CN106796209A - 在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进 - Google Patents

Abstract

表明在流体食物产品中存在或不存在微生物的系统。该系统具有用于容纳待检测的样本的瓶。该瓶具有传感器，该传感器将监测和检测至少一个样本参数中的变化，但是不存在包含支持微生物生长的营养物的添加物。瓶被放入培养箱中，且该瓶中的传感器被监测变化。培养箱被编程，以便如果传感器检测到监测的参数的值达到特定值，那么样本被确认为微生物生长阳性。

Description

在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进

相关申请的交叉参考

本申请要求2014年5月27日提交的中国专利申请号CN201410227620.9的权益，其公开内容在此通过引用并入本文。

背景技术

由食物传播的疾病是公众关注的问题。多数发达国家具有适当的政策和程序保证可靠安全的食物供应，避免了由可引起由食物传播的疾病的病原体造成的污染。

许多国家都已经开发了用于检查食物污染的测试和协议，以保证被污染的食物不会进入食物供应。这种协议的一个例子是中华人民共和国的国家食品安全标准。在美国，监控食物供应的病原体的检测和标准是由美国农业部公布并实施的。

这些检测的目标是使不安全或可能不安全的食物远离消费者。然而，像任何这样的检测一样，检测的完善性对确定对于消费是潜在地不安全的食物并使它们远离消费者而没有对病原体或污染进行错误的样本检测是至关重要的。假阳性对社会造成经济负担，对于供应商和消费者都一样。所以任何检查食物的方法、系统或装置在其对呈现现实的公众健康危机的食物进行确定时都必须准确。

中国检查标准的协议如图1所示。基本上，当静止于其被包装的容器中时，样本100(例如，如奶)被检查(120)在容器完整性上容器损坏或裂口的迹象。如果容器被确定为是完好的，则容器在步骤140被放入培养箱中。在约35℃的温度下容器被存储在培养箱中10天。在这段时间之后，容器被视觉地检查任何指示病原体存在的膨胀或扩张的迹象。如果容器具有在温育过程中在容器中微生物生长的特征，则容器在样本被打开并检查之前在冰箱中冷却。这确保了被污染的样本在其被打开时将不会被抽出容器。对照样本也被放入冰箱中作为经过温育的样本的对照。当经过温育的样本的内容物的pH值被测量时，其与经过冷藏的样本的内容物的pH值进行比较。0.5或更大的pH值差值表示在经过温育的样本中的微生物生长。

在温育(且在适当的时候进行冷却)后，表现出微生物生长的物理迹象的容器被打开(150)。内容物的等量试样被移出(160)且被放入无菌容器中。保留的样本被接种到培养基上，且样本被培养以确定是微生物污染来源的微生物。

当容器被打开时，内容物的pH值被测量，且样本的感官(organoleptic)特性(例如，由感觉经受到的特性如气味、颜色等)被检查(170)。然后准备该样本以进行显微镜检查(180)。显微镜检查是为了确认微生物污染的来源并确定微生物是否是致病的。在检查后发出报告。报告指出样本是可接受的(即，商业无菌)或是不可接受的(非商业无菌)。

由于长时间等待样本的温育，图1所述的方法费时。已经作出努力以利用自动化系统检测样本中的微生物生长来加速这种样本的检查。Zheng,J.等人的“study on rapiddetect commercial sterilization of fungus(i.e.mushroom)cans with BacT/ALERT3D system”，Food Science and Technology第9期，第196-199页(2007年)报道了利用BacT/ALERT 3D系统检测3天。在BacT/Alert中，样本被放入具有培养基的瓶中。该瓶还具有CO₂传感器。传感器检测样本中二氧化碳的存在。如果系统检测到温育过程中样品瓶的二氧化碳含量的增加超出了一定水平，则系统将样本标记为微生物生长阳性。对于这种研究，使用了两种包含培养基的瓶子。一个(i AST瓶)包含用于需氧细菌检测的培养基，而另一个(iNST瓶)包含用于厌氧细菌检测的培养基。这些瓶子(其包含培养基)被掺入(spiked)有低水平的不同种类的细菌和10ml的产物(蘑菇罐头中的溶液)。使用BacT/Alert获得结果的时间被列在表1中，且被报告在16小时至约30小时的范围内。还被报告的是使用45个包含蘑菇的罐头的未被掺入的样本试验。来自BacT/Alert的结果与利用中国协议检查的结果进行比较，此处中国协议被称为标准测试协议。BacT/Alert在45个样本中确认了一个阳性样本，并且使用标准测试协议验证污染。

Zheng,J.等人的“Application of BacT/Alert3D system in detection ofCommercial Sterilization of Konjac Cans”，NEED TO INSERT NAME OF JOURNAL,第29卷，第10期，第463-467页(2008年)描述了以BacT/Alert 3D检测Konjac罐头。59个罐头的样本(没有掺入)被检测。结果与使用标准测试进行检测的罐头结果进行比较。三个容器的样品用于此检测。从一个容器中，10ml的样本被加入每个BacT/Alert瓶中。具体地，10ml样本被加至i.AST和i.NST瓶的每一个中。第二个容器通过标准测试协议进行分析，而第三个容器被保持在室温下以用于随后的检测。对于使用标准测试协议检测的罐头，没有罐头未通过质量控制。然而，以BacT/Alert检测的样本中的19个被报告为在一个或两个瓶子中微生物生长呈阳性。当与对照(使用标准测试进行检测)比较时，这些阳性结果被认为是假阳性。在该19个BacT/Alert阳性样本中，其中的三个被确定不含微生物。为了确定微生物的存在或不存在，来自阳性瓶子的样本被接种到五种不同的标准培养基上以检测微生物生长的存在或不存在。同时，来自阳性瓶子的样本也在显微镜下被检查以证明微生物生长。根据这些，确定的是该三个阳性样本是假阳性样本，因为对于这些样本中的所有三个，从被接种的培养物或使用显微镜检查的样本中，没有微生物生长的迹象。从其它16个通过使用BacT/Alert检测而确认为阳性的瓶子中分离出了多种细菌。根据此文章，Konjac罐头可能包含一些活的微生物，但是由于高pH环境(10-12.5)，那些微生物不能在Konjac罐头中生长。因此，在这些罐头中，任何可能存在的微生物都不是致病的，不会使得内容物对于消费是不安全的，且会通过由中国政府建立的标准测试协议。然而，一旦样本在包含培养基的瓶子中被稀释以用于BacT/Alert检测，微生物能够生长且引起BacT/Alert仪器报告阳性结果。

Dong,R.等人在黑龙江省CDC，中国初级保健(Chinese Primary Health Care)第23卷，第12期(2009年12月)描述了将BacT/Alert用于评估奶的无菌性。在这项研究中，一种超高温(UHT)奶掺入有两种细菌菌株(大肠杆菌和蜡状芽孢杆菌(B.cereus))。由于这两种细菌菌株在有氧环境下生长，所以仅评估了AST瓶。该检测证明了较大体积的样本更为灵敏，但是由于没有将利用BacT/Alert得到的结果与标准测试协议的结果进行比较，所以没有解决假阳性问题。

因而，继续寻找具有较少检测时间但又在假阳性或假阴性的数量方面有利地与标准测试协议相比较的测试食物病原体的替代方法和系统。

发明内容

用于检测流体食物污染的系统。系统使用适合被用于培养箱中的样本容器，该培养箱监测置于容器中的样本以证明微生物生长。在这方面，传感器被置于容器中。当样本在培养箱中被加热时，传感器监测样本的至少一个参数。该参数是这样的样本条件，其在温育过程中在样本中发生微生物生长时将会变化。在这方面，传感器会对样本参数中的变化提供响应，该样本参数响应于微生物的代谢活动而变化。这样的参数包括样本中的氧浓度、样本中的二氧化碳浓度、或样本的pH。

当监测传感器时，如果参数的测量值超出预定值时，则系统将瓶子标记为微生物存在阳性。传感器被置于容器中，以便当样本被引入容器中时，传感器与样本接触。系统被编程有与微生物生长相关的监测参数的预定阈值。在这方面，如果测得的参数是由微生物的代谢活动产生的(例如，CO₂)，则测得的参数将增加。由此产生，如果测量参数值被微生物代谢活动消耗(例如，O₂)，则该参数将降低。

系统在培养箱中具有用于接收样本容器的容纳器(receptacle)。样本容器被放置以使得系统检测器能在样本在培养箱中温育过程中监测传感器。样本容器是为了向其中引入样本而不含包括用于微生物生长的营养物的添加物而提出的。

还描述了检测流体食物的微生物污染的方法。在该方法中，从被检查的商业包装的样本中抽出检测样本。检测样本被引入无菌容器中，该容器具有监测与微生物生长相关的参数的传感器。样本以液体形式被引入容器中。然而，样本可以是液体样本(例如奶)或包裹有另外的固体样本的盐水或液体，或为了检测而被液化的固体样本。样本在本文中被称为液体样本，其中被检测的样本在环境和检测温度下是液体。传感器被放置在容器中，以便其在随后的温育过程中会接触检测样本。容器不具有支持在其中微生物生长的营养物。样本随后在约30℃到38℃的温度下被温育，同时监测传感器的由传感器监测的参数的变化。如果传感器读数是与微生物生长相关的预定值，那么样本被标记为对于微生物生长为阳性的样本。

附图说明

当结合附图进行阅读时，本发明的这些和其它目的、优点以及新颖的特点将从下述的详细描述中变得更容易理解，其中：

图1是标准测试协议的流程图；

图2是根据本发明的实施方式的采用多个温育和测量仪器的系统的框图，其每一个利用光热光谱来监测样品瓶中的气体，例如，氧或二氧化碳的浓度，从而检测样品瓶中的微生物生长；

图3是图1所示的系统中所用的仪器的详细视图；

图4是图3中的仪器的剖面顶视图；和

图5是被配置用于此处描述的系统和方法的BACTEC瓶。

详细描述

图2示出了根据本发明的实施方式的用于检测样本培养物中的微生物生长的系统100。如所示，系统100包括与中央计算机104连接的多个温育和测量模块102。中央计算机104可控制温育温度和时间，以及由模块102完成的测量定时，且能对由模块102获得的数据读数进行搜集和分类。系统100还可包括数据输出设备，例如打印机106，其可被中央计算机104控制以打印由温育和测量模块102获得的数据读数。

这种系统的实例是本领域技术人员所熟知的，因而此处不再详述。这种系统的一个实例是BD BACTEC^TM FX40，其可从Becton Dickinson购得。BD BACTEC^TM FX40的操作描述在文件号为8090414以及产品目录号为441980的BD BACTEC^TM FX40的仪器用户手册中，该手册通过引用并入本文。BD BACTEC^TM FX40和其它这样的仪器(例如，Lansing Michigan的Neogen公司的)的操作是本领域技术人员所公知的，因而此处不再详述。

图3和图4示出了温育和测量模块102的更多细节。如所示，本实施例中的每个温育和测量模块102包括外壳108和可以在沿箭头A的方向滑入和滑出外壳108的两个搁板(shelves)110。每个搁板110包括多个开口112，每个开口都适于容纳样品瓶114。开口112被以如所示的多个行和列设置，且每个搁板110可具有任何实际数目的开口。例如，开口112可被设置成9行，每行具有9列，因此每个搁板110总计81个开口112。

当样本将被温育和测量模块102分析时，样本被放置于样品瓶114中，而样品瓶114被装载入温育和测量模块102中的各自开口112。在本实施例中样品瓶114是密闭的样品瓶。温育和测量模块102还可包括键盘、条形码阅读器、或任何其它适合的接口，其使实验员能将关于样本的信息输入存储于温育和测量模块102、中央计算机104，或两者的存储器中的数据库。信息可包括，例如，患者信息、样本类型、装载样品瓶114的开口112的行和列，等等。

每个温育和测量模块102还包括可移动的监测组件116，其能够通过监测来自布置于样品瓶114内的传感器210的信号来监测样品瓶114中的培养基的内容物。参见图5。这种传感器监测样品瓶114在温育过程中的参数。这样的样本包括氧水平、二氧化碳水平、pH值等。传感器将检测这种条件下随时间的变化。这种传感器是本领域技术人员所熟知的，因而此处不再详述。配置培养箱，以便当被监测的参数的值超过(crosses)特定阈值时，系统将瓶子(及其内容物)标记为微生物生长阳性。

如上所述，保证食品供应不被病原体污染是重要的。根据世界卫生组织(WHO/FAO)，食品供应的目标是商业无菌。这被定义为“不存在能够在食品可能在生产、分配和存储过程中被保持的常规非冷藏条件下在食品中生长的微生物”。

由中华人民共和国食品安全国家标准推荐的商业无菌标准测试协议(GB4789.26-2013)是在36℃+/-1℃下将包装食品温育10天，寻找膨胀的包装，然后将所有包装打开用于pH检测、视觉和显微镜检查。

尽管每次手工检测的成本相对低，但是手工方案是费时和费力的过程。对于大容量培养箱(容纳各种形式的大包装食品)的需求明显增加了食品制造商和检测食品的那些机构的成本。在本文描述的实施方式中，用于检测血液培养物中微生物生长的常规仪器已经被改装(adapted)和改造(modified)以监测食品是否存在微生物。这种仪器，例如，BDBACTEC^TMFX40，在本文描述的方法中的使用提供了一种方法和系统，该方法和系统在控制假阳性和假阴性的数量时递送获得结果的时间(time to result)快得多。因此，本文描述的系统和方法提供了快得多的获得结果时间(time to result)，而没有明显增加现有方法实现的假阳性或假阴性的数量。

在本文描述的方法中，食品样本(例如奶)被引入被配置用于系统的样品瓶中，该系统监测血液培养物的微生物生长。样品瓶114具有布置在内部——优选在其中传感器将在样本被引入瓶中时接触样本的位置处——的传感器210。瓶114是无菌的，且空气基本上完全从其中排空。

瓶容量约为50ml。瓶的尺寸将会变化，所以瓶的容量也将改变。然而，瓶必须具有适当的容量以容纳将确保样本的足够灵敏度的样本容量。在这一点上，如果瓶只能容纳极小的样本，则该样本在样本部分中的污染物(如果有的话)方面不能代表样本内容。例如，如果容器的尺寸是一加仑，而用于检测的样本体积仅为10ml，则真有可能的是样本部分可不包含微生物，即使它们存在于容器中。对于本文描述的方法和装置，最小的样本尺寸将会是不少于约10ml，且优选不少于50ml。

瓶优选处于一定程度的真空下，以便样本可易于被引入样品容器中。用于将液体样本引入容器中的装置是公知的，因而此处不再赘述。

传感器通常是CO₂传感器。合适的传感器的实例在Gentle等的美国专利号5,998,517中被描述，该专利通过引用并入本文。传感器，例如硅传感器，被布置于凝胶基质中。传感器在温育过程中被询问以监测样本中二氧化碳水平的变化。当瓶中的二氧化碳水平超过预定的阈值时，该瓶被标记为包含被检测为其中微生物存在为阳性的样品。

其中分配有样本的样品瓶114不包含任何促进微生物生长的营养培养基。对于这种应用，重要的是保持样本完整并保证用于微生物生长的营养物来自样本本身而不是来自添加到样本中的添加物。如下面的实例所示，当培养基存在于容器——其中样本被布置、温育和监测微生物生长的存在与否——中时，假阳性的数量惊人地增加。

使用UHT奶作为食物样本的实例，准备不包含培养基的样品瓶。在一个实施方式中，瓶是被配置用于BACTEC血液培养设备的那些瓶。UHT奶样本(50ml)从三种不同的盒获得。这些样本被掺入有微生物(蜡状芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌(B.licheniform)；产气芽孢杆菌(C.perfringens)；金黄色葡萄球菌(S.aureus)；铜绿假单胞菌；发酵乳杆菌(L.fermentus))。为了比较，10ml相同被掺入的UHT奶样本也被加入至含有裂解/厌氧(Lytic/Anaerobic)培养基的BACTEC瓶。所有的BACTEC瓶被加载在FX200或BACTEC9240中用于检测。

通过上述标准测试协议检测掺入有相同浓度的微生物的UHT奶样本。当使用标准测试协议时，使用空的BACTEC瓶和50ml奶样本的结果显示与获得的结果较好地关联。尽管申请人不期望坚持特定理论，但是申请人相信，与在具有培养基的瓶中的样本相比，在没有培养基的瓶中测试的样本的更低假阴性率是由于较大的样本尺寸(50ml对10ml)和/或产生了错误结果的培养基的选择。较大的样本尺寸对具有低浓度生物的样本更敏感。

还观测到当使用上述标准测试协议检测那些盒时，某些细菌(例如产气芽孢杆菌)在两种奶盒中没有生长。当使用BACTEC在不具有培养基的瓶中检测50ml样本时，进行相同的观测。因此，本文描述的方法产生了与已建立的测试协议兼容的结果。相反，当向含有裂解/厌氧培养基的瓶引入10ml样本时，测得那些样本对于微生物生长为阳性。这被解释为是假阳性。因此，使用不含培养基的BACTEC瓶的假阳性率低于具有培养基的BACTEC瓶(使用标准测试协议)。

在3种不同种类的盒中获得已经使用超高温巴氏灭菌的奶(UHT奶)：i)预包装(软塑料)；ii)利乐包(硬塑料)；和利乐砖(硬纸板盒)。这些产品均从中国当地超市购得。

细菌原液溶液被稀释至非常低的浓度，且相同的量被掺入两个相同的UHT奶包装盒中(每个盒中掺入0.01cfu-0.5cfu/ml)。其中一个被掺入的盒被密封并放入36℃培养箱中(现有技术的参考方法，也被称作标准程序)，而另一个被用于含有和不含培养基的BACTEC瓶的研究。

在参考方法中，每天检查盒的泄露/膨胀，并且如果在盒中观测到异常，立刻打开盒以进一步检查。其它看上去正常的盒在被打开以进一步检测之前被留在培养箱中约10天。该检测是：i)pH值；ii)气味；iii)检查沉淀或聚集的物质；和iv)将物质铺平板于TSA和RCM琼脂上并在36℃下温育后寻找菌落生长。如果上述参数中的任意一个出现异常，这些样本被确认为被污染的样本。

这些样本中的部分被布置于包含用于BACTEC的标准裂解/厌氧培养基的瓶中。这种培养基可以从Becton Dickinson商业获得，在此不再赘述。

对于另一组瓶子，培养基就像任何残余气体一样被吸出瓶子。在那些瓶子中，注入50ml被掺入的UHT奶。

对于第三组瓶子，5ml盐水被加入空的BACTEC瓶，然后该BACTEC瓶被高压灭菌。那些瓶中的气体被注射器抽出以在瓶中生成足够的真空来将样本吸入。然后50ml被掺入的奶被注入瓶中，且在每次试验中使用两个相同的瓶子。这些瓶子被加载到BACTEC FX200或BACTEC 9240中以进行检测。如果在五天的温育后样本仍然是阴性的，那么样本被认为是商业无菌的。

相同的被掺入的样本盒是用于在不含培养基的瓶中研究和用于在具有培养基的瓶中研究的样本的来源。每个盒包含大于200ml的奶，因此存在用于这两种研究的足量样本。注入每个包含裂解/厌氧培养基的瓶中的被掺入的样本的量为10ml。两个相同的瓶被用于每次试验。对于掺入有铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的样本，除了其中两个具有厌氧培养基的瓶之外还使用一个包含好氧培养基的瓶。如果在温育5天后样本仍然是阴性的，那么这些样本被认为是商业无菌的。

表1.培养基对于掺入有铜绿假单胞菌的样本的结果的影响

结果显示不是所有的生物都在所有的培养基中生长。如上所示，铜绿假单胞菌在好氧培养基中生长而不在厌氧培养基中生长。显然，如果使用不具有培养基的瓶子，则不必选择生物会在其中生长的特定培养基。如果使用不具有培养基的瓶子，则不考虑培养基选择。来自不具有培养基的瓶中的样本的测试结果与其中目标生物生长的培养基(好氧培养基)中的样本的结果完全一致。布置在不具有培养基的瓶中的样本的结果与使用标准协议温育的样本的结果完全一致。

表2样本尺寸对掺入有发酵乳杆菌的样本的结果的影响

该试验显示在含培养基和仅十毫升(mls)的样本的瓶中获得了假阴性。假阴性没有一致地获得，从而，将需要至少两个瓶，瓶中仅含十毫升与培养基组合的样本。该两个瓶对标记假阳性或假阴性是必须的。这种假阳性或假阴性将针对另外的相同样本通过不一致的结果被标记。当样本尺寸为50ml时，没有产生假阴性。无培养基的测试结果与参考方法匹配(两者都显示了污染)，而一半使用培养基的瓶(具有10ml样本尺寸)产生了假阴性结果。

表3培养基对生物生长的影响，该生物在不含掺入有产气芽孢杆菌样本的培养基的情况下在样本中不能生长

如使用参考协议得到的结果所示，产气芽孢杆菌在那两种包装的UHT奶中不生长。然而，使用其中布置有厌氧培养基的瓶产生那些样本的阳性结果。这种实验显示不含培养基的瓶中的样本分析产生与测试协议关联更好的结果。这是因为不存在表现出促进微生物生长的培养基。因此，虽然含培养基的瓶能促进微生物的生长——该微生物反而不会在样本中生长，但是本方法和系统将不产生假阳性。

尽管本发明已经通过具体实施方式得到描述，应理解的是这些实施方式仅仅说明本发明的原理和应用。因此应理解的是可以对说明性实施方式做出许多更改，并且可以设想其它的安排，而不脱离所附权利要求限定的本发明的精神和范围。

Claims (14)

1.检测食物污染的系统，所述系统包括：

样本容器，所述样本容器被配置用于培养箱，所述培养箱监测布置于所述容器中的样本；

布置于所述容器中的传感器，所述传感器被配置以当所述样本在所述培养箱中被加热时监测所述样本的至少一个参数，条件为响应所述样本中的微生物生长而改变的条件，其中所述传感器被置于所述容器中，以便，当所述样本被引入所述容器中时，所述传感器与所述样本接触；

所述系统编程有所述监测的参数的预定值，所述预定值指示所述样本中的微生物生长；

在所述培养箱中的容纳器，用于容纳所述样本；

检测器，用于在所述培养箱中的所述样本温育期间监测所述传感器中的变化；

其中，所述样本容器不含包含用于微生物生长的营养物的添加物。

2.权利要求1所述的系统，其中所述监测的参数选自二氧化碳浓度、氧浓度和pH。

3.权利要求1所述的系统，其中所述样本是液体样本。

4.权利要求1所述的系统，其中所述样本是奶。

5.权利要求1所述的系统，其中所述温育温度为约30℃至约38℃。

6.权利要求1所述的系统，其中所述容器的体积为至少约10ml。

7.权利要求1所述的系统，其中所述样本的体积为至少约10ml。

8.用于测试食品样本的微生物污染的方法，包括：

从被检查的商业包装的样本抽取测试样本；

将处于液体形式的所述测试样本引入无菌容器中，所述无菌容器其中布置有传感器，所述传感器监测与微生物生长相关的参数，所述传感器被置于所述容器中，以便其在随后的温育过程中接触所述测试样本；

当监测所述传感器时，在从约30℃至38℃的温度下温育所述测试样本；

监测来自所述传感器的信号，并且如果所述监测的来自所述传感器的信号是与微生物生长相关的预定值，则将所述样本标记为微生物生长阳性；

其中，在其中引入所述测试样本的所述样本容器不包含支持微生物生长的营养物。

9.权利要求8所述的方法，其中所述监测的参数选自二氧化碳浓度、氧浓度和pH。

10.权利要求8所述的方法，其中所述测试样本是液体食物或已被液化的固体食物样本的液体测试样本。

11.权利要求10所述的方法，其中所述液体食物为奶。

12.权利要求8所述的方法，其中温育温度约为35℃。

13.权利要求8所述的方法，其中所述容器的体积为至少约10ml。

14.权利要求8所述的方法，其中所述测试样本的体积为至少约10ml。