情况下才和CK-BB及第一抗体特异性结合，而第三抗体在任何情况下都能和第一抗体结合。

所述样品垫和金标结合垫至少部分重叠，而金标结合垫和层析膜至少部分重合。

所述胶体金粒径为10-100nm，且胶体金颗粒的制备使用恒温回流加热法。

所述检测线靠近胶金垫一端，所述质控线靠近吸收垫一端，所述检测线和质控线相隔距离在0.5-1.5cm之间。

所述所述试剂盒包括相互匹配并扣合的上下半卡壳，所述卡壳具有加样孔和观察孔，加样孔位于金标结合垫和样品垫处并局部裸露样品垫，而观察孔位于层析膜上方并裸露检测线和质控线。

进一步的，牛血清样本加样后，胶体金免疫层析试剂盒结合胶体金读取仪检测血清样本中含有的CK-BB的浓度水平。

进一步的，所述胶体金读取仪采用胶体金免疫层析定量读取仪，属于一种由光、机、电组成的精密仪器，扫描读取检测线和质控线的信号强度值，将信号强度值通过光电及模/数转换，转为数字信号，内置优化好的CK-BB光度-浓度标准曲线，数字信号在标准曲线中计算后，获得所检测得到的浓度值。所述胶体金读取仪扫描检测线与质控线时，吸收光扫描范围根据胶体金粒径大小。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：试剂盒中，作为检测标记物CK-BB的单克隆抗体，采用目前被广泛使用的胶体金作为标记物质，标记条件成熟稳定无毒，试剂盒本身分辨率、灵敏度、稳定较强，可以选择用肉眼做半定量检测，也可配合胶体金读取仪的使用做定量检测。

本发明的CK-BB胶体金免疫层析快速检测试纸条及检测系统，操作简单直接加血清样本、检测时间短，适合于推广使用，克服了现有酶联免疫方法及化学发光法，价格昂贵，检测耗时且需要投入专业操作人员的缺点。

本发明结合了胶体金读取仪体积小、重量轻、便于携带、并能独立处理数据从而定量检测的优点，特别适合牛血清CK-BB水平在基层牧场的检测。

本发明通过临床验证、评价和对本方法的完善，提高检测血清肌酸激酶指标揭示和反应奶牛子宫内膜感染炎症程度的灵敏性、准确性，最终建立奶牛子宫内膜炎早期快速诊断新方法，做到不需要专业仪器，通过简单操作，实现在田间进行奶牛子宫内膜炎现场快速检测和辅助临床检查做出早期快速诊断。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1：以牛心源肌酸激酶(CK-MB)为标准物采用SDS-PAGE电泳，检测子宫内膜炎牛血清样本，图中的CK标准物为商品牛源CK-MB和兔源CK；

图2：样本牛血清与CK-BB多克隆抗体WB检测，图2-A为正常曝光时间拍得WB照片，图2-B为长时间曝拍得WB照片；图2-C表明所有样本血清中的均与抗CK-BB多克隆抗体有特异性反应；

图3：质粒pET28b-CK-BB经Nde I和Xho I双酶切；

图4：牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白诱导结果：1：诱导前总蛋白，2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；

图5：牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白蛋白纯化SDS-PAGE分析图，M：Protein marker；1：上样；2：流出；3：10mM Imidazole洗脱组分；4：20mM Imidazole洗脱组分；5-9：50mMImidazole洗脱组分；10-12：500mM Imidazole洗脱组分；

图6：牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白蛋白SDS-PAGE分析图，M：Protein marker；1：目的蛋白；

图7：牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白Western Blot分析图M：Protein marker；1：目的蛋白；

图8：蛋白浓度测定曲线图；

图9：胶体金免疫层析试纸条结构示意图；

图10：标准品检测结果：从左往右依次为1、0.5、0.2、0.1、0ppm；

图11：胶体金免疫层析快速检测试纸条判定方法；

图12：胶体金免疫层析快速检测试纸条检测，梯度用PBS稀释表达蛋白至0、0.5、1、5、10、40PPm；

图13：采用胶体金免疫层析快速检测试纸条检测31组血清样本结果。

具体实施方式

实施例1.奶牛血清中肌酸激酶与子宫内膜炎的相关性研究

取得通过常规方法确诊为患有子宫内膜炎牛的血清，检测其肌酸激酶(CK)值，通过对照与阳性组的比较，确定牛子宫内膜炎与CK的相关性。

采集到来自呼和浩特和包头周边牛场的多份临床症状为奶牛子宫内膜炎患牛血清，进行生化分析检测肌酸激酶活力并得到相关数据。以牛心源肌酸激酶(CK-MB)为标准物采用SDS-PAGE电泳，检测子宫内膜炎牛血清样本(图1)，通过观察目的条带的大小和颜色的深浅判断临床血清样本CK与牛心源肌酸激酶(CK-BB)为标准物的一致性和符合度。初步研究结果如下：1、临床诊断为奶牛子宫内膜炎的病牛血清样本中的CK活性比健康牛值显著增高。正常牛只的血清肌酸激酶活性在80-200U/L，主要集中在100-200U/L，感染牛只在200-1796U/L。2、图中的CK标准物为商品牛源CK-MB和兔源CK，与临床血清样本CK有较大差异，结合有关人和动物的CK监测结果，基本判定与临床确诊为子宫内膜炎相关的病牛血清样本CK本质是CK-BB。

我们还从牛场采集到的临床症状符合奶牛子宫内膜炎的病牛血清6份，进行CK活力检测(表1)，同时采用蛋白免疫印迹方法Wenstern-Blot，以兔抗重组表达CK-BB的多克隆抗体检测临床样本血清中CK与重组表达CK-BB多克隆抗体的特异性结合率(图2)，以考察重组表达CK-BB与临床血清样本CK的相关性，结果显示：1、6个临床确诊子宫内膜炎病牛血清中肌酸激酶CK活性均增高。2、重组表达CK-BB的兔源多克隆抗体与临床确诊子宫内膜炎病牛血清中肌酸激酶CK有特异性的结合，为研制胶体金免疫层析试纸条奠定了理论基础。

表1样本牛血清CK活力检测

综合奶牛血清中肌酸激酶与子宫内膜炎的相关性研究结果及重组牛肌酸激酶同工酶(CK-BB)蛋白免疫印迹(Western-Blot)分析结果，可以确定由重组牛肌酸激酶同工酶(CK-BB)开始研制检测牛肌酸激酶同工酶(CK-BB)胶体金免疫层析试纸条，在此基础上进一步研发奶牛子宫内膜炎早期快速诊断试剂盒。

实施例2.全基因合成牛肌酸激酶同功酶CK-BB

由于牛子宫内膜炎与血清中牛肌酸激酶同功酶CK-BB具有高相关性，因此采用牛肌酸激酶同功酶CK-BB作为抗原制备相关单抗和多抗。在本发明中，关键的试剂牛脑源或平滑肌源肌酸激酶CK-BB的短缺，严重制约了实验的开展。由于CK-BB的应用较小，市面上的牛源肌酸激酶大多数是以CK-MB为主要成分，没有CK-BB的商品，给研究造成了困难。

为了解决CK-BB不足的问题，发明人研究决定采用全基因合成的方法合成牛源CK-BB基因，并对其进行原核表达。通过NCBI查询到牛肌酸激酶CK-BB的氨基酸序列，序列号为：GenBank:AAX08725.1并对其进行适用于大肠杆菌BL21的密码子优化，采用二步法人工合成牛CK-BB的全基因，接下来将合成好的全基因连接到表达载体pET28b，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经小量表达试验测得有大量目的蛋白表达，成功制备了牛肌酸激酶同功酶CK-BB的大肠杆菌工程菌，为后期大量制备牛CK-BB奠定了坚实的基础。实验过程简述如下：

2.1CK-BB基因遗传密码子改造及引物的设计和人工合成

根据牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列(GenBank:AAX08725.1)，在Bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列，将起始密码子ATG和终止密码子TAA分别添加于CK-BB序列的5’端和3’端；使用DNAworks软件以大肠杆菌密码子使用频率为基准，对该基因的密码子进行优化，引物设计合成54条互相重叠的40bp的引物，从中选取引物CK-1和CK-54(表2)分别引入Nde I和Xho I酶切位点。引物合成后经脱盐、PAGE纯化后备用。

引物名称	引物序列
		CK-1	GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCCTTTCAGCAA
CK-54	CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCTGC

表2CK-BB全基因合成和扩增编码DNA引物序列

2.2牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因合成

首先对合成CK-BB全基因测序结果，随后人工合成改造后的牛肌酸激酶同功酶CK-BB全基因序列，合成的质粒pET28b-CK-BB可经Nde I和Xho I双酶切(图3)。

2.3通过原核表达系统，小量表达重组牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白。

PET28b-CK-BB阳性质粒转化原核表达宿主菌BL21和Rosetta，涂布于对应固体培养基，37℃培养12-16h。挑取单菌落于对应液体培养基培养12-16h，保存甘油菌于-80℃。菌种活化：复苏菌种，37℃过夜培养活化。诱导表达：次日，菌种以1：50扩大培养5mL，37℃培养至OD600＝0.4-0.6，收取2.5mL菌种经处理作为诱导前对照。剩余2.5mL加入0.5mM的IPTG，37℃诱导表达3h，离心收集的菌体经处理作为诱导后样品，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况。

原核表达载体信息：

复苏PET28b-CK-BB(BL21)菌种，37℃过夜培养活化。次日，菌种以1：50扩大培养800mL，37℃培养至OD600＝0.4-0.6，加入0.5mM的IPTG，37℃诱导表达5h。8000rpm、4℃离心5min，收集菌体。加100mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率60％、超声2s、间隔2s、时间15min。12000rpm、4℃离心15min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测，判断目的蛋白的表达形式。利用高亲和性NI树脂纯化上清，收集流穿液、洗脱液，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。将纯化的目的蛋白透析去除咪唑，SDS-PAGE检测蛋白透析效果。

检测效果如下：

(1)牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白诱导结果

通过对重组表达样品进行SDS-PAGE分析(图4)，由SDS-PAGE图可以看出，在37℃沉淀中有明显表达。

(2)牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白蛋白镍琼脂糖亲和层析SDS-PAGE结果(图5)通过图SDS-PAGE分析图可以看出，目的蛋白50mM、100mM和500mM Imidazole时被陆续洗脱下来，在500mM处时目的蛋白的纯度较好。取10-12处的蛋白加0.3％SKL透析至10MmPBS，0.1％SKL，pH 8.0中。浓缩，过滤除菌，分装后于-80℃保存。

(3)牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白最终纯化SDS-PAGE分析(图6)

(4)牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白Western Blot分析(图7)

(5)牛肌酸激酶同功酶CK-BB蛋白浓度测定用SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度:2.012mg/ml，结果如图8所示。

实施例3.CK-BB单克隆抗体的制备

1.小试：PET28b-CK-BB阳性质粒转化BL21和Rosetta宿主菌，小试均有明显表达。

2.抗原制备：大量诱导表达PET28b-CK-BB(BL21)，目的蛋白在上清和包涵体明显表达，优先纯化上清，上清经纯化、透析，最终得到CK-BB重组蛋白5mg，蛋白纯度＞90％。

3.多抗制备：制备了多克隆抗体，效价1:243000。

4.单抗制备：制备了单克隆抗体，筛选到阳性细胞株5株。

5.抗体制备与纯化：植腹水，纯化得到单克隆抗体。

6.抗体配对筛选：使用ELISA方法对抗体进行配对筛选，获得能配对的抗体对。

7.ELISA条件优化：选取效果最好的抗体对进行ELISA条件优化。

8.金标条件优化：筛选效果最好的一对抗体进行金标条件优化。

制备方法简述如下：

取2月龄雌性新西兰大白兔一只进行免疫，共进行三次免疫，采取大腿肌肉多点注射。每次每只新西兰大白兔抗原免疫用量为500ug，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，耳静脉注射。第二次免疫后14天静脉采血，通过间接法测抗体效价，以此确定是否有针对目标的抗体生成。效价达标之后第三次进行加强免疫；效价不达标，则第三次继续弗氏不完全佐剂皮下进行免疫，28天后第四次进行加强免疫。加强免疫14天后取血。

取6周龄雌性BALB/c小鼠四只进行免疫，共进行三次免疫，采取批下多点注射。每次每只小鼠抗原免疫用量为25ug，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。第二次免疫后10天尾静脉采血，通过间接法测抗体效价，以此确定是否有针对抗原的抗体生成。比较四只小鼠效价，最后选择抗体效价较高的小鼠用于细胞融合。融合前三天，用抗原直接加强免疫一次，剂量同前。

从液氮中取出冻存骨髓瘤细胞细胞，立即放入37℃水浴中融化，离心，弃上清，用少量完全培养液打散细胞团，加入约完全培养基于冻存管中，用吸管吹打均匀，全部吸出转至细胞培养瓶中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养。待细胞长满瓶底后传至另一细胞瓶中培养，在倒置显微镜下观察其细胞状态，状态良好的细胞备做融合用。

取效价最高且加强免疫的小鼠，眼球摘除采血，分离血清作为检测时的阳性对照血清。将小鼠颈椎脱臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超净工作台内，固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开左侧皮肤和腹膜，无菌取出脾脏置于已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛约有基础培养液的平皿内的滤膜中，用两个注射器上的弯针头将脾脏刺孔，然后其中一个弯针头固定滤膜，另一个弯针头挤压滤膜，使脾细胞完全释放到平皿中的基础培养液中。用无菌滴管吹打细胞制成单细胞悬液，收获脾细胞悬液。将平皿中脾细胞悬液转移到离心管中，离心，弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次。用PEG将分离得到的脾细胞与提前复苏备用的骨髓瘤细胞进行融合，离心，弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次，加入用HAT的细胞培养液吹打成单细胞悬液，铺入96孔细胞培养板。细胞融合后第7天，培养板孔底长出肉眼可见的克隆，首先通过ELISA间接法对所有细胞孔进行初次筛选，记录呈现强阳性的细胞孔。对初筛呈阳性的各细胞孔应及时在24孔细胞培养板中进行扩大培养和克隆化。采用有限稀释法将细胞悬液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，转移至96孔板培养，经过数次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将获得的阳性杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养，而后冻存及制备腹水等。

取6周龄健康雌性小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡致敏，一到两周后，每只小鼠腹腔注射1-2X 10⁶个杂交瘤细胞，观察小鼠状态7-10天后待小鼠腹腔明显膨大后收集腹水，离心上清液即为腹水，分装、标记，备用。腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M,pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M,pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

应用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒进行测定以及应用间接ELISA方法测定抗体效价。

实施例4.胶体金免疫层析试纸条的制备

1.金标配对筛选

对抗体进行配对筛选，选择假阳性低、灵敏度高的抗体对。

双抗夹心的胶体金试纸方法如下：

a、胶体金制备

b、抗体标记

c、喷金与划膜

a)将包被抗原稀释至适当浓度划于T线，羊抗鼠二抗划于C线，烘干待用；

b)标记好的胶体金喷于预处理过的金标垫，烘干待用。

d、组装与测试

a)将不用编号的金与膜两两组合，检测配对效果。

2.胶体金速测试纸条件优化

对划膜、胶体金标记和反应条件等进行优化，得到合适的条件，并编写工艺文件。

3.产品生产

根据编写的工艺文件，进行胶体金速测试纸的生产(图9)。

喷金：将纯化好的金标抗体使用浓度为：2.0μL/cm用点金标(膜)机均匀的喷在处理过的金标垫上，37℃烘干24小时，待用。

划膜：选取CN140的NC膜用点金标(膜)机将浓度为2.0mg/mL的FL155-1#鼠单抗以1.0μL/cm划T线，浓度为1mg/mL的羊抗鼠二抗以1.0μL/cm划C线，37℃烘干24小时，待用。

抗体配对筛选：筛选单克隆抗体相互交叉配对，最终选择FL155-1#、FL155-2#鼠单抗，其中FL155-1#划膜，FL155-2#抗体标记。

对制备的胶体金免疫层析试纸进行标准品检测：配置0、0.2、0.5、1μg/mL的牛CK-BB表达蛋白于1.5mL离心管中，将检测条按照箭头插离心管中，在10分钟后读取结果(图10)，检测重组蛋白灵敏度可达到0.2ppm。

实施例5.CK-BB牛血清样本检测报告

1、CK-BB牛血清样本检测方法

采用双抗夹心金标法对实际样本进行检测，操作步骤如下：

(1)测试前请完整阅读使用说明书，并将速测试纸和待检样本溶液恢复至常温；

(2)从包装袋中取出速测试纸后请尽快使用；

(3)将速测试纸从试纸桶中取出，直接插入样品槽中，开始计时；

(4)结果应在10-15分钟读取，其他时间判读无效；

(5)读取结果时，速测试纸水平置于观察者正面，如图11所示。

2、表达蛋白测试

用PBS稀释表达蛋白至0、0.5、1、5、10、40PPm，如图12所示：

3、实际样本检测

3.1根据酶标的检测结果，将血清样本直接滴加测试；

3.2样本检测结果提供3组样本进行检测。

CK-BB血清样本检测结果

结论：3组共31个样本，基本都能检测出阳性(图13)。

当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于其包括：背衬、设置在试剂背衬上的样品垫、金标结合垫、层析膜和吸收垫，其中设置在背衬一端的样品垫、一端与样品垫抵靠接触的金标结合垫、一端与金标结合垫另一端抵靠接触的层析膜、以及与层析膜另一端接触的吸收垫，其中金标结合垫上包含胶体金纳米颗粒标记的鼠抗牛源肌酸同工酶的第一抗体，而层析膜上分布了不重合的检测线和质控线，其中检测线上包含了鼠抗牛源肌酸同工酶的第二抗体，质控线上包含了抗第一抗体的第三抗体。

2.根据权利要求1所述的一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述第二抗体为只有在有牛源肌酸同工酶存在的情况下才和牛源肌酸同工酶及第一抗体特异性结合，而第三抗体在任何情况下都能和第一抗体结合。

3.根据权利要求1所述的一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述样品垫和金标结合垫至少部分重叠，而金标结合垫和层析膜至少部分重合。

4.根据权利要求1所述的一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述胶体金粒径为10-100nm，且胶体金颗粒的制备使用恒温回流加热法。

5.根据权利要求1所述的一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述检测线靠近胶金垫一端，所述质控线靠近吸收垫一端，所述检测线和质控线相隔距离在0.5-1.5cm之间。

6.根据权利要求5所述的一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述试剂盒包括相互匹配并扣合的上下半卡壳，所述卡壳具有加样孔和观察孔，加样孔位于金标结合垫和样品垫处并局部裸露样品垫，而观察孔位于层析膜上方并裸露检测线和质控线。

7.一种制备抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条的方法，其特征在于其包括：

S1、制备胶体金纳米颗粒步骤；

S2、胶体金标记抗牛源肌酸同工酶的制备步骤；

S3、胶金垫的处理步骤；

S4、样品垫的制备步骤；

S5、检测垫上检测线及质控线的包被步骤；

S6、抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条的组装步骤。

8.权利要求1所述一种抗牛源肌酸同工酶胶体金免疫层析检测试纸条在制备诊断牛子宫内膜炎试剂中的应用。