CN113866302A - 一种快速区分水果罐头商业无菌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速区分水果罐头商业无菌的检测方法，它利用顶空气相色谱‑质谱联用技术检测正常水果罐头与腐败水果罐头保温前后顶部空气中二氧化碳水平，根据二氧化碳水平是否发生显著变化（峰面积百分比差值超过10%），来区分水果罐头的商业无菌，达到区分水果罐头商业无菌的目的。本发明采用的方法中，比现有的传统检测方法时间缩短5~6天，该检测方法作为一种水果罐头商业无菌的初步筛选工具，不但可以降低检测成本，而且还适应快速发展的国际贸易需求。

Description

一种快速区分水果罐头商业无菌的检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用顶空气相色谱-质谱联用(Headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技术快速区分水果罐头商业无菌的检测方法。
背景技术
罐头食品在生产过程中控制微生物引发的腐败变质及其产生毒素是至关重要的。密封不良或者杀菌不足会造成内容物腐败变质或平酸菌败坏[1]。水果罐头是以新鲜水果为主要原料，经过加工处理、罐装、排气、密封、加热杀菌、冷却等工序，达到商业无菌，延长了食品保质期。水果罐头属于酸性罐头食品，热力杀菌不充分的话，无法达到食品保藏要求，各种细菌、霉菌、酵母菌等腐败菌在酸性环境得以生长引起水果罐头腐败变质，无法达到商业无菌的要求。
我国为了规范罐头食品安全，针对罐头食品的微生物检测制定了专门的检测标准GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》。标准中商业无菌检验的原理为：将罐头食品在特定温度下保温十天。保温过程中，罐头内未被充分杀死的微生物会利用罐头食品本身的营养进行生长繁殖，导致pH值变化、气体产生、产品感官的变化(外观，色泽，气味等)，通过涂片染色镜检可以看到有明显的微生物增殖情况。罐头食品经保温试验出现胖听或泄露，经过感官检查不正常、pH值有明显变化、涂片镜检微生物有明显增殖现象时为非商业无菌。
我国不仅是全球最大的罐头生产国，同时也是全球最大的罐头出口国。罐头食品的商业无菌检验都采用传统的的十天保温微生物学检验法，该方法检测周期长，无法适应快速发展的贸易需求，因此建立一种快速的检测水果罐头商业无菌的方法，十分必要。
微生物(细菌、霉菌、酵母菌等腐败菌)的生长会产生二氧化碳，水果罐头腐败后，产生的二氧化碳使容器膨胀。通过比较保温前后水果罐头中顶部空气中二氧化碳水平变化，判断是否商业无菌：若二氧化碳水平发生显著变化，说明样品中有微生物繁殖，则判定为非商业无菌；在指定的天数之后，若二氧化碳水平没有发生显著的变化，则判定为商业无菌。非商业无菌的水果罐头的进一步验证，留样按GB 4789.26-2013中进行附录B异常原因分析试验并记录。
本方法采用顶空气相色谱质谱联用法对水果罐头顶空中的二氧化碳等气体进行检测，通过比较保温前后罐头食品顶空中二氧化碳水平变化，对罐头食品是否为商业无菌进行判断。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速区分水果罐头商业无菌的检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：利用顶空气相色谱-质谱联用(Headspace gaschromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技术检测正常水果罐头与腐败水果罐头中保温前后顶部空气中二氧化碳水平，根据二氧化碳水平是否发生显著变化，区分水果罐头商业无菌。
1、水果罐头的前处理
开启包装后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后作为保温前检测，用顶空针抽取1mL上层气体进样；同时用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后30℃～40℃放置1～5d后，作为保温后检测，设定顶空自动进样器条件，用顶空针抽取1mL上层气体进样。
2、HS-GC-MS分析条件
顶空(HS)进样条件：加热箱温度30～50℃，定量环温度：60℃，传输线温度：60℃，样品平衡时间：1～10min；进样体积：1mL；分流比：70:1。
气相色谱(GC)条件：色谱柱(30m×250μm×3μm)；进样口温度：220℃；载气：高纯氦(He)，流速：1.2mL/min。
质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度230℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：20～300u。
3、水果罐头顶空气测定
3.1将试样注入气相色谱-质谱联用仪，设定自动识别信噪比大于100的色谱峰；质谱图的相似度≥80％的色谱峰，MS结果经计算机检索谱库进行定性分析，利用面积归一法计算，得到水果罐头食品试样顶空气体的含量。空气本底、正常和异常水果罐头保温前后顶空气体的含量参见实施例。
3.2罐头食品顶空气体的百分比Yi，按式(1)计算，通过测定相应峰面积对所有成分峰面积总和的百分数来计算给定组分i的含量：
Figure BDA0003280851430000031
式中：
Yi——水果罐头中某种顶空气体占总顶空气体的百分比，单位为百分率(％)；
Asi——水果罐头中某种顶空气体i的峰面积；
∑Asi——水果罐头中所有顶空气体峰面积之和。
结果保留3位有效数字。
水果罐头保温前后顶空气体中二氧化碳含量未有显著增加，结果为阴性；水果罐头保温前后顶空气体中二氧化碳含量显著增加(峰面积百分比差值超过10％)，表明有微生物繁殖，结果为阳性。
仪器分析结果为阴性，感官检查、pH测定正常，则报告为商业无菌。
仪器分析结果为阳性，经过国标GB 4789.26-2013验证试验无微生物增殖现象，则报告为商业无菌。
仪器分析结果为阳性，经过国标GB 4789.26-2013验证试验有微生物增殖现象，则报告为非商业无菌。
该检测方法作为一种水果罐头商业无菌的初步筛选工具，比现有的传统检测方法时间缩短5～6天，不但可以降低检测成本，而且还适应快速发展的国际贸易需求。
附图说明
图1是空气本底总离子流(TIC)质谱色谱图。
图2是商业无菌的黄桃罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图。
图3是非商业无菌的黄桃罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图。
图4是商业无菌的草莓罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图。
图5是非商业无菌的草莓罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1黄桃罐头商业无菌的检测方法-顶空气相色谱质谱联用法
(1)、黄桃罐头的前处理
开启包装后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后作为保温前检测，用顶空针抽取1mL上层气体进样；同时用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口36℃放置4d后，作为保温后检测，设定顶空自动进样器条件，用顶空针抽取1mL上层气体进样。
(2)、HS-GC-MS分析条件
顶空(HS)进样条件：加热箱温度36℃，定量环温度：60℃，传输线温度：60℃，样品平衡时间：1min；进样体积：1mL；分流比：70:1。
气相色谱(GC)条件：Agilent CP7348PT PoraBOND Q PT色谱柱(30m×250μm×3μm)或等效柱；进样口温度：220℃；载气：高纯氦(He)，流速：1.2mL/min。
质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度230℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：20～300u。
(3)、黄桃罐头顶空气测定
3.1将试样注入气相色谱-质谱联用仪，设定自动识别信噪比大于100的色谱峰；质谱图的相似度≥80％的色谱峰，MS结果经计算机检索谱库进行定性分析，利用面积归一法计算，得到黄桃罐头试样顶空气体的含量。空气本底、正常和异常黄桃罐头保温前后顶空气体的含量参见表1、表2、表3。
3.2罐头食品顶空气体的百分比Yi，按式(1)计算，通过测定相应峰面积对所有成分峰面积总和的百分数来计算给定组分i的含量：
Figure BDA0003280851430000051
式中：
Yi——黄桃罐头中某种顶空气体占总顶空气体的百分比，单位为百分率(％)；
Asi——黄桃罐头中某种顶空气体i的峰面积；
∑Asi——黄桃罐头中所有顶空气体峰面积之和。
结果保留3位有效数字。
黄桃罐头保温前后顶空气体中二氧化碳含量未有显著增加，结果为阴性；罐头食品保温前后顶空气体中二氧化碳量显著增加(峰面积百分比差值超过10％)，表明有微生物繁殖，结果为阳性。
仪器分析结果为阴性，感官检查、pH测定正常，则报告为商业无菌。
仪器分析结果为阳性，经过国标GB 4789.26-2013验证试验无微生物增殖现象，则报告为商业无菌。
仪器分析结果为阳性，经过国标GB 4789.26-2013验证试验有微生物增殖现象，则报告为非商业无菌。
表1空气本底质谱色谱峰对应气体列表
Figure BDA0003280851430000061
5mL无菌水至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后检测空气本底气体组成，空气本底总离子流(TIC)质谱色谱图(图1)，结果为空气本底二氧化碳含量低于2％(表1)。
表2商业无菌的黄桃罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表
Figure BDA0003280851430000062
国标方法检测为商业无菌的黄桃罐头，黄桃罐头内容物5mL至灭菌顶空进样瓶内，商业无菌的黄桃罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图(图2)，结果为保温前和保温后二氧化碳含量差值(峰面积百分比差值)为1.41％，未有显著增加，结果为阴性，与国标方法检测方法一致，均为商业无菌(表2)。
表3非商业无菌的黄桃罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表
Figure BDA0003280851430000071
国标方法检测为非商业无菌的黄桃罐头，黄桃罐头内容物5mL至灭菌顶空进样瓶内，非商业无菌的黄桃罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图(图3)，结果为保温前和保温后二氧化碳含量差值(峰面积百分比差值)为59.8％，二氧化碳量显著增加，结果为阳性，与国标方法检测方法一致，均为非商业无菌(表3)。
黄桃罐头通过充氮气和二氧化碳混合气体等，极大地降低食品和容器中氧气的含量，使容器内潜在的微生物生长处于停滞状态，有效控制罐头的腐败变质，因此检测到罐头顶空气中含有二氧化碳。水果罐头漏气或者其他原因造成罐头腐败、变质，微生物繁殖，顶空气中二氧化碳含量发生变化。
实施例2草莓罐头商业无菌的检测方法-顶空气相色谱质谱联用法
(1)、草莓罐头的前处理
开启包装后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后作为保温前检测，用顶空针抽取1mL上层气体进样；同时用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口36℃放置4d后，作为保温后检测，设定顶空自动进样器条件，用顶空针抽取1mL上层气体进样。
(2)、HS-GC-MS分析条件
顶空(HS)进样条件：加热箱温度36℃，定量环温度：60℃，传输线温度：60℃，样品平衡时间：1min；进样体积：1mL；分流比：70:1。
气相色谱(GC)条件：Agilent CP7348PT PoraBOND Q PT色谱柱(30m×250μm×3μm)或等效柱；进样口温度：220℃；载气：高纯氦(He)，流速：1.2mL/min。
质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度230℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：20～300u。
(3)、草莓罐头顶空气测定
3.1将试样注入气相色谱-质谱联用仪，设定自动识别信噪比大于100的色谱峰；质谱图的相似度≥80％的色谱峰，MS结果经计算机检索谱库进行定性分析，利用面积归一法计算，得到草莓罐头试样顶空气体的含量。空气本底、正常和异常草莓罐头保温前后顶空气体的含量参见表4、表5、表6。
3.2罐头食品顶空气体的百分比Yi，按式(1)计算，通过测定相应峰面积对所有成分峰面积总和的百分数来计算给定组分i的含量：
Figure BDA0003280851430000081
式中：
Yi——草莓罐头中某种顶空气体占总顶空气体的百分比，单位为百分率(％)；
Asi——草莓罐头中某种顶空气体i的峰面积；
∑Asi——草莓罐头中所有顶空气体峰面积之和。
结果保留3位有效数字。
草莓罐头保温前后顶空气体中二氧化碳含量未有显著增加，结果为阴性；罐头食品保温前后顶空气体中二氧化碳量显著增加(峰面积百分比差值超过10％)，表明有微生物繁殖，结果为阳性。
仪器分析结果为阴性，感官检查、pH测定正常，则报告为商业无菌。
仪器分析结果为阳性，经过国标GB 4789.26-2013验证试验无微生物增殖现象，则报告为商业无菌。
仪器分析结果为阳性，经过国标GB 4789.26-2013验证试验有微生物增殖现象，则报告为非商业无菌。
表4空气本底质谱色谱峰对应气体列表
Figure BDA0003280851430000091
5mL无菌水至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后检测空气本底气体组成，空气本底总离子流(TIC)质谱色谱图(图1)，结果为空气本底二氧化碳含量低于2％(表4)。
表5商业无菌的草莓罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表
Figure BDA0003280851430000092
国标方法检测为商业无菌的草莓罐头，草莓罐头内容物5mL至灭菌顶空进样瓶内，商业无菌的草莓罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图(图4)，结果为保温前和保温后二氧化碳含量差值(峰面积百分比差值)为0.3％，未有显著增加，结果为阴性，与国标方法检测方法一致，均为商业无菌。
表6非商业无菌的草莓罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表
Figure BDA0003280851430000101
国标方法检测为非商业无菌的草莓罐头，草莓罐头内容物5mL至灭菌顶空进样瓶内，非商业无菌的草莓罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(TIC)质谱色谱图(图5)，结果为保温前和保温后二氧化碳含量差值(峰面积百分比差值)为54.1％，二氧化碳量显著增加，结果为阳性，与国标方法检测方法一致，均为非商业无菌。
草莓罐头通过充氮气和二氧化碳混合气体等，极大地降低食品和容器中氧气的含量，使容器内潜在的微生物生长处于停滞状态，有效控制罐头的腐败变质，因此检测到罐头顶空气中含有二氧化碳。水果罐头漏气或者其他原因造成罐头腐败、变质，微生物繁殖，顶空气中二氧化碳含量发生变化。

Claims (3)

1.一种快速区分水果罐头商业无菌的检测方法，其特征在于，利用顶空气相色谱-质谱联用技术检测正常水果罐头与腐败水果罐头保温前后顶部空气中二氧化碳含量，根据二氧化碳含量是否发生显著变化，来区分水果罐头的商业无菌。
2.如权利要求1所述的快速区分水果罐头商业无菌的检测方法，其特征在于，二氧化碳含量是否发生显著变化的判断依据是峰面积百分比差值超过10%。
3.如权利要求1所述的快速区分水果罐头商业无菌的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）开启包装后，用灭菌吸管以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后作为保温前检测，设定顶空自动进样器条件，用顶空针抽取1 mL上层气体进样；
2）开启包装后，同时用灭菌吸管以无菌操作取出内容物至少5mL至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后30℃~40℃放置1~5d后，作为保温后检测，设定顶空自动进样器条件，用顶空针抽取1 mL上层气体进样；
正常水果罐头保温前和保温后顶空气体二氧化碳含量未有显著变化，腐败水果罐头保温前后顶部空气中二氧化碳含量显著增加，峰面积百分比差值超过10%。
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