CN106519027A

CN106519027A - 抗h7n9全人源单克隆抗体5j13及其制法与应用

Info

Publication number: CN106519027A
Application number: CN201611038444.XA
Authority: CN
Inventors: 万晓春; 李俊鑫; 刘绿艳
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-11-11
Also published as: CN106519027B; WO2018086599A1

Abstract

本发明涉及抗H7N9全人源单克隆抗体5J13及其制法与应用，该抗体的重轻链CDR1、CDR2及CDR3区的氨基酸序列分别为重链CDR1区：GFSFSNYG；重链CDR2区：ISYDGTNK；重链CDR3区：AKGRGPYCSSSICYHGMDV；轻链CDR1区：QSVLSGSINMNY；轻链CDR2区：WAS；轻链CDR3区：QQYYSTPLT。本发明抗体可靶向结合H7N9病毒的血凝素HA，具有显著地抗H7N9病毒感染的中和活性；相比鼠源抗体，全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。

Description

抗H7N9全人源单克隆抗体5J13及其制法与应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体地涉及抗H7N9全人源单克隆抗体5J13及其制法与应用。

背景技术

在2015年全球十大畅销药中，有6个是全人源或人源化单克隆抗体药物。排名第一的是艾伯维公司治疗关节炎的抗TNFa单克隆抗体Humira，这是一个全人源单克隆抗体，已经是连续3年销售额100亿以上的药王。从1986年第一个单克隆抗体药物上市开始，单抗药物经历了鼠源单抗药物(如Orthoclone OKT3)、嵌合单抗药物(Rituximab)、人源化单抗药物(Herceptin)和全人源单抗药物(Humira)等阶段。由于人体出现抗鼠抗体反应(HAMA)，鼠源单抗药物、嵌合单抗药物已经逐渐被淘汰，目前占据市场的单克隆抗体药物全都是人源化单克隆抗体药物。与国际先进的人源抗体生产技术相比，深圳乃至全中国都有很大差距，主要表现在人源抗体药物领域的创新能力薄弱，自主研发的品种少，目前还没有原创人源化单克隆抗体药物上市的报道，庞大的抗体药物市场被国外药企占领。我国要改变落后局面，争夺消费潜力巨大的国内外抗体药物市场，亟需攻克全人源单克隆抗体技术。

人源单克隆抗体在治疗炎症、癌症特别是流行性感冒方面具有高特异性的显著疗效。流行性感冒是由流感病毒引起的传染性疾病，严重威胁人类健康。全球每年约有10亿人受季节性流感病毒感染，其中有25-50万人死亡。H7N9病毒是一种流感病毒，对传统的抗病毒药金刚烷胺(amantadine)和金刚烷乙胺(rimantadine)有耐药性，目前尚没有有效治疗手段。H7N9病毒在入侵细胞时需要依赖病毒自身表达的特定分子与人细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和病毒的人源抗体是人B淋巴细胞产生的某些特异抗体，能够与病毒表面的抗原结合，从而阻止该病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵入细胞，能够高效防治H7N9流行性感冒。因此，提供一种抗H7N9全人源单克隆抗体及其制法是本领域亟待解决的技术问题之一。

发明内容

本发明的目的之一在于提供抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够中和H7N9病毒的生物活性片段。

本发明的另一目的在于提供编码所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的基因及含该基因的载体或细胞。

本发明的另一目在于提供产生所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13的方法。

本发明的另一目在于提供包含所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的药物组合物。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段或所述药物组合物的应用。

本发明的另一目的在于提供一种检测H7N9病毒的试剂盒。

为实现上述目的，一方面，本发明提供抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段，其中，该抗体的重轻链CDR1、CDR2及CDR3区的氨基酸序列分别如下所示：

重链CDR1区：GFSFSNYG；

重链CDR2区：ISYDGTNK；

重链CDR3区：AKGRGPYCSSSICYHGMDV；

轻链CDR1区：QSVLSGSINMNY；

轻链CDR2区：WAS；

轻链CDR3区：QQYYSTPLT。

优选地，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或

该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

在本发明的一具体实施方式中，该抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或

该抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

经ELISA实验验证，本发明所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13可以靶向结合H7N9病毒的血凝素HA。血凝抑制试验证明5J13可以中和H7N9病毒，其IC₅₀值可低至0.2071μg/ml，KD值为3.04×10^-10。本发明所述抗体为全人源性单克隆抗体，相比鼠源抗体，全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。

另一方面，本发明提供编码本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13的基因。优选地，所述基因包含编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸的核苷酸序列，更优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或

所述基因包含编码具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明一具体实施方式中，所述基因包含编码具有SEQ ID NO:6的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；和/或

所述基因包含编码具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明SEQ ID NO:1～8的序列如序列表所示，SEQ ID NO:1中第76～99位序列以及SEQ ID NO:5中第124～147位序列：ggattcagcttcagtaactatggt(框显于图1及图3中)用于编码重链CDR1区GFSFSNYG序列。SEQ ID NO:1中第151～174位序列以及SEQ ID NO:5中第199～222位序列：atctcatatgacggaactaataaa(框显于图1及图3中)用于编码重链CDR2区ISYDGTNK序列。SEQ ID NO:1中第289～345位序列以及SEQ ID NO:5中第337～393位序列：gcgaaaggtcgggggccttattgtagtagttccatctgctatcacggtatggacgtc(框显于图1及图3中)用于编码重链CDR3区AKGRGPYCSSSICYHGMDV序列。SEQ ID NO:3中第79～114位序列以及SEQID NO:7中第127～162位序列：cagagtgttttatccggctccatcaatatgaactac(框显于图2及图4中)用于编码轻链CDR1区QSVLSGSINMNY序列。SEQ ID NO:3中第166～174位序列以及SEQ IDNO:7中第214～222位序列：tgggcatct(框显于图2及图4中)用于编码轻链CDR2区WAS序列。SEQ ID NO:3中第283～309位序列以及SEQ ID NO:7中第331～357位序列：cagcaatattacagtactccgctcact(框显于图2及图4中)用于编码轻链CDR3区QQYYSTPLT序列。图3中还框显有SEQ ID NO:5中用于编码信号肽的第1～48位序列：atgggctggtcctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggc。

另一方面，本发明提供含如上所述基因的载体。

再一方面，本发明提供含如上所述基因或如上所述载体的细胞。

再一方面，本发明提供一种产生所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的方法，该方法是采用单个B细胞法制备所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13。

现有技术中存在采用噬菌体展示技术制备抗H7N9病毒人源单克隆抗体的方法，尽管该方法具有生产成本低、不经过免疫和细胞融合等繁琐工作的优点，但是其缺点也比较明显，从非免疫抗体库中获得的抗体往往亲和力不足、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容量不足以涵盖动物的抗体多样性等。本发明采用单个B细胞PCR技术，从病人的血液中分离分泌功能抗体的B细胞，然后提取RNA和合成cDNA，从中克隆分泌目的抗体的基因，最后重组和表达全人源单克隆抗体。该技术操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特异性，此外，可进一步采用改进的从记忆B细胞中分离具有中和病毒功能或杀伤肿瘤功能的本发明所述单克隆抗体技术，更是大大减少了繁琐操作和成本。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。

另一方面，本发明提供所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段或所述的药物组合物在制备用于治疗由H7N9病毒引起的疾病的药物中的应用。

另一方面，本发明提供一种检测H7N9病毒水平的试剂盒，其含有本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段；优选所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；优选所述第二抗体为抗本发明所述单克隆抗体5J13的抗抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13可以靶向结合H7N9病毒的血凝素HA，具有显著抗H7N9病毒感染的中和活性。

(2)相比鼠源抗体，全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。

(3)相较于现有技术提供的噬菌体展示技术制备抗H7N9病毒人源单克隆抗体的方法，本发明采用的单个B细胞PCR技术具有操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特异性等优点。

附图说明

图1～图4分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5(部分)及SEQ ID NO:7序列，其中框显了用于编码重轻链CDR1、CDR2、CDR3及信号肽的序列片段。

图5为实施例1NTH-3T3表达CD40L的流式检测结果图。

图6为实施例1流式细胞仪分选记忆B细胞结果图。

图7为实施例1 ELISA实验结果图。

图8为实施例2琼脂糖凝胶电泳结果图。

图9为实施例2 SDS-PAGE蛋白电泳结果图。

图10为实施例3血凝抑制实验结果图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

(1)构建稳定表达CD40L的NTH-3T3细胞系(3T3-CD40L)

利用慢病毒建立3T3-CD40L饲养细胞。构建慢病毒表达载体pLVX-CD40L，转染293T细胞，转染第四天收集病毒上清液。活化NIH-3T3细胞，培养3代后用慢病毒感染，继续培养并传代3次。利用流式细胞仪进行分选FITC荧光强度在MFI附近的细胞，重新加入至培养瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中培养和检测，检测结果如图5所示，其是将表达CD40L的3T3细胞和空载体pLVX(带有ZxGreen)转染的3T3细胞分别用带有APC的抗CD40L染色，然后上流式细胞仪分析。结果发现，所有3T3-CD40L饲养细胞都表达CD40L。当细胞长到80％～90％时，消化收集细胞，浓度为每毫升1×10⁷细胞。置于辐射仪中进行5000rads辐射，冻存液重悬细胞，浓度为每毫升3.5×10⁷细胞，分装1ml在冷冻小管，液氮冻存(可以保存2年)。

(2)记忆B细胞的分选和活化

用淋巴分离液分离和冻存曾经感染H7N9病毒的康复病人的PBMC，每管10～50×10⁶细胞，冻存在液氮罐中。配制PBMC流式染色液，其成分如下表1所示

表1 PBMC流式染色液

抗体	体积(μL)
		CD19-PE-Cy7	0.5
IgM-PE	1.0
		IgA-APC	2.5
IgD-FITC	2.5
		PBS-1％(wt/vol)BSA	43.5

解冻PBMC，加入上述PBMC流式染色液并在流式细胞仪上分选，结果如图6所示，分选出CD19⁺IgM^–IgA^–IgD^–的记忆B细胞，细胞纯度需在90％以上，若低于90％，重复分选过程。配制激活B细胞的混合培养基，如下表2所示：

表2

组分	体积
		完全IMDM培养基	336mL
IL-2(10,000U mL^-1)	3.5mL
		IL-21(100μg mL^-1)	175μL
步骤(1)中得到的3T3-CD40L	10mL

将记忆B细胞加入到混合培养基中，混匀后有限稀释在384孔板，每孔1个细胞，体积为50μl，置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养。13天后，取上清液进行ELISA，获得人源单克隆抗体5J13。

(3)人源单克隆抗体5J13结合H7N9病毒的血凝素HA实验

流感病毒血凝素HA是病毒包膜表面柱状抗原，能与人、鸡、豚鼠等多种红细胞受体结合引起红细胞凝集，具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒。对上述获得的人源单克隆抗体5J13进行ELISA实验，具体地：

(1)将100ng/100μl的H7N9病毒的HA蛋白(购自ACROBiosystems)包被在96孔酶标板中，每孔100μl；

(2)放置4℃冰箱过夜；

(3)用PBST溶液洗涤三遍，每孔加5％的脱脂奶粉溶液200μl，37℃孵育1小时；

(4)用PBST溶液洗涤三遍，加100μl没有感染病毒的正常人血清(阴性对照)或加感染病毒的病人血清或抗H7N9全人源单克隆抗体5J13，各三个重复；

(5)37℃孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；

(6)以1:5000稀释带HRP的抗人IgG抗体(abcam)，加入酶标版中，每孔100μl；

(7)37℃孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；

(8)每孔加100μl TMB底物溶液(Thermo Scientific)，37℃5分钟；

(9)每孔加终止溶液2M硫酸100μl，立刻在酶标仪中450nm波长检测吸光值。其结果如图7所示，ELISA实验表明本发明获得的人源单克隆抗体5J13可以靶向结合H7N9病毒的血凝素HA。

实施例2人源化单克隆抗体5J13基因的克隆、重组、表达和纯化

将实施例1获得的能够分泌结合H7N9病毒的抗体的B细胞进行裂解，取裂解液进行RNA的反转录，获得人源抗体基因的PCR模板cDNA。设计和合成克隆抗体基因的引物，以cDNA为模板克隆抗体的重链和轻链的基因，并且重组在真核细胞293F或HEK293中进行表达和纯化。具体地：

(1)将裂解后的B细胞液转移至96孔板(Eppendorf，030133366)。

(2)反转录体系：150ng随机引物(invitrogen,48190-011),0.5μl 10mM dNTP(Invitrogen,18427-088),1μl 0.1M DTT(Invitrogen,18080-044),0.5％v/v Igepal CA-630(Sigma,I3021-50ML),4U RNAsin(Promega),6U Prime RNAse Inhibitor(Eppendorf)and 50U III reverse transcriptase(Invitrogen,18080-044)，补DEPC水至14μl/well。

(3)反转录反应程序：42℃，10min；25℃，10min；50℃，60min；94℃，5min。

(4)cDNA保存在-20℃。

(5)引物的设计和合成:

正向引物5′-3′序列(Forward Primer 5′-3′sequence)

重链可变区PCR引物:

5′VH1 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:9)

5′VH1/5 CTGCAACCGGTGTACATTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:10)

5′VH3 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:11)

5′VH3-23 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG(SEQ ID NO:12)

5′VH4 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG(SEQ ID NO:13)

5′VH 4-34 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG(SEQ ID NO:14)

5′VH 1-18 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:15)

5′VH 1-24 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTCCAGCTGGTACAG(SEQ ID NO:16)

5′VH3-33 CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:17)

5′VH 3-9 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:18)

5′VH4-39 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG(SEQ ID NO:19)

5′VH 6-1 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTACAGCTGCAGCAG(SEQ ID NO:20)

3′JH 1/2/4/5 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG(SEQ ID NO:21)

3′JH 3 TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG(SEQ ID NO:22)

3′JH 6 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG(SEQ ID NO:23)

κ轻链可变区PCR产物

5′Vκ1-5CTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCCAGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:24)

5′Vκ1-9TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT(SEQ ID NO:25)

5′Vκ1D-43CTGCAACCGGTGTACATTGTGCCATCCGGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:26)

5′Vκ2-24CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACCCAGAC(SEQ ID NO:27)

5′Vκ2-28CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACTCAGTC(SEQ ID NO:28)

5′Vκ2-30CTGCAACCGGTGTACATGGGGATGTTGTGATGACTCAGTC(SEQ ID NO:29)

5′Vκ3-11TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC(SEQ ID NO:30)

5′Vκ3-15CTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATAGTGATGACGCAGTC(SEQ ID NO:31)

5′Vκ3-20TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT(SEQ ID NO:32)

5′Vκ4-1CTGCAACCGGTGTACATTCGGACATCGTGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:33)

3′Jκ1/4GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC(SEQ ID NO:34)

3′Jκ2GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC(SEQ ID NO:35)

3′Jκ3GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC(SEQ ID NO:36)

3′Jκ5GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC(SEQ ID NO:37)

(6)用KOD-Plus-Neo(TOYOBO，KOD401)试剂盒PCR分别扩增抗体基因的重链和轻链，40μL体系：3.5μL cDNA，20nM混合引物，4μL缓冲液(buffer)，4μL 2mM dNTPs，2.4μLMgSO₄，1μL KOD。

(7)反应程序：94℃，2min；45个循环：[98℃,10s；58℃,30s；68℃,28s。

(8)对扩增产物进行琼脂糖凝胶，其结果如图8所示，结果显示，抗体轻链为κ，大小为339bp，重链大小是378bp。

(9)抗体基因重链可变区PCR产物测序结果如SEQ ID NO:1所示序列，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示序列。抗体基因轻链可变区PCR产物测序结果如SEQ ID NO:3所示序列，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示序列。

依据所得重轻链可变区序列，设计并委托Invitrogen公司合成抗体基因重链全长H基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，带有BamH1/EcoR1双酶切位点，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；及抗体基因轻链全长L基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，带有Not1/Xho1双酶切位点，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

(10)将H基因和pcDNA3.1分别进行BamH1/EcoR1双酶切后相连，形成pcDNA3.1-H载体。

(11)将L基因和pcDNA3.1分别进行Not1/Xho1双酶切后相连，形成pcDNA3.1-L载体。

(12)培养293F细胞。

(13)20μg pcDNA3.1-L载体和10μg pcDNA3.1-H载体共转染293F细胞，培养96小时。

(14)取上清液进行ELISA(ABC是上清液，DEF是阳性对照，GH是阴性对照)；ELISA具体的实验步骤如前所述，ELISA实验结果如下表3所示：

表3

数据	450nm	数据	450nm
				A	3.103	E	1.885
B	3.321	F	1.201
				C	3.001	G	0.0675
D	1.914	H	0.0554

上述结果显示上清液中含有能够结合H7N9病毒的抗体。

(15)纯化过程，具体地，全人源单克隆抗体5J13的纯化过程为：

(a)200μg pcDNA3.1-L载体和100μg pcDNA3.1-H载体共转染300ml 293F细胞，培养96小时。

(b)收集上清液，加入proteinA亲和层析柱，用10倍PBS清洗，加入2ml pH3.0，0.1M甘氨酸收集抗体。收集管中加入100μl中和缓冲液(1M Tri-HCL)，以便及时中和洗脱所得抗体液的pH值。

(c)在磷酸盐缓冲液(PBS)中透析，透析完后，近期用的存放在4℃，长期储存在-20℃。共获得300μg抗体，跑SDS-PAGE蛋白电泳结果如图9所示，从图9中可以看出获得了高纯度的抗体。

实施例3纯化后的全人源单克隆抗体5J13的中和实验及抗体亲和力实验

全人源单克隆抗体5J13的中和实验

(1)血凝实验

(a)取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1～12孔每孔加25μL PBS，共滴8排，后4排的第1列孔再补加25μL PBS。

(b)吸取25μL标准禽流感抗原(H7N9病毒)加入到第1列孔中，吹打3～5次充分混匀。

(c)从第1列孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25μL弃之，设第12列孔为红细胞对照。

(1)自右向左依次向各孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液。

(2)将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温(20-25℃)静置45min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

(3)结果判定：在红细胞对照孔出现正确结果的情况下，将反应板作45°倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。

(2)血凝抑制实验

(a)根据血凝试验结果配制4单位抗原(H7N9病毒)。

(b)取96孔V形微量反应板，用移液器在第1～12孔各加入25μL PBS。

(c)在第一排中加入被测纯化后的全人源单克隆抗体5J13(50μg/ml)，充分混匀后移出25μl加至第二排，依次类推，倍比稀释至第8排，第8排弃去25μL。

(d)各孔加入25μL 4单位抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温20-25℃下静置30min。

(e)自右向左依次向各孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液。

(f)将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温(20-25℃)静置40min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

本发明对比了2016年05年10日向中国国家知识产权局递交的，申请号为“201610303416.X”，发明名称为“抗H7N9全人源单克隆抗体2L11及其制法与应用”中的单克隆抗体2L11，及2016年05月03日向中国国家知识产权局递交的，申请号为“201610288358.8”，发明名称为“抗H7N9全人源单克隆抗体2J17及其制法与应用”中的单克隆抗体2J17，与本案5J13的中和活性，实验结果如图10所示，从图10中可以看出本发明5J13中和H7N9病毒的IC₅₀为0.2071μg/ml，而2L11及2J17(图中均示为同型对照)抗体没有中和活性。

抗体亲和力检测：

亲和力检测的仪器为PALL的Fortebio。配制200μl 50μg/ml 5J13抗体，结合proteinA传感器300秒，HA抗原配制50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.125nM浓度溶液，结合抗体240秒，解离时间为30分钟，显示5J13对H7N9病毒有高亲和力，KD＝3.04×10^-10。

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。

序列表

<110> 深圳先进技术研究院

<120> 抗H7N9全人源单克隆抗体5J13及其制法与应用

<130> 1

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cagcttcagt aactatggtt tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggactg ggtggcagtt atctcatatg acggaactaa taaatattat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgcat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggtcgg 300

gggccttatt gtagtagttc catctgctat cacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360

acggtcaccg tctcctca 378

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Arg Gly Pro Tyr Cys Ser Ser Ser Ile Cys Tyr His Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tccggctcca tcaatatgaa ctacttagct 120

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcactggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

gtcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttacagtact 300

ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Gly

20 25 30

Ser Ile Asn Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Val Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 5

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60

gtggagtctg ggggaggcgt ggtccagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcc 120

tctggattca gcttcagtaa ctatggtttg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 180

ctggactggg tggcagttat ctcatatgac ggaactaata aatattatgc agactccgtg 240

aagggccgat tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgcatct gcaaatgaac 300

agcctgagag ctgaggacac ggctgtgtat tactgtgcga aaggtcgggg gccttattgt 360

agtagttcca tctgctatca cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420

tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc cgtcctacag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1419

<210> 6

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

20 25 30

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

35 40 45

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

50 55 60

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

65 70 75 80

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His

85 90 95

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Lys Gly Arg Gly Pro Tyr Cys Ser Ser Ser Ile Cys Tyr His Gly

115 120 125

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 7

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcga catcgtgatg 60

acccagtctc cagactccct ggctgtgtct ctgggcgaga gggccaccat caactgcaag 120

tccagccaga gtgttttatc cggctccatc aatatgaact acttagcttg gtaccagcag 180

aaaccaggac agcctcctaa gctgctcatt tactgggcat ctacccggga atccggggtc 240

cctgaccgat tcactggcag cgggtctggg acagatttca ctctcaccgt cagcagcctg 300

caggctgaag atgtggcagt ttattactgt cagcaatatt acagtactcc gctcactttc 360

ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaaacc gtggccgccc cctccgtgtt catcttcccc 420

ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 480

tacccccggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 540

caggagtccg tgaccgagca ggactccaag gactccacct actccctgtc ctccaccctg 600

accctgtcca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt tacccaccag 660

ggcctgtcct cccccgtgac caagtccttc aaccggggcg agtgctag 708

<210> 8

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

20 25 30

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Gly

35 40 45

Ser Ile Asn Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Val Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tggtgcag 38

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctgcaaccgg tgtacattcc gaggtgcagc tggtgcag 38

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tggtggag 38

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tgttggag 38

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tgcaggag 38

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tacagcagtg 40

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctgcaaccgg tgtacattcc caggttcagc tggtgcag 38

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctgcaaccgg tgtacattcc caggtccagc tggtacag 38

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctgcaaccgg tgtacattct caggtgcagc tggtggag 38

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgcaaccgg tgtacattct gaagtgcagc tggtggag 38

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctgcaaccgg tgtacattcc cagctgcagc tgcaggag 38

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctgcaaccgg tgtacattcc caggtacagc tgcagcag 38

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc ag 32

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgcgaagtcg acgctgaaga gacggtgacc attg 34

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc gtg 33

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ctgcaaccgg tgtacattct gacatccaga tgacccagtc 40

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ttgtgctgca accggtgtac attcagacat ccagttgacc cagtct 46

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ctgcaaccgg tgtacattgt gccatccgga tgacccagtc 40

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgacccagac 40

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgactcagtc 40

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctgcaaccgg tgtacatggg gatgttgtga tgactcagtc 40

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttgtgctgca accggtgtac attcagaaat tgtgttgaca cagtc 45

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ctgcaaccgg tgtacattca gaaatagtga tgacgcagtc 40

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ttgtgctgca accggtgtac attcagaaat tgtgttgacg cagtct 46

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ctgcaaccgg tgtacattcg gacatcgtga tgacccagtc 40

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gccaccgtac gtttgatytc caccttggtc 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gccaccgtac gtttgatctc cagcttggtc 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gccaccgtac gtttgatatc cactttggtc 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gccaccgtac gtttaatctc cagtcgtgtc 30

Claims

1.抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段，其中，该抗体的重轻链CDR1、CDR2及CDR3区的氨基酸序列分别如下所示：

重链CDR1区：GFSFSNYG；

重链CDR2区：ISYDGTNK；

重链CDR3区：AKGRGPYCSSSICYHGMDV；

轻链CDR1区：QSVLSGSINMNY；

轻链CDR2区：WAS；

轻链CDR3区：QQYYSTPLT。

2.根据权利要求1所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段，其中，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或

该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；

优选地，该抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或

3.编码权利要求1或2所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的基因；优选地，所述基因包含编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸的核苷酸序列，更优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或

4.根据权利要求3所述的基因，其中，所述基因包含编码具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；和/或

5.含权利要求3或4所述基因的载体。

6.含有权利要求3或4所述基因或含有权利要求5所述载体的细胞。

7.一种产生权利要求1或2所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的方法，该方法是采用单个B细胞法制备所述抗H7N9全人源单克隆抗体5J13。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。

9.权利要求1或2所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段，或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗由H7N9病毒引起的疾病的药物中的应用。

10.一种检测H7N9病毒水平的试剂盒，其含有权利要求1或2所述的抗H7N9全人源单克隆抗体5J13或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段；优选所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；优选所述第二抗体为抗权利要求1或2所述单克隆抗体5J13的抗抗体。