CN1067896A - 麦芽低聚糖苷衍生物，用于测定α-淀粉酶活性的试剂和方法 - Google Patents
麦芽低聚糖苷衍生物，用于测定α-淀粉酶活性的试剂和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种上式所示的麦芽低聚糖苷衍
生物，其中n，R，X和Y的定义详见说明书。一种含
有所述的麦芽低聚糖苷衍生物作为有效成分的用于
测定α-淀粉酶活性的试剂，和一种用于测定α-淀粉
酶活性的方法。
Description
本发明涉及一种新的麦芽低聚糖苷衍生物、含有该衍生物作为有效成分用于测定α-淀粉酶活性的试剂和用该衍生物有效而精确地测定α-淀粉酶活性的方法。
迄今，测定体液如血清、尿、胰液和唾液中α-淀粉酶活性对临床诊断是很重要的，并且在诊断急性或慢性疾病如肝炎、胰腺炎、胰腺癌和流行性腮腺炎中是必要的项目。
迄今已知有多种测定α-淀粉酶活性的方法。其中之一方法包括目前已被广泛采用的、用一化合物（对偶合酶的水解具有抗性（稳定性））作为底物的方法，该化合物中的取代苯基麦芽低聚糖苷之非还原末端葡萄糖被多种取代基所修饰。所说的方法是用α-淀粉酶裂解该化合物，并用偶合酶处理裂解产物，随后直接或（若有必要）在调节pH之后，或在苯酚的缩合之后对得到的取代苯酚进行定量的比色测定。
在上述方法中所用的底物一般需具有这样的特性，即底物的D-葡糖苷键只有一个被水解，水解的作用方式和反应速度不随两种α-淀粉酶（同功酶）而变化，水解产物不再被α-淀粉酶进一步水解，底物对α-淀粉酶具有高亲和力（即，Km值小）并具有高水解率，同时底物具有极好的水溶性。然而，迄今尚未发现完全满足这些要求的具有修饰的非还原末端的底物。
本发明的目的在于克服测定α-淀粉酶活性的常规试剂和用这些试剂的测定方法存在的上述缺点，并提供一种适用于有效而精确地测定α-淀粉酶活性的新化合物和一种用该化合物作为试剂测定α-淀粉酶活性的新方法。
为实现上述目的，本发明已进行了认真的研究。结果，他们已发现一种全新的麦芽低聚糖苷衍生物作为测定α-淀粉酶活性的试剂是非常适用的并且用该试剂测定α-淀粉酶活性可达到上述目的。
也就是说，本发明提供了式（Ⅰ）所示的麦芽低聚糖苷衍生物;一种含有式（Ⅰ）所示化合物作为有效成分用于测定α-淀粉酶活性的试剂;一种测定α-淀粉酶活性的方法，该方法包括将式Ⅰ化合物的α-异头物和α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶，或它们的混合物加到含有α-淀粉酶的样品中，以进行酶促反应，并定量测定释放出的芳香发色化合物;以及一种测定α-淀粉酶活性的方法，该方法包括将式Ⅰ所示化合物的β-异头物或其α-异头物和β-异头物的混合物，α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶和β-葡糖苷酶加到含有α-淀粉酶的样品中，以进行酶促反应并定量测定释放出的芳香发色化合物，
其中n代表整数3～5，R代表芳香发色团，X代表≥CH
CH2N3或≥C＝CH2，Y代表氢原子，取代或未取代的烃基或烷磺酰基或芳磺酰基。
作为本发明式（Ⅰ）所示的麦芽低聚糖苷衍生物的麦芽低聚糖部分，可使用所有相应于α-和β-D-麦芽戊糖至α-和β-D-麦芽庚糖范围内的糖。
式（Ⅰ）中的X代表≥CHCH2N3或≥C＝CH2，在≥CHCH2N3中CH的H具有在环平面下方成键的构象。
另一方面，Y代表氢原子，取代或未取代的烃基或烷磺酰基或芳磺酰基。作为取代或未取代的烃基，可提及的有直链，支链或环状烷基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基或环己基，芳烷基，例如苄基，和芳基，例如苯基、甲苯基和萘基。这些烷基、芳烷基和芳基可被官能团如酰基、烷氧基、羧基、硝基、卤原子、烷基甲硅烷基和磺酰基取代，并且烷基可以是不饱和基团如乙烯基和烯丙基。
作为上述烷磺酰基或芳磺酰基，可提及的有例如甲磺酰基、甲苯磺酰基或喹啉磺酰基。
此外，式（Ⅰ）所示麦芽低聚糖苷衍生物中，作为取代还原末端葡萄糖1位上羟基的芳香发色团R，可使用任何能进行光学测定的基团。例如，可提及的有下式所示的基团：
其中R1-R5可以相同或不同，可以代表氢原子、卤原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，或R1和R2或R2和R3可键合起来形成一个稠合的芳环，
其中R6代表氢原子或烷基，
其中R7代表氢或卤原子，和
其中R8-R15可以相同或不同，可以代表氢原子、卤原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，R8和R9或R10和R11可键合起来形成一个稠合的芳环，R9和R10和/或R13和R14可分别代表一个共用氧原子以形成一个稠合的醚环，Z代表氮原子或N→O。
此外，式（Ⅰ）麦芽低聚糖苷衍生物既可以是α-异头物（α-葡糖苷），也可以是β-异头物（β-葡糖苷）。
上述式（Ⅰ）所示的化合物包括，例如，2-氯-4-硝基苯基66-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲磺酰基-β-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-β-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰基-β-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基67-叠氮基-67-脱氧-α-D-麦芽庚糖苷，2，4-二氯苯基67-叠氮基-67-脱氧-47-O-甲苯磺酰基-β-D-麦芽庚糖苷，靛酚基（phenolindo）-31-氯苯基65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲基-β-D-麦芽戊糖苷，4-甲基繖形酮基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷，刃天青基56-烯醇式-α-D-麦芽己糖苷，荧光素基67-叠氮基-67-脱氧-47-O-烯丙基-β-D-麦芽庚糖苷，或靛酚基-31-氯苯基55-烯醇式-45-O-（2-甲氧基）乙氧基甲基-β-D-麦芽戊糖苷。
在这方面，上述符号如65-，67-，45-和47意指从构成麦芽低聚糖的葡萄糖单位之还原末端侧起第5个和第7个葡萄糖（即，具有非还原末端的葡萄糖单位）的6位和4位上的羟基被取代。
迄今，在对麦芽三糖的非还原末端上化学修饰的研究中，已知1，6-脱水-61-叠氮基-61-脱氧-β-麦芽三糖八乙酸盐可作为修饰的麦芽三糖的中间体〔“Carbohydrate Research”，51，73-84（1976）〕。该化合物相当于其中n等于1的式（Ⅰ）化合物，但不同点在于该已知化合物具有分子内醚结构，无发色团，是乙酰衍生物。而且，其中n等于1的式（Ⅰ）化合物几乎不能被α-淀粉酶作用，因此不适于用作测定α-淀粉酶活性的底物，以致它不能被用于本发明的目的。
本发明式（Ⅰ）所示的麦芽低聚糖苷衍生物是一种尚未见文献记载的新化合物，并且能够不受特殊限制地使用任何制备方法。
也就是说，式（Ⅱ）所示的D-麦芽低聚糖苷：
其中R和n的定义同上，是市场上可买到的或可用熟知的生产方法得到，例如应用2-氯-4-硝基苯基β-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基α-D-麦芽庚糖苷和靛酚基-31-氯苯基β-D-麦芽戊糖苷作为起始原料，并且使式（Ⅲ）所示的羰基化合物或它的缩醛或缩酮与D-麦芽低聚糖苷反应，得到式（Ⅳ）所示的4，6-O-烷氧基亚甲基化麦芽低聚糖苷衍生物：
式Ⅲ中R16代表氢原子，甲氧基、乙氧基、烷基或芳基，R17代表甲氧基或乙氧基，
式Ⅳ中R16和R17，R和n的定义同上，例如2-氯-4-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亚甲基-β-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基47，67-O-（1-甲氧基）亚乙基-α-D-麦芽庚糖苷和靛酚基-31-氯苯基45，65-O-（1-乙氧基）亚乙基-β-D-麦芽戊糖苷。
作为式（Ⅲ）所示的羰基化合物或它的缩醛或缩酮，可提及的有例如四甲氧基甲烷，原乙酸三乙酯或原乙酸三甲酯。
制备式（Ⅳ）所示的4，6-O-烷氧基亚甲基化麦芽低聚糖苷衍生物的反应一般是在非质子传递极性溶剂如N，N-二甲基甲酰胺（DMF），N，N-二甲基乙酰胺（DMA），二甲亚砜（DMSO）或六甲基磷酸三酰胺（HMPA）中，在催化剂如对甲苯磺酸，氯化氢，硫酸，无水氯化锌和强酸性离子交换树脂存在下进行。
如此得到的式（Ⅳ）所示的4，6-O-烷氧基亚甲基化麦芽低聚糖苷衍生物可被酰化为4，6-O-烷氧基亚甲基化酰基麦芽低聚糖苷衍生物，例如2-氯-4-硝基苯基十四烷-O-乙酰-45，65-O-二甲氧基亚甲基-β-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基十二烷-O-苯甲酰-47，67-O-（1-甲氧基）亚乙基-α-D-麦芽庚糖苷和靛酚基-31-氯苯基十四烷-O-丁酰-45，65-O-（1-乙氧基）亚乙基-β-D-麦芽戊糖苷。在这种情况下，作为酰化剂，可使用羧酸如乙酸，一氯乙酸丙酸、正丁酸和苯甲酸，或其反应衍生物如酸酐，酰氯和酯。酰化的条件不是关键性的，可使用常用于酰化的条件。
接着对如此制得的4，6-O-烷氧基亚甲基化酰基麦芽低聚糖苷衍生物进行脱烷氧基亚甲基化反应，以制备式（Ⅴ）所示部分酰化的麦芽低聚糖苷衍生物：
其中R18代表酰基，R和n的定义同上，例如2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖苷和4-硝基苯基O-（2，3-二-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（2，3，6-三-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3 6-三-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡糖苷。上述脱烷氧基亚甲基化的条件不是关键性的，并且该反应可用熟知的方法进行，例如使乙酸和甲酸与4，6-烷氧基亚甲基化酰基麦芽低聚糖苷衍生物反应（例如见J.Am.Chem.soc.，84，430（1962）〕。
接着使如此制得的式（Ⅴ）所示部分酰化的麦芽低聚糖苷衍生物与大量的烷磺酰氯或芳磺酰氯（如甲苯磺酰氯和萘磺酰氯）反应，以只对6-位上的羟基进行烷磺酰化或芳磺酰化，然后修饰4一位上的羟基，以制备式（Ⅵ）所示酰基磺酰麦芽低聚糖苷衍生物：
其中n，R和R18的定义同上，W1代表烷磺酰基或芳磺酰基，W2代表酰基，取代或未取代的烃基或烷磺酰基或芳磺酰基，例如2-氯-4-硝基苯基十五烷-O-乙酰基-65-O-甲苯磺酰基-β-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基十四烷-O-丁酰基-45-O-乙酰基-65-O-萘磺酰-α-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基十二烷-O-苯甲酰-47-O-甲磺酰基-67-O-甲苯磺酰基-β-麦芽庚糖苷，和靛酚基-31-氯苯基十四烷-O-氯乙酰基-65-O-（2，4-二甲基）苯磺酰-45-O-甲基-β-D-麦芽戊糖苷。
上述6-位上羟基的烷磺酰化或芳磺酰化（W1的引入）条件不是关键性的，并且该反应通常按下法进行：在吡啶或在非极性溶剂如二氯甲烷和甲苯中，在碱例如三乙胺和二氮杂双环十一烷（DBU）存在下，不经加热，用3-30摩尔当量的大量烷基-或芳基磺酰卤处理部分酰化的麦芽低聚糖苷衍生物。
此外，为了将取代基W2引入到4-位羟基上，酰化是在式（Ⅰ）中Y代表氢原子的情况下进行的，而烃基的引入，例如烷基化或芳烷基化或烷磺酰化或芳磺酰化是必要时在其它情况下进行的。这些反应可按以下方法进行，例如在酰化情况下按以上列举的方法进行，烷基化是在氢氧化钾存在下，于DMSO中用烷基卤进行处理〔例如，Tetrahedron，35，2169（1979）〕芳烷基化是在氢化钠存在下，于苯中与芳烷基卤进行反应〔例如，J.Chem.Soc.88，82（1966）〕，烷磺酰化或芳磺酰化是在吡啶中与磺酰氯进行反应〔例如Methods of Carbohydrate Chem.，63，99（1978）〕。当Y为烷磺酰基或芳磺酰基时，4-位和6-位上的羟基可同时被磺酰化，例如通过延长反应时间，或提高反应温度或使用非大量的烷磺酰化或芳磺酰化剂如甲磺酰氯。
当X代表＞CHCH2N3时，用碘化钠或溴化钠处理如上制得的式（Ⅵ）所示的酰基磺酰基麦芽低聚糖苷衍生物，以形成6-碘代或6-溴代衍生物，然后与例如叠氮化钠反应，以制备式（Ⅶ）所示的酰基叠氮基麦芽低聚糖苷衍生物：
其中n，R，R18和W2的定义如上，例如，2-氯-4-硝基苯基十五烷-O-乙酰基-65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基十四烷-O-丁酰基-45-O-乙酰基-65-叠氮基-65-脱氧-α-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基十二烷-O-苯甲酰基-67-叠氮基-67-脱氧-47-O-甲磺酰基-β-D-麦芽戊糖苷或靛酚基-31-氯苯基十四烷-O-氯乙酰基-65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲基-β-D-麦芽戊糖苷。
6-位上羟基的碘化、溴化或叠氮化条件不是关键性的，并且该反应通常按下法进行：在非质子传递溶剂如DMSO，DMF，HMPA和甲乙酮中，将上述酰基磺酰基麦芽低聚糖苷衍生物加热到常用的温度，并用5-50摩尔当量的碘化钠，溴化钠或叠氮化钠处理。在这一方面，不需要逐步进行碘化或溴化，然后在得到6-碘代或6-溴代衍生物之后再进行叠氮化反应，这些反应可在同一反应系统中连续地进行。6-溴代衍生物也可通过用NBS处理上述的4，6-O-烷氧基亚甲基化酰基麦芽低聚糖苷衍生物来制备。在这种情况下，W2代表酰基。
当X代表＞C＝CH2时，可用碘化钠或溴化钠处理如此制得的式（Ⅵ）所示的酰基磺酰基麦芽低聚糖苷衍生物，以形成6-碘代或6-溴代衍生物，接着用脱卤化氢剂如氟化银处理该衍生物，以制备酰基-不饱和-麦芽低聚糖苷衍生物（Ⅶ′）：
其中n，R，R18和W2的定义同上，例如，2-氯-4-硝基苯基十四烷-O-乙酰-55-烯醇式-45-O-甲磺酰基-β-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基十四烷-O-丁酰基-45-O-乙酰-55-烯醇式-α-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基二十一烷-O-苯甲酰-57-烯醇式-β-D-麦芽庚糖苷或靛酚基-3′-氯苯基十四烷-O-氯乙酰-55-烯醇式-45-O-甲基-β-D-麦芽戊糖苷。
6位上羟基进行碘化或溴化的条件不是关键性的，并且该反应例如可按上述方法进行。脱去卤化氢的条件也不是关键性的，并且该反应可按下法进行：在吡啶中用2-20摩尔当量的氟化银处理上述6-碘代或6-溴代衍生物至常用的温度，或在上述极性非质子传递溶剂中在加热或不加热情况下用5-50摩尔当量的碱（如DBU）处理。
最后，脱去式（Ⅶ）或（Ⅶ′）所示的酰基麦芽低聚糖苷衍生物的酰基，得到式（Ⅰ）所示的麦芽低聚糖苷衍生物的优选化合物，其中当W2代表酰基时，Y代表氢原子，而当W2代表取代或未取代的烃基或烷磺酰基或芳磺酰基时，Y代表与W2相同的基团。脱酰基的条件也不是关键性的，例如可在醇如甲醇中，用碱如碳酸钾、氨水和氰化钾处理酰基麦芽低聚糖苷衍生物〔见“Protective Groups in Organic Synthesis by Theodora W.Greene，pp.50-55，1980，JOHN WILEY & SONS，New York〕。
制备式（Ⅰ）所示的麦芽低聚糖苷衍生物的另一方法，可提及的有例如：通过用熟知的环状糊精酶〔例如见日本专利公开3-86701〕处理按熟知的方法〔例如见Carbohyd.Res.，18，29-37（1971）〕制备的6-叠氮基-6-脱氧环状糊精，然后用外型糖化酶如葡糖淀粉酶处理，以得到其中在非还原末端葡萄糖的6位羟基被叠氮基所取代的麦芽低聚糖，并按熟知的方法〔例如见日本专利公开60-78994〕将芳香发色团引入到该麦芽低聚糖上来制备上述衍生物，或通过将上述6-叠氮基-6-脱氧环状糊精加到市售的或熟知的具有芳香发色团作为糖苷配基的葡萄糖苷中，用熟知的酶，环状糊精葡聚糖转移酶处理，最后用外型糖化酶如葡糖淀粉酶处理来制备上述衍生物。
如此制得的麦芽低聚糖苷衍生物（Ⅰ）对于测定α-淀粉酶活性是非常有用的，因此可用麦芽低聚糖苷衍生物测定α-淀粉酶活性。
如上所述，式（Ⅰ）的麦芽低聚糖苷衍生物具有α-异头物和β-异头物。当在测定α-淀粉酶活性中只使用α-异头物时，需要α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶作为偶合酶系统。当只用β-异头物或α-异头物和β-异头物的混合物时，除需要α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶或二者之外还需要β-葡糖苷酶，必要的话，也可用β-淀粉酶。
作为一种有利于测定α-淀粉酶活性的系统值得一提的是pH4-10的系统，该系统含有0.1-10mM式（Ⅰ）所示的麦芽低聚糖苷衍生物，2-300mM缓冲剂，作为偶合酶的浓度为5-1000单位/ml的α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶，当使用β-葡糖苷酶时，其浓度为0.5-30单位/ml。在该系统中所用的缓冲剂包括，例如，磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、Good氏缓冲剂、硼酸盐、柠檬酸盐或二甲基戊二酸盐。
α-葡糖苷酶可得自于任何来源，例如动物、植物和微生物，以得自于酵母者为宜。同样，葡糖淀粉酶也可得自于任何来源，以得自于Rizopus种的酶为宜。再者，β-葡糖苷酶也可得自于任何来源，例如可使用得自于杏仁的β-葡糖苷酶。
β-淀粉酶也可得自于任何来源，例如可使用得自于细菌或植物的β-淀粉酶。
除上述成分之外，若有必要还可向这一系统中加入各种常规添加剂如甘油、牛血清白蛋白、α-或β-环状糊精和Triton X-100作为助溶剂或稳定剂，但它们不应削弱本发明的目的。作为α-淀粉酶活化剂，也可加入Cl-，Ca2+或Mg3+离子，它们可以NaCl，MgCl2，MgSo4，CaCl2或CaCl2·H2O的形式应用。在制备上述系统的合适步骤中，以上添加剂可以单独地应用，或者合并使用上述二种或二种以上的添加剂。
本发明的试剂可以干燥产品或溶液形式或以膜载体如薄片形式使用，或使用其中该试剂已浸渍到纸中的浸渍纸形式。通过使用本发明的试剂，可用简便的方法以高灵敏度精确地测定各种样品中所含α-淀粉酶的活性。
在附图中：
图1是用于在实施例5中测定α-淀粉酶活性的标准曲线;
图2是用于在实施例6中测定α-淀粉酶活性的标准曲线;
图3是在实施例9的测定系统中本发明的底物和参照底物之稳定性的图示;
图4是在实施例10的测定系统中本发明的底物和参照底物之稳定性的图示。
现参照优选实施方案来说明本发明的方法。
首先，将5-1000单位/ml，优选10-500单位/ml的α-葡糖苷酶或葡糖淀粉酶或二者作为偶合酶加到含有α-淀粉酶的样品中。当式（Ⅰ）的麦芽低聚糖苷衍生物含有β-异头物时，还要加入0.5-30单位/ml，优选1-15单位/mlβ-葡糖苷酶，与此同时或在此之后，连同缓冲剂一起加入0.1-10mM，优选0.3-5mM的麦芽低聚糖苷衍生物。随后在温度为25-45℃，优选35-40℃，pH为4-10，优选6-8的条件下使混合物经历酶反应至少1分钟，优选2-10分钟。生成的芳香发色团的吸光度变化，可直接或在调节pH之后或以常用方法进行缩合之后，在合适的波长下连续或间歇进行测定，样品中α-淀粉酶的活性可通过将上述吸光度与预先测定的标准α-淀粉酶样品的吸光度进行比较来计算。α-淀粉酶的活性也可根据芳香发色团的吸光系数计算。
虽然用于本发明的含有α-淀粉酶的样品可以是具有α-淀粉酶活性的样品，但这不是关键性的，可专门使用微生物培养液，植物提取物，或动物的体液或组织及其提取物。当含有α-淀粉酶的样品是固体时，最好将它事先溶解或悬浮于纯化水或如上所述的缓冲剂中。另外，可通过象过滤操作除去不溶物。
本发明式（Ⅰ）所示的麦芽低聚糖苷衍生物是一种符合作为底物所有要求的新化合物，它非常适合用作测定α-淀粉酶活性的试剂。通过使用上述衍生物，对存在于样品中的葡萄糖、麦芽糖、胆红素或血红蛋白无任何影响的情况下，可用自动分析的方法或人工操作的方法在短时间内精确而容易地测定α-淀粉酶活性。
本发明的化合物在一段长时间内是稳定的并且还具有增加作为底物效用的另外的优点。
参照实施例可进一步详述本发明，这些实施例不应限制本发明的范围。
在各个实施例中，除另外规定外，最大吸光度的波长是在甲醇中测定的，并且旋光度是在25℃下用钠光谱中D线测定的。
实施例1
2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰基-β-D-麦芽戊糖苷的制备
（1）2-氯-4-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亚甲基-β-D-麦芽戊糖苷的制备
将15.0g（15.2mmol）市售2-氯-4-硝基苯基β-D-麦芽戊糖苷溶于75ml无水DMF中，并进一步加入15.0ml（113mmol）四甲氧基甲烷和7.5gAmberlyst（15E）商标（日本ORGANO公司产品）。混合物于35℃搅拌4小时使进行反应。接着，在搅拌和冰冷却条件下将反应混合物缓慢滴加到2.01的100mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中。所得混合物经ODS（十八烷基硅胶）柱层析纯化，用乙腈-水混合溶液（体积比为3∶7）洗脱所需级分，浓缩并用异丙醇-甲醇重结晶，得到10.7g2-氯-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亚甲基-β-D-麦芽戊糖苷（10.1mmol，产率66.5%）。
熔点（℃）：93.0-95.0（同时分解）
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔（λmax〕（nm）＝295（logε＝3.95），227（sh），209（logε＝4.17）。
红外光谱（cm-1）：3420，2940，1648，1588，1524，1490，1352，1276，1246，1154，1082，1050，1026，930，898.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（DMSO-d6）：3.25-3.85（m），3.23（3H，s），3.30（3H，s），3.89（1H，d，J＝3.9 Hz），4.30-4.70（m），5.04（2H，d，J＝3.2 Hz），5.10（1H，d，J＝3.7 Hz），5.12（1H，d，J＝3.4 Hz），5.27（1H，d，J＝7.6 Hz），5.25-5.70（m），7.47（1H，d，J＝9.3 Hz），8.19（1H，dd，J＝9.3 Hz，2.7 Hz），8.31（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Lnc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝1∶4（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝10.2分钟。
旋光度〔α〕：（C0.50，50mM磷酸盐缓冲剂）：+86.7°。
元素分析C39H58ClNO30：
C H N
计算值（％）： 44.35 5.53 1.33
实测值（％）： 44.55 5.43 1.34
（2）2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
将实施例1步骤（1）中得到的2-氯-4-硝基苯基45，65-O-二甲氧基亚甲基-β-D-麦芽戊糖苷（3.00g，2.84mmol）溶于60ml吡啶中。将乙酸酐（30ml，384mmol）加到该溶液中，并将混合物于室温搅拌2天使进行反应。然后在减压下浓缩反应混合物以除去吡啶、乙酸酐和乙酸。将得到的油状乙酰衍生物不经纯化溶于100ml乙酸中，向该溶液中加入25ml水，混合物于30℃搅拌3天。在搅拌下使反应混合物慢慢滴入600ml冰一水中，用600ml二氯甲烷提取混合物三次。二氯甲烷层用600ml水洗三次并用无水硫酸钠干燥。过滤后，减压浓缩滤液以除去二氯甲烷。残余物经硅胶柱层析纯化，并将乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液（体积比为66∶2.5∶33）洗脱的所需级分进行浓缩，得到2.08g2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（1.32mmol，两步的总产率为46.5%）。
熔点（℃）：126.0-130.0
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax（CH3CN）〕（nm）＝282（logε＝3.94）。
红外光谱（cm-1）：3480，2970，1752，1588，1530，1486，1432，1372，1350，1236，1030，944，898.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：1.81-2.12（ca.40H，each s），3.50-4.74（m），5.05（m），7.22（1H，d，J＝9.0 Hz），8.09（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz），8.22（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔NaCalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝7∶3（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝4.2分钟。
旋光度〔α〕：（C0.25，1，4-二噁烷）：+88.0°。
（3）2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-4，6-二-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
将按实施例1步骤（2）相同方法得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（11.0g，7.00mmol）溶于500ml吡啶中，并将4.9ml甲磺酰氯（63.3mmol）和20.0g分子筛加到该溶液中。混合物于室温搅拌16小时使进行反应。接着通过硅藻土床过滤反应混合物，并减压蒸发除去滤液中所含吡啶。残余物经硅胶柱层析纯化，并将乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液（体积比为100∶1∶200）洗脱的所需级分进行浓缩，得到11.6g2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-4，6-二-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（6.67mmol，产率95.3%）。
熔点（℃）：116.0-119.0
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝283（logε＝3.98），226（sh），209（logε＝4.23）。
红外光谱（cm-1）：2950，1752，1586，1528，1368，1350，1238，1176，1032，896，826.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：2.00-2.19（ca.40H，each s），3.08（3H，s），3.10（3H，s），3.85-4.85（m），5.15-5.50（m），7.29（1H，d，J＝9.2 Hz），8.16（1H，dd，J＝9.2 Hz，2.7 Hz），8.29（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测：洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝4.0分钟。
旋光度〔α〕：（C0.674，1，4-二噁烷）：+85.5°。
元素分析C66H86ClNO46S2：
C H N
计算值（％） 45.85 5.01 0.81
实测值（％） 46.05 5.09 0.78
（4）2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
将实施例1步骤（3）得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-4，6-二-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷（11.6g，6.67mmol）溶于1000ml甲乙酮中，并将30.2g碘化钠（201mmol）加到该溶液中。混合物85℃搅拌6小时使进行反应。接着通过硅藻土床过滤反应混合物，并减压蒸发除去滤液中的甲乙酮。残余物经硅胶柱层析纯化，并将乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液（体积比为100∶1∶200）洗脱的所需级分进行浓缩，得到10.3g2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（5.85mmol，产率87.7%）。
熔点（℃）：127.0-129.0
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝283（logε＝3.98），227（sh），209（logε＝4.22）。
红外光谱（cm-1）：3550，2960，1750，1586，1528，1486，1430，1372，1350，1234，1180，1040，960，898，828.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：2.00-2.19（ca.40H，each s），3.06（3H，s），3.30（1H，dd，J＝11.5 Hz，5.4 Hz），3.50（1H，dd，J＝11.5 Hz，1.5 Hz），3.68（1H，ddd，J＝8.8 Hz，5.4 Hz，1.5 Hz），3.85-4.85（m），5.15-5.50（m），7.28（1H，d，J＝9.0Hz），8.16（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz），8.29（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂∶乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝5.6分钟。
旋光度〔α〕：（C0.674，1，4-二噁烷）：+80.7°。
元素分析C65H83ClNO43S：
C H N
计算值（％）： 44.34 4.75 0.80
实测值（％）： 44.34 4.82 0.82
（5）2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-4-O-甲磺酰-α-D-木己-5-烯醇式吡喃糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
将实施例1步骤（4）得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2 3-二-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三-〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（2.84g，1.61mmol）溶于170ml吡啶中，并将2.05g氟化银（16.1mmol），28.4mg N，N-二甲氨基吡啶（0.232mmol）和5.7g分子筛加到该溶液中。混合物于25℃搅拌15小时使进行反应。接着通过硅藻土床过滤反应混合物，并减压蒸发除去滤液中的吡啶。残余物经硅胶柱层析纯化，并将乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液（体积比为100∶1∶400）洗脱的所需级分进行浓缩，得到1.89g 2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-4-O-甲磺酰-α-D-木己-5-烯醇式吡喃糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（1.16mmol，产率72.0%）。
熔点（℃）：113.0-115.0
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝283（logε＝3.99），227（sh），209（logε＝4.25）。
红外光谱（cm-1）：3490，2970，2110，1748，1586，1532，1488，1434，1372，1350，1236，1182，1030，896.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：1.99-2.18（ca.40H，each s），3.10（3H，s），3.80-4.95（m），5.05-5.50（m），7.28（1H，d，J＝9.0 Hz），8.16（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7Hz），8.29（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝4.5分钟。
旋光度〔β〕：（C0.504，1，4-二噁烷）：+75.3°
元素分析C65H82ClNO43S：
C H N
计算值（％） 47.81 5.06 0.86
实测值（％） 47.42 5.08 0.86
（6）2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷的制备
向1.52g实施例1步骤（5）得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-4-O-甲磺酰-α-D-木己-5-烯醇式吡喃糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（0.931mmol）中加入150ml甲醇和193mg无水碳酸钾（1.40mmol），并将混合物于25℃搅拌15小时使进行反应。接着减压浓缩反应混合物以除去混合物中所含的甲醇。残余物经ODS柱层析纯化，并将乙腈-水混合溶液（体积比为25∶75）洗脱的所需级分进行浓缩并冻干，得到746mg2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷（0.715mmol，产率76.8%）。
熔点（℃）：175.0-180.0（同时分解）
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝289（logε＝4.01），228（Sh），209（logε＝4.43）。
红外光谱（cm-1）：3400，2930，1644，1584，1520，1486，1350，1274，1250，1152，1078，1020，928，890.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（DMSO-d6）：3.25-3.85（m），3.29（3H，s），4.05（1H，br s），4.30-4.60（m），4.56（2H，d，J＝2.0 Hz），5.05（2H，d，J＝3.4 Hz），5.11（1H，d，J＝3.7 Hz），5.19（1H，d，J＝2.2 Hz），5.26（1H，d，J＝7.3 Hz），5.25-5.65（m），7.47（1H，d，J＝9.3 Hz），8.18（1H，dd，J＝9.3 Hz，2.7 Hz），8.29（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Tosoh Corp.生产，TSK凝胶Amide-80柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂∶乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝5.2分钟。
旋光度〔α〕：（C0.512，H2O）：+84.5°。
元素分析C37H54ClNO29S：
C H N
计算值（％） 42.55 5.21 1.34
实测值（％） 42.23 5.28 1.40
实施例2
2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷的制备
（1）2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-叠氮基-6-脱氧-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
将按实施例1步骤（4）相同的操作方法得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（1.50g，0.852mmol）溶于130ml DMSO中，并将831mg叠氮化钠（12.8mmol）加到该溶液中。混合物于80℃搅拌3小时使进行反应。接着，将700ml甲苯加到反应混合物中，用3%（重量）NaCl水溶液洗涤混合物三次，每次300ml，然后用无水硫酸钠干燥甲苯层并通过棉塞过滤，减压除去滤液中的甲苯。残余物经硅胶柱层析纯化，并将乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液（体积比为100∶1∶400）洗脱的所需级分进行浓缩，得到1.27g 2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-叠氮基-6-脱氧-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（0.758mmol，产率89.0%）。
熔点（℃）：115.0-117.0。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax（CH3CN）〕（nm）＝283（logε＝3.97），227（Sh），209（logε＝4.22）。
红外光谱（cm-1）：3490，2960，2110，1754，1532，1372，1350，1236，1188，1032，958，898.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：2.00-2.19（ca.40H，each s），3.04（3H，s），3.43-3.60（2H，ABlike），3.85-4.85（m），5.15-5.50（m），7.28（1H，d，J＝9.0 Hz），8.16（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz），8.30（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝7.8分钟。
旋光度〔α〕：（C0.500，1，4-二噁烷）：+92.6°。
元素分析C65H83ClN4O43S：
C H N
计算值（％）： 46.59 4.99 3.34
实测值（％）： 46.43 5.01 3.38
（2）2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷的制备
除了使用1.22g实施例2步骤（1）中得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-叠氮基-6-脱氧-4-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（0.728mmol）作为起始原料之外，重复实施例1步骤（6）中的方法，得到687mg所需产物2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷（0.632mmol，产率86.8%）。
熔点（℃）：170.0-172.0（同时分解）。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝289（logε＝3.96），227（logε＝3.98）209（logε＝4.18）。
红外光谱（cm-1）：3400，2930，2110，1632，1584，1522，1486，1350，1276，1250，1172，1152，1080，1026，958，896.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（DMSO-d6）：3.20-3.85（m），3.24（3H，s），3.85-3.95（1H，ddd like），4.28（2H，br t，J＝7.2 Hz），4.40-4.60（m），5.05（2H，d，J＝3.2 Hz），5.10（1H，d，J＝5.4Hz），5.25（1H，d，J＝3.9Hz），5.27（1H，d，J＝7.3 Hz），5.30-5.70（m），7.47（1H，d，J＝9.3 Hz），8.19（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz），8.31（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Tosoh Corp.生产，TSK凝胶Amide-80柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝4.6分钟。
旋光度〔α〕：（C0.516，H2O）：+86.1°。
元素分析C37H55ClN4O29S：
C H N
计算值（％）： 40.87 5.10 5.15
实测值（％）： 40.62 4.92 5.05
实施例3
2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷的制备
（1）2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-O-甲磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三-〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
将按实施例1步骤（2）相同方法得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（11.6g，7.38mmol）溶于300ml吡啶，并将21.1g（110mmol）甲苯磺酰氯加到该溶液中。混合物于室温搅拌5小时使进行反应。然后，通过减压蒸发除去反应混合物中所含的吡啶，残余物经硅胶柱层析纯化，并将乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷（体积比为50∶1∶100）洗脱的所需级分进行浓缩，得到6.43g2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（3.72mmol，产率50.5%）。
熔点（℃）：109.0-113.5。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax（CH3CN）〕（nm）＝281（logε＝3.95），272（Sh）。
红外光谱（cm-1）：3490，2970，1752，1586，1528，1486，1430，1372，1350，1240，1178，1034，942.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：1.99-2.17（ca.40H，each s），2.45（3H，s），3.50-4.80（m），5.10-5.50（m），7.27（1H，d，J＝9.0 Hz），7.33（2H，d，J＝8.5 Hz），7.79（2H，d，J＝8.5 Hz），8.15（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz），8.29（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝7∶3（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝8.3分钟。
旋光度〔α〕：（C0.650，1，4-二噁烷）：+88.0°。
元素分析C71H88ClNO44S：
C H N
计算值（％）： 49.38 5.14 0.81
实测值（％）： 49.14 5.10 0.79
（2）2-氯-4-硝基苯基O-（2，3，4-三-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三-〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
将实施例3步骤（1）得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（4.24g，2.46mmol）溶于20ml吡啶，并将10ml乙酸酐加到该溶液中。混合物于室温搅拌15分小时使进行反应。减压蒸发除去反应混合物中的吡啶。残余物经硅胶柱层析纯化，并将乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液（体积比为40∶1∶100）洗脱的所需级分进行浓缩，得到2.90g2-氯-4-硝基苯基O-（2，3，4-三-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（1.64mmol，产率66.6%）。
熔点（℃）：116.5-118.0。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax（CH3CN）〕（nm）＝284（logε＝3.97），226（logε＝4.34）。
红外光谱（cm-1）：3490，2960，1754，1584，1528，1486，1432，1372，1352，1238，1180，1040，994，940，898.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：1.93-2.19（ca.40H，each s），2.45（3H，s），3.80-4.80（m），4.96（1H，t like），5.10-5.50（m），7.28（1H，d，J＝9.0 Hz），7.35（2H，d，J＝8.2 Hz），7.78（2H，d，J＝8.2 Hz），8.16（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.4 Hz），8.29（1H，d，J＝2.4 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝6.7分钟。
旋光度〔α〕：（C0.692，1，4-二噁烷）：+92.6°。
元素分析C73H90ClNO45S：
C H N
计算值（％）： 49.56 5.13 0.79
实测值（％）： 49.43 5.17 0.84
（3）2-氯-4-硝基苯基-O-（2，3，4-三-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷的制备
除用实施例3步骤（2）得到的2.00g 2-氯-4-硝基苯基O-（2，3，4-三-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三-〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（1.13mmol）作为起始原料之外，重复实施例1步骤（4）的方法，得到1.94g2-氯-4-硝基苯基O-（2，3，4-三-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（1.13mmol，产率99.9%）。
熔点（℃）：127.0-129.0。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax（CH3CN）〕（nm）＝284（logε＝4.10），227（Sh），214（logε＝4.25）。
红外光谱（cm-1）：3500，2970，1754，1586，1530，1486，1434，1374，1354，1238，1040，946，900.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：1.99-2.19（ca.40H，each s），3.13（1H，dd，J＝11.2 Hz，6.2 Hz），3.28（1H，dd，J＝11.2 Hz，1.5 Hz），3.68（1H，ddd，J＝8.8 Hz，6.2 Hz，1.5 Hz）.3.85-4.85（m），5.15-5.50（m），7.28（1H，d，J＝9.2 Hz），8.16（1H，dd，J＝9.2 Hz，2.8 Hz），8.29（1H，d，J＝2.8 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝6.0分钟。
旋光度〔α〕：（C0.634，1，4-二噁烷）：+91.0°。
元素分析C66H83ClNO42：
C H N
计算值（％）： 45.96 4.85 0.81
实测值（％）： 45.87 4.84 0.68
（4）2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷的制备
除使用2.16g实施例3步骤（3）得到的2-氯-4-硝基苯基O-（2，3，4-三-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-三〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-O-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-β-D-吡喃葡糖苷（1.26mmol）作为起始原料之外，用2.04g按实施例2步骤1相同方法得到的起始原料2-氯-4-硝基苯基十五烷-O-乙酰-65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷（1.20mmol，产率95.2%）重复实施例1步骤6的方法，得到876mg所需产物2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷（0.868mmol，产率72.3%）。
熔点（℃）：130.0-135.5（同时分解）。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝290（logε＝3.98），227（logε＝3.99）209（logε＝4.20）。
红外光谱（cm1）：3410，2930，2110，1584，1520，1484，1274，1150，1078，1024.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（DMSO-d6）：3.05-3.90（m），4.20-4.55（m），4.74（1H，br d，J＝4.8 Hz），4.96（1H，br d，J＝5.4 Hz），5.05（2H，d，J＝3.7 Hz），5.10（2H，d，J＝3.7 Hz），5.25（1H，d，J＝7.6 Hz），5.25-5.60（m），7.47（1H，d，J＝9.3 Hz），8.19（1H，dd，J＝9.3 Hz，2.7 Hz），8.29（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Tosoh Corp.生产，TSK凝胶Amide-80柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝6.7分钟。
旋光度〔α〕：（C0.516，H2O）：+92.4°。
元素分析C36H53ClN4O27：
C H N
计算值（％）： 42.84 5.29 5.55
实测值（％）： 42.88 5.31 5.59
实施例4
4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D麦芽庚糖苷的制备
（1）4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷的制备
将15.0g（11.8mmol）市售的4-硝基苯基α-D-麦芽庚糖苷溶于75ml无水DMF中，并将15.0ml（113mmol）四甲氧基甲烷和7.5g Amberlyst（15E）商标加到该溶液中。混合物于35℃搅拌4小时使进行反应。接着，使反应混合物缓慢滴入冰冷却下的2.01 100mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中。得到的混合物经ODS（十八烷基硅胶）柱层析纯化，并浓缩用乙腈-水混合溶液（体积比为35∶65）洗脱的所需级分。除用10.0g得到的油状4-硝基苯基47，67-二甲氧基亚甲基-α-D-麦芽庚糖苷（7.43mmol，产率63.0%）作为起始原料之外，重复实施例1步骤（2）的方法，得到6.70g 4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷（3.17mmol，两步的总产率42.6%）。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝290（logε＝3.98），227（Sh），209（logε＝4.27）。
红外光谱（cm-1）：3640，2970，1752，1612，1594，1526，1496，1432，1370，1350，1236，1038，948，898.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：2.00-2.20（Ca.60H，each s），3.65-4.85（m），5.15-5.55（m），7.08（2H，d，J＝9.1 Hz），8.22（2H，d，J＝9.1 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝7∶3（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝5.3分钟。
（2）4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-4-O-甲氧基甲基-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷的制备
除用实施例4步骤（1）得到的4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷（6.70g，3.17mmol）作为起始原料之外，重复实施例3步骤（1）的方法，得到5.57g 4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-O-甲苯磺酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷（2.46mmol，产率77.6%）。将该甲苯磺酰衍生物溶于40ml乙腈，并将1.93g甲氧基甲基氯（24mmol）和3.10g N，N-二异丙基-N-乙胺（24mmol）加到该溶液中。将混合物在回流下搅拌3小时使进行反应，并减压蒸发除去溶剂和胺。残余物溶于500ml甲乙酮中，并将15.1g碘化钠（100mmol）加到该溶液中，混合物于85℃搅拌6小时使进行反应。然后通过硅藻土床过滤反应混合物，并减压蒸发除去滤液中所含的甲乙酮。残余物经硅胶柱层析纯化，并浓缩用乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合溶液（体积比为100∶1∶100）洗脱的所需级分，得到3.58g4-硝基苯基O-2，3-二-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-4-O-甲氧基甲基-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷（1.58mmol，两步的总产率64.2%），为油状产物。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝290（logε＝3.98），227（Sh），209（logε＝4.22）。
红外光谱（cm-1）：3630，2960，1750，1610，1592，1526，1494，1430，1370，1350，1234，1040，960，898.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（CDCl3）：2.00-2.19（ca.60H，each s），3.22（1H，dd，J＝11.0 Hz，6.5 Hz），3.36（3H，s），3.46（1H，dd，J＝11.0 Hz，1.5Hz），3.68（1H，ddd，J＝8.8 Hz，6.5 Hz，1.5 Hz），3.85-4.85（m），5.15-5.50（m），7.08（2H，d，J＝9.0 Hz），8.22（2H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Nacalai Tesque Inc.生产，COSMOSIL C18柱（4.6mmID×150mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝7∶3（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝10.8分钟。
元素分析C90H118INO58：
C H N
计算值（％）： 47.64 5.24 0.62
实测值（％）： 47.34 5.42 0.55
（3）4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D-麦芽戊糖苷的制备
除用3.64g实施例4步骤（2）得到的4-硝基苯基O-（2，3-二-O-乙酰-6-脱氧-6-碘代-4-O-甲氧基甲基-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）-五〔O-（2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖基）-（1→4）〕-2，3，6-三-O-乙酰-α-D-吡喃葡糖苷（1.58mmol）作为起始原料之外，重复实施例1步骤（5）和（6）的方法，得到1.15g4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-α-D-麦芽庚糖苷（0.897mmol，两步的总产率56.8%）。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝289（logε＝4.01），228（Sh），209（logε＝4.25）。
红外光谱（cm-1）：3410，2930，1644，1612，1592，1520，1500，1346，1250，1152，1080，1020，934，876.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（DMSO-d6）：3.15-3.80（m），3.25（3H，s），4.25-4.60（m），4.56（2H，d，J＝2.0 Hz），4.70-4.90（m），5.05（2H，d，J＝3.4 Hz），5.11（1H，d，J＝3.7 Hz），5.19（3H，d，J＝2.2 Hz），5.23（1H，d，J＝3.4 Hz），5.25-5.65（m），7.23（2H，d，J＝9.2 Hz），8.23（2H，d，J＝9.2 Hz）.
高效液相色谱〔Tosoh Corp.生产，TSK凝胶Amide-80柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝65∶35（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝8.8分钟。
元素分析C50H77NO37：
C H N
计算值（％）： 46.77 6.04 1.09
实测值（％）： 46.50 6.28 1.01
实施例5 测定α-淀粉酶活性（1）
（1）制备底物溶液
将按实施例1得到的2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲苯磺酰-β-D-麦芽戊糖苷（分子量：1044）溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，制成浓度为1.14mM的底物溶液。
（2）制备偶合酶溶液
使市售的从酵母得到的α-葡糖苷酶和市售的从杏仁得到的β-葡糖苷酶溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中制成浓度为117单位/ml和13单位/ml的偶合酶溶液。作为市售的α-和β-葡糖苷酶，可使用购自Toyobo有限公司的商品。
（3）制备标准α-淀粉酶溶液
使市售的人α-淀粉酶（P∶S＝1∶1）溶于纯化水中，制成浓度分别为0，148，284，401和525IU/1的标准α-淀粉酶溶液。作为市售的人α-淀粉酶，可使用国际试剂公司生产的Calibzyme.AMY。至于α-淀粉酶的活性，在37℃下分解1μmol（市售的）2-氯-4-硝基苯基β-D-麦芽戊糖苷1分钟的酶量被定义为1国际单位（IU）。
（4）制备样品溶液
当用于测定α-淀粉酶活性的样品为液体时，其本身即可被用作样品溶液。当为固体时，精确称取500mg样品并将纯化水加到该样品中，使总体积达5ml制成样品溶液。若有必要，在使用前通过过滤等操作方法除去样品溶液中不溶性物质。
（5）绘制标准曲线
在搅拌下将1.0ml偶合酶溶液加到250μl标准α-淀粉酶溶液中，并于37℃加热该混合物1分钟。然后，在搅拌下将2.0ml底物溶液加到混合物中，并于37℃加热混合物2分钟，然后在400nm下测定吸光度变化2分钟。根据标准α-淀粉酶溶液的活性与吸光度变化之间的关系绘制一条标准曲线。结果，标准曲线可用下式表示：
U＝8.34·△A×103+11.2
其中U：酶活性（IU/l），
△A：每分钟的吸光度变化。
标准曲线见图1。
（6）测定样品溶液中α-淀粉酶活性
在搅拌下将1.0ml偶合酶加到250μl样品溶液中，并于37℃加热混合物1分钟。在搅拌下将2.0ml底物溶液加到混合物中，并于37℃加热混合物2分钟，然后在400nm下测定吸光度变化2分钟。根据测定结果和在步骤（5）中绘制的标准曲线，通过计算可测得样品溶液中α-淀粉酶的活性。当样品中酶活性超出标准曲线的应用范围（O-525IU/l）时，可在重测之前用纯化水将样品溶液稀释到适当的浓度。
实施例6 测定α-淀粉酶活性（2）
（1）制备底物溶液
将实施例3中得到的2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷（分子量：1009）溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，制成浓度为2.28mM的底物溶液。
（2）制备偶合酶溶液
（3）制备标准α-淀粉酶溶液
（4）制备样品溶液
（5）绘制标准曲线
按照实施例5步骤（2）-（5）相同的方法制备偶合酶溶液，标准α-淀粉酶溶液，样品溶液并绘制标准曲线。结果，标准曲线可用下式表示：
U＝8.66·△A×103-6.7
标准曲线见图2。
（6）测定样品溶液中α-淀粉酶活性
按照实施例5步骤（6）相同的方法测定样品溶液中α-淀粉酶的活性。
实施例7
用α-淀粉酶对前面提到的63-叠氮基-63-脱氧麦芽三糖苷衍生物和本发明新化合物65-叠氮基-65-脱氧麦芽戊糖苷衍生物进行水解，比较它们的水解速度。
（1）2-氯-4-硝基苯基63-叠氮基-63-脱氧-β-D-麦芽三糖苷的制备
除使用市售的2-氯-4-硝基苯基β-D-麦芽三糖苷（10.0g，15.2mmoles）作为起始原料之外，按照实施例3相同的方法制备2-氯-4-硝基苯基63-叠氮基-63-脱氧-β-D-麦芽三糖苷。所得63-叠氮基-63-脱氧-麦芽三糖苷的产率为1.14g（1.67mmol，八步的总产率11.0%），该产物具有下列特性：
熔点（℃）：100.5-103.5（同时分解）。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长〔λmax〕（nm）＝290（logε＝3.99），227（logε＝4.00）209（logε＝4.22）。
红外光谱（cm-1）：3410，2940，2112，1586，1522，1486，1274，1156，1078，1024，924，896.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（DMSO-d6）：3.05-3.90（m），4.25-4.55（m），4.72（1H，br d，J＝5.0 Hz），4.96（1H，br d，J＝5.5 Hz），5.08（1H，d，J＝3.1 Hz），5.11（1H，d，J＝3.8 Hz），5.26（1H，d，J＝7.6 Hz），5.25-5.60（m），7.48（1H，d，J＝9.2 Hz），8.20（1H，dd，J＝9.2 Hz，2.7 Hz），8.30（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Tosoh Corp.生产，TSK凝胶Amide-80柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝3∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝3.9分钟。
元素分析C24H33ClN4O17：
C H N
计算值（％） 42.08 4.86 8.18
实测值（％） 42.01 4.99 8.29
（2）制备底物溶液（a）
使实施例3中得到的2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷（在下文中称为本发明的底物）溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，制成浓度为3.00mM的底物溶液（a）。
（3）制备底物溶液（b）
使步骤（1）中得到的2-氯-4-硝基苯基63-叠氮基-63-脱氧-β-D-麦芽三糖苷（在下文中称为参照底物）溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，制成浓度为3.00mM的底物溶液（b）。
（4）制备偶合酶溶液
按照实施例5步骤（2）相同的方法制备偶合酶溶液。
（5）制备α-淀粉酶溶液
使市售的人α-淀粉酶（P∶S＝1∶1）溶于纯化水中，按照实施例5步骤（3）相同的方法制成浓度分别为0.250和500IU/l的α-淀粉酶溶液。
（6）α-淀粉酶水解
在搅拌下，将1.0ml偶合酶溶液加到250μlα-淀粉酶溶液中，并于37℃加热混合物1分钟。在搅拌下，将底物溶液各2.0ml加到混合物中，并于37℃加热混合物2分钟，然后在400nm下测定吸光度变化2分钟。结果示于表1中。
从表1可知，参照底物几乎不能被α-淀粉酶水解，而本发明的底物可令人满意地被α-淀粉酶水解。
实施例8
比较α-淀粉酶对53-烯醇式麦芽三糖苷衍生物和本发明的55-烯醇式麦芽戊糖苷衍生物进行水解的速度。
（1）2-氯-4-硝基苯基53-烯醇式-43-O-甲苯磺酰-β-D-麦芽三糖苷的制备
除使用市售的2-氯-4-硝基苯基β-D-麦芽三糖苷（10.0g，15.2mmol）作为起始原料之外，按照实施例1相同的方法制备麦芽三糖苷衍生物，所得产物的产率为1.23g（1.71mmol，七步的总产率11.3%），该产物具有下列特性：
熔点（℃）：142.0-145.0（同时分解）。
紫外-可见吸收光谱：最大吸收波长（λmax）（nm）＝289（logε＝4.00），228（sh），209（logε＝4.44）。
红外光谱（cm-1）：3400，2920，1642，1584，1518，1488，1348，1276，1250，1152，1080，1020，928，892.
核磁共振波谱（200 MHz）ppm（DMSO-d6）：3.25-3.85（m），3.30（3H，s），4.04（1H，br s），4.30-4.60（m），4.58（2H，br d，J＝2.2 Hz），5.11（1H，d，J＝3.8 Hz），5.19（1H，d，J＝3.2 Hz），5.26（1H，d，J＝7.4 Hz），5.25-5.65（m），7.47（1H，d，J＝9.0 Hz），8.18（1H，dd，J＝9.0 Hz，2.7 Hz），8.29（1H，d，J＝2.7 Hz）.
高效液相色谱〔Tosoh Corp生产，Tsk凝胶Amide-80柱（4.6mmID×250mm），UV280nm检测，洗脱剂：乙腈/水＝4∶1（V/V），流速：1.0ml/分钟〕：tR＝4.6分钟。
元素分析C25H34ClNO19S
C H N
计算值（％）： 41.70 4.76 1.95
实测值（％）： 41.53 4.88 1.90
（2）制备底物溶液（a）
将实施例1得到的2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲苯磺酰-β-D-麦芽戊糖苷（在下文中称为本发明的底物溶于含有40mMNaCl和2mMMgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，使浓度达3.00mM。
（3）制备底物溶液（b）
将前面步骤（1）得到的2-氯-4-硝基苯基53-烯醇式-43-O-甲苯磺酰-β-D-麦芽三糖苷（在下文中称为参照底物）溶于含有40mMNaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，使浓度达3.00mM。
（4）制备偶合酶溶液
按照实施例5步骤（2）相同的方法制备偶合酶溶液。
（5）制备α-淀粉酶溶液
按照实施例7步骤（5）相同的方法制备α-淀粉酶溶液。
（6）α-淀粉酶酶水解
按照实施例7步骤（6）相同的方法测定吸光度的变化。结果示于表2中。
从表2可知，参照底物几乎不能被α-淀粉酶水解，而本发明的底物可相当顺利地被α-淀粉酶水解。
实施例9 偶合酶抗性试验（1）
（1）制备底物溶液（a）
将实施例1中得到的2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲苯磺酰-β-D-麦芽戊糖苷（分子量：1044;在下文中称为本发明的底物）溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中使浓度达3.0mM。
（2）制备底物溶液（b）
将用常规方法得到的2-氯-4-硝基苯基β-D-麦芽戊糖苷（分子量：984;在下文中称为参照底物）溶于含有40mMNaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，使浓度达3.0mM。
（3）制备偶合酶溶液
使市售的得自于酵母的α-葡糖苷酶和市售的得自于杏仁的β-葡糖苷酶溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中制成浓度分别为1053单位/ml和15.5单位/ml的偶合酶溶液。作为市售的α-和β-葡糖苷酶，可使用购自Toyobo有限公司的商品。
（4）偶合酶反应
于37℃加热偶合酶溶液5分钟，然后使它与2.0ml本发明的底物溶液或参照底物溶液充分混合，并于37℃加热3分钟。然后在400nm处测定吸光度的变化5分钟。
结果见图3。在图3中，符号▽表示底物溶液（a）的测定值在图中的标出点，□表示底物（b）的测定值在图中的标出点。从图3可知，本发明的底物不能被偶合酶水解，在测定系统中是稳定的。
实施例10 偶合酶抗性试验（2）
除使用实施例3中得到的2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷（分子量：1009;在下文中称为本发明的底物）作为底物（a）之外，按照实施例9相同的方法进行试验。结果见图4，在图4中，符号△表示底物溶液（a）的测定值在图中的标出点，□表示底物溶液（b）的测定值在图中的标出点。从图4可知，本发明的底物不能被偶合酶水解，在测定系统中是稳定的。
实施例11 用于测定的试剂（1）
（1）试剂的制备
将下列成分溶于纯化水中配制成一定的浓度，得制试剂。
成分 浓度
2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-
甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷 0.70mM
α-葡糖苷酶 40单位/ml
β-葡糖苷酶 5.0单位/ml
β-甘油磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0） 20mM
牛血清白蛋白 0.05%
（2）测定方法
当待测样品是液体时，可直接以样品溶液形式应用。当样品是固体时，精确称取500mg样品并将纯化水加到样品中，使总体积达5ml制备样品溶液。将试剂（3.0ml）于37℃预热2分钟，在搅拌下将其加到250μl样品溶液中，并将混合物于37℃加热2分钟，在400nm处测定吸光度的变化2分钟。根据测定值和预先制备的标准曲线，通过计算可测定样品溶液中α-淀粉酶的活性。当样品中的酶活性超出标准曲线的应用范围（0-525IU/l）时，可在重测之前用纯化水将样品溶液稀释到适当的浓度。
实施例12 用于测定的试剂（2）
制备试剂和测定方法
除了用2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷代替2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷之外，重复实施例11的方法并且使用浓度为2.00mM。
实验实施例
按照下列方法检验实施例中得到的本发明底物2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-β-D-麦芽戊糖苷（EMG5CNP）和2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-β-D-麦芽戊糖苷（ADG5CNP）的Km值，水解速度，水溶性和水解作用的方式。结果见表3和4。
作为参照底物，可使用市售的2-氯-4-硝基苯基β-D-麦芽戊糖苷（G5CNP）。
（1）Km值
（ⅰ）制备底物溶液（a）
使底物溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，分别制成0.16，0.32，0.48，0.64，0.80和0.96mM的底物溶液。
（ⅱ）Km值的粗略计算
按照与下述测定水解速度相同的方法测定底物的水解速度，并粗略计算Lineweaver-Burk氏倒数（见“Tanpaku-Kohso no Jikken-hou”，ed Takelchi Horio & Jinpei Yamashita，Nanko-do，1981）得到各底物溶液的Km值。
（ⅲ）制备底物溶液（b）
将每种底物溶于含有40mM NaCl和2mM
MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，制成浓度为上述（ⅱ）中粗略计算出的Km值的0.8-1.6倍的三种底物溶液，和浓度为上述（ⅱ）中粗略计算出的Km值的1.6-3.2倍的三种底物溶液。
（ⅳ）测定Km值
按照上述（ⅱ）相同的方法计算Km值。
（2）水解速度
（ⅰ）制备底物溶液
将各底物溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中，使得底物溶液的浓度为Km值的7-9倍。该浓度大约相当于下述与α-淀粉酶反应中人α-淀粉酶Km值的5倍，因此底物溶液中底物的量足以达到最大水解速度。
（ⅱ）制备偶合酶溶液
按照实施例5步骤（2）相同的方法制备偶合酶溶液。
（ⅲ）制备α-淀粉酶溶液
按照实施例5步骤（3）相同的方法制备浓度大约为500IU/l的市售人P型和S型α-淀粉酶溶液。
（ⅳ）测定水解速度（α-淀粉酶反应）
将1.0ml偶合酶与250μl（ⅲ）中制得的α-淀粉酶溶液混合。将混合物于37℃加热1分钟，并在搅拌下将2.0ml底物溶液加到混合物中。于37℃加热该混合物2分钟，然后测定400nm处的吸光度变化2分钟。
3mMG5CNP（参照底物）水解速度的相对数值被定义为10，以此表示各底物的水解速度，即每单位时间变化的吸光度。
（3）水溶性
向100ml水中加入20g底物，观察溶解状态，
（4）作用方式
将各底物溶于含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸盐缓冲剂（pH＝7.0）中使底物溶液的浓度为0.5mM。向1.0ml底物溶液中加入100μl在（ⅲ）中制得的用于测定水解速度的α-淀粉酶溶液，充分搅拌之后，使混合物于37℃反应20分钟。通过反应混合物的高效液相色谱定量测定水解产物。
注释Am2两种人α-淀粉酶（同功酶）
P2得自于人胰液的α-淀粉酶
S3得自于人唾液的α-淀粉酶
从表3和4可知，本发明的底物基本上在单一的D-葡糖苷键处水解，两种α-淀粉酶的作用方式和水解速度是相同的，并且它们对α-淀粉酶具有高度亲和力和良好的水解速度及水溶性，因此它们作为用于测定α-淀粉酶活性的底物是相当好的。
Claims (7)
1、一种下列通式所示的麦芽低聚糖苷衍生物：
其中n代表整数3-5，R代表芳香发色团，X代表＞CHCH2N3或＞C=CH2，Y代表氢原子、取代或未取代的烃基，或烷磺酰基或芳磺酰基。
2、根据权利要求1的麦芽低聚糖苷衍生物，其中芳香发色团R以下式表示：
其中R1-R5，可以相同或不同，可以代表氢原子、卤原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，或R1和R2或R2和R3可键合起来形成一个稠合的芳环，
其中R6代表氢原子或烷基，
其中R7代表氢原子或卤原子，
其中R8-R15，可以相同或不同，可以代表氢原子、卤原子、硝基、烷基、芳基、芳烷基、氨基、磺酸基或羧基，R8和R9或R10和R11可以键合起来形成一个稠合的芳环，R9和R10和/或R13和R14可分别代表一个共用氧原子，以形成一个稠合的醚环，Z代表氮原子或N→O。
3、根据权利要求1的麦芽戊糖苷衍生物，该衍生物是2-氯-4-硝基苯基65叠氮基-65-脱氧-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲磺酰-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-D-麦芽戊糖苷，2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基57-烯醇式-47-O-甲氧基甲基-D-麦芽戊糖苷，4-硝基苯基67-叠氮基-67-脱氧-D-麦芽庚糖苷，2，4-二氯苯基67-叠氮基-67-脱氧-47-O-甲磺酰-D-麦芽庚糖苷，靛酚基-31-氯苯基65-叠氮基-65-脱氧-45-O-甲基-D-麦芽戊糖苷4-甲基繖形酮基65-叠氮基-65-脱氧-D-麦芽戊糖基，刃天青基56-烯醇式-D-麦芽己糖苷，荧光素基67-叠氮基-67-脱氧-47-O-烯丙基-D-麦芽庚糖苷或靛酚基-31-氯苯基55-烯醇式-45-O-（2-甲氯基）乙氧基-甲基-D-麦芽戊糖苷。
4、根据权利要求1的麦芽戊糖苷衍生物，该衍生物是2-氯-4-硝基苯基65-叠氮基-65-脱氧-D-麦芽戊糖苷或2-氯-4-硝基苯基55-烯醇式-45-O-甲磺酰-D-麦芽戊糖苷。
5、一种用于测定α-淀粉酶活性的试剂，该试剂含有根据权利要求1的麦芽低聚糖苷衍生物作为有效成分。
6、一种用于测定α-淀粉酶活性的方法，该方法包括将权利要求1的麦芽低聚糖苷衍生物的α-异头物和α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶加到含有α-淀粉酶的样品中进行酶促反应，并定量测定生成的芳香发色化合物。
7、一种用于测定α-淀粉酶活性的方法，该方法包括将权利要求1的麦芽低聚糖苷衍生物的β-异头物或其α-异头物和β-异头物的混合物，α-葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶和β-葡糖苷酶加到含有α-淀粉酶的样品中进行酶促反应，并定量测定生成的芳香发色化合物。
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