CN106892979A

CN106892979A - 一种全人源抗h7n9病毒的中和抗体

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Publication number: CN106892979A
Application number: CN201710231198.8A
Authority: CN
Inventors: 朱凤才; 张黎; 李靖欣; 孟繁岳; 胡月梅
Original assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Current assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2017-06-27
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: CN106892979B

Abstract

本发明公开了一种全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，本发明的中和抗体能特异性与H7N9病病毒结合并且可以有效中和病毒活性。本发明的抗体可以用于H7N9病毒的预防和治疗以及H7N9病毒检测，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

一种全人源抗H7N9病毒的中和抗体

技术领域

本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种全人源的单克隆抗体，尤其涉及一种全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体。另外，本发明还涉及该中和抗体的制备方法和用途。

背景技术

H7N9病毒属于正粘病毒科，单股负链有包膜的分节段的RNA病毒，基因组分为8个节段。病毒呈球形，大小约100nm，由衣壳和包膜组成。8个病毒RNA节段被NP覆盖形成螺旋对称的病毒衣壳，包膜来自于宿主细胞膜，表面嵌有HA与NA的蛋白质刺突。HA是以三聚体形式嵌合在包膜表面，是流感病毒的最主要抗原成分，能够凝集红细胞，并且是主要的保护性抗原，目前发现的H7N9病毒中和性抗体绝大部分是针对HA蛋白的。NA主要参与病毒的芽生释放，并可促进病毒的扩散，同时NA关键位点的突变与病毒耐药性相关。HA和NA的抗原结构很不稳定，在自然流行和宿主免疫压力下很容易发生突变获得新的生物学活性或者变成新的亚型。H7N9病毒之前一直只在禽类流行，并且在禽中症状不明显，一直未被重视。

2013年3月，在我国出现了世界上首例人感染H7N9禽流感病毒的病例。目前经实验室确诊的病例报告范围覆盖我国大陆地区的13个省、市/直辖市以及香港特别行政区和台湾。作为一种新发的具有人感染性的禽流感病毒亚型，H7N9禽流感病毒以其对人类的高致病性，高病死率，以及远高于H5N1禽流感病毒的感染率而引起全球广泛关注。由于H7N9禽流感病毒过去只在禽类传播，从未感染过人类，因此对于这种新病毒几乎所有的人都没有保护性抗体。当前H7N9禽流感病例主要呈散发状态，大部分有明确的活禽接触史，少数无明确的暴露原因。自2013年发现以来，H7N9病毒已在中国引发5波疫情流行，特别是2016年10月至2017年2月的第5波流行，已经检测到H7N9病毒发生了显著的变异，包括HA的抗原性突变，NA的耐药性突变和HA蛋白切割位点的改变。随着H7N9病毒在人间的流行，病毒变异以便更适应对哺乳类动物，同时致病性逐渐加强，并可能获得人与人之间传播的能力，这将会引发世界范围内的H7N9禽流感病毒暴发流行。

人感染H7N9禽流感后潜伏期约为7天，患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰，部分病例快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤直至死亡。与普通的季节性流感相比，H7N9禽流感病毒感染人体后，机体保护性抗体水平较低。部分病人可以在病毒感染后2周左右其外周血检测到中等水平的H7N9中和抗体。这种相对较弱的中和抗体水平可能与H7N9禽流感病毒的致病机理有关，预示着感染的病情更重，病程更长。此外，H7的抗原性与季节性流感的H1和H3抗原的交叉性非常低，机体内的H1和H3的中和抗体无法保护H7N9禽流感病毒的感染。因此，寻找具有中和作用的特异表位对发展有效的疫苗和抗体等药物具有至关重要的意义。

目前尚无针对H7N9禽流感病毒的特异性的治疗药物和疫苗上市。抗流感病毒药物奥司他韦对治疗H7N9禽流感的作用褒贬不一，其治疗效果可能与用药时间及病情轻重有关。H7N9禽流感病毒的疫苗的研发受抗原免疫原性较低、受试者接种疫苗后产生保护性免疫反应所需的时间长以及疾病散发的流行状态的影响，疫苗的保护效果和成本效益可能都不尽理想。在这样的情况下，被动免疫可能是目前有效预防和治疗人感染H7N9禽流感病毒的有效策略。在过去的研究中，针对流感病毒的单克隆中和抗体在动物实验中显示出良好的治疗作用和预防保护作用。目前国内外针对H7N9流感的单克隆中和抗体研究多为鼠源性的单克隆抗体，由于鼠蛋白的免疫反应限制了这种鼠源性的单克隆抗体的临床应用。采用基因工程技术对鼠源性的单克隆抗体进行人源化改造的人源化抗体虽然是目前单克隆抗体制品市场的主宰，但由于其仍保留鼠源的可变区序列，再加上人源化过程复杂并且结果不可控制，其发展前景也不为乐观。

发明内容

为了弥补现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种用于诊断和/或治疗的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体，具有高效和安全的特点。

本发明的目的之二在于提供上述抗体的重链、轻链或其片段。

本发明的目的之三在于提供编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或其片段，以及并入这些核酸分子以用于重组表达上述抗体的表达载体和宿主细胞。

本发明的目的之四在于提供上述抗体的制备方法和用途。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

重链CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR1具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

优选地，重链CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQID NO:8所示的氨基酸序列。

具有上述优选序列的本发明的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体命名为mAb635。

进一步，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体结合性质和中和性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。

本发明的抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与mAb635抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。

进一步，所述抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。

Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

Fab’是指包含了部分铰链区的Fab片段。

F(ab’)2指的是Fab’的二聚体。

Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

本发明的公开的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。

本发明的抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。

本发明的抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(PEG)集团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与PEG反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。

本发明还提供了编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子，所述核酸分子包括编码抗体的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3的核苷酸序列，编码抗体的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3的核苷酸序列，编码抗体的轻链可变区的核苷酸序列，或编码抗体重链可变区的核苷酸序列，其中，编码抗体的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11-13所示，编码抗体的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3的核苷酸序列分别如SEQID NO:14-16所示，编码抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示或与其具有至少80％同源性；编码抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示或与其具有至少80％同源性。

优选地，编码抗体重链可变区的核苷酸序列具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；编码抗体轻链可变区的核苷酸序列具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

本发明的编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有上述优选的核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含前面所述的核酸分子，此外，还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。

本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有前面所述的核酸分子或前面所述的表达载体。

本发明中“宿主细胞”一词指的是导入核酸分子或载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞的动物细胞。

在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选293F细胞。

本发明还提供给了一种利用前面所述的宿主细胞产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的宿主细胞并回收所述抗体。

本发明还提供了一种通过上述方法产生的抗体或抗原结合片段。

本发明还提供了一种H7N9病毒检测产品，所述检测产品包括本发明的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段。

所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是能够检测出H7N9病毒的检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。

进一步，所述药物组合物还包括可药用载体或稀释剂。可以用任何适当的药用载体施用根据本发明的药物组合物用于治疗。

用于肠胃外给药和局部给药时，本发明的全人源抗体药物组合物包括无菌水或非水溶剂、悬液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油、和可注射的有机酯。水性载体包括水、水-乙醇溶液，其中包括盐和缓冲的一般肠胃外载体，其包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏液、或非挥发性油。静脉载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如那些基于林格氏葡萄糖等的电解质补充剂。组合物可能包括其它赋形剂，如稳定化试剂或防腐剂。实用的稳定赋形剂包括表面活性剂(聚山梨酯20&80、泊咯沙姆407)、聚合物(聚乙二醇，聚乙烯吡咯酮)、糖类(蔗糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖)、醇(山梨醇，甘油丙二醇，乙二醇)、适当的蛋白质(白蛋白)、合适的氨基酸(甘氨酸，谷氨酸)、脂肪酸(乙醇胺)、抗氧化剂(抗坏血酸，半胱氨酸等)、螯合剂(EDTA盐类、组氨酸、天门冬氨酸)或金属离子(钙、镍、镁、锰)。有用的防腐剂有苯甲醇、氯代丁醇、苯扎氯铵，也可使用对羟基苯甲酸酯类。

可以以浓缩的形式或者以粉末的形式以根据需要重构提供根据本发明的药物组合物。这样的粉剂可以使用上述赋形剂。在冷冻干燥的情况下，某些冷冻保护剂是优选的，其包括聚合物(聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测H7N9病毒水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取含有H7N9病毒的样品；

(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段的接触；

(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。

本发明还提供了一种前面所述的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)分离感染H7N9的人外周血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，获得具有H7N9病毒HA蛋白阳性的单个B细胞；

(2)利用单细胞RT-PCR扩增步骤(1)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；

(3)将步骤(2)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；

(4)筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体。

本发明还提供了前面所述的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备H7N9病毒检测产品中的应用。

所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备H7N9病毒检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了前面所述的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备抑制H7N9病毒的药物中的应用。

本发明还提供了前面所述的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗由H7N9病毒感染引起的疾病的药物制剂中的应用。

本发明的全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段可以以化学方法或者通过基因工程与其他因子缀合。这些因子提供将抗体靶向所需功能位点的作用或者为抗体提高或提供其他性能。

根据本发明的全人源抗H7N9病毒的抗体可以以化学方法或者通过基因工程标记，以提供可检测的抗体。

本发明的“治疗”意在包括为受治疗者施用全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体，其目的包括改善、治疗H7N9病毒介导的疾病。

本发明的“治疗有效量”是指对H7N9病毒介导事件的有害影响至少有所改善的水平。本领域技术人员能很容易地确定该全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体的给药量和方案。

本发明所涉及的序列具体信息如下：

SEQ IDNO:1

TGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTNYTLHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTRYSQKFQARVTITRDTSASTGYMEVSSLRSEDTAVYYCARGAYYGFWNGHYMGDDDNYYYGMGVWGQGPRSPSPQRR；

SEQ IDNO:2

GYSFTNYT；

SEQ IDNO:3

INAGNGNT；

SEQ IDNO:4

ARGAYYGFWNGHYMGDDDNYYYGMGV；

SEQ IDNO:5

TGSLSQPVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVQVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGDTATLTISGTQSVDEADYYCQAWDSSRDVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPTLE；

SEQ IDNO:6

KLGDKY；

SEQ IDNO:7

QDT；

SEQ IDNO:8

QAWDSSRDVV；

SEQ IDNO:9

ACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACAGTTTCACTAACTATACTCTGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAAGATATTCACAGAAGTTCCAGGCCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGGCTACATGGAGGTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGCGTATTACGGTTTTTGGAACGGTCATTATATGGGAGACGATGACAACTATTACTACGGTATGGGCGTCTGGGGCCAAGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGAC；

SEQ IDNO:10

ACCGGTTCTCTCTCGCAGCCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCAGGTCATCTATCAAGATACCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGGACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGTCTGTGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCAGGGATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTTCCCACCCTCGAG；

SEQ IDNO:11

GGATACAGTTTCACTAACTATACT；

SEQ IDNO:12

ATCAACGCTGGCAATGGTAACACA；

SEQ IDNO:13

GCGAGAGGAGCGTATTACGGTTTTTGGAACGGTCATTATATGGGAGACGATGACAACTATTACTACGGTATGGGCGTC；

SEQ IDNO:14

AAATTGGGGGATAAATAT；

SEQ IDNO:15

CAAGATACC；

SEQ IDNO:16

CAGGCGTGGGACAGCAGCAGGGATGTGGTA。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种新的全人源抗H7N9病毒单克隆中和抗体，该抗体具有亲和力高，全人源，无副作用，中和效果好，成本低廉，成分清晰，实现生产标准化，质量控制简单等竞争优势。

利用RT-PCR与抗体筛选平台制备的全人源抗H7N9病毒中和抗体，可以有效中和H7N9病毒，具有抗感染作用，起到预防和治疗的作用。

附图说明

图1显示利用ELISA筛选出的mAb635抗体表达上清与H7N9病毒HA蛋白的结合情况；

图2显示利用SDS-PAGE检测抗体mAb635的表达及纯化情况；

图3显示利用免疫印迹检测纯化的mAb635抗体与H7N9病毒HA蛋白的结合情况；

图4显示利用血凝抑制实验检测mAb635抗体对H7N9病毒Wuxi-01介导的红细胞凝集反应的影响；

图5显示利用血凝抑制实验检测mAb635抗体对H7N9病毒Suzhou-03介导的红细胞凝集反应的影响。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体mAb635的制备

1、记忆性B细胞分选

1.1分离PBMC

采集3份H7N9恢复期病人外周抗凝血，用Ficoll密度梯度离心法分离外周血PBMC，液氮中保存。

1.2获取记忆性B细胞

将纯化的HA蛋白标记上PE和APC荧光染料，然后与Anti-CD3-Cy7APC、Anti-CD14-FITC、Anti-CD20-Cy7PE、Anti-CD19-PE-CF594、Anti-IgG-BV421、Anti-IgM-Cy55荧光标记的抗体按相应比例混合。从液氮中取出PBMC细胞，融化后经PBS洗涤，首先用AQUA染液将死细胞染色，然后再与上述混合抗体于冰上孵育结合。800g离心洗去未结合的抗体，PBS洗涤后过细胞筛去除细胞团块和可能的大块杂质，然后上BD FACSAriaⅡ流式细胞仪分选。将PE和APC双阳性以及部分GP单阳性的单个B淋巴细胞分选到已加上细胞裂解液的96孔板中，孵育裂解。

2、单细胞RT-PCR

用SuperScriptⅢ逆转录酶将96孔板中的单个B细胞的RNA逆转录成cDNA，然后先用位于抗体Leader区的混合引物进行第一轮PCR分别扩增重链、Kappa链和Lambda链，以第一轮PCR产物为模板，再用抗体起始区的混合引物进行第二轮PCR，在第二轮PCR引物中加入相应的克隆酶切位点第二轮PCR经过琼脂糖凝胶电泳，回收330bp左右的条带。

3、抗体表达

将上面获得的330bp左右的条带酶切后分别克隆入含有轻、重恒定区的IgG表达载体。重组质粒送测序，去除完全重复的序列再将轻、重链配对后转染293F细胞，表达抗体。

4、筛选抗体

待细胞克隆长成后，细胞上清采用ELISA法筛选与特异性抗原结合的抗体。步骤如下：将纯化的HA蛋白200ng/孔包被96孔ELISA板，抗体表达上清从1:20开始倍比稀释，上清加入ELISA板中37℃孵育1h，后PBST洗板，加入HRP标记的抗人Fc二抗，37℃孵育30min，PBST洗板后TMB显色。使用33株抗体表达上清与纯化的HA蛋白ELISA检测。图1所示，命名为mAb635的抗体的表达上清显示与HA蛋白结合，同时用H7N9病毒感染恢复期患者血清作为阳性对照(Positive Control,PC),用健康成人血清作为阴性对照(Negative Control,NC)，对照血清从1:1000开始倍比稀释。

5、抗体结合活性的检测

选取mAb635抗体的表达上清，从1:20开始在包被HA的ELISA板中将其倍比稀释，孵育后用HRP标记的抗人Fc检测，TMB显色后读取OD450，数值如表1所示。感染H7N9病毒患者恢复期血清作为阳性对照(Positive Control,PC),用健康成人血清作为阴性对照(NegativeControl,NC)。

表1抗体结合活性检测

稀释比例	mAb635	PC	NC
				1:20	2.057	1.585	0.064
1:40	1.911	1.065	0.058
				1:80	1.372	0.65	0.063
1:160	0.971	0.439	0.057
				1:320	0.584	0.257	0.058
1:640	0.35	0.158	0.061
				1:128	0.211	0.104	0.058
1:256	0.153	0.102	0.057

5、抗体大量表达与纯化

(1)将含有mAb635抗体重链可变区核苷酸序列的表达载体(重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)和含有mAb635抗体轻链可变区核苷酸序列的表达载体(抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)在原核细胞中大量扩增，将上述表达载体用PEI瞬时转染293F细胞，于转染72h后收集细胞表达上清。细胞沉淀重悬于Freestyle培养基中，再转染一次，4天后收集上清。

(2)细胞表达上清23000rpm离心20min去细胞碎片，然后过0.2μm滤膜后，用AKTA过Protein A株亲和层析纯化抗体。

(3)Protein A株经pH＝2.2的甘氨酸-盐酸洗脱抗体，Tris中和后用透析卡透析去除杂质。

(4)纯化后的抗体经13000rpm离心30min去杂质，然后过0.2μm滤膜除菌后分装冻存于-80℃备用。

(5)利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE检验抗体mAb635的表达及纯化情况，图2结果显示mAb635抗体的重链和轻链蛋白条带清晰可见，表明体外大量表达mAb635抗体成功。

实施例2 mAb635抗体结合特异性的检测

利用免疫印迹方法检测纯化抗体与H7N9病毒HA蛋白的结合

1、步骤：

(1)纯化的H7N9病毒的HA蛋白经SDS-PAGE，同时用纯化的H3N2病毒的HA蛋白做对照，电泳完成后将胶中的蛋白转印至PVDF膜中，PVDF膜用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜，然后加入50μg的纯化抗体，37℃孵育2h，然后用PBST洗脱；

(2)1:2000加入抗人IgG二抗，37℃孵育1h，然后PBST洗脱；

(3)PVDF膜加上化学发光液在暗室里曝光。

2、结果

结果如图3所示，纯化的mAb635抗体与H7N9病毒HA蛋白特异性结合，图3中“1”代表的是H7N9病毒HA蛋白所在的泳道，“2”代表H3N2病毒HA蛋白所在的泳道。

实施例3 mAb635抗体的血凝抑制实验

1、血清、抗体的处理

一份阳性对照血清为H7N9病毒感染恢复期患者血清，一份阴性对照血清为健康成人血清。血清和抗体分别加入3倍体积的RDE，37℃孵育16-18小时，56℃灭活30min待用，血清加入6倍体积的PBS终浓度为1:10，抗体不加，终浓度为1:4。

2、1％火鸡红细胞的配制

预先在注射器中吸入2ml阿氏液，采2ml火鸡翅根静脉血，形成4ml全血混合物。将4ml血液加到50ml离心管中，向离心管内加冷的PBS液至50ml，轻柔混匀2000rpm离心5分钟去除上层悬液，再用PBS液洗涤部分沉积的细胞两次，弃去上层悬液。稀释部分沉积TRBC至PBS，使最终浓度为1％(500μl RBCs+50ml PBS)。

3、抗原配制

(1)在V底中从第二孔到第十二孔每孔加入50μl PBS；

(2)测试病毒加100μl到第一个孔内(双份)然后2倍系列稀释；

(3)向反应板中每孔加入50μl的TRBC悬液，轻柔混匀，并将反应板置于室温下孵育30分钟；

(4)30分钟后倾斜板子并观察RBC的沉淀的流动性来读取病毒的滴度。产生完全凝集的最高稀释度的病毒可作为HA滴度的终点。HA的滴度即为发生完全凝集的最后一个孔的病毒稀释度的倒数。

(5)将表2中的两种病毒分别稀释于冷的PBS中，制备成含有8个血凝抑制单位/每50μl(8HAU/50μl)的工作溶液。

表2病毒信息

4、红细胞凝集抑制

(1)向V底的微量第二排及以后的孔中每孔加入25μl的冷的PBS，向第一行的孔(A1-A11)中每孔加入50μl的RDE处理过的血清(1:10)及RDE处理过的抗体(1:4)，然后进行2倍系列稀释；

(2)加入25μl标准化的病毒至系列稀释的血清中，轻轻的振荡混匀反应板，置于37℃孵育45分钟；

(3)每孔加入50μl 1％TRBC，如前混匀，盖上反应板，在室温下放置大约30分钟使血细胞沉淀。读取HAI(血凝抑制试验)滴度。

5、结果

结果如图4和图5所示，图4和图5中的结果表明mAb635抗体明显抑制了H7N9病毒导致的红细胞凝集反应，同时H7N9病毒感染恢复期患者血清均可以抑制H7N9病毒的红细胞凝集反应，而阴性对照血清均无抑制红细胞凝集效应，其中图4对应的是Wuxi-01病毒株的结果，图5对应的是Suzhou-03病毒株的结果。

实施例4 mAb635抗体中和活性检测

1、准备：mAb635抗体为待检抗体，对照抗体mAb32为本室制备的抗H3N2季节性流感病毒的全人源抗体，实验前用PBS稀释成终浓度为0.2mg/ml备用。

2、实验步骤(所有步骤在BSL-3实验室内完成)

(1)稀释抗体：mAb635和mAb32抗体从0.2mg/ml开始倍比稀释，每孔50μl，每个抗体做两个复孔；

(2)加入100倍TCID50/50μl病毒(病毒原液1:40稀释即可，病毒信息见表3)，于96孔板中稀释抗体轻轻混匀，37℃孵育1小时；

(3)在每个孔中加入4.5×10⁴个细胞，37℃孵育18-20小时，取出观察病变，记录CPE；

(4)在生物安全柜中将培养上清弃去，PBS洗2次，用80％丙酮固定10min，弃去丙酮，自然晾干；

(5)加入1:1000稀释的抗甲型流感NP蛋白鼠源抗体，37℃孵育1h，PBST洗3遍；

(6)加入HRP标记的抗鼠二抗，37℃孵育1h，PBST洗3遍，OPD显色；

(7)根据阴性对照孔2.5倍标准差计算cut off值，根据计算结果判断中和滴度。

表3所用病毒信息

3、结果

(1)不同浓度的mAb635抗体对Wuxi-01病毒株的中和效果见表4。

表4不同浓度的mAb635抗体对Wuxi-01病毒株的中和效果检测

(2)中和100×TCID50以下四株病毒需要的抗体质量(ng)见表5。

表5中和100×TCID50以下四株病毒需要的mAb635抗体量

病毒株	Wuxi-01	Wuxi-02	Nanjing-06	Suzhou-03
					抗体量(ng)	160	320	80	80

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省疾病预防控制中心

<120> 一种全人源抗H7N9病毒的中和抗体

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 140

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

1 5 10 15

Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

20 25 30

Ser Phe Thr Asn Tyr Thr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

35 40 45

Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Arg

50 55 60

Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Ala Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser

65 70 75 80

Ala Ser Thr Gly Tyr Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Phe Trp Asn Gly

100 105 110

His Tyr Met Gly Asp Asp Asp Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Gly Val Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Gln Arg Arg

130 135 140

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 3

Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> 人源

<400> 4

Ala Arg Gly Ala Tyr Tyr Gly Phe Trp Asn Gly His Tyr Met Gly Asp

1 5 10 15

Asp Asp Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Gly Val

20 25

<210> 5

<211> 128

<212> PRT

<213> 人源

<400> 5

Thr Gly Ser Leu Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

1 5 10 15

Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu

20 25 30

Gly Asp Lys Tyr Ala Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Val Gln Val Ile Tyr Gln Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Gly Thr Gln Ser Val Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp

85 90 95

Ser Ser Arg Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Thr Leu Glu

115 120 125

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人源

<400> 6

Lys Leu Gly Asp Lys Tyr

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人源

<400> 7

Gln Asp Thr

1

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人源

<400> 8

Gln Ala Trp Asp Ser Ser Arg Asp Val Val

1 5 10

<210> 9

<211> 421

<212> DNA

<213> 人源

<400> 9

accggtgtac attcccaggt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 60

gcctcagtga agatttcctg caaggcttct ggatacagtt tcactaacta tactctgcat 120

tgggtgcgcc aggcccccgg acaaaggctt gagtggatgg gatggatcaa cgctggcaat 180

ggtaacacaa gatattcaca gaagttccag gccagagtca ccattaccag ggacacatcc 240

gcgagcacag gctacatgga ggtgagcagc ctgagatctg aagacacggc tgtgtattac 300

tgtgcgagag gagcgtatta cggtttttgg aacggtcatt atatgggaga cgatgacaac 360

tattactacg gtatgggcgt ctggggccaa ggaccacggt caccgtctcc tcagcgtcga 420

c 421

<210> 10

<211> 384

<212> DNA

<213> 人源

<400> 10

accggttctc tctcgcagcc tgtgctgact cagccaccct cagtgtccgt gtccccagga 60

cagacagcca gcatcacctg ctctggagat aaattggggg ataaatatgc ttgctggtat 120

cagcagaagc caggccagtc ccctgtgcag gtcatctatc aagataccaa gcggccctca 180

gggatccctg agcgattctc tggctccaac tctggggaca cagccactct gaccatcagc 240

gggacccagt ctgtggatga ggctgactat tactgtcagg cgtgggacag cagcagggat 300

gtggtattcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360

gtcactctgt ttcccaccct cgag 384

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人源

<400> 11

ggatacagtt tcactaacta tact 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人源

<400> 12

atcaacgctg gcaatggtaa caca 24

<210> 13

<211> 78

<212> DNA

<213> 人源

<400> 13

gcgagaggag cgtattacgg tttttggaac ggtcattata tgggagacga tgacaactat 60

tactacggta tgggcgtc 78

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人源

<400> 14

aaattggggg ataaatat 18

<210> 15

<211> 9

<212> DNA

<213> 人源

<400> 15

caagatacc 9

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人源

<400> 16

caggcgtggg acagcagcag ggatgtggta 30

Claims

1.一种全人源抗H7N9病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

重链CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

轻链CDR1具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。

4.编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，所述核酸分子包括所述核酸分子包括编码抗体的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3的核苷酸序列，编码抗体的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3的核苷酸序列，编码抗体的轻链可变区的核苷酸序列，或编码抗体重链可变区的核苷酸序列，其中，编码抗体的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11-13所示，编码抗体的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14-16所示，编码抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；编码抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求4或5所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求4或5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

9.一种H7N9病毒检测产品，其特征在于，所述检测产品包括权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

10.一种利用权利要求8所述的宿主细胞产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养所述宿主细胞并回收抗体或抗原结合片段。

11.一种通过权利要求10所述的方法产生的抗体或抗原结合片段。

12.一种制备权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原片段的方法，其特征在于，所述制备权利要求1-3中任一项所述的抗体的方法包括如下步骤：

13.一种非诊断目的的检测H7N9病毒水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取含有H7N9病毒的样品；

(2)将步骤(1)获取的样品与权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原片段接触；

(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。

14.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备H7N9病毒检测产品中的应用。

15.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备抑制H7N9病毒的药物中的应用。

16.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或者治疗由H7N9病毒感染引起的疾病的药物制剂中的应用。