BR112016027916B1

BR112016027916B1 - Sistema para testar alimentos acerca de contaminação e método para testar uma amostra de alimento acerca de contaminação microbiana

Info

Publication number: BR112016027916B1
Application number: BR112016027916-6A
Authority: BR
Inventors: Xiao Li; Yan Zhang; Jianwei Liu
Original assignee: Becton Dickinson Holdings Pte Ltd
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2022-03-29
Also published as: EP3149471B1; AU2015267228B2; CN106796209A; US11761024B2; AU2015267228A1; WO2015183816A1; US10865432B2; MX2016015538A; EP3149471A1; CN105462824A; CN105462824B; JP6784598B2; US20170191110A1; EP3149471A4; US20210071226A1; JP2017527258A; EP3149471C0; BR112016027916A2; CN106796209B

Abstract

APERFEIÇOAMENTOS NO USO DE PLATAFORMAS DE CULTURA DE SANGUE PARA TESTES DE ESTERILIDADE COMERCIAL. Trata-se de um sistema que indica a presença ou ausência de micro-organismos em produtos alimentícios fluidos. O sistema tem uma garrafa para o recebimento de amostra a ser testada. A garrafa tem um sensor que irá monitorar e detectar alterações em pelo menos um parâmetro de amostra, mas nenhum aditivo que contêm nutrientes que sustentam o crescimento microbiano. A garrafa é colo-cada em um incubador e o sensor na garrafa é monitorado acerca de alterações. O incubador é programado de modo que, se o sensor detectar que o valor do parâmetro monitorado tem alcançado um determinado valor, então, a amostra é determina-da como positiva para crescimento microbiano.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[001] O presente pedido reivindica o benefício da data de depósito do pedido de patente chinesa n° CN201410227620.9, depositado em 27 de maio de 2014, cuja revelação está incorporada ao presente documento a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As enfermidades transmitidas por alimentos são uma matéria de preo-cupação pública. As nações mais desenvolvidas têm políticas e procedimentos ado-tados para assegurar um suprimento de alimentos confiavelmente seguro, livre de contaminação por patógenos que podem causar enfermidades transmitidas por ali-mentos.

[003] Muitos países têm desenvolvido testes e protocolos para a inspeção de alimento acerca de contaminação para assegurar que o alimento contaminado não entre no suprimento de alimento. Um exemplo de tal protocolo é o Padrão de Segu-rança Alimentar Nacional da República Popular da China. Nos Estados Unidos, os testes e padrões para o monitoramento do suprimento de alimento acerca de patóge- nos são promulgados e aplicados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Uni-dos.

[004] O objetivo desses testes consiste em manter os alimentos inseguros ou potencialmente inseguros distantes dos consumidores. No entanto, como com qual-quer tal teste, a integridade do teste é de importância crucial para identificar alimentos que são potencialmente inseguros para o consumo e manter os mesmos longe dos consumidores sem ter amostras com teste em falso acerca de patógenos ou contami-nação. Os falsos positivos são um fardo econômico para a sociedade, tanto para for-necedores como para consumidores. Assim, qualquer método, sistema ou dispositivo que inspecione alimentos precisa ser preciso em sua identificação de alimentos que apresentam um risco real para a saúde pública.

[005] O protocolo para o padrão de inspeção Chinês é ilustrado na Figura 1. Basicamente, a amostra 100 (como, por exemplo, leite) enquanto ainda no recipiente em que a mesma é embalada, é examinada (120) acerca de sinais de dano de recipi-ente ou uma violação da integridade do recipiente. Se o recipiente for determinado como adequado, o recipiente é colocado em um incubador na etapa 140. O recipiente é armazenado no incubador a uma temperatura de cerca de 35 °C durante 10 dias. Após esse tempo, o recipiente é inspecionado visualmente acerca de quaisquer sinais de inchaço ou expansão que são indicativos da presença de patógenos. Se o recipiente contiver sinais de crescimento microbiano no recipiente durante a incubação, o recipiente é resfriado em um refrigerador antes de a amostra ser aberta e inspecionada. Isso assegura que a amostra contaminada nãoseja aspirada para fora do recipiente quando a mesma é aberta. As amostras de controle são também colocadas no refrigerador como um controle para as amostras incubadas. Quando o pH dos conteúdos das amostras incubadas é medido, o mesmo é comparado com o pH dos conteúdos das amostras refrigeradas. Uma diferença de pH de 0,5 ou mais é uma indicação de crescimento microbiano na amostra incubada.

[006] Mediante a incubação (e resfriamento quando for adequado), os recipi-entes que exibem sinais físicos de crescimento microbiano são abertos (150). Uma alíquota dos conteúdos é removida (160) e colocada em um recipiente estéril. A amos-tra reservada é inoculada em meio de cultura e a amostra é cultivada para identificar os micróbios que são a fonte da contaminação microbiana.

[007] Quando o recipiente é aberto, o pH dos conteúdos é medido e as pro-priedades organolépticas da amostra (por exemplo, as propriedades experimentadas pelos sentidos, como odor, cor, etc.) são inspecionadas (170). A amostra é, então, preparada para o exame microscópico (180). O exame microscópico é destinado a identificar a fonte da contaminação microbiana e para determinar se os micróbios são patogênicos. Após a inspeção é emitido um relatório. O relatório indica que a amostra é aceitável (isto é, esterilização comercial) ou não aceitável (esterilização não comer-cial).

[008] Os métodos descritos na Figura 1 são demorados devido às longas es-peras para a incubação da amostra. Foram feitas tentativas para acelerar a inspeção de tais amostras com o uso de um sistema automatizado para a detecção de cresci-mento microbiano em amostras. Zheng, J., et al., “Study on rapid detect commercial sterilization of fungus (i.e. mushroom) cans with BacT/ALERT 3D system”, Food Sci-ence and Technology, No. 9, páginas 196 a 199 (2007), relatam três dias para a de-tecção com o uso do sistema BacT/ALERT 3D. No BacT/Alert, a amostra é colocada em uma garrafa com meio de cultura. A garrafa tem, também, um sensor de CO2. O sensor detecta a presença de dióxido de carbono na amostra. Se o sistema detectar um aumento no teor de dióxido de carbono da garrafa de amostra além de um deter-minado nível durante a incubação, o sistema sinaliza a amostra como positiva para crescimento microbiano. Para esse estudo, dois tipos de garrafas contendo meios fo-ram usados. Uma (a garrafa i AST) continha meio para detecção de bactérias aeróbi- cas e a outro (a garrafa i NST) continha meio para a detecção de bactérias anaeróbi- cas. As garrafas (que continham meios) foram reforçadas com níveis baixos de tipos diferentes de bactérias e 10 ml do produto (solução em latas de cogumelo). O tempo até o resultado com o uso de BacTAlert foi listado na Tabela 1 e foi relatado como na faixa de 16 horas a cerca de 30 horas. É relatado também um experimento de amostra não reforçada com o uso de 45 latas contendo cogumelos. Os resultados a partir do BacT/Alert foram comparados com os resultados a partir da inspeção com o uso do protocolo chinês mencionado como o protocolo de teste padrão no presente docu-mento. BacT/Alert identificou uma amostra positiva entre as 45 amostras, e a conta-minação foi verificada com o uso do protocolo de teste padrão.

[009] Zheng, J., et al., “Application of BacT/Alert 3D System in detection of Commercial Sterilization of Konjac Cans”, Food Science, Vol. 29, No. 10, páginas 463 a 467 (2008), descrevem o teste de latas de Konjac com BacT/Alert 3D. As amostras a partir de cinquenta e nove latas (não reforçadas) foram testadas. Os resultados foram comparados com os resultados das latas testadas com o uso do teste padrão. Três recipientes de amostra foram usados para esse teste. A partir de um recipiente, 10 ml de amostra foram adicionados a cada garrafa de BacTAlert. Especificamente, 10 ml de amostra foram adicionados a cada uma das garrafas i. AST e i. NST. O segundo recipiente foi analisado pelo protocolo de teste padrão e o terceiro recipiente foi mantido à temperatura ambiente para os testes de acompanhamento. Para as latas testadas com o uso do protocolo de teste padrão, todas as latas passaram no controle de qualidade. No entanto, dezenove dentre as amostras testadas com BacT/Alert fo-ram relatadas como positivas para crescimento microbiano em uma ou ambas as gar-rafas. Esses resultados positivos foram considerados falsos positivos quando compa-rados com o controle (teste por meio do teste padrão). Entre as dezenove amostras positivas de BacT/Alert, três foram confirmadas como não contendo micro-organismos. Para confirmar a presença ou ausência de micro-organismos, a amostra a partir de garrafas positivas foram inoculadas em cincos meios padrão diferentes para detectar a presença ou ausência de crescimento microbiano. Entretanto, a amostra a partir das garrafas positivas foi examinada também sob um microscópio acerca da evidência de crescimento microbiano. A partir disso, foi determinado que as três amostras positivas foram amostras falsas positivas em vez que, para todas as três dentre essas amostras, não houve sinal de crescimento microbiano a partir das culturas inoculadas ou das amostras submetidas ao exame por meio de microscópio. Diversas bactérias foram isoladas a partir das outras dezesseis garrafas identificadas como positivas através do teste com o uso de BacT/Alert. De acordo com esse artigo, as latas de Konjac provavelmente contêm alguns micro-organismos vivos, mas aqueles micro- organismos não podem crescer nas latas de Konjac devido ao ambiente de alto pH (10 a 12,5). Portanto, nessas latas, quaisquer que sejam os micro-organismos que possam estar presentes não seriam patogênicos, não tornariam os conteúdos insegu-ros para o consumo e seriam aprovados no protocolo de teste padrão estabelecido pelo governo chinês. Entretanto, uma vez que as amostras foram diluídas em garrafas contendo meio de cultura para o teste em BacT/Alert, os micro-organismos tiveram capacidade para crescer e dispararam o instrumento BacT/Alert para relatar resultados positivos.

[010] Dong, R., et al. Heilongjiang Province CDC, Chinese Primary Health Care, Vol. 23, No. 12 (dezembro de 2009) descrevem o uso de BacT/Alert para a avaliação da esterilidade de leite. Nesse estudo, um tipo de leite de temperatura ultra alta (UHT) foi reforçado com 2 cepas de bactérias (E. coli e B. cereus). À medida que ambas as cepas de bactérias cresceram em um ambiente aeróbico, apenas a garrafa AST foi avaliada. O teste demonstrou que um volume maior da amostra foi mais sen-sível, mas não tratou do problema de falsos positivos, à medida que não comparou os resultados obtidos com o uso de BacT/Alert com o protocolo de teste padrão.

[011] Consequentemente, continuam sendo procurados métodos e sistemas alternativos para testar alimentos acerca de patógenos que têm reduzido o tempo até a detecção, mas que são favoravelmente comparáveis com protocolos de teste padrão em termos de número de falsos positivos ou falsos negativos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[012] Um sistema para testar alimentos fluidos acerca da contaminação. O sistema usa um recipiente de amostra que é adaptado para ser usado em um incuba-dor que monitora uma amostra disposta no recipiente para evidência de crescimento microbiano. Sob esse aspecto, há um sensor disposto no recipiente. O sensor moni-tora pelo menos um parâmetro da amostra à medida que a amostra é aquecida no incubador. O parâmetro é uma condição da amostra que irá se alterar caso o cresci-mento microbiano ocorra na amostra durante a incubação. Sob esse aspecto, o sensor irá fornecer uma resposta às alterações em um parâmetro da amostra que se altera em resposta à atividade metabólica dos micro-organismos. Tais parâmetros incluem a concentração de oxigênio na amostra, a concentração de dióxido de carbono na amostra ou o pH da amostra.

[013] Mediante o monitoramento do sensor, o sistema irá sinalizar uma garrafa como positiva para a presença de micro-organismos se o valor medido do parâmetro exceder um valor predeterminado. O sensor é colocado no recipiente de modo que, quando a amostra é introduzida no recipiente, o sensor fique em contato com a amos-tra. O sistema é programado com o valor limiar predeterminado do parâmetro monito-rado associado ao crescimento microbiano. Sob esse aspecto, o parâmetro medido irá aumentar se o parâmetro medido for produzido pela atividade metabólica do micro-organismo (por exemplo, CO2). Por conseguinte, o parâmetro irá diminuir se o parâ-metro de medição de valor for consumido pela atividade metabólica do micro-orga-nismo (por exemplo, O2).

[014] O sistema tem um receptáculo no incubador para o recebimento dos recipientes de amostra. Os recipientes de amostra são posicionados de modo que o detector do sistema possa monitorar o sensor durante a incubação da amostra no incubador. Os recipientes de amostra são apresentados para a introdução de amostra nos mesmos sem conter aditivos que incluem nutrientes para o crescimento microbi-ano.

[015] É descrito também um método para testar alimentos fluidos acerca de contaminação microbiana. Nesse método, uma amostra de teste é retirada a partir de uma amostra comercialmente embalada mediante a inspeção. A amostra de teste é introduzida em um recipiente estéril com um sensor que monitora um parâmetro as-sociado ao crescimento microbiano. A amostra é introduzida no recipiente sob a forma líquida. No entanto, a amostra pode ser uma amostra líquida (por exemplo, leite) ou salmoura ou líquido embalado com uma amostra de outro modo sólida, ou uma amos-tra sólida que foi liquefeita para o teste. A amostra é mencionada como uma amostra líquida no presente documento, com a amostra sob o teste sendo líquida em tempe-raturas ambiente e de teste. O sensor é colocado no recipiente de modo que o mesmo entre em contato com a amostra de teste durante a incubação subsequente. O recipi-ente não tem nutrientes que sustentam o crescimento microbiano no mesmo. A amos-tra é, então, incubada a uma temperatura de cerca de 30 °C a 38 °C, mediante o monitoramento do sensor acerca de alterações no parâmetro monitorado pelo sensor. Se a leitura do sensor for um valor predeterminado associado ao crescimento micro-biano, a amostra é sinalizada como uma amostra positiva para crescimento microbi-ano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[016] Esses e outros objetivos, vantagens e características inovadoras da in-venção serão mais prontamente observadas a partir da seguinte descrição detalhada quando lida em combinação com os desenhos em anexo, em que:

[017] A Figura 1 é um diagrama de fluxo do protocolo de teste padrão;

[018] A Figura 2 é um diagrama de blocos de um sistema que emprega múlti-plos instrumentos de incubação e medição de acordo com uma modalidade da pre-sente invenção, em que cada um usa espectroscopia fototérmica para monitorar a concentração de um gás, como oxigênio ou dióxido de carbono, em garrafas de amos-tra, para detectar, assim, crescimento de micro-organismos nas garrafas de amostra;

[019] A Figura 3 é uma vista detalhada de um instrumento empregado no sis-tema mostrado na Figura 1;

[020] A Figura 4 é uma vista superior em recorte do instrumento na Figura 3; e

[021] A Figura 5 é uma garrafa BACTEC configurada para o uso no sistema e método descritos no presente documento.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[022] Um sistema 100 para a detecção de crescimento de micro-organismos em culturas de amostra, de acordo com uma modalidade da presente invenção, é mostrado na Figura 2. Conforme ilustrado, o sistema 100 inclui uma pluralidade de módulos de incubação e medição 102 que são conectados a um computador central 104. O computador central 104 pode controlar as temperaturas e tempos de incuba-ção, bem como a temporização das medições realizadas pelos módulos 102 e pode coletar e classificar as leituras de dados obtidas pelos módulos 102. O sistema 100 pode incluir também um dispositivo de saída de dados, como uma impressora 106 que pode ser controlada pelo computador central 104 para imprimir leituras de dados ob-tidas pelos módulos de incubação e medições 102.

[023] Os exemplos de tais sistemas são bem conhecidos por aqueles elemen-tos versados na técnica e não são descritos em detalhes no presente documento. Um exemplo de tal sistema é o BD BACTECTM FX40 que é comercialmente obtido junto à Becton Dickinson. A operação do BD BACTECTM FX40 é descrita no manual do usu-ário do instrumento BD BACTECTM FX40 que é o número de documento 8090414 e número de catálogo 441980, que está incorporado ao presente documento a título de referência. A operação de BD BACTECTM FX40 e outros tais instrumentos (por exem-plo, Soleris® disponível junto à Neogen Corporation de Lansing Michigan é bem co-nhecido por um elemento versado na técnica e não é descrito em detalhes no presente documento).

[024] Os detalhes adicionais do módulos de incubação e medição 102 são mostrados nas Figuras 3 e 4. Conforme ilustrado, cada módulo de incubação e medi-ção 102 inclui, nesse exemplo, um alojamento 108 e duas prateleiras 110 que podem deslizar para dentro e para fora do alojamento 108 em uma direção ao longo da seta A. Cada prateleira 110 inclui uma pluralidade de aberturas 112, das quais cada uma é adaptada para receber uma garrafa de amostra 114. As aberturas 112 são dispostas em uma pluralidade de fileiras e colunas conforme mostrado, e cada prateleira 110 pode ter qualquer número prático de aberturas. Por exemplo, as aberturas 112 podem ser dispostas em nove fileiras, com nove colunas em cada fileira, totalizando, assim, 81 aberturas 112 por prateleira 110.

[025] Quando uma amostra deve ser analisada pelo módulo de incubação e medição 102, a amostra é colocada em uma garrafa de amostra 114, e a garrafa de amostra 114 é carregada em uma respectiva abertura 112 no módulo de incubação e medição 102. A garrafa de amostra 114 é uma garrafa de amostra fechada nesse exemplo. O módulo de incubação e medição 102 pode incluir, adicionalmente, um teclado, um leitor de código de barras ou qualquer outra interface adequada que pos-sibilite que um técnico insira informações que pertencem à amostra em uma base de dados armazenada em uma memória no módulo de incubação e medição 102, no computador central 104, ou ambos. As informações podem incluir, por exemplo, infor-mações do paciente, tipo de amostra, a fileira e coluna da abertura 112 na qual a garrafa de amostra 114 está sendo carregada, e assim por diante.

[026] Cada módulo de incubação e medição 102 inclui, adicionalmente, um conjunto de monitoramento móvel 116 que tem capacidade para monitorar os conte-údos de um meio nas garrafas de amostra 114 mediante o monitoramento de sinais a partir de um sensor 210 disposto dentro da garrafa de amostra 114. Consulte a Figura 5. Tais sensores monitoram um parâmetro na garrafa de amostra 114 durante a incu-bação. Tais amostras incluem níveis de oxigênio, níveis de dióxido de carbono, pH, etc. Os sensores irão detectar uma alteração em tais condições ao longo do tempo. Tais sensores são bem conhecidos por um elemento versado na técnica e não são descritos em detalhes no presente documento. O incubador é configurado de modo que, quando o valor do parâmetro que é monitorado cruza um determinado limiar, o sistema sinalize a garrafa (e seus conteúdos) como positiva para o crescimento de micro-organismos.

[027] Conforme observado acima, é importante assegurar que o suprimento de alimento não seja contaminado por patógenos. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO/FAO), o objetivo do suprimento de alimentos é a esterilidade comercial. Isso é definido como "a ausência de micro-organismos com capacidade para crescer no alimento em condições não refrigeradas normais nas quais o alimento é propenso a ser mantido durante a fabricação, distribuição e armazenamento".

[028] O protocolo de teste padrão para a esterilidade comercial que é reco-mendada pelo Padrão Nacional da República Popular da China para a segurança dos alimentos (GB 4789.26-2013), consiste em incubar o alimento embalado a 36 °C +/- 1 °C durante 10 dias, procurar embalagens inchadas e, então, abrir todas as embalagens para o teste de pH, inspeções visuais e microscópicas.

[029] Embora o custo por teste manual seja relativamente baixo, o protocolo manual é um processo demorado e trabalhoso. A exigência por incubadores de grande capacidade (para acomodar todos os tipos de alimentos em embalagem a gra-nel) adiciona custo significativo aos fabricantes de alimento e àquelas organizações que testam o alimento. Nas modalidades descritas no presente documento, os instru-mentos convencionais para a detecção de crescimento microbiano em culturas de sangue têm sido adaptados e modificados para monitorar o alimento acerca da pre-sença ou ausência de micro-organismos. O uso de tais instrumentos, como BD BACTECTM FX40, nos métodos descritos no presente documento fornece um método e sistema que oferecem um tempo de resultado muito mais rápido, enquanto que con-trola o número de falsos positivos e falsos negativos. Portanto, o sistema e métodos descritos no presente documento fornecem um tempo de resultado muito mais rápido sem um aumento significativo no número de falsos positivos ou falsos negativos al-cançados por métodos anteriores.

[030] No método descrito no presente documento, a amostra de alimento (por exemplo, leite) é introduzida em uma garrafa de amostra configurada para o uso em um sistema que monitora culturas de sangue para o crescimento microbiano. A garrafa de amostra 114 tem um sensor 210 disposto na parte interior, de preferência, em um local em que o sensor ficará em contato com a amostra quando a amostra é introduzida na garrafa. A garrafa 114 é estéril e o ar é evacuado da mesma de modo substancialmente completo.

[031] O volume da garrafa é de cerca de 50 ml. O tamanho da garrafa irá variar e, assim, o volume da garrafa. No entanto, as garrafas precisam ser de um volume adequado para receber um volume de amostra que irá assegurar a sensibilidade ade-quada da amostra. Sob esse aspecto, se as garrafas puderem apenas receber uma amostra muito pequena, então, a amostra poderia não ser representativa dos conteú-dos de amostra em termos dos contaminantes (se houver algum) na porção de amos-tra. Por exemplo, se o tamanho do recipiente for um galão e o volume da amostra para testar for de apenas 10 ml, existe uma possibilidade real que a porção de amostra pode não conter um micro-organismo mesmo se estiverem presentes no recipiente. Para o método e aparelho descritos no presente documento, o tamanho de amostra mínimo seria não menor que cerca de 10 ml e, de preferência, não menor que 50 ml.

[032] A garrafa é, de preferência, sob algum vácuo de modo que a amostra possa ser facilmente atraída para o recipiente de amostra. O aparelho para atrair as amostras líquidas para recipientes é bem conhecido e não é descrito em detalhes no presente documento.

[033] O sensor é tipicamente um sensor de CO2. Os exemplos de sensores adequados são descritos na patente n° U.S. 5.998.517 por Gentle et al., a qual está incorporada ao presente documento a título de referência. O sensor, por exemplo, um sensor de silicone, é disposto em uma matriz de gel. O sensor é interrogado durante a incubação para monitorar alterações em níveis de dióxido de carbono na amostra. Quando os níveis de dióxido de carbono na garrafa excedem um limiar predetermi-nado, a garrafa é sinalizada como contendo amostra que apresentou um resultado positivo do teste para a presença de micro-organismos na mesma.

[034] A garrafa de amostra 114 na qual a amostra é dispensada não contém qualquer meio de nutriente que facilite o crescimento microbiano. Para essa aplicação, é importante preservar a integridade da amostra e assegurar que os nutrientes para o crescimento microbiano procedam da própria amostra e não de aditivos para a amostra. Conforme ilustrado no exemplo a seguir, o número de falso positivo aumenta surpreendentemente quando o meio de cultura está presente no recipiente em que a amostra é disposta, incubada e monitorada acerca da presença ou ausência de crescimento microbiano.

[035] Com o uso de leite UHT como um exemplo de uma amostra de alimento, as garrafas de amostra que não continham meio de cultura foram preparadas. Em uma modalidade, as garrafas são aquelas que são configuradas para uso no disposi-tivo de cultura de sangue BACTEC. As amostras (50 ml) de leite UHT foram obtidas a partir de três tipos diferentes de embalagens. As amostras foram reforçadas com mi-cro-organismos (B. cereus, B. licheniform, C. perfringens, S. aureus; P. aeruginosa; L. fermentus). Para comparação, 10 ml das mesmas amostras de leite UHT reforçadas foram também adicionados a garrafas BACTEC contendo meio lítico/anaeróbico. To-das as garrafas BACTEC foram carregadas em um FX200 ou BACTEC 9240 para a detecção.

[036] As amostras de leite UHT reforçadas com as mesmas concentrações de micro-organismos foram testadas por meio do protocolo de teste padrão descrito acima. Os resultados com o uso de garrafas BACTEC vazias com 50 ml de amostras de leite mostraram-se correlacionar melhor com os resultados obtidos quando o pro-tocolo de teste padrão foi usado. Embora os requerentes não desejem se ater a uma teoria particular, os requerentes acreditam que as taxas de falso negativo menores para as amostras testadas em garrafas sem meio em comparação com as amostras em garrafas com meio sejam devido ao tamanho de amostra maior (50 ml versus 10 ml) e/ou à seleção de um meio que rende um resultado falso. Um tamanho de amostra maior é mais sensível a amostras que têm uma baixa concentração de organismos.

[037] Foi observado também que determinadas bactérias (por exemplo, C. perfringens) não cresceram em dois tipos de embalagens de leite quando aquelas embalagens foram testadas com o uso do protocolo de teste padrão descrito acima. Quando as amostras de 50 ml foram testadas em garrafas sem meio com o uso de BACTEC, a mesma observação foi feita. Dessa forma, o método descrito no presente documento rende resultados compatíveis com o protocolo de teste estabelecido. Em contrapartida, quando as amostras de 10 ml foram introduzidas em garrafas que con-tinham meio lítico/anaeróbico, aquelas amostras apresentaram um resultado positivo do teste para crescimento de micro-organismo. Isso é interpretado como um falso po-sitivo. Portanto, a taxa de falsos positivos foi menor com o uso de garrafas BACTEC sem meio em relação à com meio (com o uso do protocolo de teste padrão).

[038] O leite que foi pasteurizado com o uso de temperaturas ultra altas (leite UHT) foi obtido em 3 tipos diferentes de embalagens: i) Prepack (plástico macio); ii) Tetra Pack (plástico duro); e Tetra Brik (caixa de papelão dura). Os produtos foram adquiridos a partir de supermercados locais na China.

[039] As soluções de estoque de bactérias foram diluídas a uma concentração muito baixa e a mesma quantidade foi reforçada em 2 embalagens idênticas de leite UHT (0,01 ufc a 0,5 ufc/ml foram reforçados em cada embalagem). Uma das embala-gens reforçadas foi vedada e colocada em um incubador a 36 °C (o método de refe-rência da técnica anterior, também mencionado como o protocolo padrão), e a outra foi usada para estudos em garrafas BACTEC com e sem meio.

[040] No método de referência, as embalagens foram examinadas diariamente acerca de vazamento/expansão e foram abertas imediatamente para o exame adicional se fossem observadas anormalidades nas embalagens. Outras embalagens que pareceram normais foram deixadas no incubador durante cerca de 10 dias antes de serem abertas para os testes adicionais. os testes foram: i) pH; ii) odor; iii) inspeção por precipitados ou material agregado; e iv) distribuição do material em placas de ágar TSA e RCM e procura por crescimento de colônia após a incubação a 36 °C. As amostras foram identificadas como amostras contaminadas se qualquer um dentre os parâmetros acima parecessem anormais.

[041] Uma porção das amostras foi disposta em garrafas que continham o meio lítico/anaeróbico padrão para BACTEC. Esse meio é obtido comercialmente junto à Becton Dickinson e não é descrito em detalhes no presente documento.

[042] Para um outro conjunto de garrafas, o meio foi aspirado para fora das garrafas, como foi qualquer ar residual. Naquelas garrafas, 50 ml de leite UHT refor-çado foram injetados.

[043] Para um terceiro conjunto de garrafas, 5 ml de solução salina foram adi-cionados a garrafas BACTEC vazias que foram, então, submetidas à autoclave. O ar naquelas garrafas foi aspirado por uma seringa para gerar vácuo suficiente na garrafa para atrair a amostra. Então, 50 ml de leite reforçado foram injetados nas garrafas e 2 duplicatas de garrafas foram usadas para cada experimento. As garrafas foram carre-gadas em um BACTEC FX 200 ou um BACTEC 9240 para a detecção. As amostras foram consideradas comercialmente estéreis se as amostras fossem ainda negativas após cinco dias de incubação.

[044] A mesma embalagem de amostra reforçada foi a fonte de amostra para estudos em garrafas sem meio e para os estudos em garrafas com meio. Cada em-balagem continham mais de 200 ml de leite e, portanto, existiu uma quantidade ade-quada de amostra para ambos os estudos. A quantidade de amostra reforçada em cada garrafa contendo meio lítico/anaeróbico foi de 10 ml. Duas garrafas duplicadas foram usadas para cada experimento. Para a amostra reforçada com P. aeruginosa, uma garrafa contendo meio aeróbico foi usado em adição a duas garrafas com meio anaeróbico nas mesmas. As amostras foram consideradas comercialmente estéreis se as amostras fossem ainda negativas após 5 dias de incubação. Tabela 1

[045] Efeito do meio sobre o resultado para amostras reforçadas com P. aeruginosa

[046] Os resultados demonstraram que nem todos os organismos irão crescer em todos os meios. Conforme demonstrado acima, P. aeruginosa cresceu em meio aeróbico, mas não cresceu em um meio aeróbico. Obviamente, se as garrafas sem meio forem usadas, um indivíduo não tem que selecionar um meio específico no qual o organismo irá crescer. Se as garrafas sem meio forem usadas, não existe preocupação em relação à seleção de meios. Os resultados do teste a partir das amostras em garrafas sem meio foram completamente consistentes com os resultados para as amostras em meio no qual o organismo alvo cresceu (o meio aeróbico). Os resultados para as amostras dispostas em garrafas sem meio tiveram correspondência completa com o resultado para as amostras incubadas com o uso do protocolo padrão. Tabela 2

[047] Efeito do tamanho de amostra sobre os resultados com amostras refor- çadas com L. ermentum

[048] Esse experimento mostrou que falsos positivos foram obtidos nas garrafas com meio e apenas dez mililitros (ml) de amostra. Os falsos negativos não foram consistentemente obtidos, assim, pelo menos duas garrafas seriam exigidas para gar-rafas que contêm apenas dez ml de amostra combinada com meio. As duas garrafas são necessárias para sinalizar falsos positivos ou falsos negativos. Tais falsos positivos ou falsos negativos seriam sinalizados por resultados inconsistentes para as amostras de outro modo idênticas. Os falsos negativos não foram gerados quando o tamanho de amostra foi de 50 ml. Os resultados de teste sem meio foram correlacionados com o método de referência (ambos mostram contaminação), enquanto que metade das garrafas com o uso de meio (com tamanho de amostra de 10 ml) gerou resultados falsos negativos. Tabela 3

[049] Efeito do meio sobre o crescimento de organismos que não poderiam crescer na amostra sem o meio para amostras reforçadas com C. perfringens

[050] C. perfringens não cresceu naqueles dois tipos de leite UHT embalado, conforme demonstrado pelos resultados com o uso do protocolo de referência. No entanto, o uso de garrafas com meio anaeróbico disposto nas mesmas rendeu resultados positivos para aquelas amostras. Esse experimento demonstra que a análise de amostra em garrafas sem meio rende resultados que se correlacionam melhor com o protocolo de teste. Isso é devido ao fato de que não existe meio presente para facilitar o crescimento de micro-organismos. Dessa forma, o presente método e sistema não irá render falsos positivos, enquanto que as garrafas com meio podem facilitar o crescimento de micro-organismos que de outro modo não cresceriam na amostra.

[051] Embora a invenção no presente documento tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, deve-se compreender que essas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Portanto, deve-se compreender que inúmeras modificações podem ser feitas para as modalidades ilustrativas e que outras disposições podem ser previstas sem que se desvie do caráter e âmbito da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Sistema para testar alimentos acerca de contaminação, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um recipiente estéril de amostra (114) configurado para o uso em um incubador (102) que monitora uma amostra líquida disposta no recipiente; um sensor (210) disposto no recipiente (114), sendo que o sensor (210) é configurado para monitorar pelo menos um parâmetro da amostra líquida à medida que a amostra líquida é aquecida no incubador (102), sendo que pelo menos um parâmetro é um parâmetro que se altera em resposta ao crescimento microbiano na amostra líquida, em que o sensor (210) é posicionado no recipiente (114) de modo que, quando a amostra líquida é introduzida no recipiente, o sensor (210) fique em contato com a amostra líquida; o sistema tendo sido programado com um valor predeterminado do parâmetro monitorado, sendo que esse valor predeterminado é indicativo de crescimento micro-biano na amostra líquida; um receptáculo (112) no incubador para o recebimento do recipiente com a amostra líquida nele; um detector para o monitoramento de alterações no sensor (210) durante a incubação da amostra líquida no incubador (102); em que a amostra líquida (114) não é combinada com o meio de cultura que contêm nutrientes para o crescimento microbiano.

2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o parâmetro monitorado é selecionado a partir do grupo que consiste em concentração de dióxido de carbono, concentração de oxigênio e pH.

3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra líquida é leite.

4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a temperatura de incubação é de 30 °C a 38 °C.

5. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o volume do recipiente é de pelo menos 10 ml.

6. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o volume da amostra líquida é de pelo menos 10 ml.

7. Método para testar uma amostra de alimento acerca de contaminação mi-crobiana, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: retirar uma amostra de teste a partir de uma amostra embalada mediante ins-peção; introduzir a amostra de teste na forma líquida em um recipiente estéril (114) com um sensor (210) que monitora um parâmetro associado ao crescimento microbiano disposto no mesmo, sendo que o sensor (210) é colocado no recipiente (114) de modo que entre em contato com a amostra de teste; incubar a amostra de teste a uma temperatura de 30 °C a 38 °C mediante o monitoramento do sensor (210) em contato com a amostra de teste durante a incubação; monitorar um sinal a partir do sensor (210) e, se o sinal monitorado a partir do sensor (210) for um valor predeterminado associado ao crescimento microbiano, sinalizar a amostra como positiva para crescimento microbiano; em que o recipiente de amostra (114) em que a amostra de teste é introduzida não contém nutrientes que sustentam o crescimento microbiano e a amostra de teste não é combinada com nutrientes que sustentam o crescimento microbiano.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o parâmetro monitorado é selecionado a partir do grupo que consiste em concentração de dióxido de carbono, concentração de oxigênio e pH.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de teste é uma amostra de teste líquida para um alimento líquido ou uma amostra de alimento sólida que foi liquefeita.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o alimento líquido é leite.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a temperatura de incubação é 35 °C.

12. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o volume do recipiente é de pelo menos 10 ml.

13. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o volume da amostra de teste é de pelo menos 10 ml.