CN106706717A - 一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，包括步骤：1、制备实验菌液；2、开启酸性罐头食品并制备样品液；3、间接阻抗法的临界值的确定；4、取被测酸性罐头食品，按步骤2的方法制备成被测样品液；在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，取被测样品液接种至装有酸性肉汤培养基的内瓶中，另取等量被测样品液接种至装有麦芽浸膏汤培养基的内瓶中进行检测；5、留样；6、按GB 4789.26‑2013对被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检；7、结果的判定。本方法对酸性罐头食品商业无菌的检测快速、灵敏、可靠，准确度高且操作简单方便。

Description

一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法
技术领域
本发明涉及一种罐头的检测方法，具体涉及一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法。
背景技术
罐藏食品是我国食品工业最重要的出口产品，在外贸出口上一直表现出强劲的势头，中国的罐头在国际市场上几乎处于垄断地位。在食品安全问题日益严峻和竞争日益激烈的今天，保证其质量安全卫生尤为重要。
罐头依据pH值的不同可分为低酸性罐头和酸性罐头。其中酸性罐头食品是指杀菌后平衡pH值小于或等于4.6的罐头食品。罐头食品经过适度的热杀菌以后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。长期以来，罐头的微生物学检验都是检验罐头商业无菌，其方法是通过将样品保温观察10天后，再做内容物感官检验、pH值测定和涂片镜检，以确证罐头食品中有无微生物增殖。其检验过程要求较长的保温时间，此外还需要大容量的保温设施，显然该方法已无法适应快速发展的贸易需求。鉴于此，有必要寻找一种快速的能与传统商业无菌检验等同效果的方法，在保证不影响检出率的条件下缩短检验时间。
电阻抗法是通过测量微生物代谢引起的培养基电特性变化来测定样品微生物含量的一种快速检测方法。根据测量技术原理又可分为直接阻抗测量法和间接阻抗测量法。间接阻抗法是通过检测微生物代谢产生的CO2来记录微生物活力水平。在这个过程中，阻抗的变化不是直接在培养基中直接检测，而是检测在氢氧化钾溶液中，由于产生的CO2引起的阻抗变化。微生物产生的CO2被电极周围的KOH溶液吸收，生成碳酸钾，因而增加溶液的电阻抗。因此测量信号指示的是一个负进程，适合于检测产气芽殖微生物。酸性罐头食品中的腐败菌主要有耐酸芽孢菌、非芽孢耐酸菌、酵母及霉菌，均代谢产生终产物CO2，适合于采用间接阻抗法。目前，还没有文献报道利用间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法。本发明的检测方法快速、灵敏、可靠、准确度高且操作简单方便。
本发明通过以下技术方案实现：
一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，包括以下步骤：
步骤1：制备实验菌液；
步骤2：开启酸性罐头食品并制备样品液；
步骤3：间接阻抗法的临界值的确定；
步骤4：取被测酸性罐头食品，按步骤2的方法制备成被测样品液；在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取被测样品液接种至装有酸性肉汤培养基的内瓶中，另取等量被测样品液接种至装有麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中；输入各测量参数后进行检测；
步骤5：在开启的被测酸性罐头食品中，以无菌操作取出不少于30mL(g)被测酸性罐头食品内容物放至灭菌容器内留样，保存在2～5℃冰箱中，待该被测酸性罐头食品得出检验结论后可弃去；
步骤6：按国家标准GB 4789.26-2013对开启的被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检；
步骤7：当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果为无IDT值时，表明被测酸性罐头食品中无微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证无微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为商业无菌；当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果IDT＞0时，表明被测酸性罐头食品中有微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证有微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为非商业无菌。
作为本发明的进一步说明，步骤1所述制备实验菌液的方法为：取实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母，将多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌分别接种至酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种至麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72h，然后将各培养物用无菌生理盐水进行10倍稀释即得实验菌液。
作为本发明的进一步说明，步骤2所述开启酸性罐头食品的方法为：去除酸性罐头食品表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况；称量酸性罐头食品并记录；用冷水和洗涤剂清洗酸性罐头食品的光滑面；水冲洗后用无菌毛巾擦干；以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完；采用易燃包装材料包装的酸性罐头食品不能灼烧，以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛巾擦干；在超净工作台或百级洁净实验室中开启；带汤汁的酸性罐头食品开启前应适当振摇；使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用；如酸性罐头食品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处；立即在开口上方嗅闻气味，并记录。
作为本发明的进一步说明，步骤2所述制备样品液的方法为：液体酸性罐头食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐头食品则称取25g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质，两者皆有时则各取12.5g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液。
作为本发明的进一步说明，步骤3所述间接阻抗法的临界值的确定方法为：在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，各取1mL实验菌液分别接种至装有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测；各测量参数预设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间:72h，预热时间：1h，临界值：-25％M；得到实验菌液检测曲线；另选取市场常见的12-15种酸性罐头食品灭菌后，按步骤2的方法制备得到样品液，在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取1mL样品液接种至装有5mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1mL样品液接种至装有5mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下同时进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值，确定间接阻抗法的临界值。
作为本发明的进一步说明，所述实验菌液中实验菌株为多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌相应培养基为酸性肉汤，实验菌株为异常汉逊酵母相应培养基为麦芽浸膏汤。
作为本发明的进一步说明，步骤4所述各测量参数设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，评价类型：M2；临界值：步骤3得到的临界值。
作为本发明的进一步说明，步骤4所述被测样品液、酸性肉汤培养基和麦芽浸膏汤培养基的加样量均为3mL。
本发明所述IDT为阻抗检测时间，步骤1至步骤6均在无菌条件下操作。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法快速、灵敏、可靠、准确度高且操作简单方便。
2、本发明的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌与直接阻抗法相比，电极不接触被测样品液，不会被被测样品液腐蚀，减少了设备更换的速率；被测样品液不干扰阻抗测量，提高了检测的准确度。
3、本发明的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌与GB 4789.26-2013检验标准相比，不需要大容量的保温设备，节省了实验室的空间，且免去了繁琐的操作步骤，全部检测过程可在3天内完成，比该方法缩短了7天的时间，减少了检测的时间，提高了检测的效率。
4、本发明的检测方法具有自动化、现代化、多功能和连续“实时”样本检测的特点，能够减少酸性罐头食品卫生检验检疫的时间，加快酸性罐头进出口检验检疫速度，提高检测的整体水平。
5、本发明采用酸性罐头食品中易污染的多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌、异常汉逊酵母作为实验菌株，具有很强的代表性，根据各实验菌液的检测曲线并结合阴性样品的最大基线漂移值确定得到的临界值作为测量参数，判断性好，准确性高。
6、本发明采用有代表性的实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌、异常汉逊酵母进行研究，确定间接阻抗法的适用性、灵敏度及测量持续时间，更具说服力，所建立的快速检测方法灵敏度高、适用范围广。
7、本发明的酸性肉汤培养基能够培养细菌，麦芽浸膏汤培养基能够培养真菌，使用两种培养基进行检测，能够同时检测出被测酸性罐头食品中含有的细菌和真菌，检测效率高，且均为传统培养基，无需购买仪器原厂的培养基，大大节约了成本。
附图说明
图1为异常汉逊酵母间接阻抗法检测曲线；横坐标表示时间(单位：h)，纵坐标表示检测信号值(单位：M％)；
图2为阴性样品黄桃罐头间接阻抗法检测曲线；横坐标表示时间(单位：h)，纵坐标表示检测信号值(单位：M％)。
具体实施方式
主要仪器设备：微生物自动快速检测系统BacTrac4300。
本发明选择酸性罐头食品中易污染的多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母作为实验菌株，其菌株保藏编号分别为CICC22649、CICC21861、GIM2.94，其对应的培养基为酸性肉汤培养基、酸性肉汤培养基和麦芽浸膏汤培养基。
一、方法学实验
1、制备实验菌液；
取实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌分别接种于酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种于麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72h。将各培养物用无菌生理盐水进行10倍系列稀释，备用；
2、开启酸性罐头食品并制备样品液；
去除酸性罐头食品表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况；称量酸性罐头食品并记录；用冷水和洗涤剂清洗待检酸性罐头食品的光滑面；水冲洗后用无菌毛巾擦干；以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完；采用易燃包装材料包装的酸性罐头食品不能灼烧，以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛巾擦干；在超净工作台或百级洁净实验室中开启；带汤汁的酸性罐头食品开启前应适当振摇；使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用；如酸性罐头食品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处；立即在开口上方嗅闻气味，并记录；
液体酸性罐头食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐头食品则称取25g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质，两者皆有时则各取12.5g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液；
3、间接阻抗法的临界值的确定；
在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，各取1mL实验菌液分别接种至装有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测；各测量参数预设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间:72h，预热时间：1h，临界值：-25％M；得到实验菌液检测曲线；另选取市场常见的12-15种酸性罐头食品灭菌后，按步骤2的方法制备得到样品液，在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取1mL样品液接种至装有5mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1mL样品液接种至装有5mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下同时进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值，确定间接阻抗法的临界值；
附图1为异常汉逊酵母间接阻抗法检测曲线，多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌的检测曲线与异常汉逊酵母的检测曲线相似，菌株的M值曲线相对于E值曲线更类似微生物的生长曲线，可确定以M值作为检测信号值。
本发明选取的13种酸性罐头食品作为阴性样品，阴性样品的基线最大漂移值分别为：什锦水果罐头、梨罐头、水黄桃罐头、杨梅罐头、桔子罐头、蜜桔罐头、杏罐头：-25％M；草莓罐头、黄桃罐头：-45％M；山楂罐头、菠萝罐头、柑橘罐头：-20％M；芒果汁罐头：-10％M。图2为阴性样品黄桃罐头间接阻抗法检测曲线，可见阴性样品的基线最大漂移值为-45％M，因此最终确定间接阻抗法的临界值为-45％M。
3、间接阻抗法的适用性实验
直接吸取1mL系列稀释实验菌液分别接种至已加有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中，各测量参数设置如下：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，临界值：-45％M；记录实验菌液到达临界值的IDT。同时将实验菌液按GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行平板菌落计数。以菌落总数的对数log(CFU)为纵坐标，
对应的IDT值为横坐标，将数据输入系统自带的数据处理软件中即可得到标准曲线和回归方程。
表1：实验菌液的回归方程及参数
菌株名称 回归方程 相关系数r 离差Syx
多粘芽孢杆菌 y＝-0.2642x+8.2952 -0.9807 0.348
肠膜明串珠菌 y＝-0.1983x+8.0663 -0.9836 0.354
异常汉逊酵母 y＝-0.1718x+8.8857 -0.9759 0.361
由表1可知，本发明各实验菌液的标准曲线具有特异性，由此说明间接阻抗法对生长特性各不相同的实验菌株均能灵敏、准确地检测出来，具有广泛的适用性，适用于不同种类的、污染菌来源不明确的酸性罐头食品商业无菌的检测。
4、间接阻抗法的灵敏度实验
将各实验菌液系列稀释，使含菌量＜5CFU/mL，直接吸取1mL实验菌液分别接种至已加有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中，各测量参数设置如下：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，临界值：-45％M；作5个平行重复测试，记录实验菌液到达临界值的IDT。实验菌液按GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行平板菌落计数。各实验菌液灵敏度实验结果见表2。
表2：灵敏度实验结果
将各实验菌液的稀释至含菌量为1CFU/mL，再次进行试验，其结果如表3所示。
表3：1CFU/mL实验菌液的IDT值
由上表2、3可知，实验菌液的五个平行值间无显著差异(P＞0.05)，在菌落数为1CFU/mL的情况下，间接电阻抗法均能灵敏地检测出。
5、测量持续时间的确定
由表3可见各实验菌液为1CFU时的最大IDT值均未超过72h，最终将测量持续时间确定为72h。
二、具体实施例
实施例1
一种间接阻抗法快速检测酸性黄桃罐头食品商业无菌的方法，包括以下步骤：
步骤1：制备实验菌液；
取实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母，将多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌分别接种至酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种至麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72h，然后将各培养物用无菌生理盐水进行10倍稀释即得实验菌液；
步骤2：开启酸性罐头食品并制备样品液；
去除酸性罐头食品表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况；称量酸性罐头食品并记录；用冷水和洗涤剂清洗待检酸性罐头食品的光滑面；水冲洗后用无菌毛巾擦干；以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完；采用易燃包装材料包装的酸性罐头食品不能灼烧，以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛巾擦干；在超净工作台或百级洁净实验室中开启；带汤汁的酸性罐头食品开启前应适当振摇；使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用；如酸性罐头食品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处；立即在开口上方嗅闻气味，并记录；
液体酸性罐头食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐头食品则称取25g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质，两者皆有时则各取12.5g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液；
步骤3：间接阻抗法的临界值的确定；
在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，各取1mL实验菌液分别接种至装有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测；各测量参数预设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间:72h，预热时间：1h，临界值：-25％M；得到实验菌液检测曲线；另选取市场常见的12-15种酸性罐头食品灭菌后，按步骤2的方法制备得到样品液，在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取1mL样品液接种至装有5mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1mL样品液接种至装有5mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下同时进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值，确定间接阻抗法的临界值为-45％M；
附图1为异常汉逊酵母间接阻抗法检测曲线，多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌间接阻抗法检测曲线均与异常汉逊酵母相似，菌株的M值曲线相对于E值曲线更类似微生物的生长曲线，可确定以M值作为检测信号值；
本发明选取的13种酸性罐头食品作为阴性样品，阴性样品的基线最大漂移值分别为：什锦水果罐头、梨罐头、水黄桃罐头、杨梅罐头、桔子罐头、蜜桔罐头、杏罐头：-25％M；草莓罐头、黄桃罐头：-45％M；山楂罐头、菠萝罐头、柑橘罐头：-20％M；芒果汁罐头：-10％M；可见阴性样品的基线最大漂移值为-45％M，因此最终确定间接阻抗法的临界值为-45％M；
步骤4：取被测酸性罐头食品，按步骤2的方法制备成被测样品液；在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取3mL被测样品液接种至装有3mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取等量被测样品液接种至装有3mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中；输入各测量参数：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，评价类型：M2；临界值：-45％M，进行检测；
步骤5：在开启的被测酸性罐头食品中，以无菌操作取出30g被测酸性罐头食品内容物放至灭菌容器内留样，保存在2～5℃冰箱中，待该被测酸性罐头食品得出检验结论后可弃去；
步骤6：按国家标准GB 4789.26-2013对开启的被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检；
步骤7：当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果为无IDT值时，表明被测酸性罐头食品中无微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证无微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为商业无菌；当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果IDT＞0时，表明被测酸性罐头食品中有微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证有微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为非商业无菌。
实施例2
一种间接阻抗法快速检测酸性桔子罐头食品商业无菌的方法，包括以下步骤：
步骤1：制备实验菌液；
取实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母，将多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌分别接种至酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种至麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72h，然后将各培养物用无菌生理盐水进行10倍稀释即得实验菌液；
步骤2：开启酸性罐头食品并制备样品液；
去除酸性罐头食品表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况；称量酸性罐头食品并记录；用冷水和洗涤剂清洗待检酸性罐头食品的光滑面；水冲洗后用无菌毛巾擦干；以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完；采用易燃包装材料包装的酸性罐头食品不能灼烧，以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛巾擦干；在超净工作台或百级洁净实验室中开启；带汤汁的酸性罐头食品开启前应适当振摇；使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用；如酸性罐头食品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处；立即在开口上方嗅闻气味，并记录；
液体酸性罐头食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐头食品则称取25g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质，两者皆有时则各取12.5g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液；
步骤3：间接阻抗法的临界值的确定；
在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，各取1mL实验菌液分别接种至装有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测；各测量参数预设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间:72h，预热时间：1h，临界值：-25％M；得到实验菌液检测曲线；另选取市场常见的12-15种酸性罐头食品灭菌后，按步骤2的方法制备得到样品液，在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取1mL样品液接种至装有5mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1mL样品液接种至装有5mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下同时进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值，确定间接阻抗法的临界值为-45％M；
附图1为异常汉逊酵母间接阻抗法检测曲线，多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌间接阻抗法检测曲线均与异常汉逊酵母相似，菌株的M值曲线相对于E值曲线更类似微生物的生长曲线，可确定以M值作为检测信号值；
本发明选取的15种酸性罐头食品作为阴性样品，阴性样品的基线最大漂移值分别为：什锦水果罐头、梨罐头、水黄桃罐头、杨梅罐头、桔子罐头、蜜桔罐头、杏罐头、葡萄罐头：-25％M；草莓罐头、黄桃罐头：-45％M；山楂罐头、菠萝罐头、柑橘罐头、黑莓罐头：-20％M；芒果汁罐头：-10％M。可见阴性样品的基线最大漂移值为-45％M，因此最终确定间接阻抗法的临界值为-45％M。
步骤4：取被测酸性罐头食品，按步骤2的方法制备成被测样品液；在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取3mL被测样品液接种至装有3mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取等量被测样品液接种至装有3mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中；输入各测量参数：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，评价类型：M2；临界值：-45％M，进行检测；
步骤5：在开启的被测酸性罐头食品中，以无菌操作取出32g被测酸性罐头食品内容物放至灭菌容器内留样，保存在2～5℃冰箱中，待该被测酸性罐头食品得出检验结论后可弃去；
步骤6：按国家标准GB 4789.26-2013对开启的被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检；
步骤7：当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果为无IDT值时，表明被测酸性罐头食品中无微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证无微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为商业无菌；当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果IDT＞0时，表明被测酸性罐头食品中有微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证有微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为非商业无菌。
实施例3
一种间接阻抗法快速检测酸性梨罐头食品商业无菌的方法，包括以下步骤：
步骤1：制备实验菌液；
取实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母，将多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌分别接种至酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种至麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72h，然后将各培养物用无菌生理盐水进行10倍稀释即得实验菌液；
步骤2：开启酸性罐头食品并制备样品液；
去除酸性罐头食品表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况；称量酸性罐头食品并记录；用冷水和洗涤剂清洗待检酸性罐头食品的光滑面；水冲洗后用无菌毛巾擦干；以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完；采用易燃包装材料包装的酸性罐头食品不能灼烧，以含4％碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛巾擦干；在超净工作台或百级洁净实验室中开启；带汤汁的酸性罐头食品开启前应适当振摇；使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用；如酸性罐头食品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处；立即在开口上方嗅闻气味，并记录；
液体酸性罐头食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐头食品则称取25g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质，两者皆有时则各取12.5g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液；
步骤3：间接阻抗法的临界值的确定；
在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，各取1mL实验菌液分别接种至装有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测；各测量参数预设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间:72h，预热时间：1h，临界值：-25％M；得到实验菌液检测曲线；另选取市场常见的12-15种酸性罐头食品灭菌后，按步骤2的方法制备得到样品液，在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取1mL样品液接种至装有5mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1mL样品液接种至装有5mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下同时进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值，确定间接阻抗法的临界值为-45％M；
附图1为异常汉逊酵母间接阻抗法检测曲线，多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌间接阻抗法检测曲线均与异常汉逊酵母相似，菌株的M值曲线相对于E值曲线更类似微生物的生长曲线，可确定以M值作为检测信号值；
本发明选取的12种酸性罐头食品作为阴性样品，阴性样品的基线最大漂移值分别为：什锦水果罐头、梨罐头、水黄桃罐头、杨梅罐头、桔子罐头、蜜桔罐头：-25％M；草莓罐头、黄桃罐头：-45％M；山楂罐头、菠萝罐头、柑橘罐头、：-20％M；芒果汁罐头：-10％M。可见阴性样品的基线最大漂移值为-45％M，因此最终确定间接阻抗法的临界值为-45％M。
步骤4：取被测酸性罐头食品，按步骤2的方法制备成被测样品液；在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2％KOH溶液，取3mL被测样品液接种至装有3mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取等量被测样品液接种至装有3mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中；输入各测量参数：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，评价类型：M2；临界值：-45％M，进行检测；
步骤5：在开启的被测酸性罐头食品中，以无菌操作取出35mL被测酸性罐头食品内容物放至灭菌容器内留样，保存在2～5℃冰箱中，待该被测酸性罐头食品得出检验结论后可弃去；
步骤6：按国家标准GB 4789.26-2013对开启的被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检；
步骤7：当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果为无IDT值时，表明被测酸性罐头食品中无微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证无微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为商业无菌；当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果IDT＞0时，表明被测酸性罐头食品中有微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证有微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为非商业无菌。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为山楂罐头。
实施例5
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为什锦水果罐头。
实施例6
本实施例与实施例3基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为水黄桃罐头
实施例7
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为草莓罐头。
实施例8
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为菠萝罐头。
实施例9
本实施例与实施例3基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为芒果汁。
实施例10
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为葡萄罐头。
实施例11
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为黑莓罐头。
实施例12
本实施例与实施例3基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为杏罐头。
实施例13
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为杨梅罐头。
实施例14
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为柑橘罐头。
实施例15
本实施例与实施例3基本相同，不同之处在于被测酸性罐头食品为蜜桔罐头罐头。
对照实施例A组
选择与实施例1-15同一生产批的罐头，按照GB 4789.26-2013保温检测。
对照实施例B组
选择与实施例1-15同一生产批的罐头，置2～5℃冰箱保存。
对照实施例C组
任意选取阴性样品中的3种罐头，如什锦水果罐头、桔子罐头、梨罐头，作为实施例C1、C2和C3，置于室温自然染菌，采用本发明的方法进行检测。
判定方法：
实施例1-15及对照实施例C组采用以下方法判定：
被测酸性罐头食品经间接电阻抗法检测未检出，按国家标准GB 4789.26-2013对开启的被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检，确证无微生物增殖现象时，则可报告该被测酸性罐头食品为商业无菌，用“无”表示。
被测酸性罐头食品经间接电阻抗法检测有检出，按国家标准GB 4789.26-2013对开启的被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检，确证有微生物增殖现象，则可报告该被测酸性罐头食品为非商业无菌，用“有”表示。
对照实施例A组采用GB 4789.26-2013进行判定。
具体检测结果见表4。
表4：实施例1-15样品检测结果
对照实施例C组采用本发明方法进行检测，检测结果均为有，为非商业无菌。
由表4可知，本发明的间接阻抗法检测酸性罐头食品的检测结果与GB 4789.26-2013标准检测方法的结果完全一致。本发明的间接阻抗法检测酸性罐头食品，与GB4789.26-2013标准相比，不需要大容量的保温设备，节省了实验室的空间，且免去了繁琐的操作步骤，全部检测过程可在3天内完成，比该方法缩短了7天的时间，减少了检测的时间，提高了检测的效率。

Claims (9)

1.一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：制备实验菌液；
步骤2：开启酸性罐头食品并制备样品液；
步骤3：间接阻抗法的临界值的确定；
步骤4：取被测酸性罐头食品，按步骤2的方法制备成被测样品液；在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，取被测样品液接种至装有酸性肉汤培养基的内瓶中，另取等量被测样品液接种至装有麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中；输入各测量参数后进行检测；
步骤5：在开启的被测酸性罐头食品中，以无菌操作取出不少于30mL（g）被测酸性罐头食品内容物放至灭菌容器内留样，保存在2～5℃冰箱中，待该被测酸性罐头食品得出检验结论后可弃去；
步骤6：按国家标准GB 4789.26-2013对开启的被测酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检；
步骤7：当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果为无IDT值时，表明被测酸性罐头食品中无微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证无微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为商业无菌；当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果IDT＞0时，表明被测酸性罐头食品中有微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证有微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐头食品为非商业无菌。
2.根据权利要求1所述的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，步骤1所述制备实验菌液的方法为：取实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母，将多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌分别接种至酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种至麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72h，然后将各培养物用无菌生理盐水进行10倍稀释即得实验菌液。
3.根据权利要求1所述的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，步骤2所述开启酸性罐头食品的方法为：去除酸性罐头食品表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况；称量酸性罐头食品并记录；用冷水和洗涤剂清洗酸性罐头食品的光滑面；水冲洗后用无菌毛巾擦干；以含4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完；采用易燃包装材料包装的酸性罐头食品不能灼烧，以含4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛巾擦干；在超净工作台或百级洁净实验室中开启；带汤汁的酸性罐头食品开启前应适当振摇；使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用；如酸性罐头食品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处；立即在开口上方嗅闻气味，并记录。
4.根据权利要求1所述的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，步骤2所述制备样品液的方法为：液体酸性罐头食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐头食品则称取25g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质，两者皆有时则各取12.5g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液。
5.根据权利要求1所述的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，步骤3所述间接阻抗法的临界值的确定方法为：在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，各取1mL实验菌液分别接种至装有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测；各测量参数预设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间:72h，预热时间：1h，临界值：-25%M；得到实验菌液检测曲线；另选取市场常见的12-15种酸性罐头食品灭菌后，按步骤2的方法制备得到样品液，在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，取1mL样品液接种至装有5mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1mL样品液接种至装有5mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下同时进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值，确定间接阻抗法的临界值。
6.根据权利要求5所述的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，所述实验菌液中实验菌株为多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌相应培养基为酸性肉汤，实验菌株为异常汉逊酵母相应培养基为麦芽浸膏汤。
7.根据权利要求1所述的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，步骤4所述各测量参数设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，评价类型：M2；临界值：步骤3得到的临界值。
8.根据权利要求1所述的间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，步骤4所述被测样品液、酸性肉汤培养基和麦芽浸膏汤培养基的加样量均为3mL。
9.一种间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：制备实验菌液；
取实验菌株多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母，将多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌分别接种至酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种至麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72h，然后将各培养物用无菌生理盐水进行10倍稀释即得实验菌液；
步骤2：开启酸性罐头食品并制备样品液；
去除酸性罐头食品表面标签，在包装容器表面用防水的油性记号笔做好标记，并记录容器、编号、产品性状、泄漏情况、是否有小孔或锈蚀、压痕、膨胀及其他异常情况；称量酸性罐头食品并记录；用冷水和洗涤剂清洗待检酸性罐头食品的光滑面；水冲洗后用无菌毛巾擦干；以含4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面15min后用无菌毛巾擦干，在密闭罩内点燃至表面残余的碘乙醇溶液全部燃烧完；采用易燃包装材料包装的酸性罐头食品不能灼烧，以含4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面30min后用无菌毛巾擦干；在超净工作台或百级洁净实验室中开启；带汤汁的酸性罐头食品开启前应适当振摇；使用无菌开罐器在消毒后的罐头光滑面开启一个适当大小的口，开罐时不得伤及卷边结构，每一个罐头单独使用一个开罐器，不得交叉使用；如酸性罐头食品为软包装，可以使用灭菌剪刀开启，不得损坏接口处；立即在开口上方嗅闻气味，并记录；
液体酸性罐头食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐头食品则称取25g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质，两者皆有时则各取12.5g加至225mL灭菌林格氏溶液或蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液；
步骤3：间接阻抗法的临界值的确定；
在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，各取1mL实验菌液分别接种至装有5mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测；各测量参数预设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间:72h，预热时间：1h，临界值：-25%M；得到实验菌液检测曲线；另选取市场常见的12-15种酸性罐头食品灭菌后，按步骤2的方法制备得到样品液，在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，取1mL样品液接种至装有5mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1mL样品液接种至装有5mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下同时进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值，确定间接阻抗法的临界值为-45%M；所述实验菌液中实验菌株为多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌相应培养基为酸性肉汤，实验菌株为异常汉逊酵母相应培养基为麦芽浸膏汤
步骤4：取黄桃罐头，按步骤2的方法制备成被测样品液；在聚苯乙烯测量瓶中加入1mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，取3mL被测样品液接种至装有3mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取等量被测样品液接种至装有3mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15min内将其放入BacTrac4300培养箱中；输入各测量参数：培养温度：36℃，测量间隔时间：10min，测量持续时间：72h，预热时间：1h，评价类型：M2；临界值：-45%M，进行检测；
步骤5：在开启的黄桃罐头中，以无菌操作取出30g黄桃罐头内容物放至灭菌容器内留样，保存在2℃冰箱中，待该黄桃罐头得出检验结论后可弃去；
步骤6：按国家标准GB 4789.26-2013对开启的黄桃罐头内容物进行感官检查和pH测定，对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检；
步骤7：当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果为无IDT值时，表明黄桃罐头中无微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证无微生物增殖现象时，可报告该黄桃罐头为商业无菌；当BacTrac4300检测结束后，仪器测量结果IDT＞0时，表明黄桃罐头中有微生物增殖，经感官检查、pH测定、涂片染色镜检确证有微生物增殖现象时，可报告该黄桃罐头为非商业无菌。
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