CN107011436A - 抗h7n9病毒的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗H7N9病毒的单克隆抗体。本发明具体公开了一种能识别并结合H7N9病毒HA蛋白的抗体、其编码基因、表达载体、用途。本发明的单克隆抗体能阻止H7N9病毒侵染易感细胞，且是全人源的，与其它动物源性的抗H7N9病毒的分子相比，免疫原性大大减少，且亲和性良好，不仅治疗效果好，而且副作用低。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种全人源的单克隆抗体，尤其涉及一种全人源抗H7N9的单克隆中和抗体。另外，本发明还涉及该中和抗体的制备方法和用途。
背景技术
H7N9病毒属于正粘病毒科，单股负链有包膜的分节段的RNA病毒，基因组分为8个节段。病毒呈球形，大小约100nm，由衣壳和包膜组成。8个病毒RNA节段被NP覆盖形成螺旋对称的病毒衣壳，包膜来自于宿主细胞膜，表面嵌有HA与NA的蛋白质刺突。HA是以三聚体形式嵌合在包膜表面，是流感病毒的最主要抗原成分，能够凝集红细胞，并且是主要的保护性抗原，目前发现的H7N9病毒中和性抗体绝大部分是针对HA蛋白的。NA主要参与病毒的芽生释放，并可促进病毒的扩散，同时NA关键位点的突变与病毒耐药性相关。HA和NA的抗原结构很不稳定，在自然流行和宿主免疫压力下很容易发生突变获得新的生物学活性或者变成新的亚型。H7N9病毒之前一直只在禽类流行，并且在禽中症状不明显，一直未被重视。
2013年3月，在我国出现了世界上首例人感染H7N9禽流感病毒的病例。目前经实验室确诊的病例报告范围覆盖我国大陆地区的13个省、市/直辖市以及香港特别行政区和台湾。作为一种新发的具有人感染性的禽流感病毒亚型，H7N9禽流感病毒以其对人类的高致病性，高病死率，以及远高于H5N1禽流感病毒的感染率而引起全球广泛关注。由于H7N9禽流感病毒过去只在禽类传播，从未感染过人类，因此对于这种新病毒几乎所有的人都没有保护性抗体。当前H7N9禽流感病例主要呈散发状态，大部分有明确的活禽接触史，少数无明确的暴露原因。自2013年发现以来，H7N9病毒已在中国引发5波疫情流行，特别是2016年10月至2017年2月的第5波流行，已经检测到H7N9病毒发生了显著的变异，包括HA的抗原性突变，NA的耐药性突变和HA蛋白切割位点的改变。随着H7N9病毒在人间的流行，病毒变异以便更适应对哺乳类动物，同时致病性逐渐加强，并可能获得人与人之间传播的能力，这将会引发世界范围内的H7N9禽流感病毒暴发流行。
人感染H7N9禽流感后潜伏期约为7天，患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰，部分病例快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤直至死亡。与普通的季节性流感相比，H7N9禽流感病毒感染人体后，机体保护性抗体水平较低。部分病人可以在病毒感染后2周左右其外周血检测到中等水平的H7N9中和抗体。这种相对较弱的中和抗体水平可能与H7N9禽流感病毒的致病机理有关，预示着感染的病情更重，病程更长。此外，H7的抗原性与季节性流感的H1和H3抗原的交叉性非常低，机体内的H1和H3的中和抗体无法保护H7N9禽流感病毒的感染。因此，寻找具有中和作用的特异表位对发展有效的疫苗和抗体等药物具有至关重要的意义。
目前尚无针对H7N9禽流感病毒的特异性的治疗药物和疫苗上市。抗流感病毒药物奥司他韦对治疗H7N9禽流感的作用褒贬不一，其治疗效果可能与用药时间及病情轻重有关。H7N9禽流感病毒的疫苗的研发受抗原免疫原性较低、受试者接种疫苗后产生保护性免疫反应所需的时间长以及疾病散发的流行状态的影响，疫苗的保护效果和成本效益可能都不尽理想。在这样的情况下，被动免疫可能是目前有效预防和治疗人感染H7N9禽流感病毒的有效策略。在过去的研究中，针对流感病毒的单克隆中和抗体在动物实验中显示出良好的治疗作用和预防保护作用。目前国内外针对H7N9流感的单克隆中和抗体研究多为鼠源性的单克隆抗体，由于鼠蛋白的免疫反应限制了这种鼠源性的单克隆抗体的临床应用。采用基因工程技术对鼠源性的单克隆抗体进行人源化改造的人源化抗体虽然是目前单克隆抗体制品市场的主宰，但由于其仍保留鼠源的可变区序列，再加上人源化过程复杂并且结果不可控制，其发展前景也不为乐观。
发明内容
本发明的目的是提供一种结合H7N9病毒的HA蛋白的全人源抗H7N9的单克隆中和抗体，该抗体可以用于防治H7N9、并且还可以用于鉴定H7N9。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种抗H7N9的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区的互补性决定区域CDR1、CDR2、CDR3以及轻链可变区的互补性决定区域CDR1、CDR2、CDR3；重链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4所示，或者分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的序列至少具有80％同源性；轻链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示，或者分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的序列至少具有80％同源性。
优选地，重链CDR1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQID NO:8所示的氨基酸序列。将具有上述优选序列的抗体命名为mAb6137。
进一步，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的抗H7N9的单克隆抗体结合性质和中和性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。
本发明的抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与mAb6137抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。
进一步，所述抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述核酸分子编码包括SEQ ID NO:1-8所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸序列的的核苷酸序列。
进一步，所述核酸分子包括SEQ ID NO:9-16所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列，或包括与SEQ ID NO:9-16所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列至少在80％以上的核苷酸序列。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:9-16所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列。
具体明确，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:9；SEQID NO:2所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:16。
本发明的编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有上述优选的核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。
本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外，表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
表达载体是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的种类包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的表达载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS,293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选293F细胞。
用重组DNA转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明还提供给了一种利用前面所述的宿主细胞产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的宿主细胞并回收抗体或抗原结合片段。
本发明还提供了一种通过上述方法产生的抗体或抗原结合片段。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。
所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于已经被美国食品与药品管理局认可的而可用于人类或动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、香味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。
本发明还提供了一种包括本发明的抗H7N9的单克隆抗体或其抗原结合片段的H7N9检测产品。
所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出H7N9的检测产品均包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测H7N9水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取含有H7N9病毒的样品；
(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的抗H7N9病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段的接触；
(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。
本发明还提供了一种前面所述的抗H7N9的单克隆抗体的制备方法，所述制备方法采用的是单个B淋巴细胞抗体制备技术。所述单个B淋巴细胞抗体制备技术是将单细胞分离鉴定技术结合多种PCR技术形成的一种单克隆抗体的体外表达系统，即从人B淋巴细胞中直接获取全人源的单克隆抗体的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)分离感染H7N9的人外周血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，获得具有H7N9病毒HA蛋白阳性的单个B细胞；
(2)利用单细胞RT-PCR扩增步骤(1)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；
(3)将步骤(2)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；
(4)筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的抗H7N9病毒的单克隆抗体。
本发明还提供了前面所述的抗H7N9的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备H7N9检测产品中的应用。
所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的全抗H7N9病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备H7N9病毒检测产品均包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了前面所述的抗H7N9的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备前面所述的药物组合物中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗H7N9的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备抑制H7N9病毒的药物中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗H7N9的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗由H7N9感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明的抗体可以用于治疗H7N9感染患者，所述治疗是通过给予这些患者治疗有效量的能够结合H7N9病毒HA蛋白的抗体。“治疗有效量”是指能够在个体中有效减轻H7N9感染症状的剂量，或者是有效降低循环中病毒颗粒的剂量。
本发明的公开的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。
本发明的抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。
本发明的抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(PEG)集团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与PEG反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。
本发明的抗H7N9的单克隆抗体或其抗原结合片段可以以化学方法或者通过基因工程与其他因子缀合。这些因子提供将抗体靶向所需功能位点的作用或者为抗体提高或提供其他性能。
根据本发明的抗H7N9的抗体可以以化学方法或者通过基因工程标记，以提供可检测的抗体。可检测的抗体可以用于例如评定对象是否己经感染H7N9病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测H7N9病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。
为了检测和/或分析和/或诊断目的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
本文所用的术语“H7N9”与“H7N9病毒”可以互换使用。
本发明所涉及的序列具体信息如下：
SEQ ID NO:1
TGVHSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFIFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNNNNRAYADSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDILSLNMVRGGDEYYGIDVWGQGTTVTVSSAS；
SEQ ID NO:2
GFIFDDYA；
SEQ ID NO:3
ISWNNNNR；
SEQ ID NO:4
AKDILSLNMVRGGDEYYGID；
SEQ ID NO:5
TGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGSLLTFGGGTKVDIKRT；
SEQ ID NO:6
QDINNY；
SEQ ID NO:7
DAS；
SEQ ID NO:8
QQYGSLLT；
SEQ ID NO:9
ACCGGTGTACATTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCACCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAGTTGGAATAATAATAATAGAGCTTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAGGATATTCTCAGTCTTAATATGGTTCGGGGAGGGGACGAGTATTACGGTATCGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCG；
SEQ ID NO:10
ACCGGTGTACATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAACAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTCGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAATATGGTTCTCTTCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG；
SEQ ID NO:11
GGATTCATCTTTGATGATTATGCC；
SEQ ID NO:12
ATTAGTTGGAATAATAATAATAGA；
SEQ ID NO:13
GCAAAGGATATTCTCAGTCTTAATATGGTTCGGGGAGGGGACGAGTATTACGGTATCGAC；
SEQ ID NO:14
CAGGACATTAACAACTAT；
SEQ ID NO:15
GATGCATCC；
SEQ ID NO:16
CAACAATATGGTTCTCTTCTCACG。
本发明的优点和有益效果：
本发明制备的的抗H7N9病毒的单克隆抗体效价高、特异性强、成分清晰，可以高效表达、标准化生产、质量控制容易，成本低廉，可以有效中和H7N9病毒，具有抗感染作用，起到预防和治疗的作用。
附图说明
图1显示利用ELISA筛选出的mAb6137抗体表达上清与H7N9病毒HA蛋白的结合情况；
图2显示利用SDS-PAGE检测抗体mAb6137的表达及纯化情况；
图3显示利用免疫印迹检测纯化的mAb6137抗体与H7N9病毒HA蛋白的结合情况；
图4显示利用血凝抑制实验检测mAb6137抗体对H7N9病毒Wuxi-01介导的红细胞凝集反应的影响；
图5显示利用血凝抑制实验检测mAb6137抗体对H7N9病毒Suzhou-03介导的红细胞凝集反应的影响；
图6显示病毒感染后注射mAb6137抗体对H7N9病毒感染小鼠存活率的影响；
图7显示病毒感染前注射mAb6137抗体对H7N9病毒感染小鼠存活率的影响。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1 抗H7N9病毒的单克隆抗体mAb6137的制备
1、记忆性B细胞分选
1.1分离PBMC
采集3份H7N9恢复期病人外周抗凝血，用Ficoll密度梯度离心法分离外周血PBMC，液氮中保存。
1.2获取记忆性B细胞
将纯化的HA蛋白标记上PE和APC荧光染料，然后与Anti-CD3-Cy7APC、Anti-CD14-FITC、Anti-CD20-Cy7PE、Anti-CD19-PE-CF594、Anti-IgG-BV421、Anti-IgM-Cy55荧光标记的抗体按相应比例混合。从液氮中取出PBMC细胞，融化后经PBS洗涤，首先用AQUA染液将死细胞染色，然后再与上述混合抗体于冰上孵育结合。800g离心洗去未结合的抗体，PBS洗涤后过细胞筛去除细胞团块和可能的大块杂质，然后上BD FACSAriaⅡ流式细胞仪分选。将PE和APC双阳性以及部分GP单阳性的单个B淋巴细胞分选到已加上细胞裂解液的96孔板中，孵育裂解。
2、单细胞RT-PCR
用SuperScriptⅢ逆转录酶将96孔板中的单个B细胞的RNA逆转录成cDNA，然后先用位于抗体Leader区的混合引物进行第一轮PCR分别扩增重链、Kappa链和Lambda链，以第一轮PCR产物为模板，再用抗体起始区的混合引物进行第二轮PCR，在第二轮PCR引物中加入相应的克隆酶切位点第二轮PCR经过琼脂糖凝胶电泳，回收330bp左右的条带。
3、抗体表达
将上面获得的330bp左右的条带酶切后分别克隆入含有轻、重恒定区的IgG表达载体。重组质粒送测序，去除完全重复的序列再将轻、重链配对后转染293F细胞，表达抗体。
4、筛选抗体
待细胞克隆长成后，细胞上清采用ELISA法筛选与特异性抗原结合的抗体。步骤如下：将纯化的HA蛋白200ng/孔包被96孔ELISA板，表达上清从1:20开始倍比稀释，待测抗体的表达上清抗体加入ELISA板中37℃孵育1h，后PBST洗板，加入HRP标记的抗人Fc二抗，37℃孵育30min，PBST洗板后TMB显色。使用33株抗体表达上清与纯化的HA蛋白ELISA检测。图1所示，命名为mAb6137的抗体的表达上清显示与HA蛋白结合，同时用H7N9病毒恢感染复期患者血清为阳性对照(Positive Control,PC),用健康成人血清作为阴性对照(NegativeControl,NC)，对照血清从1:1000开始倍比稀释。
5、抗体结合活性的检测
选取mAb6137抗体的表达上清，从1:20开始在包被HA的ELISA板中将其倍比稀释，孵育后用HRP标记的抗人Fc检测，TMB显色后读取OD450，数值如表1所示。用感染H7N9病毒恢复期患者血清为阳性对照(Positive Control,PC),用健康成人血清作为阴性对照(Negative Control,NC)，对照血清从1:1000开始倍比稀释。
表1抗体结合活性检测
| 稀释比例 | mAb6137 | PC | NC |
| 1:20 | 2.057 | 1.585 | 0.064 |
| 1:40 | 1.911 | 1.065 | 0.058 |
| 1:80 | 1.372 | 0.65 | 0.063 |
| 1:160 | 0.971 | 0.439 | 0.057 |
| 1:320 | 0.584 | 0.257 | 0.058 |
| 1:640 | 0.35 | 0.158 | 0.061 |
| 1:128 | 0.211 | 0.104 | 0.058 |
| 1:256 | 0.153 | 0.102 | 0.057 |
5、抗体大量表达与纯化
(1)将含有mAb6137抗体重链可变区核苷酸序列的表达载体(重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)和含有mAb6137抗体轻链可变区核苷酸序列的表达载体(抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)在原核细胞中大量扩增，将上述表达载体用PEI瞬时转染293F细胞，于转染72h后收集细胞表达上清。细胞沉淀重悬于Freestyle培养基中，再转染一次，4天后收集上清。
(2)细胞表达上清23000rpm离心20min去细胞碎片，然后过0.2μm滤膜后，用AKTA过Protein A株亲和层析纯化抗体。
(3)Protein A株经pH＝2.2的甘氨酸-盐酸洗脱抗体，Tris中和后用透析卡透析去除杂质。
(4)纯化后的抗体经13000rpm离心30min去杂质，然后过0.2μm滤膜除菌后分装冻存于-80℃备用。
(5)利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE检验抗体mAb6137的表达及纯化情况，图2结果显示mAb6137抗体的重链和轻链蛋白条带清晰可见，表明体外大量表达mAb6137抗体成功。
实施例2 mAb6137抗体结合特异性的检测
利用免疫印迹方法检测纯化抗体与H7N9病毒HA蛋白的结合
1、步骤：
(1)纯化的H7N9病毒的HA蛋白经SDS-PAGE，同时用纯化的H3N2病毒的HA蛋白做对照，电泳完成后将胶中的蛋白转印至PVDF膜中，PVDF膜用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜，然后加入50μg的纯化抗体，37℃孵育2h，然后用PBST洗脱；
(2)1:2000加入抗人IgG二抗，37℃孵育1h，然后PBST洗脱；
(3)PVDF膜加上化学发光液在暗室里曝光。
2、结果
结果如图3所示，纯化的mAb6137抗体与H7N9病毒HA蛋白相结合。图3中“1”代表的是H7N9病毒HA蛋白所在的泳道，“2”代表的是H3N2病毒HA蛋白所在的泳道。
实施例3 mAb6137抗体的血凝抑制实验
1、血清、抗体的处理
一份阳性对照血清为H7N9病毒感染恢复期患者血清，一份阴性对照血清为健康成人血清。血清和抗体分别加入3倍体积的RDE，37℃孵育16-18小时，56℃灭活30min待用，血清加入6倍体积的PBS终浓度为1:10，抗体不加，终浓度为1:4。
2、1％火鸡红细胞的配制
预先在注射器中吸入2ml阿氏液，采2ml火鸡翅根静脉血，形成4ml全血混合物。将4ml血液加到50ml离心管中，向离心管内加冷的PBS液至50ml，轻柔混匀2000rpm离心5分钟去除上层悬液，再用PBS液洗涤部分沉积的细胞两次，弃去上层悬液。稀释部分沉积TRBC至PBS，使最终浓度为1％(500μl RBCs+50ml PBS)。
3、抗原配制
(1)在V底中从第二孔到第十二孔每孔加入50μl PBS；
(2)测试病毒加100μl到第一个孔内(双份)然后2倍系列稀释；
(3)向反应板中每孔加入50μl的TRBC悬液，轻柔混匀，并将反应板置于室温下孵育30分钟；
(4)30分钟后倾斜板子并观察RBC的沉淀的流动性来读取病毒的滴度。产生完全凝集的最高稀释度的病毒可作为HA滴度的终点。HA的滴度即为发生完全凝集的最后一个孔的病毒稀释度的倒数。
(5)将表2中的两种病毒分别稀释于冷的PBS中，制备成含有8个血凝抑制单位/每50μl(8HAU/50μl)的工作溶液。
表2病毒信息
4、红细胞凝集抑制
(1)向V底的微量第二排及以后的孔中每孔加入25μl的冷的PBS，向第一行的孔(A1-A11)中每孔加入50μl的RDE处理过的血清(1:10)及RDE处理过的抗体(1:4)，然后进行2倍系列稀释；
(2)加入25μl标准化的病毒至系列稀释的血清中，轻轻的振荡混匀反应板，置于37℃孵育45分钟；
(3)每孔加入50μl 1％TRBC，如前混匀，盖上反应板，在室温下放置大约30分钟使血细胞沉淀。读取HAI(血凝抑制试验)滴度。
5、结果
结果如图4和图5所示，图4和图5中的结果表明mAb6137抗体明显抑制了H7N9病毒导致的红细胞凝集反应，同时H7N9病毒感染恢复期患者血清可以抑制H7N9病毒的红细胞凝集反应，而阴性对照血清均无抑制红细胞凝集效应。其中图4对应的是Wuxi-01病毒株的结果，图5对应的是Suzhou-03病毒株的结果。
实施例4 mAb6137抗体中和活性检测
1、准备：mAb6137抗体为待检抗体，对照抗体mAb32为本室制备的抗H3N2季节性流感病毒的全人源抗体，实验前用PBS稀释成终浓度为0.2mg/ml备用。
2、实验步骤(所有步骤在BSL-3实验室内完成)
(1)稀释抗体：mAb6137和mAb32抗体从0.2mg/ml开始倍比稀释，每孔50μl，每个抗体做两个复孔；
(2)加入100倍TCID50/50μl病毒(病毒原液1:40稀释即可，病毒信息见表3)，于96孔板中稀释抗体轻轻混匀，37℃孵育1小时；
(3)在每个孔中加入4.5×104个细胞，37℃孵育18-20小时，取出观察病变，记录CPE；
(4)在生物安全柜中将培养上清弃去，PBS洗2次，用80％丙酮固定10min，弃去丙酮，自然晾干；
(5)加入1:1000稀释的抗甲型流感NP蛋白鼠源抗体，37℃孵育1h，PBST洗3遍；
(6)加入HRP标记的抗鼠二抗，37℃孵育1h，PBST洗3遍，OPD显色；
(7)根据阴性对照孔2.5倍标准差计算cut off值，根据计算结果判断中和滴度。
表3所用病毒信息
3、结果
(1)不同浓度的mAb6137抗体对Wuxi-01病毒株的中和效果见表4：
表4不同浓度mAb6137抗体对Wuxi-01病毒株的中和效果检测
(2)中和100×TCID50以下四株病毒需要的抗体质量(ng)见表5：
表5中和100×TCID50以下四株病毒需要的抗体质量
| 病毒株 | Wuxi-01 | Wuxi-02 | Nanjing-06 | Suzhou-03 |
| 抗体量(ng) | 40 | 80 | 20 | 40 |
实施例5 mAb6137抗体小鼠攻毒实验
1、治疗实验
1.1步骤
6W龄雌性小鼠轻度麻醉滴鼻感染10LD50H7N9病毒，小鼠分为两个大组，一个大组感染后2h腹腔注射mAb6137抗体、另一个大组感染后2h腹腔注射对照抗体mAb32(该抗体为本室制备的抗H3N2季节性流感病毒的全人源抗体)。按照抗体的注射剂量将每个大组分成四个小组：1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg。每个小组小鼠8只，观察14天，记录小鼠体重变化和死亡情况(用存活率表示)。小鼠体重下降超过30％的进行人道终点。
1.2结果
(1)小鼠存活率
如表6和图6所示，注射mAb6137抗体的感染小鼠，在5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg注射剂量下，从第9天一直到第14天存活率分别维持在37.5％、37.5％、75％，即从第9天开始小鼠无死亡。而注射对照抗体的小鼠到第7天的存活率就为0。上述结果表明，mAb6137抗体能有效治疗H7N9病毒感染。
表6小鼠存活率
| 攻毒后天数(d) | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 14 |
| mAb6137 1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 37.5 | 0 | |||
| mAb6137 5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 50 | 37.5 | 37.5 | 37.5 | 37.5 |
| mAb6137 10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 62.5 | 50 | 37.5 | 37.5 | 37.5 |
| mAb6137 20mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 87.5 | 75 | 75 | 75 | 75 |
| 对照抗体1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 75 | 25 | 0 | |||
| 对照抗体5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 75 | 25 | 0 | |||
| 对照抗体10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 62.5 | 0 | |||
| 对照抗体20mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 62.5 | 0 |
(2)小鼠的体重变化
如表7所示，注射mAb6137抗体的病毒感染小鼠，在5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg注射剂量下经历了体重下降又回升的过程。在5mg/kg、10mg/kg注射剂量下，到第14天小鼠的体重与开始时基本相同，在20mg/kg注射剂量下，到第14天小鼠的体重平均下降了7.51g，而注射对照抗体的小鼠体重一直在下降，到第5天体重平均下降了32.84，而到第7天的体重就因为下降了30％而进行人道终点。上述结果表明，mAb6137抗体能有效治疗H7N9病毒感染。
表7小鼠的体重变化
注：负值代表体重下降。
2、预防实验
2.1步骤
6W龄雌性小鼠分为两个大组，感染前1天分别腹腔注射mAb6137抗体、对照抗体mAb32注射1天后将小鼠轻度麻醉滴鼻感染10LD50H7N9病毒。按照抗体的注射剂量将每个大组分成三个小组：1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg。每组小鼠8只，观察14天，记录小鼠体重变化和死亡情况。小鼠体重下降超过30％的进行人道终点。
2.2结果
(1)小鼠存活率
如表8和图7所示，提前注射mAb6137抗体的感染小鼠，在5mg/kg、10mg/kg、注射剂量下，从第7天到第9天存活率分别维持在为25％、75％，即从第7天开始小鼠保持无死亡。而提前注射对照抗体的小鼠到第7天的存活率就为0了。上述结果表明，mAb6137抗体能有效预防H7N9病毒感染。
表8小鼠存活率
| 攻毒后天数(d) | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 14 |
| mAb6137 1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 50 | 12.5 | 0 | |||
| mAb6137 5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 37.5 | 25 | 25 | 25 | 25 |
| mAb6137 10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 87.5 | 75 | 75 | 75 | 75 |
| 对照抗体1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 50 | 25 | 0 | |||
| 对照抗体5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 75 | 12.5 | 0 | |||
| 对照抗体10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 50 | 0 |
(2)小鼠的体重变化
如表9所示，注射mAb6137抗体的感染小鼠。在5mg/kg、10mg/kg注射剂量下，经历了体重下降又回升的过程，到第14天小鼠的体重平均分别下降了5.27g和1.41g，而注射对照抗体的小鼠体重一直下降，到第5天体重平均下降了28.08g，而到第7天的体重就因为下降了30％而进行人道终点。上述结果表明，mAb6137抗体能有效预防H7N9病毒感染。
表9小鼠的体重变化
注：负值代表体重下降。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省疾病预防控制中心
<120> 抗H7N9病毒的单克隆抗体
<160> 16
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<210> 1
<211> 135
<212> PRT
<213> 人源
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Thr Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
1 5 10 15
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
20 25 30
Ile Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Asn Asn Asn Arg Ala
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala
65 70 75 80
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Leu Ser Leu Asn Met Val Arg
100 105 110
Gly Gly Asp Glu Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人源
<400> 2
Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人源
<400> 3
Ile Ser Trp Asn Asn Asn Asn Arg
1 5
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人源
<400> 4
Ala Lys Asp Ile Leu Ser Leu Asn Met Val Arg Gly Gly Asp Glu Tyr
1 5 10 15
Tyr Gly Ile Asp
20
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 人源
<400> 5
Thr Gly Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln
20 25 30
Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Phe Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Gly Ser Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
100 105 110
Thr
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人源
<400> 6
Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人源
<400> 7
Asp Ala Ser
1
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人源
<400> 8
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 405
<212> DNA
<213> 人源
<400> 9
accggtgtac attctgaagt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt acagcctggc 60
aggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcatct ttgatgatta tgccatgcac 120
tgggtccggc aagcaccagg gaagggcctg gagtgggtct ctggtattag ttggaataat 180
aataatagag cttatgcgga ctctgtgaag ggccgcttca ccatctccag agacagcgcc 240
aagaactccc tctatctgca aatgaacagt ctgagagctg aggacacggc cttgtattac 300
tgtgcaaagg atattctcag tcttaatatg gttcggggag gggacgagta ttacggtatc 360
gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag cgtcg 405
<210> 10
<211> 339
<212> DNA
<213> 人源
<400> 10
accggtgtac attcagacat ccagttgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta 60
ggagacagag tcaccatcac ttgccaggcg agtcaggaca ttaacaacta tttaaattgg 120
tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct tcgatgcatc caatttggaa 180
acaggggtcc catcaaggtt cagtggaagt ggatctggga cagattttac tttcaccatc 240
agcagcctgc agcctgaaga tattgcaaca tattactgtc aacaatatgg ttctcttctc 300
acgttcggcg gagggaccaa agtggatatc aaacgtacg 339
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人源
<400> 11
ggattcatct ttgatgatta tgcc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人源
<400> 12
attagttgga ataataataa taga 24
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人源
<400> 13
gcaaaggata ttctcagtct taatatggtt cggggagggg acgagtatta cggtatcgac 60
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人源
<400> 14
caggacatta acaactat 18
<210> 15
<211> 9
<212> DNA
<213> 人源
<400> 15
gatgcatcc 9
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人源
<400> 16
caacaatatg gttctcttct cacg 24
Claims (16)
1.一种抗H7N9病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区的互补性决定区域CDR1、CDR2、CDR3和/或轻链可变区的互补性决定区域CDR1、CDR2、CDR3；重链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4所示；轻链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO:9-16所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列。
6.一种包括权利要求4或5所述的核酸分子的表达载体。
7.一种包括权利要求4或5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。
8.一种包括治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
9.一种包括权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的H7N9病毒检测产品。
10.一种制备权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)分离感染H7N9病毒的人外周血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，获得具有H7N9病毒HA蛋白阳性的单个B细胞；
(2)利用单细胞RT-PCR扩增步骤(1)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；
(3)将步骤(2)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；
(4)筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的抗H7N9病毒的单克隆抗体。
11.一种利用权利要求7所述的宿主细胞产生抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括在合适的条件下培养所述的宿主细胞并回收抗体或抗原结合片段。
12.一种通过权利要求11所述的方法产生的抗体或抗原结合片段。
13.一种非诊断目的的检测H7N9病毒水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取含有H7N9病毒的样品；
(2)将步骤(1)获取的样品与权利要求1-3中任一项所述的抗H7N9病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段的接触；
(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。
14.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备H7N9病毒检测产品中的应用。
15.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备抑制H7N9病毒的药物中的应用。
16.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗由H7N9病毒感染引起的疾病的药物制剂中的应用。
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| CN108640981A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-10-12 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | H7n9亚型流感病毒重组蛋白及病毒疫苗 |
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- 2017-04-10 CN CN201710229262.9A patent/CN107011436B/zh active Active
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