CN106955287A - 脱氧胆酸的组合物、用途及其纯化方法 - Google Patents

脱氧胆酸的组合物、用途及其纯化方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及脱氧胆酸的组合物、用途及其纯化方法。本发明提供制备脱氧胆酸和其中间体的合成方法、高纯度合成脱氧胆酸、组合物和使用方法。还提供由Δ‑9,11‑烯、11‑酮基或11‑羟基‑β‑类固醇合成12‑酮基或12‑α‑羟基类固醇的方法。本发明还涉及在所述合成期间制备的新颖化合物。本发明还涉及从氢化可的松(Hydrocortisone)开始合成脱氧胆酸。

Description

脱氧胆酸的组合物、用途及其纯化方法
本申请是申请日为2010年12月17日，申请号为201080056763.8、发明名称为“脱氧胆酸的纯化方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请案的引用
本申请案主张2009年12月18日申请的美国临时申请案第61/288,132号、2010年2月12日申请的美国临时申请案第61/303,816号、2010年5月25日申请的英国申请案第1008726.0号和2010年5月26日申请的美国临时申请案第61/348,686号的权利，所有所述申请案以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明针对脱氧胆酸和其盐的合成以及适用于脱氧胆酸合成的中间体。在一个实施例中，本发明提供以氢化可的松(Hydrocortisone)为起始材料制备脱氧胆酸或其盐的合成方法。本发明还针对例如12-酮基或12-α-羟基类固醇等中间体以及用于其制备的新颖方法。本发明更进一步提供纯化的脱氧胆酸组合物和纯化方法，其中脱氧胆酸的纯度为至少96％。
背景技术
快速去除体脂是一个久远的理想，且已主张许多物质来实现这类效果，但鲜有成效。“美塑疗法(mesotherapy)”或使用用于去除脂肪的可注射剂虽然已自20世纪50年代就宣称用于顺势疗法和美容，但仍因安全性和功效问题而不能为开业医师广泛接受。美塑疗法最初作为利用含有用于治疗局部医学和美容病症的化合物混合物的皮肤注射液的方法在欧洲构想出来。虽然美塑疗法传统上用于疼痛减轻，但其美容应用、尤其脂肪和脂肪团(cellulite)去除，近来在美国已受到关注。一种所述报导的在巴西流行且使用磷脂酰胆碱注射液的用于局部脂肪减少的治疗已被误认为与美塑疗法同义。尽管其吸引之处为声称的“溶脂”注射液，但几乎没有这些美容治疗的安全性和功效的资料。参看罗坦达A.M.(Rotunda,A.M.)和M.克洛德尼(M.Kolodney),皮肤外科学(Dermatologic Surgery)32:,465–480(2006)(“美塑疗法和磷脂酰胆碱注射液：历史阐明和综述(Mesotherapy andPhosphatidylcholine Injections：Historical Clarification and Review)”)。
近来公开的文献报导，胆酸、脱氧胆酸和其盐在注入活体内脂肪沉积处时具有脂肪去除性质。参看WO 2005/117900和WO 2005/112942以及US2005/0261258、US2005/0267080、US2006/127468和US20060154906，全部以全文引用的方式并入本文中)。注入脂肪组织的脱氧胆酸盐经由细胞溶解机理降解脂肪细胞。因为注入脂肪的脱氧胆酸盐因暴露于蛋白质而快速失活，接着快速返回到肠内容物，所以其作用受空间限制。作为赋予临床安全性的此减弱作用的结果，脂肪去除疗法通常需要4-6疗程。此无需外科手术的局部脂肪去除不仅有利于与病理学局部脂肪沉积(例如HIV治疗中的医学介入易发的血脂异常)相关的治疗性处理，而且有利于美容脂肪去除且无外科手术(例如吸脂术)所固有的伴随风险。参看罗坦达(Rotunda)等人,皮肤外科学(Dermatol.Surgery)30：1001-1008(2004)(“脱氧胆酸钠的清洁作用是用于局部脂肪溶解的可注射磷脂酰胆碱调配物的主要特征(Detergenteffects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectablephosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution)”)和罗坦达(Rotunda)等人,美国皮肤学会杂志(J.Am.Acad.Dermatol.)(2005：973-978)(“用皮下脱氧胆酸盐注射液治疗的脂肪瘤(Lipomas treated with subcutaneous deoxycholateinjections)”)，两者以全文引用的方式并入本文中。
另外，许多重要的类固醇在类固醇的C-环上具有12-α-羟基取代基。这些化合物包括例如胆汁酸，例如脱氧胆酸、胆酸、石胆酸等。迄今为止，在成本效率基础上，这些化合物通常从牛和羊来源回收，牛和羊来源提供现成的胆汁酸来源。然而，最近发现例如朊病毒等病原体会污染这些来源，由植物来源或合成起始材料合成胆汁酸的替代方法已日益变得重要。举例来说，来自新西兰的动物的脱氧胆酸是在美国管理制度下供人类使用的胆汁酸来源，只要动物持续保持分离，不然不含可观察到的病原体。这些严格的条件对适合的哺乳动物源胆汁酸的量施加了限制，且不排除胆汁酸将不含这些病原体的可能性。
仍需要由开头可知不含动物起源部分(或能够作用于动物(尤其哺乳动物)且供人类使用时，对人类具有有害影响的病原性部分)和其它例如动物或微生物代谢物、毒素(包括细菌毒素，例如致热原)等有害试剂的适量例如脱氧胆酸等有效胆汁酸，其在人类中用作药剂。
另外，需要制备不含其它未计划的胆汁酸的胆汁酸组合物。就此而论，已知哺乳动物源脱氧胆酸受胆酸污染。反过来，进一步已知胆酸是胆囊结石形成中的必需组分。因此，正需要提供制备脱氧胆酸的方法，所述方法不导致受其它胆汁酸污染。
迄今为止，GB2452358揭示以9α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮为起始物合成脱氧胆酸。在所述合成中，中间体3α-羟基-5β-雄-9(11)-烯-17-酮经揭示为自9α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮衍生而来。虽然9α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮如所述专利中所揭示有效地转化为脱氧胆酸，但由氢化可的松合成脱氧胆酸将特别有用，这是因为氢化可的松可广泛获得。
可的松和氢化可的松分别具有11-酮基或11-β-羟基而不是脱氧胆酸的12-α-羟基。类固醇主链上的11-酮基或11-β-羟基转化成相应12-α-羟基或12-酮基并非平凡的，因为不仅必须进行转化，而且必须选择性进行转化。国际专利申请公开案第WO2008/157635号报导多个反应流程，其中在一个情况下，3-β-乙酰氧基-11-α-酮基类固醇经由在所述类固醇中形成Δ-9,11-烯官能团，接着用三氧化铬在12-位进行烯丙基氧化而转化为3-β-乙酰氧基-12-α-羟基类固醇。使用三氧化铬提供适度产率的Δ-9,11-烯-12-氧代官能团，且此反应产生的副产物妨碍所要产物的纯化。此外，三氧化铬具有高毒性、腐蚀性并且致癌。其是六价铬，一种环境危害的主要实例。在氧化过程中应限制使用三氧化铬。
鉴于以上描述，需要提供使用环境上相容和毒性较低的氧化剂使11-β-羟基/11-酮基类固醇转化成相应Δ-9,11-烯、12-α-羟基/12-酮基类固醇的高效合成方法。
医药级化学品需要一贯可重现的纯度。在一些实施例中，纯化方法应提供至少95％纯度或至少99％纯度。然而，纯化到至少99％在技术上具挑战性。举例来说，纯化方法中所用的溶剂可俘获产物，由此降低其纯度，且其它污染物可由任何纯化方法带出。
这一问题尤其与脱氧胆酸和其盐相关，因为这一产品已揭示用于去除不想要脂肪沉积的美容用途。参看例如美国专利第7,622,130号，其以全文引用的方式并入本文中。困为美容手术完全任意选择，所以管理机构通常要求较高安全标准。
发明内容
本发明提供适用于制备胆汁酸或其盐的方法和组合物以及纯化如此制备的胆汁酸的方法。
在一个实施例中，提供消除或限制在Δ-9,11-烯类固醇的12-位进行烯丙基氧化期间所采用的铬(VI)氧化剂量的氧化方法。氧化反应采用提供化合物1、2和3的环境上相容的共氧化剂混合物：
其中Pg是羟基保护基，R是氢、羟基或-OPg，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸，其中所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基酯化，且R2是氢，或R1和R2连同其所连接之碳原子一起形成酮基或酮基保护基；和各R3、R4和R5独立地为C1-C3烷基。
任选地，在另一步骤中，上述混合物经铬(VI)氧化剂处理以使部分氧化产物在12-位转化成相应酮。在此方法中，所采用的铬(VI)氧化剂量显著少于采用三氧化铬作为唯一氧化剂的美国第12/153,446号的实例10中所报导的量。
因此，在一个实施例中，提供一种方法，所述方法在Δ-9,11-烯类固醇化合物4的12-位实现烯丙基氧化：
形成相应12-酮基化合物3：
所述方法包含使化合物4与包含碱金属次氯酸盐和叔烷基过氧化氢的共氧化剂混合物在氧化条件下接触，得到化合物3；
其中Pg是羟基保护基，R是氢、羟基或-OPg，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸，其中所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基酯化，且R2是氢，或R1和R2连同其所连接之碳原子一起形成酮基或酮基保护基。
在另一实施例中，化合物4经所述共氧化剂混合物氧化得到以下化合物：
其中Pg是羟基保护基，R是氢、羟基或-OPg，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸，其中所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基酯化，且R2是氢，或R1和R2连同其所连接之碳原子一起形成酮基或酮基保护基；和各R3、R4和R5独立地为C1-C3烷基。
任选地提供的混合物可用微过量铬氧化剂处理以使化合物2和任选的化合物1转化成化合物3，由此提高化合物3的总产率。因此，在这一实施例中，提供一种方法，所述方法在Δ-9,11-烯类固醇化合物4的12-位实现烯丙基氧化：
形成相应12-酮基化合物3：
所述方法包含使化合物4与包含碱金属次氯酸盐和叔烷基过氧化氢(TBHP)的共氧化剂混合物在氧化条件下接触，得到化合物1、2和3的混合物；和
进一步用有效量的铬(VI)氧化剂氧化所述混合物，得到化合物3，其中Pg是羟基保护基，R是氢、羟基或-OPg，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸，其中所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基酯化，且R2是氢，或R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基或酮基保护基。
在一个任选实施例中，使化合物1、2和3的混合物在经铬(VI)氧化剂氧化之前在氢化条件下反应以使Δ-9,11-烯氢化。
当所述任选氢化反应在经铬(VI)氧化之前发生时，得到式5和6的新颖中间体：
其中Pg、R、R1、R2、R3、R4和R5如上文所定义。
在一个优选实施例中，氢化反应在氧化步骤完成之后发生。
在另一实施例中，本发明提供一种制备Δ-9,11-烯-12-酮基化合物7的方法：
其由相应Δ-9,11-烯化合物8制备：
其中Pg是羟基保护基，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸，其中所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基酯化，且R2是氢，或R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基或酮基保护基；
其中所述方法包含：
藉由在存在共氧化剂的情况下与式(R3)(R4)(R5)C-O-OH的叔烷基过氧化氢反应在化合物8的12-位实现烯丙基氧化，其中各R3、R4和R5独立地为C1-C3烷基，首先得到化合物9、10和7的混合物：
且任选地其中化合物11b然后进一步经铬(VI)氧化剂氧化，得到Δ-9,11-烯-12-酮化合物7。
在一个任选实施例中，使化合物9、10和7的混合物在经铬(VI)氧化剂氧化之前在氢化条件下反应以使Δ-9,11-烯氢化。
当所述任选氢化反应在经铬(VI)氧化剂氧化之前发生时，得到式11a和11b的新颖中间体：
其中Pg、R1、R2、R3、R4和R5如上文所定义。
在另一实施例中，本发明提供一种使11-β-羟基类固醇转化成相应12-酮基类固醇的方法，其中所述方法包含：
a)选择适当保护的11-β-羟基类固醇；
b)使所述11-β-羟基类固醇脱水，在所述类固醇中提供Δ-9,11-烯官能团；
c)通过在存在共氧化剂的情况下使上述b)的类固醇产物与叔烷基过氧化氢反应在12-位实现烯丙基氧化；和
d)使Δ-9,11-烯官能团氢化，得到9-α-氢-11-二氢-12-酮基类固醇；和
e)任选地用有效量的还原剂使上述d)中产生的9-α-氢-11-二氢-12-酮基类固醇的12-酮基官能团还原，得到9-α-氢-11-二氢-12-α-羟基类固醇。
在另一实施例中，本发明提供一种制备化合物12的方法，
其包含在脱水条件下接触化合物13(其中Pg是羟基保护基)：
得到化合物12。
在另一实施例中，本发明提供一种制备式14化合物的方法，
a)使氢化可的松：
与至少1摩尔当量的氢气在氢化条件下接触，得到4,5-二氢氢化可的松-化合物15：
b)使化合物15与至少2当量还原剂在羰基还原成醇基的条件下接触，得到化合物16：
c)在氧化条件下使化合物16与邻位醇氧化剂接触，得到化合物17：
d)选择性保护化合物17的3-羟基，得到式13化合物：
其中Pg是羟基保护基；
e)在脱水条件下接触式13化合物，得到式12化合物；
f)和去除羟基保护基，得到化合物14。
在另一实施例中，本发明提供一种制备式18化合物的方法：
所述方法包含：
a)使氢化可的松：
与至少1摩尔当量的氢气在氢化条件下接触，得到4,5-二氢氢化可的松-化合物15：
b)在羰基还原成醇基的条件下使化合物15与至少2当量还原剂接触，得到化合物16：
c)在氧化条件下使化合物16与邻位醇氧化剂接触，得到化合物17：
d)选择性保护化合物17的3-羟基，得到化合物13：
其中Pg是羟基保护基；
e)在脱水条件下接触式13化合物，得到化合物12；和
f)和在烯烃形成条件下转化化合物12，形成化合物18；
在另一实施例中，本发明提供一种制备脱氧胆酸或其盐的方法，所述方法包含：
a)在上述程序后得到化合物18；
b)在存在路易斯酸(Lewis acid)的情况下使化合物18与丙炔酸烷酯CH≡CC(O)OR'或丙烯酸烷酯CH2＝CHC(O)OR'(其中R'是烷基)反应，形成化合物19，其中虚线是单键或双键；
h)使式19化合物与H2在氢化条件下反应，形成化合物20：
i)使化合物20与氧化剂反应，得到化合物21：
j)在氢化条件下使化合物21与H2反应，得到化合物22：
k)使化合物22与还原剂反应，得到化合物23：
l)在脱除保护基和水解条件下接触化合物23，形成脱氧胆酸或其盐。
在另一实施例中，本发明提供一种制备化合物24的方法，
所述方法包含：
a)在包含氢气和至少8重量％的50％湿(出于安全性而含水)Pd/碳的氢化条件下于选自由丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃组成的群组的溶剂中于维持在高压下的高压釜内接触化合物25：
得到化合物26：
b)在存在硫酸的情况下在除去水的条件下使化合物26脱水，得到化合物27：
c)使化合物27与过量三叔丁氧基氢化铝锂在包括-40℃到-45℃温度的选择性还原条件下接触，得到化合物28：
d)在威蒂希反应条件(Wittig reaction condition)下使化合物28与过量乙基三芳基卤化膦接触，得到化合物29：
e)在包括过量无水乙酸酐的乙酰化条件下保护化合物29的羟基，得到化合物30：
f)在存在过量二氯化C1-C2烷基铝的情况下在烷基化条件下使化合物30与过量丙烯酸甲酯接触，形成化合物31：
g)使化合物31与氢气和选自铂和无水钯/碳的氢化催化剂于惰性溶剂中在包括维持在高压下的高压釜的氢化条件下接触，得到化合物32；
h)在氧化条件下在包括过量C4-C6叔烷基过氧化氢作为第一氧化剂和过量NaOCl作为共氧化剂的共氧化条件下接触溶解于惰性溶剂中的化合物32，任选地接着用微过量的氯铬酸吡啶鎓进一步氧化，得到化合物24：
所述化合物用甲醇洗涤。
在本发明的另一实施例中，提供一种制备脱氧胆酸或其盐的方法，所述方法包含：
a)使化合物24
与氢气和Pd/C在包含氢气和Pd/碳的氢化条件下于维持在高压下的高压釜中接触，任选地接着在氧化条件下用氯铬酸吡啶鎓氧化在氢化反应期间形成的任何12-羟基，得到化合物33；
b)在还原条件下使化合物33与三叔烷氧基氢化铝锂反应，得到化合物34：
c)使化合物34暴露于脱除保护基和水解条件，形成脱氧胆酸或其盐。
在另一实施例中，本发明提供一种制备化合物26的方法，
其通过使用选自由N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和包含多达5％水的丙酮水溶液组成的群组的溶剂在包含氢气和10％Pd/C的氢化条件下接触化合物25来制备：
在另一实施例中，本发明提供一种制备纯度大于96％的脱氧胆酸(DCA)或其盐的方法，所述方法包含：
(a)使纯度为约95％或小于95％的DCA与包含二氯甲烷的溶剂在一定条件下接触，形成DCA溶液；
(b)使DCA从得自步骤(a)的DCA溶液中结晶，得到含有结晶DCA的溶液；
(c)回收纯度大于96％的所述结晶DCA。
在另一实施例中，本发明提供一种制备纯度大于96％的脱氧胆酸(DCA)的方法，所述方法包含：
(a)使纯度为约95％或小于95％的DCA与包含二氯甲烷和甲醇的溶剂在一定条件下接触，形成DCA溶液；
(b)使DCA从得自步骤(1)的DCA溶液中结晶，得到含有结晶DCA的溶液；
(c)回收结晶DCA和去除足量二氯甲烷以使得所述回收的结晶DCA的纯度大于96％。
在另一实施例中，本发明提供一种合成的脱氧胆酸(DCA)或其医药学上可接受的盐，其中合成的DCA或其医药学上可接受的盐的纯度为至少99％。
在另一实施例中，本发明提供一种组合物，其包含纯度为至少99％的DCA或其医药学上可接受的盐和医药学上可接受的赋形剂。
在另一实施例中，本发明提供一种用于非外科手术去除局部脂肪的组合物，所述组合物基本上由纯度为至少99％的DCA或其医药学上可接受的盐组成，其中DCA基本上是所述组合物唯一的脂肪去除组分。
在另一实施例中，本发明提供一种组合物，其包含DCA和溶剂，所述溶剂包含含甲醇或不含甲醇的二氯甲烷，其中DCA比溶剂的浓度为40:1到约10:1。
附图说明
图1提供使用500MHz仪器得到的化合物9的质子NMR谱。
图2提供使用125MHz仪器得到的化合物9的13C NMR谱。
图3提供化合物9的质谱。
具体实施方式
在本发明中，各种公开案、专利和公开的专利说明书以鉴别引用的方式参考。这些公开案、专利和公开的专利说明书的揭示内容以引用的方式并入本说明中以更详细地描述本发明所属技术领域的现状。
如本文中所用，某些术语可具有以下确定的含义。除非上下文另有明确规定，否则如说明书和附加权利要求书中所用，单数形式“一”和“所述”包括单数和复数提及物。
除非另有指示，否则应理解说明书和权利要求书中所用的所有表示成分数量、反应条件等的数字在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非相反指示，否则以下说明书和随附权利要求书中阐述的数字参数都是近似值。各数字参数至少应根据所报导的有效数字的数目并通过应用普通舍入技术来解释。
如本文中所用，术语“包含”意味着化合物和方法包括所列举要素，但不排除其它要素。“基本上由......组成”当用于限定组合物和方法时意思应为排除对化合物或方法具任何本质意义的其它要素。“由......组成”意思应为排除所主张化合物和实质性方法步骤的其它成分的不可忽视的要素。由各这些转折语限定的实施例在本发明的范围内。因此，希望方法和化合物可包括额外的步骤和组分(包含)，或者包括无关紧要的额外步骤和化合物(基本上由......组成)，或者仅意欲所述方法步骤或化合物(由......组成)。
术语“烷基”是指具有1至10个碳原子或1至6个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。术语“低级烷基”是指具有1-6个碳原子或1-4个碳原子的烷基。此术语包括例如直链和分支链烃基，例如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)和新戊基((CH3)3CCH2-)。
术语“叔烷基(t-alkyl/tert-alkyl)”是指式R1R2R3C-的叔烷基，其中各R1、R2和R3独立地为1至3个碳原子的烷基且总共为10个碳原子。这些基团优选具有不超过4-6个碳原子。
术语“氧化剂”是指在氧化还原反应中可接受电子的试剂。以此方式，可向分子中添加氧，或可从分子中去除氢。仅举例来说，氧化剂包括琼斯试剂(Jones reagent)、叔丁基过氧化氢、次氯酸钠、氯铬酸吡啶鎓和CrO3。在一个实例中，氧化剂对邻位(1,2)醇具专一性且包括高碘酸盐化合物。这些氧化剂有时称为“邻位醇氧化剂”。
术语“铬氧化剂”是指能够实现氧化的铬VI化合物。在一个实施例中，铬氧化剂能够将伯醇氧化为醛，将仲醇氧化为酮。这些选择性铬氧化剂通常与例如吡啶等碱络合。一种尤其优选的铬氧化剂是氯铬酸吡啶鎓。在另一实施例中，铬氧化剂能够将亚甲基α氧化为乙烯基不饱和，从而形成烯丙基酮。在这一实施例中，优选铬氧化剂包括三氧化铬和NaOCl与叔烷基过氧化氢(例如叔丁基过氧化氢，TBHP)的共氧化剂混合物。
术语“羟基保护基”是指能够保护化合物的羟基(-OH)并在适合的脱除保护基条件下释放羟基的基团。常见的这类基团包括酰基(与羟基的氧原子形成酯)，例如乙酰基、苯甲酰基，和与羟基的氧原子形成醚的基团，例如苯甲基和甲氧基甲基，等。羟基保护基在有机合成领域中为熟知的。
术语“消除条件”是指例如H2O、HCl或HBr等小分子从包含羟基、氯或溴基团等的化合物中失去以形成包含烯基的相应化合物的反应条件。在一个实例中，消除条件包括脱水条件，其中羟基和邻位氢原子被消除以形成乙烯基(“烯”)基团。脱水条件可包括使羟基转化成离去基，例如氯、溴、甲苯磺酰基、甲磺酰基、-OS(O)Cl。
术语“Ac”是指具有式CH3C(O)-的乙酰基。
术语“酮基”是指基团(>C＝O)。
术语“酮基保护基”是指能够保护化合物的酮基并在适合的脱除保护基条件下释放酮基的基团。常见的这类基团包括缩酮和缩羰(基)酯(acylal)。酮基保护基在有机合成领域中为熟知的。
适合的羟基或酮基保护基和可采用的其它保护基和其去除条件描述于例如以下书中：有机合成中的保护基(Protective groups in organic synthesis),第3版,T.W.格林尼(T.W.Greene)和P.G.M.乌兹(P.G.M.Wuts)编,约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),美国纽约(New York,N.Y.,U.S.A.),1999，且为所属领域的技术人员所熟知，这本书其全文引用的方式并入本文中。
术语“缩酮”是指两个-OR22基团连接于分子中的同一碳原子的基团，其中R22表示烷基或两个R22基团连同其所连接的碳原子和两个氧原子一起形成环结构。两个-OR22基团可相同或不同。
术语“缩羰(基)酯”是指两个-O(C＝O)R23基团连接于分子中的同一碳原子的基团，其中R23表示烷基或两个R23基团连同其所连接的碳原子和两个-O(C＝O)-基团一起形成环结构。两个-O(C＝O)R23基团可相同或不同。
术语“还原剂”是指可在氧化还原反应中供给电子的试剂，从而使得向分子中加氢。适合的还原剂包括氢化铝锂、硼氢化钠、氰基硼氢化钠等。
术语“乙酰基化试剂”是指可向分子的醇部分中添加乙酰基(Ac)基团CH3C(O)-的试剂。
术语“酸”是指能够供给H+的试剂。
术语“路易斯酸”是指电子对受体。路易斯酸包括有机金属试剂，例如卤化烷基铝(例如Et2AlCl和MeAlCl2)。
术语“氢化条件”是指在一个或一个以上双键上引入H2的适合的条件和催化剂。氢化催化剂包括基于铂族金属(铂、钯、铑和钌)的催化剂，例如Pd/C和PtO2。
术语“烯化试剂”是指与酮反应形成相应烯烃的试剂。术语“烯烃形成条件”是指适于进行这类转变的条件。这类试剂的实例包括威蒂希试剂和威蒂希烯化条件。
术语“回流条件”是指液体沸腾且沸腾液体的蒸气冷凝并向下返回至下方液体中的条件。
术语“医药学上可接受的盐”是指脱氧胆酸的医药学上可接受的盐，所述盐源自所属领域中熟知的多种有机和无机相对离子，且仅举例来说，包括钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵。
如本文中所用的类固醇骨架编号遵循一般约定：
应了解，除非另作说明，否则骨架仅表示碳原子的位置。两个相邻碳原子之间的一个或一个以上键可为双键，且一个或一个以上碳原子可任选地经取代。
如本文中所用，术语“Δ-9,11-烯类固醇”或“Δ-9,11-烯化合物”是指9与11碳原子之间具有双键的类固醇化合物，可由以下骨架表示：
如本文中所用，术语“11-β-羟基类固醇”或“11-β-羟基化合物”是指11-位碳原子上具有羟基取代基的类固醇化合物，可由以下骨架表示：
如本文中所用，术语“11-酮基类固醇”或“11-酮基化合物”是指11-位碳原子上具有酮基取代基的类固醇化合物，可由以下骨架表示：
如本文中所用，术语“12-酮基类固醇”或“12-酮基化合物”是指12-位碳原子上具有酮基取代基的类固醇化合物，可由以下骨架表示：
如本文中所用，术语“12-α-羟基类固醇”或“12-α-羟基化合物”是指12-位碳原子上具有羟基取代基的类固醇化合物，可由以下骨架表示：
术语“胆汁酸的17-侧链”是指17-位碳原子上的取代基。
合成方法
A.由氢化可的松合成DCA
在一个实施例中，本发明提供化合物14的合成，所述为用于合成脱氧胆酸(DCA)或其医药学上可接受的盐的中间体。
流程1.由氢化可的松合成3α-羟基-5β-雄-9(11)-烯-17-酮(14)
其中Pg是保护基。
这一方法包含使化合物13(其合成在下文中描述)：
其中Pg是羟基保护基，暴露于脱水条件下，得到化合物12
和去除羟基保护基。
在一些实施例中，Pg是-C(O)R1，其中R1是低级烷基。在一些实施例中，Pg是-C(O)CH3。
在一个实施例中，脱水条件包含使式13化合物的羟基转化成-L，其中-L是离去基，例如-OS(O)Cl、-OSO2R2(其中R2是低级烷基或苯基或经烷基取代的苯基，例如-CH3或-C6H5CH3)或-OPX2(其中X是溴或OR3，其中R3是低级烷基)。在一些实施例中，脱水条件包含亚硫酰氯和吡啶。
在一些实施例中，化合物13利用包含选择性保护化合物17的3-羟基的方法来制备：
在一个实施例中，保护基Pg是-C(O)-低级烷基，例如-C(O)CH3。在一些实施例中，使化合物17暴露于酰化条件下，形成35，例如通过用乙酸酐和有机碱(例如三乙胺(Et3N)、吡啶和/或二甲基氨基吡啶)处理17。
在一些实施例中，化合物17利用包含在氧化条件下使化合物16
与邻位醇氧化剂接触的方法来制备。
在一些实施例中，邻位醇氧化剂是四乙酸铅(Pb(OAc)4)或高碘酸钠(NaIO4)。
在一些实施例中，化合物16利用包含在羰基还原成醇基的条件下使化合物15
与至少2当量还原剂接触的方法来制备。
在一些实施例中，还原剂包含硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢化铝锂等。
在一些实施例中，化合物15利用包含在氢化条件下使氢化可的松：
与至少1摩尔当量氢气反应的方法来制备。
在一些实施例中，氢化条件包含Pd/C作为催化剂。在一些实施例中，氢化条件包含DMF作为溶剂。
在一些实施例中，制备化合物12的方法包含：
a)在氢化条件下使氢化可的松：
与至少1摩尔当量的氢气接触，得到4,5-β-二氢氢化可的松-化合物15：
b)在羰基还原成醇基的条件下使化合物15与至少2当量还原剂接触，得到化合物16：
c)在氧化条件下使化合物16与邻位醇氧化剂接触，得到化合物17：
d)选择性保护化合物17的3-羟基，得到化合物13：
其中Pg是羟基保护基；
e)使化合物13经受脱水条件，得到化合物12：
另一方面，本发明提供一种制备化合物28的方法，所述方法包含使化合物12暴露于脱除保护基条件。在一些实施例中，Pg是-C(O)低级烷基，且脱除保护基条件包含水解条件。在一些实施例中，水解条件包含碱金属氢氧化物或碱金属烷醇盐和水。
在一些实施例中，本发明提供一种制备DCA或其盐的方法，所述方法包含：
a-e)如上所述制备化合物12
f)在烯烃形成条件下转化化合物12，形成化合物18：
g)在存在路易斯酸(Lewis acid)的情况下使化合物18与丙炔酸烷酯CH≡CC(O)OR或丙烯酸烷酯CH2＝CHC(O)OR(其中R是烷基)反应，形成化合物19，其中虚线是单键或双键；
h)在氢化条件下使式19化合物与H2反应，形成化合物20
i)使化合物20与氧化剂反应，形成化合物21
j)在氢化条件下使化合物21与H2反应，形成化合物22
k)使化合物22与还原剂反应，形成化合物23：
l)使化合物23暴露于脱除保护基和水解条件，形成脱氧胆酸或其盐。
在一个实施例中，部分a)的氢化条件包含Pd/C催化剂。在一些实施例中，氢化条件包含溶剂DMF作为溶剂。
在一个实施例中，部分b)的还原剂是NaBH4。
在一个实施例中，部分c)的邻位醇氧化剂是NaIO4。
在一个实施例中，式13-23化合物的保护基Pg是-C(O)-低级烷基，例如-C(O)CH3。在一些实施例中，使化合物17暴露于酰化条件下形成35，例如通过用乙酸酐和有机碱(例如Et3N、吡啶和/或二甲基氨基吡啶)处理17。
在一个实施例中，步骤e)的脱水条件包含使式13化合物的羟基转化成-L，其中-L是离去基，例如-OS(O)Cl、-OSO2R2(其中R2是低级烷基或苯基或经烷基取代的苯基，例如-CH3、-C6H5CH3)、-OPX2(其中X是溴或OR3，其中R3是低级烷基)。在一些实施例中，脱水条件包含亚硫酰氯和吡啶。
在一个实施例中，部分f)的烯烃形成条件包含威蒂希试剂，例如Ph3PCH2CH3 +Br-。
在一个实施例中，部分g)的路易斯酸是EtAlCl2。
在一个实施例中，部分g)的丙炔酸烷酯是丙炔酸甲酯。
在一个实施例中，部分g)的丙烯酸烷酯是丙烯酸甲酯。
在一个实施例中，部分h)的氢化条件包含PtO2或Pd/C催化剂。
在一个实施例中，部分i)的氧化剂是CrO3。
在一个实施例中，部分i)的氧化剂包含叔丁基过氧化氢。在一个实施例中，部分i)的氧化剂包含过量叔丁基过氧化氢(例如约35当量)和过量次氯酸钠(例如约7当量)，在低温(例如约0-5℃)下。在另一实施例中，部分i)的氧化剂包含钯试剂(例如Pd/C)、过量叔丁基过氧化氢(例如约5当量)和碳酸钾，在二氯甲烷(DCM)中。
在一个实施例中，部分j)的氢化条件包含Pd/C催化剂。
在一个实施例中，部分k)的还原剂是LiAl(OtBu)3H。
在一个实施例中，部分l)的脱除保护基和水解条件当Pg是-C(O)CH3时包含使化合物38与碱金属氢氧化物、碱金属烷醇盐或两者的混合物反应。
在一个实施例中，碱金属氢氧化物是LiOH或NaOH。
在一个实施例中，脱氧胆酸的盐可通过与碱金属烷醇盐或氢氧化物反应来制备。脱氧胆酸的盐包括钠(Na+)、钾(K+)和锂(Li+)盐。
在一个实施例中，本发明提供如实例3中所示的副产物，其可通过化学修饰来再循环以用作本文所述方法中的中间体。
B.使11-β-羟基/11-酮基类固醇转化成相应12-α-羟基/12-酮基类固醇
在另一实施例中，本发明提供使11-β-羟基/11-酮基类固醇高效转化成相应12-α-羟基/12-酮基类固醇的合成方法，所述化合物适用于合成胆汁酸。所述方法优选采用例如9-HAD、可的松或氢化可的松等类固醇，所述类固醇还可利用例如以下文献中所描述的方法合成制备和转化成化合物4：2010年2月12日申请的名为“脱氧胆酸和其中间体的制备(Preparation of Deoxycholic Acid and Intermediates Thereof,)”美国临时专利申请案第61/303,816号，其以全文引用的方式并入本文中。
在方法的一个方面，本发明针对一种方法，其使Δ-9,11-烯化合物4：
转化成相应12-酮基化合物3：
其中Pg是羟基保护基，R是氢、羟基或-OPg，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸，其中所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基酯化，且R2是氢，或R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基或酮基保护基，例如缩酮；
其中所述方法包含：
通过在存在共氧化剂的情况下与式(R3)(R4)(R5)C-O-OH的叔烷基过氧化氢反应在化合物4的12-位实现烯丙基氧化，其中各R3、R4和R5独立地为C1-C3烷基，首先得到化合物1、2和3的混合物：
且其中任选地使化合物1和/或2进一步转化，得到Δ-9,11-烯-12-酮化合物3。
在一些实施例中，叔烷基过氧化氢是叔丁基化过氧化氢。
共氧化剂通常是与烷基过氧化氢协同工作以在12-位实现氧化的任何氧化剂，不管氧化提供如上式1、2和3中所示的烯丙基酮基、烯丙基醇还是烯丙基过氧化物。在一些实施例中，共氧化剂是次氯酸钠水溶液(NaOCl)。在一个实施例中，化合物4的12-位的烯丙基氧化利用过量叔丁基过氧化氢(例如等于或高于1.5当量、等于或高于6当量、等于或高于10当量或约35当量)和过量次氯酸钠(例如约7当量)在低温(例如等于或低于22℃、等于或低于10℃和约0-5℃)下实现。叔丁基过氧化氢可以浓度为例如约70％的水溶液形式添加。次氯酸钠可以浓度为例如约2.5％至13％、约5％或10％的水溶液形式添加。在一些实施例中，烯丙基氧化反应在选自由水、乙酸乙酯、己烷、庚烷、甲苯、叔丁醇、二甲氧基丙烷、石油醚和二氯化乙烷或其组合组成的群组的溶剂中实现。在一些实施例中，可采用相转移催化剂。使用这些共氧化剂可在不使用毒性铬VI氧化剂的情况下实现氧化。
在一些实施例中，共氧化剂是金属化合物，例如CuI。
在一些实施例中，烯丙基氧化反应在存在钯/炭和碱的情况下实现。在另一实施例中，利用钯试剂(例如Pd/C、Pd(OAc)2·BINAP、Pd(OCOCF3)2或Pd(OAc)2/木炭)、过量叔丁基过氧化氢(例如约5当量)和碳酸钾或磷酸二氢钠于溶剂(例如DCM)中实现化合物4的12-位的烯丙基氧化。
在一些实施例中，使化合物1转化成化合物3包含在溶剂(例如DCM)中添加钯试剂(例如Pd/C、Pd(OAc)2·BINAP、Pd(OCOCF3)2或Pd(OAc)2/木炭)、过量叔丁基过氧化氢(例如约5当量)和碳酸钾或磷酸二氢钠。
在一些实施例中，化合物2的氧化包含添加能够将醇官能团(-OH)氧化成酮基官能团(＝O)的氧化剂，其在所属领域中为已知的，例如氯铬酸吡啶鎓(PCC)。当如此使用时，所采用的氯铬酸吡啶鎓的量显著小于三氧化铬[VI]的用量。举例来说，在一个优选实施例中，所采用的氯铬酸吡啶鎓与化合物2的摩尔比为约1至1.5，且优选摩尔比为约1.1。此与先前用于实现氧化反应的三氧化铬的约4倍的量相比为有利的。
在一些实施例中，首先从混合物中分离出化合物1，接着通过用例如还原剂(例如铝汞齐)还原或催化氢化反应来转化为化合物2。
在方法的另一方面，本发明针对一种两步法，其使化合物1、2和3的混合物：
转化成相应12-酮基化合物39：
其中各Pg、R、R1、R2、R3、R4和R5如上文所定义；
其中所述方法包含首先在氢化条件下使所述混合物反应；和
然后在氧化条件下使由此形成的产物反应。
在一些实施例中，化合物1、2和3的混合物的氢化反应可形成包含化合物5、6和39的化合物的混合物。
在一些实施例中，氢化条件包含氢气、催化剂和溶剂。在一些实施例中，催化剂选自由以下组成的群组：基于铂(Pt)、钯(Pd)、铑(Rh)和钌(Ru)的催化剂，例如Pd/C、RhCl(PPh3)3和PtO2。在一些实施例中，溶剂是乙酸乙酯(AcOEt)。
在一些实施例中，氧化条件包含能够将醇官能团(-OH)氧化成酮基官能团(＝O)的氧化剂，其在所属领域中为已知的。
所属领域中已知的氧化条件包括(但不限于)科里-基姆氧化(Corey-Kimoxidation)(使用N-氯丁二酰亚胺和二甲硫)、戴斯-马丁氧化(Dess-Martin oxidation)(使用2-碘酰基苯甲酸或戴斯-马丁高碘烷)、琼斯氧化(Jones oxidation)(使用CrO3)和斯文氧化(Swern Oxidation)(使用二甲亚砜和乙二酰氯)。
在一些实施例中，氧化剂是氯铬酸吡啶鎓(PCC)。其它氧化剂可包括(但不限于)重铬酸吡啶、过碳酸钠、碘酰基苯甲酸、V2O5、Na2Cr2O7、CrO3、过碳酸钠、脲过氧化氢和过硫酸氢钾(oxone)等。
当R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基时，可利用例如WO2008/157635(以全文引用的方式并入本文中)中所述的方法等所属领域中已知的方法，使酮基转化为胆汁酸的17-位侧链。
在方法的一个方面，所述方法进一步包含使化合物39还原，得到化合物40：
在一些实施例中，使化合物39还原得到化合物40包含添加能够立体选择性、优选立体专一性将酮基官能团(＝O)还原为醇官能团(-OH)的还原剂，例如三叔丁氧基氢化铝锂。
在一些实施例中，R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基。
在一些实施例中，R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基保护基，例如：
其中n为1、2或3，且波形线表示连接至分子其余部分的连接点。
在一些实施例中，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸。在一些实施例中，所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基酯化，C1-C6烷基例如C1-C4烷基，例如甲基。
在一些实施例中，R1选自由以下组成的群组：
其中R6是低级烷基，且波形线表示连接至类固醇骨架的17-位的连接点。
在一些实施例中，Pg是-C(O)R12，其中R12是任选地经1至5个选自由卤基、-OR13组成的群组的取代基取代的低级烷基；和任选地经1至5个选自由卤基、低级烷基和-OR13组成的群组的取代基取代的苯基；其中R13是氢或低级烷基。在一些实施例中，Pg是-C(O)CH3或-C(O)CH2CH3。在一些实施例中，Pg是：
在一些实施例中，Pg是-R14，其中R14选自由以下组成的群组：任选地经苯基、-OR13或乙烯基(-CH＝CH2)取代的低级烷基；-Si(R15)3；杂环烷基；和任选地经1至5个选自由卤基、低级烷基和-OR13组成的群组的取代基取代的苯基；其中R13是氢或低级烷基，且各R15独立地选自由低级烷基和苯基组成的群组。在一些实施例中，Pg选自由以下组成的群组：
本发明方法采用使11-β-羟基类固醇(可利用常规酮基还原反应由相应11-酮基类固醇制备)转化，接着脱水，得到Δ-9,11-烯类固醇，其利用烷基过氧化氢氧化成相应12-酮基类固醇。与先前已知的使用例如CrO3等氧化剂使Δ-9,11-烯类固醇转化成12-酮基类固醇的方法相比，这一方法提供出乎意料高的产率。如以下实例2之表中所示，脱氧胆酸制备期间使用CrO3的产率通常为小于50％或小于40％。使用本发明方法，一致获得高于60％的出乎意料高的产率。此外，使用NaOCl(漂白剂)和TBHP显著比铬(VI)氧化剂环境相容。
在方法的另一方面，本发明针对一种使11-β-羟基类固醇转化成相应12-酮基类固醇的方法，其中所述方法包含：
a)选择适当保护的11-β-羟基类固醇；
b)使11-β-羟基类固醇脱水，在所述类固醇中得到Δ-9,11-烯官能团；
c)通过在存在共氧化剂的情况下使上述b)的类固醇产物与烷基氢过氧化物反应在12-位实现烯丙基氧化；和
d)使Δ-9,11-烯官能团氢化，得到9-α-氢-11-二氢-12-酮基类固醇；和
e)任选地用有效量的还原剂使上述d)中产生的9-α-氢-11-二氢-12-酮基类固醇的12-酮基官能团还原，得到9-α-氢-11-二氢-12-α-羟基类固醇。
在一些实施例中，烷基过氧化氢是叔丁基过氧化氢。共氧化剂可为本文所述的共氧化剂之一。
在一些实施例中，11-β-羟基类固醇通过用至少化学计量量的还原剂使相应11-酮基类固醇还原得到11-β-羟基类固醇来制备。
在一些实施例中，11-β-羟基类固醇是氢化可的松或氢化可的松衍生物，例如经保护的氢化可的松。
应了解，本文所述方法的个别步骤可如所描述依次进行，但未必依次进行。一个或一个以上步骤可作为较大流程的一部分进行。所属领域的技术人员可轻易地使本文所述化合物的其它部分反应，从而制得这些化合物的类似物。
C.由化合物25合成化合物24
在另一实施例中，本发明提供一种制备化合物24的方法，
所述方法包含：
a)在包含氢气和至少8重量％的50％湿Pd/碳的氢化条件下于选自由丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃组成的群组的溶剂中于维持在高压下的高压釜内接触化合物25：
得到化合物26：
b)在存在硫酸的情况下在除去水的条件下使化合物26脱水，得到化合物27：
c)在包括-40℃到-45℃温度的选择性还原条件下使化合物27与过量三叔丁氧基氢化铝锂接触，得到化合物28：
d)在威蒂希反应条件下使化合物28与过量乙基三芳基卤化膦接触，得到化合物29：
e)在包括过量无水乙酸酐的乙酰化条件下保护化合物29的羟基，得到化合物30：
f)在存在过量二氯化C1-C2烷基铝的情况下在烷基化条件下使化合物30与过量丙烯酸甲酯接触，形成化合物31：
g)在惰性溶剂中在包括维持在高压下的高压釜的氢化条件下使化合物31与氢气和选自铂和无水钯/碳的氢化催化剂接触，得到化合物32；
h)在氧化条件下在包括过量C4-C6叔烷基过氧化氢作为第一氧化剂和过量NaOCl作为共氧化剂的共氧化条件下接触溶解于惰性溶剂中的化合物32，任选地接着用微过量的氯铬酸吡啶鎓进一步氧化，得到化合物24：
所述化合物用甲醇洗涤。
在一个替代实施例中，本发明提供一种制备化合物31的方法，
其通过在存在路易斯酸的情况下使化合物30
与丙烯酸甲酯接触来制备。
在另一实施例中，路易斯酸是EtAlCl2。
在另一实施例中，本发明提供一种制备化合物26的方法，
其通过在包含氢气和10％Pd/C的氢化条件下接触化合物25来制备：
其中氢化反应在存在N,N-二甲基甲酰胺或丙酮的情况下发生。
在另一实施例中，氢化反应在存在丙酮的情况下发生。
在另一实施例中，本发明提供一种制备化合物24的方法，所述方法包含：
a)在包含氢气和至少8重量％的50％湿Pd/碳的氢化条件下于选自由丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃组成的群组的溶剂中于维持在高压下的高压釜内接触化合物25：
得到化合物26：
b)在存在硫酸的情况下在除去水的条件下使化合物26脱水，得到化合物27：
c)在包括-40℃到-45℃温度的选择性还原条件下使化合物27与过量三叔丁氧基氢化铝锂接触，得到化合物28：
d)在威蒂希反应条件下使化合物28与过量乙基三芳基卤化膦接触，得到化合物29：
e)在包括过量无水乙酸酐的乙酰化条件下保护化合物29的羟基，得到化合物30：
f)在存在过量二氯化C1-C2烷基铝的情况下在烷基化条件下使化合物30与过量丙烯酸甲酯接触，形成化合物31：
g)在惰性溶剂中在包括维持在高压下的高压釜的氢化条件下使化合物31与氢气和选自由：铂和无水钯/碳组成的群组的氢化催化剂接触，得到化合物32；
h)在氧化条件下在包括过量C4-C6叔烷基过氧化氢作为第一氧化剂和过量NaOCl作为共氧化剂的共氧化条件下接触溶解于惰性溶剂中的化合物32，任选地接着用微过量的氯铬酸吡啶鎓进一步氧化，得到化合物24：
i)任选地用甲醇洗涤化合物24。
在另一实施例中，
步骤a)包含丙酮作为溶剂；
步骤b)包含二氯甲烷作为溶剂；
步骤c)包含无水四氢呋喃作为溶剂，在惰性氛围下；
步骤d)的威蒂希反应条件包含于作为溶剂的无水四氢呋喃中的叔丁醇钾，在惰性氛围下；
步骤e)包含三乙胺和4-二甲基氨基吡啶；
步骤f)的二氯化C1-C2烷基铝包含于作为溶剂的无水二氯甲烷中的二氯化乙基铝，在惰性氛围下，在0-5℃下；
步骤g)的氢化催化剂包含于作为溶剂的乙酸乙酯中的无水钯/碳；和
步骤h)的C4-C6叔烷基过氧化氢包含于作为溶剂的水中的叔丁基过氧化氢，在低于5℃的温度下。
在另一实施例中，本发明提供一种制备脱氧胆酸或其盐的方法，所述方法包含：
a)在包含氢气和Pd/碳的氢化条件下使化合物24
与氢气和Pd/C接触，任选地接着在氧化条件下用氯铬酸吡啶鎓氧化在氢化反应期间形成的任何12-羟基，得到化合物33；
b)在还原条件下使化合物33与三叔烷氧基氢化铝锂反应，得到化合物34：
c)使化合物34暴露于脱除保护基和水解条件，形成脱氧胆酸或其盐。
化合物
另一方面，本发明针对一种式1或5化合物：
其中
Pg是羟基保护基；
R是氢、羟基或-OPg；
R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸，其中所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基或苯甲基酯化，和甘氨胆酸，且R2是氢，或R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基或酮基保护基；和
各R3、R4和R5独立地为C1-C3烷基。
在一些实施例中，R1选自由以下组成的群组：
其中R6是低级烷基，且波形线表示连接至类固醇骨架的17-位的连接点。
在一些实施例中，R1是胆汁酸的17-侧链，所述胆汁酸选自由以下组成的群组：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和甘氨胆酸。在一些实施例中，所述侧链的羧基官能团任选地经C1-C6烷基(例如甲基、乙基或叔丁基)酯化。
在一些实施例中，R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基。
在一些实施例中，R1和R2连同其所连接的碳原子一起形成酮基保护基，例如：
其中n为1、2或3，且波形线表示连接至分子其余部分的连接点。
在一些实施例中，式1化合物是化合物41：
在一些实施例中，式1化合物选自由以下组成的群组：化合物42、43、44、45或46：
在一些实施例中，式5化合物是化合物47：
在一些实施例中，式5化合物选自由以下组成的群组：化合物48、49、50、51或52：
在一些实施例中，式6化合物选自由以下组成的群组：化合物48a、49a、50a、51a或52a：
D.由化合物53合成DCA
在另一实施例中，提供一种制备脱氧胆酸(DCA)或其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含：
(1)使式53化合物
与还原剂反应形成式54化合物，其中Pg是保护基且R是烷基
(2)使式54化合物暴露于脱除保护基和水解条件，形成脱氧胆酸或其医药学上可接受的盐。
在一些实施例中，Pg是-C(O)R1，其中R1是低级烷基。在一些实施例中，Pg是-C(O)CH3。在一些实施例中，水解条件包含碱金属氢氧化物、碱金属烷醇盐或其混合物。在一些实施例中，碱金属氢氧化物是LiOH或NaOH。
在一些实施例中，式53化合物是式33化合物，其为3α-乙酰氧基-5β-胆烷-12-酮-24-酸甲酯：
且式54化合物是式34化合物，其为3α-乙酰氧基-12α-羟基-5β-胆烷-24-酸甲酯：
在一些实施例中，本发明提供一种制备式26化合物的方法，其为9α-羟基-5β-雄烷-3,17-二酮：
所述方法包含在氢化条件下使9α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮120
与H2反应形成9α-羟基-5β-雄烷-3,17-二酮。
在一些实施例中，氢化条件包含溶剂，所述溶剂是DMF、丙酮、乙酸乙酯等。
在一些实施例中，本发明提供一种制备式27化合物的方法，式27化合物为5β-雄-9(11)-烯-3,17-二酮：
所述方法包含使式26化合物
与酸反应，形成式27化合物。
在一些实施例中，本发明提供一种制备式29化合物的方法，式29化合物为(Z)-3α-羟基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯：
且所述方法包含在烯烃形成条件下使式28化合物
与双碳烯化试剂反应，形成(Z)-3α-羟基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯。
在一些实施例中，式28化合物通过使式27化合物
与还原剂反应形成式28化合物来制备。
在一些实施例中，本发明提供一种制备式18化合物的方法：
所述方法包含使式29化合物
转化成式18化合物，其中Pg是保护基。
在一些实施例中，Pg是-C(O)R1，其中R1是低级烷基。在一些实施例中，Pg是-C(O)CH3。
在一些实施例中，式18化合物是式30化合物，其为(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯：
其中所述方法包含使式55化合物暴露于酰化条件，形成(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯。
在一些实施例中，本发明提供一种制备式19化合物的方法：
其中R是烷基，Pg是保护基，且虚线是单键或双键，所述方法包含在存在路易斯酸的情况下使式18化合物
与丙炔酸烷酯CH≡CC(O)OR或丙烯酸烷酯CH2＝CHC(O)OR反应，形成式19化合物。
在一些实施例中，Pg是-C(O)R1，其中R1是低级烷基。在一些实施例中，Pg是-C(O)CH3。在一些实施例中，Pg是CH3C(O)，且R是CH3。
在一些实施例中，式19化合物是式31化合物，其为3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11),16-二烯-24-酸甲酯：
且其中所述方法包含在存在路易斯酸的情况下使式30化合物
与CH2CHC(O)OCH3反应，形成3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11),16-二烯-24-酸甲酯。在一些实施例中，本发明提供一种制备式21化合物的方法：
其中Pg是保护基，且R是烷基，所述方法包含使式20化合物
与氧化剂反应形成式21化合物。
在一些实施例中，式20化合物通过在氢化条件下使式19化合物
与H2反应形成式20化合物来制备，其中虚线是单键或双键。
在一些实施例中，式21化合物是式24化合物，其为3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11)-烯-12-酮-24-酸甲酯：
且所述方法包含使式56化合物
与氧化剂反应形成式24化合物。
在一些实施例中，本发明提供一种制备式53化合物的方法：
其中Pg是保护基，且R是烷基，所述方法包含在氢化条件下使式57化合物
与H2反应形成式53化合物。
在一些实施例中，Pg是-C(O)R1，其中R1是低级烷基。在一些实施例中，Pg是-C(O)CH3。
在一些实施例中，式53化合物是式33化合物，其为3α-乙酰氧基-5β-胆烷-12-酮-24-酸甲酯：
且所述方法包含在氢化条件下使式58化合物
与H2反应，形成3α-乙酰氧基-5β-胆烷-12-酮-24-酸甲酯。
在一些实施例中，所述方法包含
(a)在氢化条件下使式21化合物
与H2反应形成式53化合物与式59化合物的混合物：
(b)使式53化合物与式59化合物的混合物与氧化剂在一定条件下接触，形成式57化合物与式53化合物的混合物，和
(c)在氢化条件下使式57化合物与式53化合物的混合物与H2接触，形成式53化合物。
在一些实施例中，氧化剂是氯铬酸吡啶鎓。
优选实施例的化合物可由可容易地获得的起始材料使用以下一般方法和程序制备。应了解，除非另有说明，否则当给定典型或优选工艺条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)时，也可使用其它工艺条件。虽然最佳反应条件可随所使用的特定反应物或溶剂而变化，但所述条件可由所属领域的技术人员通过常规优化程序确定。
另外，如所属领域的技术人员显而易见，可能必需常规保护基以防止某些官能团经受不想要的反应。适于各种官能团的保护基以及适于保护特定官能团与脱除特定官能团保护基的条件为所属领域所熟知。举例来说，若干保护基描述于T.W.格林尼(T.W.Greene)和G.M.乌兹(G.M.Wuts),有机合成中的保护基(Protecting Groups in OrganicSynthesis),第3版,威利公司(Wiley),纽约(New York),1999和其中所引用的参考文献中。
本文所述反应的起始材料和试剂一般是已知化合物，或可由已知程序或其明显变体来制备。举例来说，可从以下商品供应商处获得许多起始材料和试剂：例如阿尔德里奇化学公司(Aldrich Chemical Co.)(美国威斯康星州密尔沃基(Milwaukee,Wisconsin,USA))、巴赫姆(Bachem)(美国加利福尼亚州托兰斯(Torrance,California,USA))、艾马卡化学(Emka-Chem)或西格玛(Sigma)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,Missouri,USA))。其它可由以下标准参考书中描述的程序或其明显变体来制备：例如菲泽(Fieser)和菲泽(Fieser),有机合成的试剂(Reagents for Organic Synthesis),第1-15卷(约翰威利父子公司(John Wiley and Sons),1991)；罗德(Rodd),碳化合物的化学(Chemistry of CarbonCompounds),第1-5卷和增刊(爱思唯尔科学出版社(Elsevier Science Publishers),1989),有机反应(Organic Reactions),第1-40卷(约翰威利父子公司,1991)；玛曲(March),先进有机化学(Advanced Organic Chemistry),(约翰威利父子公司,第4版)；和拉罗克(Larock),综合有机转变(Comprehensive Organic Transformations)(VCH出版社公司(VCH Publishers Inc.),1989)。举例来说，氢化可的松可由可的松使用常规还原技术制备。
优选实施例的各种起始材料、中间体和化合物适当时可使用常规技术分离和纯化，这些技术例如沉淀、过滤、结晶、蒸发、蒸馏和色谱。这些化合物的表征可使用常规方法进行，例如利用熔点、质谱、核磁共振和各种其它光谱分析。
方法学
本发明的纯化方法采用纯度为约95％或小于95％且在一些情况下纯度为约80％或小于80％的脱氧胆酸(DCA)。这些方法使这些DCA组合物的纯度增加到至少约96％或至少99％。
在一方面，本发明提供一种纯化脱氧胆酸(DCA)得到纯度大于96％或为至少99％的DCA的方法。在一个实施例中，所述方法包含：
(a)使纯度为约95％或小于95％的DCA与包含二氯甲烷的溶剂在一定条件下接触，形成DCA溶液；
(b)使DCA从得自步骤(a)的DCA溶液中结晶，得到含有结晶DCA的溶液；
(c)回收结晶DCA和去除足量二氯甲烷以使得回收的结晶DCA的纯度大于96％。
在一些实施例中，本发明提供一种纯化脱氧胆酸(DCA)得到纯度大于96％或为至少99％的DCA的方法。在一个实施例中，所述方法包含：
(a)使纯度为约95％或小于95％的DCA与包含二氯甲烷和甲醇的溶剂在一定条件下接触，形成DCA溶液；
(b)使DCA从得自步骤(a)的DCA溶液中结晶，得到含有结晶DCA的溶液；
(c)回收结晶DCA和去除足量二氯甲烷以使得回收的结晶DCA的纯度大于96％。
在一些实施例中，重复任一上述方法。
在一个实施例中，将纯度为约95％或小于95％的DCA溶解于二氯甲烷与甲醇的混合物中。必要时，可通过加热溶剂到回流来促进溶解。此外，必要时，任何不溶解的杂质可通过过滤去除，通常在高温下过滤溶液，例如使用孔径尺寸为约5μm或小于5μm的过滤器。
本发明方法的溶剂系统中最初所用的二氯甲烷和甲醇的量最佳由约100:1至约3:1或约50:1至约4:1或约20:1至10:1的二氯甲烷与甲醇的重量比确定。
所用DCA的量相对于最初所用溶剂的总量最佳由约40:1至约10:1或约30:1至约15:1或约19:1的溶剂比DCA的比率确定。
在另一实施例中，在回流温度下添加额外的二氯甲烷。额外二氯甲烷的量在并入溶剂系统中的二氯甲烷的最初量的约20至100体积％范围内。在一些实施例中，额外二氯甲烷的量为所用二氯甲烷最初量的约30-70体积％或约50体积％。
溶解和任选过滤之后，然后通过在大气压力下共沸蒸馏去除实质上所有甲醇，留下主要包含二氯甲烷的溶液。使DCA从二氯甲烷中结晶得到纯度为至少96％或至少99％的DCA。
在一个实施例中，DCA源自哺乳动物来源，其一般可自市面上购得。
在另一实施例中，DCA合成得到。制备合成DCA的方法在本文中和以US2008-0318870A1公开的美国专利申请案第12/035,339号和以US 2009-0270642A1公开的美国专利申请案第12/153,446号中均有描述，所述申请案以全文引用的方式并入本文中。
组合物
在组合物的一个方面，本发明提供一种为合成脱氧胆酸(DCA)或其医药学上可接受的盐的化合物，其中合成DCA或其医药学上可接受的盐的纯度为至少99％。
在组合物的另一方面，本发明提供一种包含DCA和包含二氯甲烷和甲醇的溶剂的溶液，其中溶剂比DCA的浓度为40:1至约10:1，且另外其中二氯甲烷比甲醇的比率为约100:1至约3:1。
本发明还提供一种组合物，其包含纯度为至少99％的DCA或其医药学上可接受的盐和可接受的赋形剂。本发明还提供一种组合物，基本上由纯度为至少99％的DCA或其医药学上可接受的盐组成，其中DCA基本上是所述组合物的唯一脂肪去除组分。
组合物可包含本发明DCA与至少一种可接受的赋形剂或医药学上可接受的赋形剂的组合。这些赋形剂可为所属领域的技术人员通常可获得的任何固体、液体、半固体或在气雾剂组合物的情况下气态赋形剂。
固体赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油类，包括石油、植物起源油或合成起源油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载剂的实例，尤其对可注射溶液来说，包括水、生理盐水、右旋糖水溶液和二元醇。
组合物中的DCA的浓度可为约0.001至10％、0.01至5％或0.1至2％w/w、w/v或v/v。在一些实施例中，DCA的浓度可为约0.1-5％w/w或约1％w/w。在一些实施例中，脂肪溶解溶液包含多达100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.05、0.02或0.01克一种或一种以上清洁剂、胆汁酸和/或胆汁盐、脱氧胆酸或其盐或脱氧胆酸钠。
在一些实施例中，本文中的组合物不包括脂质、磷脂或磷脂酰胆碱。在一些实施例中，本文中的组合物包括至多5％w/w、w/v或v/v脂质、磷脂或磷脂酰胆碱。
在一些实施例中，组合物可进一步包含选自由以下组成的群组的第二治疗剂：抗微生物剂、血管收缩剂、抗血栓形成剂、抗凝血剂、抗抑郁剂(suds-depressant)、消炎剂、止痛剂、分散剂、抗分散剂、渗透增强剂、类固醇、镇静剂、肌肉松弛剂和抗腹泻剂。在一些实施例中，溶液处于含有多达500mL溶液的容器中。这些容器可为注射器或可装载注射器的容器。
使用方法
纯度优选为至少99％的本发明DCA或其医药上可接受的盐或组合物适用于各种医药或美容应用，例如如美国专利第7,622,130号和美国专利申请案第2005-0267080A1号和第2006-0127468A1号中所述，所述申请案以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，本发明涉及减少个体皮下脂肪沉积的方法。这些方法包含向个体的皮下脂肪沉积局部投与包含以下的组合物的步骤：(i)纯度优选为至少99％的脂肪溶解有效量的脱氧胆酸或其盐(例如脱氧胆酸钠)；(ii)医药、兽医或美容赋形剂；且其中DCA或其盐基本上是组合物的唯一脂肪去除组分。在一些实施例中，脂肪沉积从美容角度来看无吸收力，且将其去除可改善个体外观。在一些实施例中，脂肪沉积与选自由以下组成的群组的病状有关：肥胖症、脂肪再分布综合征、眼睑脂肪疝出、脂肪瘤、德尔肯氏病(Dercum'sdisease)、脂质营养不良、水牛背脂质营养不良、颈背面脂肪、内脏肥胖、乳房增大(breastenlargement)、肥胖过度、躯干和手臂周围体脂扩散和与脂肪团相关的脂肪沉积。在一些实施例中，上述方法不包括对所述个体进行外科手术。
本文所揭示的实施例的上述和其它方面可结合以下实例更透彻地理解。
实例
在说明书以下和别处的实例中，以下缩写具有所指示含义。如果缩写未定义，那么其具有公认的含义。
概要：氧和水份敏感材料的所有操作都在氩气或氮气氛围下用标准两颈火焰干燥烧瓶进行。柱色谱使用硅胶(60-120目)进行。分析薄层色谱(TLC)在默克基辛格(MerckKiesinger)60F254(0.25mm)板上进行。色斑通过UV光(254nm)或装填硫酸(5％)和对茴香醛(3％)于乙醇中的溶液来观测。
装置：质子和碳-13核磁共振谱(1H NMR和13C NMR)在瓦里安墨丘利-盖米尼200(Varian Mercury-Gemini 200)(1H NMR，200MHz；13C NMR，50MHz)或瓦里安墨丘利-伊诺瓦500(Varian Mercury-Inova 500)(1H NMR，500MHz；13C NMR，125MHz)光谱仪上记录，其中以溶剂共振作为内标物(1H NMR，CHCl3，7.26ppm或DMSO，2.5ppm和DMSO-H2O，3.33ppm；13C NMR，CDCl3，77.0ppm或DMSO，39.5ppm)。1H NMR数据如下报导：化学位移(δ，ppm)，多重性(s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，br＝宽峰，m＝多重峰)，耦合常数(Hz)和积分。红外光谱(FT-IR)在JASCO-460+型号上进行。质谱由珀金埃尔默API-2000光谱仪(Perkin ElmerAPI-2000spectrometer)使用ES+模式获得。熔点使用LAB-INDIA熔点测量装置测定且未校正。HPLC色谱使用具PDA检测器的SHIMADZU-2010型号记录。比旋度采用JASCO-1020在589nm下确定且未校正。
化学品：除非另外说明，否则市售试剂不经纯化即使用。乙醚和THF从钠/二苯甲酮中蒸馏得来。使用实验室级无水DMF、市售DCM、乙酸乙酯和己烷。
实例1
由氢化可的松合成3α-乙酰氧基-5β-雄烷-9,11-烯-17-酮(36)
步骤1
向氢化可的松(25.0g)于DMF(150mL)中的溶液中添加10％Pd/C(1.5g，6-wt％)，且所得浆液在高压釜(60psi)中在25-35℃下氢化6小时。在由TLC(30％EtOAc的DCM溶液)证明起始材料完全消失后，经(8g)床过滤粗反应混合物并用DMF(100mL)洗涤。通过在低于65℃下真空蒸馏完全去除溶剂，得到呈白色固体状的化合物15(23.0g，91.5％)。
步骤2
向化合物15(23.0g)于乙醇(350mL)和DCM(350mL)中的溶液中添加硼氢化钠(2.4g)，且在25-35℃下搅拌所得溶液3小时。此时，添加50％丙酮水溶液(200mL)以淬灭过量试剂，然后添加高碘酸钠(33.7g)。在25-35℃下搅拌所得溶液16小时。TLC显示中间体完全消失(40％EtOAc的DCM溶液)。向反应混合物中添加水(400mL)。分离各相且用DCM(600mL)萃取水层。合并有机层，然后用饱和盐水溶液(200mL)洗涤。真空蒸发溶剂，得到呈白色固体状的粗化合物16(23.0g)。在30℃下于己烷(200mL)中搅拌粗产物1小时，过滤且用己烷(50mL)洗涤，得到呈白色固体状的化合物16(19.0g，98％)。
步骤3
在25-35℃下向化合物16(19.3g)于DCM(340mL)中的溶液中添加三乙胺(12.7g)、DMAP(0.76g)和乙酸酐(12.9g)。在25-35℃下搅拌2小时后，TLC分析(60％EtOAc的己烷溶液)显示反应完全。用饱和碳酸氢钠溶液(200mL)洗涤反应混合物，接着用盐水溶液(100mL)再次洗涤。经Na2SO4(50g)干燥有机层并过滤。通过真空蒸馏浓缩滤液，得到呈灰白色固体状的化合物35(18.0g，82％)。
步骤4
在25-35℃下向化合物35(18.0g)于吡啶(100mL)中的溶液中添加亚硫酰氯(6.0mL)，且在25-35℃下搅拌所得溶液1小时。此时，由TLC(30％EtOAc的己烷溶液)确定反应完全。在低于60℃下通过真空蒸发去除吡啶。将粗物质溶解于水(100mL)与乙酸乙酯(180mL)的混合物中，且分离各相。用乙酸乙酯(180mL)萃取水相，且合并有机相。用2N HCl(100mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤合并的有机相。经无水Na2SO4(40g)干燥后，过滤混合物且通过真空蒸馏浓缩滤液到干燥，得到呈白色固体状的化合物36(15.0g，88％)。
实例2
(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯(30)：
化合物30可利用类似于实例8中所述的程序，使化合物28转化成化合物30来制备。
由化合物60制备和纯化DCA的方法和实例描述于GB2452358和2009年12月18日申请的名为“纯化脱氧胆酸的方法(METHODS FOR THE PURIFICATION OF DEOXYCHOLICACID)”的美国临时申请案61/288,132中，两者以全文引用的方式并入本文中。
实例3
DCA或其中间体制备期间分离的杂质
以下化合物在本文所述合成期间作为杂质回收：
上述化合物具有作为可再循环进入产生化合物18的反应流程中的中间体的效用。举例来说，化合物61和62可通过常规方式脱氢，得到4,5-烯化合物，而此可再氢化以在5-位达成适当立体化学。
化合物63和65的17-酮基可通过例如缩酮形成等常规方式来保护。化合物63与65的3-羟基然后可氧化形成3-酮基。对于化合物63，在4,5位处脱氢，接着氢化，将在5-位达成适当立体化学。对于化合物63与65，使3-酮基还原，接着将17-酮基脱除保护基，得到化合物18。
化合物64可在3-羟基处选择性保护且然后可氧化17-羟基，接着在3-羟基处脱除保护基，得到化合物18。
可氧化3,17二-烯丙基化合物66，得到3,17二-酮基化合物，而所述化合物可通过常规方式还原，得到3,17-二羟基化合物，例如化合物64。
可在3-位氧化化合物67，然后还原，且保护3-羟基，得到化合物18。
类似地，其余化合物可同样修饰以产生一种或一种以上用于本发明方法中的中间体。
实例4
利用本发明方法由化合物79合成化合物80
在0-5℃下，使用70％叔丁基过氧化氢((CH3)3C-O-OH)于水(35当量)中的溶液和10％次氯酸钠(NaOCl)(7.0当量；在7小时持续时间中添加)于乙酸乙酯中的溶液氧化化合物79(120.0g)。处理后，用亚硫酸钠处理有机层，接着进行PCC(1.0当量)处理，得到185g残余物。将残余物于20％甲醇水溶液(2体积)中进行浆液纯化，得到75.2g(60.6％产率)纯化合物80。
使用CrO3的由化合物79合成化合物80的比较程序
在洁净且干燥的烧瓶中，分两个批次(40g和25g)向化合物79(65g，139mmol)于AcOH(975mL)中的溶液中添加CrO3(65g，599mmol)。(注意：高度放热，需要时用冰水冷却控制温度低于50℃)。在30-35℃下加热所得混合物3小时。可使用25-35℃的较低温度。由TLC(30％EtOAc于己烷中的溶液，NMT 2％化合物79)得知反应完全后，添加异丙醇(108mL)，且在低于60℃下，在真空蒸发溶剂之前，搅拌混合物15分钟。向残余物材料中添加水(1200mL)和MTBE(650mL)。分离两相且用MTBE(2×650mL)萃取水层。用水(750mL)和盐水溶液(332mL)洗涤合并的有机层。在低于50℃下在真空下完全去除溶剂。向残余物中添加甲醇(195mL)，且在低于50℃下经由真空蒸馏完全去除溶剂。再次添加甲醇(130mL)，且冷却混合物到10-15℃，在10-15℃下搅拌1小时，过滤，且用冷(0-5℃)甲醇(65mL)洗涤滤饼。在热空气干燥器中在50-55℃下干燥白色固体直至LOD为NMT 0.5％，得到化合物80(36g，53.7％产率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.71(s,1H),4.71-4.75(m,1H),3.66(s,3H),2.37-2.42(m,3H),2.02-2.31(m,2H),2.0(s,3H),1.67-1.98(m,9H),1.24-1.56(m,9H),1.19(s,3H),1.01-1.02(d,J＝6.5Hz,3H),0.90(s,3H)。
13C NMR(500MHz,CDCl3):δ＝204.9,174.5,170.4,163.8,123.6,73.7,53.4,53.0,51.3,47.2,41.7,39.8,37.7,35.2,35.0,33.9,31.4,30.5,29.6,27.6,27.3,26.4,26.1,24.1,21.2,19.4,10.6。
质谱(m/z)＝445.0[M++1],462.0[M++18]。
IR＝3437,3045,2946,2870,1729,1680,1252,1168,1020cm-1。
m.p.＝137-139℃(来自EtOAc/己烷混合物)。
[α]D＝+93(c＝1％CHCl3溶液)。
实例5
下表显示使用CrO3或(CH3)3C-O-OH和NaOCl作为氧化剂由化合物79制备化合物80的结果。
*纯度基于化合物峰面积比总峰面积的比率
**纯度基于化合物峰面积比已知参考标准物的峰面积的比率
实例6
过氧化物化合物81的鉴别
过滤纯化合物80后，收集过滤母液(富含约30％杂质，保留时间为3.14分钟)。利用柱色谱分离3.14分钟杂质，得到100mg呈油状的纯产物。NMR和质谱数据揭露杂质是12-叔丁基过氧基化合物81，提供于图1-3中。
实例7
在室温下，用Pd/C(12wt％)、叔丁基过氧化氢(5当量)和碳酸钾(0.025当量)于二氯甲烷(10份)中处理12-叔丁基过氧基化合物81(50mg)24小时，HPLC分析揭露仍存在89％未反应的化合物12-叔丁基过氧基化合物81，且仅观察到11％化合物80。
在45-50℃下在氢气压力下，使用商业干燥10％Pd/C(25wt％)于乙酸乙酯(25份)中氢化化合物80(10.0g)18小时，得到约25％烯丙醇，在室温下用PCC(1.2当量)处理烯丙醇2小时，然后用水和盐水溶液洗涤。真空蒸馏一半有机层，然后在45-50℃下在50psi氢气压力下使用新鲜Pd/C(25wt％)再进行氢化18小时，得到9.5g化合物82(95％产率，HPLC-RI纯度为87％)。
实例8
在以下流程2中，提供一种脱氧胆酸总合成的流程。
流程2
化合物25转化成化合物26：
溶剂的选择
在这一步骤的变体中研究数种溶剂：使用上述溶剂进行以下实验，且结果制表如下。
当使用二氯甲烷、甲醇或乙酸乙酯作为化合物25氢化反应溶剂的溶剂时，观察到(通过TLC)起始材料完全消耗。产物分离和由HPLC-RI分析后，化合物26的5α-异构体与5β-异构体以约1:1比率形成。当使用丙酮作为化合物25氢化反应溶剂时，观察到(通过TLC)起始材料完全消耗。产物分离和由HPLC-RI分析后，几乎仅形成化合物26的5β-异构体，且形成少于10％的5α-异构体。因此，丙酮在这一步骤中的选择性大于90％，且产率大于85％。
向9α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮(150.0g)于丙酮(3600mL)中的溶液中添加10％Pd/C(12g，8wt％，50％湿)，且在25-25℃下于高压釜(50psi)中氢化所得浆液5小时。在由TLC(30％EtOAc的DCM溶液)证明起始材料完全消失后，经床(20g)过滤粗反应混合物并用二氯甲烷(1500mL)洗涤。真空去除滤液，且获得呈白色固体状的粗产物(145.0g)。在0℃下使此粗产物与(145.0g)丙酮(300mL)组合，搅拌1小时，然后过滤并用冷丙酮(150mL)洗涤且在50℃下真空干燥。此得到呈白色固体状的化合物26(129g，85％)。
TLC：炭化对茴香醛。化合物26的Rf＝0.48和化合物25的Rf＝0.3。洗提剂是含30％EtOAc的DCM。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝2.40-2.37(m,1H),2.11-.2.02(m,2H),1.91-1.31(m,19H),0.96(s,3H),0.84(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝221.0,95.7,80.1,47.0,43.6,38.6,38.5,37.1,35.9,33.41,32.9,32.0,27.9,26.9,21.5,20.2,20.0,12.6。
质谱(m/z)＝305.0[M++1],322.0[M++18]。
IR(KBr)＝3443,2938,1722,1449,1331,1138cm-1。
m.p＝213-216℃(丙酮)。
[α]D＝+116(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：99.0％。
化合物26转化成化合物27：
在5-10℃下在惰性氛围下，经15分钟向化合物26(121g)于DCM(1815mL)中的溶液中添加硫酸(19.1mL)。使温度上升到25-35℃，且搅拌混合物2小时。此时，确定反应完全(TLC，含30％EtOAc的DCM)。用水(600mL)洗涤混合物，然后用10％NaHCO3水溶液(600mL)洗涤。依次用水(200mL)和饱和盐水溶液(200mL)再次洗涤有机层。然后真空蒸馏溶剂，得到呈灰白色固体状的化合物27(108.2g，95％)。粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤中。
TLC：炭化对茴香醛，化合物27的Rf＝0.76和化合物25的Rf＝0.44。洗提剂是含30％EtOAc的DCM。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.61(s,1H),2.57-2.47(m,2H),2.42-2.24(m,4H),2.20-2.05(m,3H),1.99-1.86(m,2H),1.85-1.84(d,J＝6Hz 1H),1.63-1.57(m,5H),1.40-1.37(d,J＝13.5Hz,1H)1.28-1.25(dd,J＝4.0,13.5Hz,1H),1.17(s,3H)0.85(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝221.3,212.8,140.1,118.5,48.5,45.9,44.3,43.5,39.0,38.0,37.3,36.1,35.8,33.3,28.8,26.0,25.5,22.5,13.9。
质谱(m/z)＝287[M++1],304[M++18]。
IR(KBr)＝3450,2913,1737,1707,1413,1403,1207cm-1。
m.p.＝143.4-145.9℃(DCM)。
[α]D＝+142(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：96.7％。
化合物27转化成化合物30：
在-40℃至-45℃下在惰性氛围下，向化合物27(108.0g)于THF(1080mL)中的溶液中添加三叔丁氧基氢化铝锂(700mL)。在-40℃至-45℃下搅拌所得反应混合物2小时。在由TLC(含30％EtOAc的DCM)证明反应完全后，通过添加2N HCl溶液淬灭反应混合物。分离各相且用二氯甲烷(648mL)萃取所得水层。合并有机部份，且依次用水(648mL)和饱和盐水溶液(540mL)洗涤。真空蒸发有机层，得到化合物28，溶解于THF(540mL)中。
在25-35℃下在氮气下，经20分钟向溴化乙基三苯基膦(417g)于THF(216mL)中的溶液中逐滴添加叔丁醇钾(1086mL，1M THF溶液)。在相同温度下再搅拌所得暗红色反应混合物1小时。在25-35℃下，在30-40分钟内，向上述悬浮液中缓慢添加上述化合物28的溶液。再搅拌反应混合物3-5小时，使得起始材料完全消耗(由TLC证明；含30％EtOAc的DCM)。用冰水(1.080L)淬灭反应混合物。用MTBE(2×540mL)萃取水层，且用饱和盐水溶液(540mL)洗涤合并的有机萃取物，真空浓缩有机层且通过使用MTBE(2×540mL)纯化粗物质，过滤，从滤液中真空蒸馏出25％溶剂。冷却化合物29的溶液到25℃，在25-35℃下在氮气下向其中添加三乙胺(105.2mL)、DMAP(4.5g)和乙酸酐(53.5mL)。在25-35℃下搅拌2小时后，由TLC(含10％EtOAc的己烷)确定反应完全。依次用水(1080mL)和盐水溶液(324mL)洗涤反应混合物。真空浓缩有机层，得到粗化合物30(225g)，使残余物在2％甲醇水溶液中再结晶，得到85g纯化合物30(63.5％产率，HPLC-RI纯度为96％)。
TLC：炭化对茴香醛，化合物30的Rf＝0.5和化合物29的Rf＝0.15。洗提剂＝含10％EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.38(s,1H),5.20-5.18(d,J＝6.5Hz,1H),4.76-4.72(m,1H),2.40-2.35(m,3H),2.25-2.22(m,1H),2.09-2.03(m,3H),2.01(s,3H),1.98-1.49(m,10H),1.41-1.31(m,2H),1.27-1.16(m,3H),1.07(s,3H),0.79(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝170.5,150.0,140.4,119.6,114.3,74.7,53.5,42.0,41.7,39.6,38.6,35.6,35.3,33.8,31.9,29.5,27.8,26.7,26.6,25.5,21.3,16.9,13.2
质谱(m/z)＝342.9[M++1],360[M++18]。
IR(CHCl3)＝3440,3035,1730,1451,1367,1258,1028cm-1。
Mp＝93.9-97.8℃。
[α]D＝+109(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：96.0％。
化合物30经由化合物84转化成化合物32：
在0-5℃下在惰性氛围下，向化合物30(56g)于DCM(560mL)中的溶液中添加丙烯酸甲酯(35.13mL)，搅拌60分钟，冷却溶液到0-5℃，经60分钟的时间添加二氯化乙基铝(272.9mL；1.8M甲苯溶液)。温度然后上升到25-35℃，且搅拌混合物约18小时。此时，因为由TLC(含10％EtOAc的己烷)分析显示反应完全，所以将混合物倾入冰冷水(1120mL)中。分离各相且用DCM(2×255mL)萃取水层。合并有机层且依次用水(560mL)和盐水溶液(560mL)洗涤，真空蒸发有机层，得到呈油状的化合物84(66g)。
在25-35℃下，向化合物84于乙酸乙酯(550mL)中的溶液中添加Pd/C(6.7g)于乙酸乙酯(110mL)中的浆液。在约70psi氢气压力下搅拌所得浆液约16小时。由HPLC监测反应的进展。在床(25g)上过滤催化剂，且用乙酸乙酯(990mL)洗涤滤饼。真空蒸发滤液，得到呈固体状的化合物32(59g，85％)。
TLC：炭化对茴香醛，化合物32的Rf＝0.32和化合物84的Rf＝0.30。洗提剂＝含10％EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.31(s,1H),4.73(m,1H),3.66(s,3H),2.37-2.03(m,7H),2.01(s,3H),1.98-1.09(m,18H),1.06(s,3H),0.92-0.91(d,J＝6.0Hz,3H),0.59(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝174.6,170.5,139.8,119.5,74.8,56.0,53.3,51.4,41.9,41.7,40.9,38.5,36.4,35.4,35.2,33.8,31.0,30.9,29.5,28.2,27.8,26.8,26.7,25.2,21.4,17.9,11.5
质谱(m/z)＝448.2[M++18]。
IR(KBr)＝3435,3039,2941,1729,1448,1435,1252,1022cm-1。
m.p.＝122.1-123.9℃。
[α]D＝+56(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：93.0％。
化合物30经由化合物85转化成化合物32：
在0℃下在惰性氛围下向丙炔酸甲酯(13.58mL，153mmol)于DCM(100mL)中的溶液中添加二氯化乙基铝(104.5mL，192mmol，1.8M甲苯溶液)。搅拌所得溶液15分钟，然后添加化合物30(22g，64.3mmol)。在0℃下再搅拌20分钟后，温度上升到25℃且再保持18小时。此时，由TLC确定反应完全，且将混合物倾入冷(0℃)水(200mL)中。分离各相且用DCM(150mL)萃取水层。合并有机层，且依次用水(200mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤。然后经无水Na2SO4(40g)干燥并过滤。真空浓缩滤液，且通过在甲醇(280mL)中形成浆液纯化所得固体，得到呈白色固体状的化合物85(17.5g，68％)。
TLC：炭化对茴香醛，85的Rf＝0.32和30的Rf＝0.5。
TLC流动相：含10％EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝6.92-6.926(q,J＝7.5,15.5Hz,1H),5.80-5.83(d,J＝16Hz,1H),5.37-5.43(m,2H),4.73-4.75(m,1H),3.73(s,3H),3.02-3.04(t,J＝6.5Hz,1H),2.15-2.23(m,3H),2.05-2.08(m,3H),2.01(s,3H),1.48-1.99(m,8H),1.24-1.34(m,2H),1.20-1.21(d,J＝5Hz,3H),1.11-1.17(m,1H),1.07(s,3H),0.67(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝170.5,167.2,155.0,153.7,141.6,124.0,118.8,118.7,74.6,53.9,51.3,45.7,41.7,38.8,37.1,35.5,35.3,34.6,33.7,31.8,29.5,27.7,26.5,26.5,21.3,19.7,15.7。
质谱(m/z)＝444.0[M++18]。
IR(KBr)＝3443,3030,2930,1719,1650,1247,1359,1032,1170cm-1。
m.p.＝114-116℃(甲醇)
[α]D＝+102(c＝1％CHCl3溶液)。
ELSD纯度：99.7％，保留时间＝19.57(Inertsil ODS 3V 250×4.6mm，5μm)，ACN:含0.1％TFA的水(90:10)。
向化合物85(17.5g，41mmol)于EtOAc(350mL)中的溶液中添加PtO2(4.37g)，且所得浆液在帕尔装置(Parr apparatus)(70psi)中氢化14-16小时。此时，由TLC确定反应完全。经小塞过滤混合物，且真空去除溶剂，得到呈白色固体状的化合物32(17.0g，96.0％)。上述产物不经进一步纯化即用于下一步骤中。
TLC：炭化对茴香醛，32的Rf＝0.32和85的Rf＝0.30。
TLC流动相：含10％-EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.31(s,1H),4.73(m,1H),3.66(s,3H),2.03-2.37(m,7H),2.01(s,3H),1.09-1.98(m,18H),1.06(s,3H),0.91-0.92(d,J＝6.0Hz,3H),0.59(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝174.6,170.5,139.8,119.5,74.8,56.0,53.3,51.4,41.9,41.7,40.9,38.5,36.4,35.4,35.2,33.8,31.0,30.9,29.5,28.2,27.8,26.8,26.7,25.2,21.4,17.9,11.5
质谱(m/z)＝448.2[M++18]。
IR(KBr)＝3435,3039,2941,1729,1448,1435,1252,1022cm-1。
m.p.＝122.1-123.9℃(EtOAc)。
[α]D＝+56(c＝1％CHCl3溶液)
ELSD纯度：97.7％；保留时间＝14.57(ZORBAX SB C-18 150×4.6mm，5μm，ACN：含0.1％TFA的水(90:10)
化合物32转化成化合物24：
向化合物32(20g)于乙酸乙酯(200mL)中的溶液中添加70％TBHP水溶液(200mL)，冷却反应溶液到0℃，在0-5℃下缓慢添加10％次氯酸钠持续约6-7小时，在相同温度下搅拌2-3小时。由TLC(洗提剂＝含20％EtOAc的己烷)得知化合物32完全消失后，分离有机层，且用乙酸乙酯(60mL)萃取水层。用水(2×400mL)洗涤合并的有机层，接着在50-55℃下经20％亚硫酸钠溶液(220mL)处理2小时，分离两个层，在25-30℃下用氯铬酸吡啶鎓(10.9g)处理有机层6-8小时。由TLC(洗提剂＝含20％EtOAc的己烷)得知烯丙醇完全消失后，依次用热水(4×500mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤有机层。在45-50℃下真空蒸发有机层。通过在5-10℃下将所得粗物质与20％甲醇水溶液(40mL)一起搅拌1小时来纯化，过滤；用20％甲醇水溶液(20mL)洗涤滤饼，然后在45-50℃下真空干燥，得到呈浅黄色固体状的化合物24(13g)。
TLC：炭化对茴香醛，化合物24的Rf＝0.28和化合物32的Rf＝0.52。洗提剂＝含20％EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.71(s,1H),4.75-4.71(m,1H),3.66(s,3H),2.42-2.37(m,3H),2.31-2.02(m,2H),2.0(s,3H),1.98-1.67(m,9H),1.56-1.24(m,9H),1.19(s,3H),1.02-1.01(d,J＝6.5Hz,3H),0.90(s,3H)。
13C NMR(500MHz,CDCl3):δ＝204.9,174.5,170.4,163.8,123.6,73.7,53.4,53.0,51.3,47.2,41.7,39.8,37.7,35.2,35.0,33.9,31.4,30.5,29.6,27.6,27.3,26.4,26.1,24.1,21.2,19.4,10.6。
质谱(m/z)＝445.0[M++1],462.0[M++18]。
IR＝3437,3045,2946,2870,1729,1680,1252,1168,1020cm-1。
m.p.＝141-142℃。
[α]D＝+102(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：96.2％。
化合物24转化成化合物33：
添加使用含无水10％Pd/C(15wt％)的乙酸乙酯(20份)以10.0g规模对化合物24进行氢化，且施加约50psi氢气压力且使温度上升到70℃。达到温度70℃后，观察到氢气压力增加到约60psi，在这些条件下维持60小时。60小时后，仍观察到0.6％化合物24和2.75％烯丙醇，所以再搅拌12小时(观察到0.16％烯丙醇和0.05％化合物24)。处理后，反应得到9.5g残余物。
在上述条件下对25g化合物24再进行氢化反应76小时，得到24.5g残余物。
方法A
向化合物24(2.0g，4.5mmol)于EtOAc(150mL)中的溶液中添加10％Pd/C(900mg)，且在50℃下于帕尔装置(50psi)中氢化所得浆液16小时。此时，由TLC确定反应完全。经小塞过滤混合物，且真空去除溶剂，得到呈白色固体状的化合物33(1.6g，80％产率)。
TLC：炭化对茴香醛，33的Rf＝0.36和25的Rf＝0.32。
TLC流动相：含20％-EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝4.67-4.71(m,1H),3.66(s,3H),2.45-2.50(t,J＝15Hz,2H),2.22-2.40(m,1H),2.01(s,3H),1.69-1.96(m,9H),1.55(s,4H),1.25-1.50(m,8H),1.07-1.19(m,2H),1.01(s,6H),0.84-0.85(d,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝214.4,174.5,170.4,73.6,58.5,57.4,51.3,46.4,43.9,41.2,38.0,35.6,35.5,35.2,34.8,32.0,31.2,30.4,27.4,26.8,26.2,25.9,24.2,22.6,21.2,18.5,11.6
质谱(m/z)＝447.0[M++1],464.0[M++18]。
IR(KBr)＝3445,2953,2868,1731,1698,1257,1029cm-1。
m.p.＝142.2-144.4℃(EtOAc/己烷混合物)。
[α]D＝+92(c＝1％CHCl3溶液)。
ELSD纯度：96.6％；保留时间＝9.93(Inertsil ODS 3V,250×4.6mm，5μm，ACN:含0.1％TFA的水(90:10)
方法B
向化合物24(36g，81mmol)于EtOAc(720mL)中的溶液中添加10％Pd/C(9g于180mL乙酸乙酯中)浆液，且在45-50℃下用氢气(50psi)处理所得浆液16小时。(可使用总计1080mL溶剂)。此时，由HPLC(化合物24为NMT 1％)确定反应完全。经(10g)过滤混合物且用乙酸乙酯(900mL)洗涤。在低于50℃下经由真空蒸馏浓缩滤液到其体积的50％。当由HPLC(烯丙醇含量为NMT 1％)得知反应完全时，在25-35℃下向浓溶液中添加氯铬酸吡啶鎓(20.8g)，且在25-35℃下搅拌混合物2小时。
如果化合物24含量大于5％，那么可进行以下过程。经(10g)过滤反应物质且用乙酸乙酯(360mL)洗涤。依次用水(3×460mL)和饱和盐水(360mL)洗涤滤液。经硫酸钠(180g)干燥有机相，过滤且用乙酸乙酯(180mL)洗涤。在低于50℃下经由真空蒸馏将体积浓缩50％。转移溶液至洁净且干燥的高压釜中。添加10％钯/碳(9g于180mL乙酸乙酯中)浆液。用氢气加压到50psi，且在45-50℃下搅拌反应混合物16小时。
由HPLC得知化合物24完全消耗(化合物24的含量为NMT 1％)后，经(10g)过滤反应混合物且用乙酸乙酯(900mL)洗涤滤饼。在低于50℃下经由真空蒸馏浓缩溶剂到干燥。添加甲醇(150mL)且在低于50℃下经由真空蒸馏浓缩到干燥。向残余物中添加甲醇(72mL)，且在10-15℃下搅拌混合物15-20分钟，过滤且用甲醇(36mL)洗涤滤饼。在热空气干燥器中在45-50℃下干燥白色固体8小时直至LOD为NMT 1％，得到化合物33(30g，83.1％产率)。
化合物33转化成化合物34：
方法A
在周围温度下，向化合物33(2.5g，5.6mmol)于THF(25mL)中的溶液中逐滴添加三叔丁氧基氢化铝锂(1M，22.4mL，22.4mmol)的THF溶液。再搅拌4-5小时后，由TLC确定反应完全。通过添加HCl水溶液(1M，10mL)淬灭反应，且用EtOAc(30mL)稀释混合物。分离各相，且依次用水(15mL)和饱和盐水溶液(10mL)洗涤有机相。然后经无水Na2SO4(3g)干燥有机相并过滤。真空浓缩滤液且由柱色谱[29mm(W)×500mm(L)，60-120目二氧化硅，50g]以EtOAc/己烷(2:8)洗提[5mL部份，由用炭化对茴香醛的TLC监测]来纯化所得固体。合并含有产物的部份且真空浓缩，得到呈白色固体状的化合物34(2.3g，91％)。
TLC：炭化对茴香醛，34的Rf＝0.45和33的Rf＝0.55。
TLC流动相：含30％-EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝4.68-4.73(m,1H),3.98(s,1H),3.66(s,3H),2.34-2.40(m,1H),2.21-2.26(m,1H),2.01(s,3H),1.75-1.89(m,6H),1.39-1.68(m,16H),1.00-1.38(m,3H),0.96-0.97(d,J＝5.5Hz,3H),0.93(s,3H),0.68(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝174.5,170.5,74.1,72.9,51.3,48.1,47.2,46.4,41.7,35.8,34.9,34.7,34.0,33.5,32.0,30.9,30.8,28.6,27.3,26.8,26.3,25.9,23.4,22.9,21.3,17.2,12.6
质谱(m/z)＝449.0[M++1],466.0[M++18]。
IR(KBr)＝3621,2938,2866,1742,1730,1262,1162,1041cm-1。
m.p＝104.2-107.7℃(EtOAc)。
[α]D＝+56(c＝1％CHCl3溶液)。
ELSD纯度：97.0％：保留时间＝12.75(Inertsil ODS 3V,250×4.6mm，5μm，ACN:水(60:40)
方法B
在0-5℃下，经1小时向化合物33(30.0g，67mmol)于无水THF(300mL)中的溶液中添加三叔丁氧基氢化铝锂(1M，107.6mL，107.6mmol)的THF溶液。在5-10℃下再搅拌4小时后，由HPLC(化合物33为NMT 1％)确定反应完全。冷却反应到0-5℃，且通过添加4N HCl(473mL)淬灭。分离各相。用DCM(2×225mL)萃取水层，且依次用水(300mL)和饱和盐水溶液(300mL)洗涤合并的有机相。然后在低于50℃下通过真空蒸馏浓缩有机相到干燥。向残余物中添加甲醇(150mL)且在低于50℃下通过真空蒸馏浓缩到干燥。然后向残余物中添加水(450mL)，且搅拌混合物15-20分钟，过滤且用水(240mL)洗涤滤饼。在热空气干燥器中在35-40℃下干燥白色固体6小时，得到化合物34(30g，99.6％)。
化合物34转化成粗DCA：
方法A
向化合物34(500mg，1.11mmol)于THF(8mL)和MeOH(8mL)中的溶液中添加LiOH(187mg，4.4mmol)于H2O(2.0mL)中的溶液。在50℃下搅拌所得混合物3-4小时。由TLC得知起始材料完全消失后，真空浓缩反应混合物。合并水(10mL)与3N HCl(1mL)的混合物且冷却到0℃，然后添加至粗产物中。在0℃下搅拌1小时后，过滤沉淀的固体，然后用水(10mL)和己烷(20mL)洗涤。在室温下真空干燥，得到呈白色固体状的脱氧胆酸(DCA，400mg，91％产率)。
TLC：炭化对茴香醛，DCA的Rf＝0.32和2.1a的Rf＝0.82。
TLC流动相：含10％-甲醇的DCM。
1H NMR(500MHz,DMSO):δ＝11.92(s,1H),4.44(s,1H),4.19(s,1H),3.77(s,1H),3.35-3.36(m,1H),2.19-2.21(m,1H),2.08-2.10(m,1H),1.73-1.80(m,4H),1.43-1.63(m,6H),1.15-1.35(m,12H),0.98-1.05(m,2H),0.89-0.90(d,J＝6.0Hz,3H),0.83(s,3H),0.58(s,3H)。
13C NMR(125MHz,DMSO):δ＝174.8,71.0,69.9,47.4,46.1,46.0,41.6,36.3,35.6,35.1,34.9,33.8,32.9,30.8,30.7,30.2,28.6,27.1,27.0,26.1,23.5,23.0,16.9,12.4。
质谱(m/z)＝393[M+,+1]。
IR＝3363,2933,2863,1694,1453,1372,1042cm-1。
m.p.＝171.4-173.6℃(乙醇)；174-176℃(阿法埃莎(Alfa Aesar))和171-174℃(阿尔德里奇(Aldrich))
[α]D＝+47(c＝1％EtOH溶液)+54°(c＝2％乙醇溶液)[阿法埃莎(Alfa Aesar)]
ELSD纯度：99.7％:保留时间＝5.25(Inertsil ODS 3V，250×4.6mm，5μm，ACN:含0.1％TFA的水(90:10)。
方法B
在0-5℃下，向化合物34(30g，67mmol)于THF(120mL)和MeOH(120mL)中的溶液中添加NaOH(40g，270mmol)于H2O(54mL)中的20％溶液。在25-35℃下搅拌所得混合物4小时。由HPLC得知反应完全(化合物34和中间体为NMT 0.5％)后，在低于50℃下经由真空蒸馏去除溶剂。将残余物溶解于水(300mL)中且用DCM(2×150mL)洗涤。用2N HCl(约173mL)调节水层的pH值为1-2。过滤固体，用水(3L)彻底洗涤，且利用热空气干燥器在70-75℃下干燥直至水分含量少于2％，得到呈白色固体状的脱氧胆酸(DCA，26g，99％产率)。
实例9
脱氧胆酸(DCA)纯化
1.溶剂选择
研究两个溶剂系统以进一步纯化DCA：
·含10％己烷的EtOAc
·DCM
已进行以下实验且实验结果制表如下。
*将欲纯化的DCA溶解于甲醇与DCM的混合物中，然后通过共沸蒸馏去除甲醇。溶解粗DCA所需的甲醇量取决于其开始时的纯度。典型的粗物质为约75％纯，且可在回流下每克使用约20毫升10％甲醇-DCA(以体积计)溶解。在更纯的DCA下，甲醇的百分比必须增至15％。
通过在产物溶解于甲醇与DCM的混合物中之后使产物从DCM中结晶且经由常压蒸馏共沸去除甲醇达成有效纯化。
2.溶剂数量
已使用不同溶剂体积进行实验，且实验结果制表如下。
编号 批料规模(g) 溶剂数量 输出(g) 纯度(HPLC)
1 4.0 25体积 3.0 由RI检测到的HPLC纯度为99.3％
2 5.0 15体积 3.56 由RI检测到的HPLC纯度为99.3％
3 5.0 20体积 3.4 由RI检测到的HPLC纯度为99.3％
4 100 15体积 70 由RI检测到的HPLC纯度为99.3％
5 47 15体积 44 由RI检测到的HPLC纯度为99.5％
在所有溶剂含量下都获得极佳回收率和产物质量。
3.分离温度
通过改变分离温度进行以下实验且结果制表如下：
编号 批料规模(g) 温度(℃) 输出(g) 注释
1 5.0 10-15 3.0 由RI检测到的HPLC纯度为99.0％。
2 100 25-30 70 由RI检测到的HPLC纯度为99.3％。
3 47 25-30 44 由RI检测到的HPLC纯度为99.5％。
与10-15℃相比，当在25-30℃下进行分离时获得较高质量的产物。
100g规模的DCA的纯化
这一步骤的最终纯化程序如下：
编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 粗DCA 100 g 392 0.255 1.0
2 二氯甲烷 5.0 L - - 50V
3 甲醇 250 mL - - 2.5V
4 NaOH 12.23 g 40 0.3058 1.2
5 2N HCl 204 mL - - 2.04V
6 脱矿物质(D.M.)水 10 L - - 100V
将粗DCA(110g)在回流温度下溶解于含10％甲醇的DCM(2.5L)中。在回流温度下向这一澄清溶液中添加2.5L二氯甲烷，然后在大气压(反应物质上清液的GC分析揭露存在约3％甲醇)下蒸馏约3.0L溶剂。冷却反应浆液到20-25℃，然后搅拌3-4小时。过滤混合物，且用DCM(300mL)洗涤固体。在热空气烘箱中在50-55℃下干燥产物6-8小时。
向水(1.0L)中添加上述干燥的DCA，然后添加10％氢氧化钠溶液(122mL)，得到澄清溶液。经5μ滤纸过滤这一溶液。用水(2.0L)稀释滤液，且用2N HCl溶液(204mL)调节pH值至1-2。搅拌沉淀的固体1小时，过滤且再用水(7.0L)洗涤固体。在热空气烘箱中在70-75℃下干燥16-20小时后，获得呈白色固体状的纯化的DCA(约66g，由HPLCRI检测纯度大于99％)。
TLC：炭化对茴香醛，DCA的Rf＝0.32和化合物34的Rf＝0.82。
洗提剂＝含10％甲醇的DCM。
1H NMR(500MHz,DMSO):δ＝11.92(s,1H),4.44(s,1H),4.19(s,1H),3.77(s,1H),3.36-3.35(m,1H),2.21-2.19(m,1H),2.10-2.08(m,1H),1.80-1.73(m,4H),1.63-1.43(m,6H),1.35-1.15(m,12H),1.05-0.98(m,2H),0.90-0.89(d,J＝6.0Hz,3H),0.83(s,3H),0.58(s,3H)。
13C NMR(125MHz,DMSO):δ＝174.8,71.0,69.9,47.4,46.1,46.0,41.6,36.3,35.6,35.1,34.9,33.8,32.9,30.8,30.7,30.2,28.6,27.1,27.0,26.1,23.5,23.0,16.9,12.4。
质谱(m/z)＝393[M+,+1]。
IR＝3363,2933,2863,1694,1453,1372,1042,cm-1。
m.p.＝171.4-173.6℃(乙醇)；174-176℃(阿法埃莎(Alfa Aesar))和171-174℃(阿尔德里奇(Aldrich))。
脱氧胆酸(DCA)的再结晶
将上述获自方法B的DCA(26g)装入洁净且干燥的烧瓶。添加甲醇(65mL)和DCM(585mL)。加热混合物到回流，获得澄清溶液。向溶液中装入DCM(650mL)，且在大气压下蒸馏溶剂直至收集到780mL溶剂。由GC分析混合物以确定溶剂组成。如果甲醇含量大于2％，那么添加DCM(200mL)且在大气压下蒸馏直至收集到200mL馏份。(由GC检查甲醇含量)。经1-2小时冷却反应混合物到20-25℃，且在此温度下搅拌3-4小时。过滤产物，且用DCM(81mL)洗涤，在热空气干燥器中在50-55℃下干燥8小时。由HPLC确定纯度。如果单一最大杂质大于0.1％，那么重复上述过程。
将上述干燥的材料装入洁净的烧瓶中。依次添加水(190mL)和10％NaOH水溶液(3.18g于31.8mL水中)。经5μ滤纸过滤溶液，且再用水(380mL)稀释滤液。用2N HCl(53mL)调节pH值为1-2。过滤所得固体，用水(1.9L)彻底洗涤，且在热空气干燥器中在70-75℃下干燥直至水分含量低于1％，得到呈白色固体状的DCA(17g，回收％：65)。
实例10
由化合物33合成DCA和纯化DCA的替代方法
步骤1a-氢化3α-乙酰氧基-12-氧代--5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯(24)
向含24(300.0g，0.7mol)的EtOAc(7.5L，25体积)中添加干的Pd/C(75.0g，25wt％)。加热反应混合物到45℃-50℃，且加压到50psi H2。21小时后的HPLC分析指示剩余<1.0％曲线下面积(AUC)的24；形成4.6％AUC的烯丙醇杂质86和11.1％AUC的87。冷却反应混合物到30-35℃，经(300g)过滤，且用EtOAc(7.5L)洗涤以去除催化剂。浓缩所得滤液至约6L，且不经进一步操作即进行下一步(由HPLC得知，为67.8％AUC，5.5％AUC的烯丙醇杂质86和13.0％AUC的87)。
步骤1b/c-氧化烯丙醇86和87，且使24再氢化为3α-乙酰氧基-12-氧代-5β-胆烷-24-酸甲酯(33)
步骤1b-PCC氧化烯丙醇86和87
在20℃-25℃下，向上述33溶液中添加PCC(149.1g，1.03当量)于EtOAc(1.5L)中的浆液。允许反应继续进行3.5小时，其中HPLC分析显示剩余<1％AUC的烯丙醇86和<1％AUC的87。经(300g)过滤反应混合物，且用EtOAc(3.0L)洗涤。用去离子(DI)水(2×3.6L)和盐水(3.6L)洗涤EtOAc滤液，经(300g)过滤，且用EtOAc(3.0L)洗涤。浓缩所得滤液到约7.5L，且不经进一步操作即进行下一步(由HPLC得知，为77.7％AUC，含有5.3％AUC的24)。
步骤1c-使24再氢化为33
向上述含有24的粗33溶液中添加粉末状活性碳DARCO(60g，20wt％)。加热所得浆液到45℃-50℃持续4小时，冷却到30℃-35℃并经过滤。用EtOAc(7.5L)洗涤滤饼，浓缩到约7.5L，且添加到干的Pd/C(60.0g，20wt％)中。加热反应混合物到45℃-50℃，且加压到50psi H2维持6小时。HPLC分析指示剩余<1.0％AUC的24；形成1.1％AUC的86杂质和<1.0％AUC的87。认为反应完全且冷却到30℃-35℃，经过滤且用EtOAc(7.5L)洗涤。浓缩EtOAc滤液到约5体积且用MeOH(2×4.5L)共沸回到约5体积。用去离子水(2.4L)稀释所得浆液且维持在20-25℃下。过滤浆液，用去离子水(2×600mL)洗涤且在40℃-50℃下真空干燥，得到266g(88％)33(由HPLC得知，为66.2％AUC)。
步骤2-合成34
冷却33(245g，0.5mol)于THF(2.5L)中的溶液到0-5℃，且添加1M Li(t-BuO)3AlH的溶液(822.9mL，1.5当量)，同时维持温度低于5℃。在5-10℃下搅拌反应混合物22小时。在2-4小时内反应完全。HPLC分析指示反应完全，<1％的33剩余。用4M HCl(3.7L)淬灭反应，同时维持温度低于20℃。用CH2Cl2(2×2.5L)萃取反应混合物，且用去离子水(2×2.5L)洗涤合并的有机相。浓缩CH2Cl2相，得到300g(122％)34(由HPLC可知为73.5％AUC)。1H NMR分析指示剩余9.7wt％的THF和0.8wt％的CH2Cl2。
步骤3-合成DCA
在0℃-5℃下，向34(245g，0.5mol)于MeOH(980mL)和THF(475mL)中的溶液中添加NaOH(87.6g，4当量)于去离子水(438.6mL)中的溶液。使反应混合物升温到20-25℃。HPLC分析显示，1小时后反应完全，剩余<0.5％的34和<0.5％的水解中间体。用去离子水(2.5L)稀释反应且浓缩到约10体积。用CH2Cl2(2×1.3L)洗涤水溶液且使用2M HCl(1.6L)调节至pH1.7-2.0。白色浆液形成且在20℃-25℃下搅拌1小时。过滤浆液，用去离子水(7×1L)洗涤且真空干燥，得到195g(91％)DCA(由HPLC得知，为82.2％AUC)。
步骤4-DCA的纯化
加热以上所获得的DCA(190g，0.48mol)于MeOH(475mL)和CH2Cl2(4275mL)中的溶液到35℃-40℃。从混合物中蒸馏出MeOH/CH2Cl2，同时添加CH2Cl2(4740mL)以匹配蒸馏速率。由1H NMR分析溶剂组成指示相对于CH2Cl2剩余4.5mol％MeOH。冷却浆液到20℃-25℃且保持16小时。通过过滤分离固体，用CH2Cl2(600mL)洗涤，且真空干燥，得到104g(55％)DCA(由HPLC-RID得知为>99％AUC，且由HPLC-CAD得知为98.7％AUC)。
通过加热DCA(103g，0.3mol)于MeOH(359mL)和CH2Cl2(1751mL)中的混合物到35℃-40℃，重复再结晶。从混合物中蒸馏出MeOH/CH2Cl2，同时添加CH2Cl2(3760mL)以匹配蒸馏速率。由1H NMR分析溶剂组成指示相对于CH2Cl2剩余4.7mol％MeOH。使浆液冷却到20℃-25℃。1小时后，通过过滤分离固体，用CH2Cl2(309mL)洗涤且真空干燥，得到82g(79％)DCA(由HPLC-RID得知为>99％AUC且由HPLC-CAD得知为99.3％AUC)。
为评估额外纯化和再处理的作用，在正常最终水分离步骤之前使产物第三次再结晶。加热存于MeOH(240mL)和CH2Cl2(1400mL)中DCA的上述样品(80g，0.2mol)到35℃-40℃。从混合物中蒸馏出MeOH/CH2Cl2，同时添加CH2Cl2(2000mL)，匹配蒸馏速率。由1H NMR分析溶剂组成指示相对于CH2Cl2剩余6.7mol％MeOH。使浆液冷却到20℃-25℃。1小时后，通过过滤分离固体，用CH2Cl2(240mL)洗涤且真空干燥，得到72g(89％)DCA(由HPLC-CAD得知为99.7％AUC)。
将样品于去离子水(840mL)中形成浆液，且用NaOH(14.0g)于去离子水(140mL)中的溶液稀释。经过滤所得溶液且用去离子水(1.4L)洗涤。用2M HCl(约300mL)调节滤液到pH 1.6，产生白色沉淀，将其在20℃-25℃下保持1小时。通过过滤分离产物，用去离子水(9.0L)洗涤且真空干燥，得到63g(87％)DCA(由HPLC-CAD得知为99.7％AUC)。
实例11
脱氧胆酸关键起始材料化合物24的制造方法已经修改并且适用于大规模生产。制造方法是安全、经济、环境友好的且产生一致地符合规格的高质量最终产物。
制造方法涉及：
·关键起始材料(即3α-乙酰氧基-12-氧代-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯)化合物24的制备。
关键起始材料由9-α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮(9-HAD)分八个化学步骤制备。因为一些中间体未分离，所以这一部分方法对应于阶段-I至阶段-V。所有中间体的结构配置与NMR和质谱数据一致。最终方法的详细程序以及各步骤产物的光谱数据提供于方法章节中。
杂质以及其状态(分离的、已鉴别、未观察到等)的列表、原材料清单和关键方法参数的说明全部提供于报告的最后章节中。
基于方法修改和演示批示的结果，制造方法适于其预定目的。
流程1-以9α-羟基雄烯二酮为起始材料的合成流程
最终方法的修改
·所提出方法步骤的初始运行的缺点
虽然DCA的制备方法在初始运行时经由所提出途径工作十分顺利且我们能够制备多克数量的相当高纯度的合成DCA，但缺点在于关键起始材料纯度、产率和威蒂希阶段柱色谱在工厂规模上不可行，通过使用于甲醇水溶液中的结晶化方法可成功避免这些事项，烯丙基氧化反应还提高化合物24的良好产率和纯度，初始实验程序和各步骤结果如下。
对新颖方法修改的各步骤进行了修改。本章节描述这些修改研究。尝试合并步骤以使处理和分离减至最少，从而提高效率。所得方法具有总计八个阶段–五个步骤涉及制备控制性起始材料(关键起始材料，化合物24)，且三个步骤涉及其转化成DCA。还有一个额外的最终纯化阶段。
步骤1的修改研究
产物的化学名称：9α-羟基-5β-雄烷-3,17-二酮
合成流程：
步骤1的修改计划
·溶剂的选择
·溶剂数量
·反应时间
·催化剂数量
溶剂的选择
这一步骤的修改中研究以下溶剂：
·N,N-二甲基甲酰胺(DMF)
·丙酮
·丙酮水溶液
·二氯甲烷(DCM)
·甲醇(MeOH)
·乙醇(EtOH)
·异丙醇(IPA)
·正丁醇
·四氢呋喃(THF)
·甲基叔丁基醚(MTBE)
·1,4-二噁烷
·乙酸乙酯(EtOAc)
已使用上述溶剂进行以下实验，且结果制表如下。
注释:
当使用二氯甲烷、甲醇或乙酸乙酯作为25氢化反应中的溶剂时，观察到(通过TLC)起始材料完全消耗。产物分离并且由HPLC-RI分析后，化合物26的5α-异构体与5β-异构体以约1:1比率形成。
当使用丙酮作为25氢化反应中的溶剂时，观察到(通过TLC)起始材料完全消耗。产物分离并且由HPLC-RI分析后，观察到几乎仅形成化合物26的5β-异构体，且形成少于10％的5α-异构体。
结论：基于以上实验结果，选择丙酮作为优选溶剂，在这一挑战性步骤中的选择性大于90％，且产率大于85％。
溶剂数量
已用不同体积的丙酮进行反应以确定优选的溶剂数量。已进行以下实验且结果制表如下：
注释:
·产物的产率和质量在所有浓度下类似。
·产物的质量利用HPLC(RI检测)、NMR和MASS监测。
结论：因为产率和产品质量在所有浓度下基本上相同，所以选择24mL/g，因为此将最具生产力，体积较小，此外起始材料不可溶。
反应时间
已进行以下实验以确定最适合的反应时间，且结果制表如下。
样品编号 输入 时间 输出 注释
1 10g 5hr 8.63g 25完全消耗
2 10g 12hr 8.32g 25完全消耗
3 0.3g 3hr - 25未完全消耗
4 50g 5hr 43.3g 25完全消耗
结论：基于实验结果，反应时间设定为4-5小时(在25-35℃下)。
催化剂数量
为修改Pd/C数量，已进行以下实验且实验结果制表如下。各情况下所用的催化剂都是50％湿的钯/碳。
注释:
当用7wt％催化剂进行实验时，即使在5小时的反应时间后，反应亦不完全。
结论：应使用至少8重量％的催化剂以可靠地实现起始材料的完全消耗。
步骤1的最终修改的方法：
这一步骤的最终修改的方法如下：
原材料输入详情：
样品编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 9α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮 150.0 g 302 0.496 1.0
2 10％Pd/C(50％湿) 12.0 g - - 8wt％
3 丙酮 4050 mL - - 27.0V
4 二氯甲烷 1500 mL - - 15V
5 Celite 20 g - - -
实验程序：向9α-羟基雄-4-烯-3,17-二酮(150.0g)于丙酮(3600mL)中的溶液中添加10％Pd/C(12g，8wt％，50％湿)，且在25-25℃下在高压釜(50psi)中氢化所得浆液5小时。在由TLC(30％EtOAc的DCM溶液)证明起始材料完全消失后，经床(20g)过滤粗反应混合物并用二氯甲烷(1500mL)洗涤。真空去除滤液，且获得呈白色固体状的粗产物(145.0g)。在0℃下使此粗产物与(145.0g)丙酮(300mL)组合，搅拌1小时，然后过滤并用冷丙酮(150mL)洗涤且在50℃下真空干燥。此得到呈白色固体状的化合物26(129g，85％)。
TLC：炭化对茴香醛。化合物26的Rf＝0.48和化合物25的Rf＝0.3。洗提剂是含30％EtOAc的DCM。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝2.40-2.37(m,1H),2.11-.2.02(m,2H),1.91-1.31(m,19H),0.96(s,3H),0.84(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝221.0,95.7,80.1,47.0,43.6,38.6,38.5,37.1,35.9,33.41,32.9,32.0,27.9,26.9,21.5,20.2,20.0,12.6。
质谱(m/z)＝305.0[M++1],322.0[M++18]。
IR(KBr)＝3443,2938,1722,1449,1331,1138cm-1。
m.p＝213-216℃(丙酮)。
[α]D＝+116(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：99.0％。
步骤2的修改研究
产物的化学名称：5β-雄-9(11)-烯-3,17-二酮
合成流程：
步骤2的修改计划
·试剂的选择
试剂的选择
已进行以下实验且结果制表如下。
结论：选择硫酸作为用于消除的优选试剂，在酸性树脂中，反应不完全。
步骤2的最终修改的方法：
这一步骤的最终修改的方法如下：
参考实验编号：BDA-09-008-II-02
样品编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 化合物26 121 g 304 0.3979 1.0
2 硫酸 19.1 mL 98 0.3579 0.9
3 二氯甲烷 1815 mL - - 15V
4 水 800 mL - - 6.6V
5 碳酸氢钠 600 mL - - 5.0V
6 盐水溶液 200 mL - - 1.65V
实验程序：在5-10℃下在惰性氛围下，经15分钟向化合物26(121g)于DCM(1815mL)中的溶液中添加硫酸(19.1mL)。使温度上升到25-35℃，且搅拌混合物2小时。此时，确定反应完全(TLC，含30％EtOAc的DCM)。用水(600mL)洗涤混合物，然后用10％NaHCO3水溶液(600mL)洗涤。依次用水(200mL)和饱和盐水溶液(200mL)再次洗涤有机层。然后真空蒸馏溶剂，得到呈灰白色固体状的化合物27(108.2g，95％)。粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤中。
TLC：炭化对茴香醛，化合物27的Rf＝0.76和化合物25的Rf＝0.44。
洗提剂是含30％EtOAc的DCM。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.61(s,1H),2.57-2.47(m,2H),2.42-2.24(m,4H),2.20-2.05(m,3H),1.99-1.86(m,2H),1.85-1.84(d,J＝6Hz 1H),1.63-1.57(m,5H),1.40-1.37(d,J＝13.5Hz,1H)1.28-1.25(dd,J＝4.0,13.5Hz,1H),1.17(s,3H)0.85(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝221.3,212.8,140.1,118.5,48.5,45.9,44.3,43.5,39.0,38.0,37.3,36.1,35.8,33.3,28.8,26.0,25.5,22.5,13.9。
质谱(m/z)＝287[M++1],304[M++18]。
IR(KBr)＝3450,2913,1737,1707,1413,1403,1207cm-1。
m.p.＝143.4-145.9℃(DCM)。
[α]D＝+142(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：96.7％。
步骤3的修改研究
产物的化学名称：(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯(化合物30)：
合成流程：
步骤3的最终修改的方法：
这一步骤的最终修改的程序如下：
步骤3的修改计划
·溶剂数量
溶剂数量
为评估MTBE溶剂数量，已进行以下实验且结果制表如下。
结论：这一反应在每克基质12毫升溶剂下同样执行顺利。因为在12毫升/克下产量更大，所以选择此作为优选量。
纯化溶剂选择:
关于这一最终纯化，研究数个溶剂系统。其为：
·甲醇
·甲醇水溶液
·乙醇
·异丙醇
·丙酮
已进行以下实验且实验结果制表如下。
结论：通过使产物从2％甲醇水溶液中结晶达成极有效纯化、纯度和产率。
溶剂数量
已使用不同溶剂体积进行实验，且实验结果制表如下。
结论：在所有溶剂含量下都可见极佳回收率和产物质量，所以选择4体积，因为此最具生产力。
分离温度
通过改变分离温度进行以下实验且结果制表如下：
结论：在15-20℃下分离产物，得到良好质量和产率。
步骤3的最终修改的方法：
这一步骤的最终修改的程序如下：
实验程序：在-40℃至-45℃下在惰性氛围下，向化合物27(108.0g)于THF(1080mL)中的溶液中添加三叔丁氧基氢化铝锂(700mL)。在-40℃至-45℃下搅拌所得反应混合物2小时。在由TLC(含30％EtOAc的DCM)证明反应完全后，通过添加2N HCl溶液淬灭反应混合物。分离各相且用二氯甲烷(648mL)萃取所得水层。合并有机部份，且依次用水(648mL)和饱和盐水溶液(540mL)洗涤。真空蒸发有机层，得到化合物28，溶解于THF(540mL)中。
在25-35℃下在氮气下，经20分钟向溴化乙基三苯基膦(417g)于THF(216mL)中的溶液中逐滴添加叔丁醇钾(1086mL，1M THF溶液)。在相同温度下再搅拌所得暗红色反应混合物1小时。在25-35℃下，在30-40分钟内，向上述悬浮液中缓慢添加上述化合物28的溶液。再搅拌反应混合物3-5小时，使得起始材料完全消耗(由TLC证明；含30％EtOAc的DCM)。用冰水(1.080L)淬灭反应混合物。用MTBE(2×540mL)萃取水层，且用饱和盐水溶液(540mL)洗涤合并的有机萃取物，真空浓缩有机层且通过使用MTBE(2×540mL)纯化粗物质，过滤，自滤液中真空蒸馏出25％溶剂。冷却化合物29的溶液到25℃，在25-35℃下在氮气下向其中添加三乙胺(105.2mL)、DMAP(4.5g)和乙酸酐(53.5mL)。在25-35℃下搅拌2小时后，由TLC(含10％EtOAc的己烷)确定反应完全。依次用水(1080mL)和盐水溶液(324mL)洗涤反应混合物。真空浓缩有机层，得到粗化合物30(225g)，使残余物在2％甲醇水溶液中再结晶，得到85g纯化合物30(63.5％产率，HPLC-RI纯度为96％)。
TLC：炭化对茴香醛，化合物30的Rf＝0.5，且化合物29的Rf＝0.15。
洗提剂＝含10％EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.38(s,1H),5.20-5.18(d,J＝6.5Hz,1H),4.76-4.72(m,1H),2.40-2.35(m,3H),2.25-2.22(m,1H),2.09-2.03(m,3H),2.01(s,3H),1.98-1.49(m,10H),1.41-1.31(m,2H),1.27-1.16(m,3H),1.07(s,3H),0.79(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝170.5,150.0,140.4,119.6,114.3,74.7,53.5,42.0,41.7,39.6,38.6,35.6,35.3,33.8,31.9,29.5,27.8,26.7,26.6,25.5,21.3,16.9,13.2
质谱(m/z)＝342.9[M++1],360[M++18]。
IR(CHCl3)＝3440,3035,1730,1451,1367,1258,1028cm-1。
Mp＝93.9-97.8℃。
[α]D＝+109(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：96.0％。
步骤4的修改研究
产物的化学名称：3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11),16-二烯-24-酸甲酯(化合物84)。
合成流程：
步骤6的修改计划
·路易斯酸的选择
·路易斯酸数量
·催化剂选择
·催化剂数量
路易斯酸的选择
为在这一步骤中检查作为催化剂的替代性路易斯酸，已进行以下实验且结果制表如下：
路易斯酸数量：
发现二氯化乙基铝对这一步骤有效。我们研究了二氯化乙基铝的摩尔比且结果制表如下：
结论：在3.0当量二氯化乙基铝下，反应执行顺利。
催化剂选择
在这一步骤中，最初已使用氧化铂作为催化剂。钯/碳价格比较低廉，而且还是典型的氢化催化剂，所以也对其进行研究。已进行以下实验且结果制表如下：
结论：50％湿钯/碳在小规模上在乙酸乙酯介质中执行，使用商业干钯催化剂。
步骤4的最终修改方法：
这一步骤的最终修改程序如下：
样品编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 化合物30 56 g 342 0.163 1.0
2 二氯甲烷 1120 mL - - 20V
3 丙烯酸甲酯 35.13 mL 86 0.389 2.38
4 二氯化乙基铝(1.8M甲苯溶液) 272.9 mL - 0.491 3.0
5 水 1680 mL - - 30V
6 盐水溶液 560 mL - - 10V
7 甲醇 336 mL - - 6.0V
8 乙酸乙酯 1650 mL - - 29.5V
9 10％钯/碳 6.7 g - - 12wt％
10 Celite 25 g - - -
实验程序：在0-5℃下在惰性氛围下，向化合物30(56g)于DCM(560mL)中的溶液中添加丙烯酸甲酯(35.13mL)，搅拌60分钟，冷却溶液到0-5℃，经60分钟的时间添加二氯化乙基铝(272.9mL；1.8M甲苯溶液)。然后使温度上升到25-35℃，且搅拌混合物约18小时。此时，因为由TLC(含10％EtOAc的己烷)分析显示反应完全，所以将混合物倾入冰冷水(1120mL)中。分离各相且用DCM(2×255mL)萃取水层。合并有机层且依次用水(560mL)和盐水溶液(560mL)洗涤，真空蒸发有机层，得到呈油状的化合物84(66g)。
在25-35℃下，向化合物84于乙酸乙酯(550mL)中的溶液中添加Pd/C(6.7g)于乙酸乙酯(110mL)中的浆液。在约70psi氢气压力下搅拌所得浆液约16小时。由HPLC监测反应的进展。在床(25g)上过滤催化剂，且用乙酸乙酯(990mL)洗涤滤饼。真空蒸发滤液，得到呈固体状的化合物32(59g，85％)。
TLC：炭化对茴香醛，化合物32的Rf＝0.32和化合物84的Rf＝0.30。
洗提剂＝含10％EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.31(s,1H),4.73(m,1H),3.66(s,3H),2.37-2.03(m,7H),2.01(s,3H),1.98-1.09(m,18H),1.06(s,3H),0.92-0.91(d,J＝6.0Hz,3H),0.59(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝174.6,170.5,139.8,119.5,74.8,56.0,53.3,51.4,41.9,41.7,40.9,38.5,36.4,35.4,35.2,33.8,31.0,30.9,29.5,28.2,27.8,26.8,26.7,25.2,21.4,17.9,11.5
质谱(m/z)＝448.2[M++18]。
IR(KBr)＝3435,3039,2941,1729,1448,1435,1252,1022cm-1。
m.p.＝122.1-123.9℃。
[α]D＝+56(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：93.0％。
步骤5的修改研究
产物的化学名称：3α-乙酰氧基-12-氧代-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯(化合物24)
合成流程：
步骤8的修改计划
·试剂的选择
·试剂化学计量
·溶剂选择
·溶剂数量
·反应温度
·反应时间
·产物分离溶剂
·产物再结晶
试剂选择
用多种替代性氧化剂试验反应。已进行以下实验且结果制表如下。
·注解：DDHT：二溴二甲基乙内酰脲，DMP：二甲基吡唑，DMB：3,3-二甲基1-丁烯
·TBHP-叔丁基过氧化氢
还试验数个其他试剂，例如CrO3/TBHP、NaClO2/TBHP等。
结论：关于TBHP/NaOCl，应注意除三氧化铬以外的替代性氧化剂并不能执行顺利。因此，选择TBHP/NaOCl作为氧化剂。
溶剂选择
在这一步骤运行期间，使用乙酸作为溶剂。选择以下溶剂作为替代物，且比较结果。
·二氯甲烷
·乙酸乙酯
·水
·已在不同氧化条件下试验众多其它溶剂。一些其它溶剂是ACN、丙酮和AcOH，但可并入其它溶剂。
已进行以下实验且结果制表如下。
结论：与DCM相比，当使用EtOAc作为溶剂时，结果更佳。因此，选择乙酸乙酯作为优选溶剂。
溶剂数量
在这一步骤初始运行中，使用20体积的乙酸乙酯。进行以下实验以查看是否可使用较少的溶剂。结果制表如下。
结论：选择10体积溶剂作为优选量。
试剂化学计量
用较少当量的TBHP进行这一步骤的初始运行。已进行以下实验以修改这一试剂的这一量，且结果制表如下。
结论：在34当量试剂下，反应完全，但在使用较少量的两个实验中，反应不完全。因此，选择34当量作为优选量。
试剂化学计量
用较少当量的NaOCl进行这一步骤的初始运行。已进行以下实验以修改这一试剂的这一量，且结果制表如下。
结论：在7.0当量试剂下，反应完全，但在使用较少量的两个实验中，反应不完全。因此，选择7.0当量作为优选量。
反应温度
为修改反应温度，已进行以下实验且结果制表如下。
结论：反应在0℃与5℃之间的所有温度下执行，所以选择0-10℃的范围，因为预期反应在较低温度下更具选择性，且观察到产率较高。
反应时间
在初始运行期间，在0-5℃下进行反应(24小时)。为确定是否修改反应时间，进行以下实验且结果制表如下。
结论：反应似乎在0-5℃下在8小时内完成，所以选择此作为优选反应时间。
产物分离溶剂选择:
关于这一最终纯化，研究两个溶剂系统。其为：
·甲醇
·甲醇水溶液
已进行以下实验且实验结果制表如下。
结论：通过从20％甲醇水溶液中分离产物达成极有效纯化、纯度和产率。或者，使用利用硅胶和梯度溶剂系统(EtOAc/己烷)的柱纯化。
纯化溶剂选择:
关于这一最终纯化，研究两个溶剂系统。其为：
·甲醇
·甲醇水溶液
已进行以下实验且实验结果制表如下。
结论：通过使产物从13％甲醇水溶液中再结晶达成极有效纯化、纯度和产率。或者，使用利用硅胶和梯度溶剂系统(EtOAc/己烷)的柱纯化。
步骤8的最终修改的方法：
这一步骤的最终修改的程序如下。
样品编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 化合物32 20.0 g 430 0.046 1.0
2 10％次氯酸钠 220 mL 74.5 0.322 7.0
3 70％TBHP水溶液 200 mL 90 1.56 34.0
4 乙酸乙酯 300 mL - - 15V
5 氯铬酸吡啶鎓 10.9 g 215.5 0.056 1.1
6 甲醇 140 mL - - 7.0V
7 水 2000 mL - - 100V
8 盐水溶液 100 mL - - 5.0V
实验程序：向化合物32(20g)于乙酸乙酯(200mL)中的溶液中添加70％TBHP水溶液(200mL)，冷却反应溶液到0℃，在0-5℃下缓慢添加10％次氯酸钠持续约6-7小时，在相同温度下搅拌2-3小时。由TLC(洗提剂＝含20％EtOAc的己烷)得知化合物32完全消失后，分离有机层，且用乙酸乙酯(60mL)萃取水层。用水(2×400mL)洗涤合并的有机层，接着在50-55℃下经20％亚硫酸钠溶液(220mL)处理2小时，分离两个层，在25-30℃下用氯铬酸吡啶鎓(10.9g)处理有机层6-8小时。由TLC(洗提剂＝含20％EtOAc的己烷)得知烯丙醇完全消失后，依次用热水(4×500mL)和饱和盐水溶液(100mL)洗涤有机层。在45-50℃下真空蒸发有机层。通过在5-10℃下将所得粗物质与20％甲醇水溶液(40mL)一起搅拌1小时来纯化，过滤；用20％甲醇水溶液(20mL)洗涤滤饼，然后在45-50℃下真空干燥。浓缩有机层且吸收于二氧化硅(1.5当量)上。分别用7当量二氧化硅制备硅胶(己烷)柱且将所得含有产物的混合物加载于柱上。然后用己烷/EtOAc梯度混合物洗提产物，得到含有化合物24的柱部份。对各部份进行取样且测试纯度。合并所有具所要纯度的部份且真空浓缩。然后从己烷中沉淀所得混合物，然后在45-50℃下真空干燥，得到呈浅黄色固体状的化合物24(13g)。
TLC：炭化对茴香醛，化合物24的Rf＝0.28和化合物32的Rf＝0.52。洗提剂＝含20％EtOAc的己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.71(s,1H),4.75-4.71(m,1H),3.66(s,3H),2.42-2.37(m,3H),2.31-2.02(m,2H),2.0(s,3H),1.98-1.67(m,9H),1.56-1.24(m,9H),1.19(s,3H),1.02-1.01(d,J＝6.5Hz,3H),0.90(s,3H)。
13C NMR(500MHz,CDCl3):δ＝204.9,174.5,170.4,163.8,123.6,73.7,53.4,53.0,51.3,47.2,41.7,39.8,37.7,35.2,35.0,33.9,31.4,30.5,29.6,27.6,27.3,26.4,26.1,24.1,21.2,19.4,10.6。
质谱(m/z)＝445.0[M++1],462.0[M++18]。
IR＝3437,3045,2946,2870,1729,1680,1252,1168,1020cm-1。
m.p.＝141-142℃。
[α]D＝+102(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：96.2％。
流程3-由25最终合成
概述
阶段-I：9α-羟基-5β-雄烷-3,17-二酮
阶段-II：5β-雄-9(11)-烯3,17-二酮
阶段-III：(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯
阶段-IV：3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯
阶段-V：3α-乙酰氧基-12-氧代-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯
阶段-I：9α-羟基5β-雄烷-3,17-二酮
原材料：
样品编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 9α-羟基雄烯二酮(9-HAD) 100.0 g 302.4 0.330 1.0
2 10％Pd/C(湿) 8.0 g - - 8.0wt％
3 丙酮 3000 mL - - 30.0V
4 二氯甲烷 1200 mL - - 12.0V
5 Celite 20 g - - -
实验程序：
01.向洁净且干燥的高压釜中装入丙酮(2200mL)。
02.在同一高压釜中装入9-HAD(100g)。
03.在25℃(室温)下搅拌反应混合物且添加Pd/C(8.0g)于丙酮(200mL)中的浆液。
04.用氮气惰性化后，用氢气加压到60psi。
05.在25-35℃(室温)和60psi下搅拌反应混合物4-5小时。
06.由HPLC(含30％EtOAc的DCM；25为NMT 0.5％)验证完全。
07.用二氯甲烷(300mL)稀释反应混合物。
08.经床(20g)过滤且用二氯甲烷(900mL)洗涤
09.在低于45℃下经由真空蒸馏所有溶剂浓缩滤液。
10.装入丙酮(300mL)且在低于65℃下在真空下完全去除溶剂。
11.装入丙酮(200mL)且冷却到0-5℃。
12.在0-5℃下维持所得浆液2小时，然后过滤。
13.用冷(0-10℃)丙酮(100mL)洗涤湿滤饼。
14.在热空气烘箱中于45-50℃下干燥所得白色固体直至LOD为NMT 1％。
湿重：105g
干重：86g
产率：85.4％
LOD<1.0％
熔化范围：218-219.7℃
SOR：+126.4(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：99.0％。
注解：氢化反应的替代方法。
原材料：
编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 9α-羟基雄烯二酮(9-HAD) 100.0 g 302 0.331 1.0
2 10％Pd/C(干) 7.0 g - - 7.0wt％
3 N,N-二甲基甲酰胺 700 mL - - 7.0V
4 二氯甲烷 1200 mL - - 12.0V
5 丙酮 600 mL - - 6.0V
6 Celite 20 g - - -
实验程序：
15.向洁净且干燥的高压釜中装入DMF(500mL)。
16.在同一高压釜中装入9-HAD(100g)。
17.在25℃(室温)下搅拌反应混合物且添加Pd/C(7.0g)于DMF(200mL)中的浆液。
18.用氮气惰性化后，用氢气加压到60psi。
19.在25-35℃(室温)和60psi下搅拌反应混合物3小时。.
20.由TLC(含30％EtOAc的DCM；25为NMT 2％)验证完全。
21.用二氯甲烷(300mL)稀释反应混合物。
22.经床(20g)过滤且用二氯甲烷(900mL)洗涤
23.在低于65℃下经由真空蒸馏所有溶剂浓缩滤液。
24.装入丙酮(300mL)且在低于65℃下在真空下完全去除溶剂。
25.装入丙酮(200mL)且冷却到0-5℃。
26.在0-5℃下维持所得浆液2小时，然后过滤。
27.用冷(0-10℃)丙酮(100mL)洗涤湿滤饼。
28.在热空气烘箱中于45-50℃下干燥所得白色固体直至LOD为NMT 1％。
湿重：105g
干重：88g
产率：87.4％
LOD<1.0％
熔化范围：218-219.7℃
SOR：+126.4(c＝1％CHCl3溶液)
阶段-II：5β-雄-9(11)-烯-3,17-二酮
原材料：
样品编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 阶段-I产物 85.0 g 304 0.279 1.0
2 硫酸 13.5 mL 98 0.251 0.9
3 二氯甲烷 1530 mL - - 18.0V
4 己烷 340 mL - - 4V
5 水 1700 mL - - 20.0V
6 碳酸氢钠 425 mL - - 5.0V
7 饱和盐水溶液 425 mL - - 5.0V
实验程序：
01.向洁净且干燥的烧瓶中装入二氯甲烷(1275mL)和阶段-I产物。
02.冷却混合物到10℃，然后在10-15℃下经15分钟缓慢添加硫酸(13.5mL)。
03.使反应溶液温度上升到25-35℃且在25-35℃下搅拌2小时。
04.由TLC(含30％EtOAc的DCM；阶段-I产物为NMT 1％)验证完全。
05.用水(300mL)洗涤反应混合物。
06.用DCM(2×212mL)反萃取水层，然后合并有机层。
07.用饱和碳酸氢钠溶液(425mL)洗涤有机层。
08.依次用水(550mL)和盐水溶液(425mL)洗涤有机层。
07.在低于45℃下在真空下完全蒸馏出溶剂。
08.添加己烷(340mL)且在低于50℃下在真空下完全蒸馏出溶剂。
09.添加水(616mL)，在室温下搅拌15分钟，然后过滤且用水(255mL)洗涤滤饼。
10.在热空气干燥器中于55-60℃下干燥白色固体直至水分含量为NMT 0.5％。
湿重：约190g。
干重：76g
产率：95％
水分<0.5％
熔化范围：148.5-150.1℃
SOR：+144.4(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：96.0％。
阶段-III：(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕-9(11),17(20)-二烯(化合物30)
原材料：
实验程序：
01.在氮气下向洁净且干燥的烧瓶中装入无水THF(760mL)和阶段-II产物(76g)。
02.冷却到-35℃至-45℃，然后在-35℃至-45℃下经1小时添加三叔丁氧基氢化铝锂的溶液。
03.在-35℃至-45℃下搅拌所得反应混合物2-3小时。
04.由HPLC(含30％EtOAc的DCM；阶段-II产物为NMT 3％)监测反应。
05.向反应混合物中添加2N HCl溶液(474mL)，维持温度<0℃。
06.分离各层且用二氯甲烷(2×380mL)反萃取水层两次。
07.依次用水(380mL)和盐水溶液(380mL)洗涤合并的有机层。
08.在低于60℃下通过常压蒸馏完全去除溶剂。
09.检查残余物的水含量。如果其≥0.5％，那么添加DCM(156mL)且在低于60℃下再次在大气压下蒸馏。
10.将残余物溶解于无水THF(380mL)中，且在氮气氛围下保持溶液。
此为阶段IIIA产物。
11.在氮气下向洁净且干燥的烧瓶中装入溴化乙基三苯基膦(295g)和无水THF(250mL)。
12.经10分钟添加叔丁醇钾的溶液(1M THF溶液，769mL)，然后在25-35℃下搅拌所得红色溶液1小时。
13.经1/2小时添加步骤10的THF溶液，然后在25-35℃下再搅拌3小时。
14.由TLC(含30％EtOAc的DCM；阶段-IIIA产物为NMT 1％)验证完全。
15.在25-35℃下向反应混合物中添加冰水(780mL)(放热5-8℃)。
16.分离各层且用MTBE(2×380mL)反萃取水相。
17.合并有机层且依次用水(380mL)和盐水(380mL)洗涤。
18.在真空和低于50℃下完全蒸馏出溶剂。
19.添加MTBE(264mL)且在低于50℃下在真空下完全蒸馏出。
20.再添加MTBE(380mL)且在25-35℃下搅拌2小时。
21.过滤不想要的盐，用MTBE(380mL)对其进行洗涤且合并滤液。
22.在真空和低于50℃下完全蒸馏出溶剂。
23.添加新鲜MTBE(380mL)，然后在真空下完全蒸馏出。
24.再添加MTBE(380mL)且在25-35℃下搅拌2小时。
25.过滤不想要的盐，用MTBE(380mL)对其进行洗涤且合并滤液，在真空下蒸馏直至20％，添加新鲜MTBE(180mL)。
26.向洁净且干燥的烧瓶中装入滤液(760mL)阶段-IIIB产物。
27.装入DMAP(3.2g)。
28.添加三乙胺(73.8mL)。
29.在25-35℃下经15分钟缓慢添加乙酸酐(37.58mL)。
30.在25-35℃下搅拌反应混合物2-3小时。
31.由TLC(含10％EtOAc的己烷；阶段-IIIB产物为NMT 1％)验证完全。
32.用水(760mL)洗涤反应混合物，然后用MTBE(380mL)萃取水层，用饱和盐水溶液(380mL)洗涤合并的有机层。
33.在低于50℃下通过完全常压蒸馏浓缩有机层。
34.装入甲醇(152mL)且在低于50℃下在真空下完全去除溶剂。
35.装入2％甲醇水溶液(304mL)且加热到60-65℃。
36.在60-65℃下维持所得澄清溶液1小时，然后缓慢冷却到15-20℃，在相同温度下维持2小时，然后过滤。
37.用冷(10-15℃)2％甲醇水溶液(76mL)洗涤湿滤饼。
38.在热空气烘箱中于45-50℃下干燥所得白色固体直至LOD为NMT 1％。
湿重：约70g。
干重：55g
产率：63％
水分<0.5％
HPLC/RI纯度：95.0％。
阶段-IV：3α-乙酰氧基-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯
原材料：
实验程序：
01.装入二氯甲烷(1000mL)和阶段-III产物(102g)，冷却反应物质到0℃。
02.在0-5℃下经1/2小时添加丙烯酸甲酯(61mL)。
03.在0-5℃下搅拌1小时，然后在0-5℃下经1小时添加二氯化乙基铝的溶液(1.8M，甲苯溶液，496mL)。(注意：此试剂与水剧烈反应)。
04.在0-5℃下搅拌1/2小时，且使温度上升到25-35℃并搅拌16小时。
05.由TLC(含10％EtOAc的己烷；阶段-III产物为NMT 5％)验证完全。
06.在10-15分钟内将反应物质缓慢倾倒于冰水(2000mL)中并分离各相。
07.用DCM(500mL)萃取水层。
08.合并有机相，且依次用水(1000mL)和饱和碳酸氢盐溶液(1000mL)和盐水溶液(1000mL)洗涤。
09.在低于50℃下真空浓缩有机相到干燥。此为阶段IVA产物。
10.将残余物溶解于己烷(1000mL)中，穿过二氧化硅床布氏漏斗(buchnorfunnel)，用含10％乙酸乙酯的己烷(3000mL)洗涤床。
11.在低于50℃下真空收集总滤液到干燥。此为阶段IVA产物。
12.卸载烧瓶后，用含40％甲醇的乙酸乙酯(800mL)清洗，且保存此清洗液以用于下一步骤。
13.向干燥的高压釜中装入存于上述含40％甲醇的乙酸乙酯清洗液(200mL)中的阶段IVA产物。
14.装入10％钯/碳(12g于200mL乙酸乙酯中)浆液。
15.用氢气(70psi)加压，且在25-35℃下搅拌混合物16小时。
16.由HPLC(阶段IVA产物为NMT 1％)验证完全。
17.经(30g)过滤反应混合物且用乙酸乙酯(1000mL)洗涤滤饼。
18.在低于60℃下经由真空蒸馏浓缩滤液到干燥。
19.添加甲醇(200mL)且在低于60℃下经由真空蒸馏浓缩到干燥。
20.添加3％甲醇水溶液(300mL)，在0-5℃下搅拌15分钟，过滤且用3％甲醇水溶液(100mL)洗涤滤饼。
21.在热空气干燥器中于50-55℃下干燥白色固体直至水分含量为NMT 0.5％。
湿重：约80g
干重：60g
产率：85％
水分<0.5％
熔化范围：131.7-133.1℃
SOR：+57.4(c＝1％CHCl3溶液)。
HPLC/RI纯度：93.0％。
阶段-V：3α-乙酰氧基-12-氧代-5β-胆-9(11)-烯-24-酸甲酯
原材料：
样品编号 原材料 数量 单位 分子量 摩尔数 摩尔比
1 IV阶段产物 60 g 430 0.139 1.0
2 70％TBHP水溶液 610 mL 99.99 5.06 34.0
3 10％次氯酸钠 660 mL 74.5 1.036 7.0
4 氯铬酸吡啶鎓 32.8 g 215 0.1636 1.1
5 乙酸乙酯 900 mL - - 15V
6 20％甲醇水溶液批次1和2 210 mL - - 3.5V
7 20％亚硫酸钠 600 mL - - 10V
8 甲醇批次1 240 mL - - 4.0V
9 水 6000 mL - - 100V
10 饱和盐水溶液 300 mL - - 5.0V
11 甲醇批次2 383 mL - - 6.4V
12 水 57 mL - - 0.95V
13 13％甲醇水溶液 40 mL - - 0.66V
实验程序：
01.向洁净且干燥的烧瓶中装入乙酸乙酯(600mL)和阶段-IV产物(60g)。
02.在25-35℃下搅拌10分钟。
03.在25-35℃下添加70％TBHP水溶液(610mL)，然后在0-5℃下冷却。
04.在0-5℃下经7小时添加10％次氯酸钠(660mL)。
05.在0-5℃下搅拌反应混合物3小时。
06.由HPLC-RI(含20％EtOAc的己烷；阶段IV产物为NMT 1％)验证完全。
07.分离有机层，用乙酸乙酯(300mL)萃取水层。
08.用水(2×600mL)洗涤合并的有机层。
09.装入乙酸乙酯层和20％亚硫酸钠水溶液(600mL)，在55℃下维持2小时。
10.分离有机层，用水(2×600mL)洗涤。
11.向R.B.烧瓶中装入有机层，在25-30℃下装入PCC(32.8g)。
12.在25-30℃下搅拌反应混合物6-8小时。
13.由HPLC-RI(含20％EtOAc的己烷；烯丙醇为NMT 2％)验证完全。
14.装入脱矿物质水(1200mL)且搅拌15分钟，分离有机层。
15.用脱矿物质水(3×600mL)和盐水溶液(300mL)洗涤有机层。
16.在低于50℃下在真空蒸馏下完全去除溶剂。
17.添加甲醇(240mL)且在低于50℃下经由真空蒸馏完全去除溶剂。
18.添加20％甲醇水溶液(180mL)，然后冷却到0-5℃。
19.在0-5℃下搅拌2小时，过滤且用冷(0-5℃)20％甲醇水溶液(30mL)洗涤滤饼。
20.在热空气干燥器中于50-55℃下干燥固体8小时，粗重量为约38g。
21.向新鲜且干燥的RBF中装入粗38g阶段-V材料
22.装入甲醇383mL。
23.使反应物质回流，得到澄清溶液。
24.在回流下逐滴添加脱矿物质水57mL，且继续回流30分钟(观察到固体沉淀)。
25.缓慢冷却反应物质到20-25℃，然后冷却到10-15℃，且搅拌1小时。
26.过滤，吸干且用13％甲醇水溶液(40mL)洗涤。
27.在热空气烘箱中于60-65℃下干燥化合物直至LOD：<0.5％。
湿重：38g。
干重：32g。
产率：51.6％。
熔化范围：142-143.1℃。
SOR：+102.4(c＝1％丙酮溶液)。
HPLC/RI纯度：94.0％。
05.原材料和溶剂清单
以下原材料和溶剂的清单是基于上述方法的详情。
06.关键参数
在方法修改期间，鉴别以下步骤作为关键参数，其可显示对质量或产率的显著影响。
阶段III
操作：在-40℃至-45℃下，在氮气氛围下向化合物中添加三叔丁氧基氢化铝锂溶液。
解释：
对还原剂三叔丁氧基氢化铝锂的化学计量的控制对这一步骤的有利结果至关重要。如果使用太少还原剂，那么反应将不完全。如果使用太多，那么将形成更多副产物化合物83。
因为还原剂易湿，所以对化学计量的控制更具挑战性。因此，重要的是使用无水溶剂和在氮气氛围下进行反应。如果反应受水分污染，那么将淬灭一部分三叔丁氧基氢化铝锂。
操作：在25-35℃下，在氮气氛围下向化合物中添加叔丁醇钾溶液。
解释：
此反应需要强碱。叔丁醇钾是足够强的碱且执行顺利。如果暴露于水，那么碱被淬灭且改为形成氢氧化钾，而氢氧化钾不为足以引起所要反应的强碱。为此，重要的是使用无水溶剂且在氮气氛围下进行此反应。
阶段IV
操作：
在0至5℃下，在氮气氛围下添加二氯化乙基铝溶液。
解释：
二氯化乙基铝对此反应来说是独特良好的催化剂。虽然已试验其它价格比较低廉的催化剂，但反应在这些催化剂下执行不顺利。水将与二氯化乙基铝反应且破坏其催化此反应的能力。为此，重要的是此反应使用无水溶剂和氮气氛围。如果反应暴露于即使少量的水，那么反应也不能执行。
阶段V
操作：
次氯酸钠的添加应需要6-7小时，温度必须控制在低于5℃。
说明：
高于5℃的温度在此反应中产生较差的结果，且在次氯酸钠添加期间温度可能上升超过此极限。因此，重要的是以足够缓慢以便仍能对温度和时间进行充分控制的速率添加次氯酸钠。此在大规模上可证明为甚至更大的问题。
07.清洁程序
已对脱氧胆酸中间体进行研究以建立清洁程序。推断，脱氧胆酸中间体易溶于二氯甲烷中，接着易溶于水和甲醇中。
08.DCA-中间体中的杂质：
在工艺过程开发过程期间，分离并鉴别了许多杂质，或在一些情况下单独地合成可凝杂质。这些化合物以及就各化合物所获得的数据的清单列于下表中。
实例12
如流程2中所示由化合物24合成脱氧胆酸的制造方法适用于大规模生产。制造方法是安全、经济、环境友好的且产生一致地符合规格的高质量最终产物。
化合物33的制备
化合物33在40克规模上形成。依次向10.0g(25wt％)干的10％钯/碳(Pd/C)中添加化合物24(40.0g，90.0mmol，由HPLC得知为98.2％AUC)和600mL乙酸乙酯(EtOAc)。使反应混合物加压到60psi氢气(H2)，且在70℃下反应。13小时后的HPLC分析指示由HPLC得知<1％AUC的化合物24剩余，形成<1％AUC的烯丙醇和形成14.5％AUC的化合物24 34的非对映异构体。认为反应完全，冷却到30-35℃，且经Celite过滤。用EtOAc(400mL)洗涤Celite滤饼，且浓缩所得滤液到约25体积，且不经进一步操作即用于下一步。
使用上述化合物33于EtOAc(25体积)中的样品进行PCC氧化。向化合物33(90.0mmol)于EtOAc(25体积)中的样品中添加PCC(19.4g，1.0当量，阿尔德里奇(Aldrich)批号S37874-058)。将反应混合物在20-25℃下维持25小时。HPLC分析指示化合物34的非对映异构体为1.1％AUC。认为反应混合物完全，用去离子水(400mL)稀释并经Celite过滤。用EtOAc(2×200mL)洗涤滤饼。用去离子水(2×400mL)洗涤所得滤液，且经DARCOKB-G(8.0g)处理。加热混合物到45-50℃后维持4小时，然后冷却到20-25℃。经Celite过滤浆液且用EtOAc(2×200mL)洗涤滤饼。浓缩EtOAc滤液到约5体积且用MeOH(2×600mL)共沸回到约5体积。利用1H NMR分析所得浆液，指示6.4mol％EtOAc剩余。用去离子水(320mL)稀释浆液且维持在20-25℃下1小时。过滤浆液，用去离子水(2×200mL)洗涤且在35℃-45℃下真空干燥，得到27.4g(68％)化合物33(由HPLC得知，为97.9％AUC，含有0.8％AUC的化合物34的非对映异构体)。KF分析指示水为0.02wt％。低于预期产率很可能归因于沉淀期间存在的高含量EtOAc。
化合物34的制备
将上述化合物33的样品的10克部分用于在以下分离条件下实施的化合物34的形成。在4-6℃下，向化合物33(10.0g，22.4mmol)于60mL四氢呋喃(THF)中的溶液中添加33.6mL(1.5当量，阿尔德里奇批号00419TH)1M三叔丁氧基氢化铝锂(Li(t-BuO)3AlH)的THF溶液，维持温度低于6℃。18小时后的HPLC分析指示<1％AUC的化合物33剩余，并且形成5.5％AUC的化合物34的非对映异构体。认为反应完全，且用4M HCl(150mL)淬灭，维持温度低于20℃。用庚烷(2×100mL)萃取反应混合物。用1M HCl(100mL)和去离子水(2×100mL)洗涤合并的有机相。蒸馏澄清溶液减至约10体积，且用庚烷(2×100mL)共沸减至约10体积。观察到一些积垢，且用庚烷(100mL)和MTBE(2.5mL)稀释样品。然后在70-75℃下加热样品以溶解且当固体沉淀时，经1小时的时间逐步冷却降至约52℃。将稀浆液在52℃下保持1小时，48℃保持1小时和42℃保持1小时，之后切断热且缓慢冷却浆液至20-25℃过夜。过滤浆液，用庚烷(2×25mL)洗涤且在35℃-45℃下真空干燥，得到6.8g(68％)呈白色固体状的化合物34(96.0％AUC，含有2.8％AUC的化合物34的非对映异构体)。过滤后在烧瓶中观察到一些积垢。将固体溶解于CH2Cl2中，且浓缩，得到1.3g(13％)化合物34(96.5％AUC，含有1.9％AUC的化合物34的非对映异构体)。浓缩母液和洗涤液，得到1.6g(16％)化合物34。
由于沉淀所得低于预期产率，所以使用100％庚烷代替1.25％MTBE/庚烷重复所述程序。用庚烷(200mL)稀释化合物34的样品(10g，22.4mmol，由HPLC得知为93.4％AUC)，且在80-85℃下加热以溶解。当固体沉淀时，经1小时的时间缓慢冷却溶液到约65℃。将稀浆液保持在65℃下1小时，且以5℃增量经2小时的时间冷却到30℃。在30℃下过滤浆液，用庚烷(2×25mL)洗涤且在35-45℃下真空干燥，得到7.5g(75％回收率)呈白色固体状的化合物34(95.7％AUC，含有0.1％AUC的化合物34的非对映异构体)。过滤后在烧瓶中观察到一些积垢。对反应器清洗液和母液进行HPLC分析
粗DCA的制备
用2-MeTHF(2×340mL)洗涤粗DCA水溶液的样品(340mL)。利用HPLC分析水相，指示0.1％AUC的RRT＝1.12的不明杂质。用2-MeTHF(340mL)稀释水相且使用4M HCl(60mL)调节至pH＝1.7-2.0。分离各相且用去离子水(2×400mL)洗涤2-MeTHF相。浓缩2-MeTHF相到约5体积且用庚烷(3×320mL)共沸回到约5体积。利用1H NMR分析5体积浆液，指示相对于庚烷，2.0mol％2-MeTHF剩余。用庚烷(320mL)稀释浆液且在20-25℃下保持1小时。过滤浆液，用庚烷(2×150mL)洗涤且在35-45℃下真空干燥，得到24.2g(96％)粗DCA(95.7％AUC，含有0.4％AUC的粗DCA的非对映异构体、1.8％AUC的RRT＝0.5的不明杂质和0.04％AUC的RRT＝1.12的不明杂质，)
DCA的制备
在2.0g下尝试粗DCA的一系列浆液纯化以评估纯度和回收率。用25体积的MeOH/CH2Cl2(参看表1)稀释粗DCA的样品(2.0g，5.1mmol)，且将所得浆液在特定温度(参看表1)下保持1小时。使浆液冷却到特定温度(参看表1)并过滤。用CH2Cl2(2×3体积)洗涤滤饼且在35-40℃下真空干燥过夜，得到DCA(参看表1)。结果概述于下表1中。
表1：DCA的结果
条目1-3的结果指示，在20-25℃下用1mol％MeOH进行浆液纯化得到较佳回收率和与在35-37℃下用2mol％MeOH进行浆液纯化的类似的结果。利用1H NMR分析DCA的样品，指示干燥后存在<1wt％的CH2Cl2。

Claims (3)

1.一种医药组合物，其包含DCA：
及12-βDCA
其中由HPLC AUC所确定所述12-βDCA为所述DCA及所述12-βDCA的总量的小于5.5％。
2.一种医药组合物在制备用于脂肪去除的药物的用途，所述医药组合物包含DCA
及12-βDCA
其中由HPLC AUC所确定所述12-βDCA为所述DCA及所述12-βDCA的总量的小于5.5％。
3.一种用于脂肪去除的医药组合物，所述医药组合物包含DCA：
及
其中由HPLC AUC所确定所述12-βDCA为所述DCA及所述12-βDCA的总量的小于5.5％。
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