CN103898193B - α‑淀粉酶的检测试剂和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α‑淀粉酶的检测试剂和检测方法，检测试剂包括10mmol/L～40mmol/L的麦芽戊糖、1000U/L～5000U/L的α‑葡萄糖苷酶、10mmol/L～30mmol/L的氯化钙和1mmol/L～50mmol/L的缓冲液。检测方法包括将α‑淀粉酶溶液加入到α‑淀粉酶的检测试剂中进行催化反应，反应完成后，利用便携式葡萄糖检测仪对所得反应产物进行检测，记录检测仪的读数，计算α‑淀粉酶溶液的浓度。本发明的检测试剂可快速定量检测α‑淀粉酶，检测方法操作简便、快速、所用仪器可便携、灵敏度高、选择性好、且无需专业培训即可快速对α‑淀粉酶进行检测。

Description

α-淀粉酶的检测试剂和检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测试剂和检测方法，具体涉及一种α-淀粉酶的检测试剂和利用便携式血糖仪或其它葡萄糖检测仪快速定量检测α-淀粉酶的方法。

背景技术

α-淀粉酶（α-1,4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）能切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4 葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等。α-淀粉酶由唾液腺和胰腺内具有分泌功能的上皮细胞合成。流行性腮腺炎，特别是急性胰腺炎时，血和尿中的α-淀粉酶浓度显著增高。一些急腹症，如急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、溃疡病穿孔等均可引起血清α-淀粉酶升高，因此α-淀粉酶的检测具有重要的临床意义。

传统的用于α-淀粉酶测定的方法主要有：（1）以天然淀粉为底物的测定方法。以天然淀粉为底物时，由于天然淀粉分子结构组成的不确定性及酶解产物的不均一性，使酶促反应不能按化学式量进行计算。应用不同来源、厂家、批号的淀粉作为底物时，测得结果差别较大，方法不易标准化。目前除碘-淀粉法外，这类方法已被淘汰。（2）使用结构确定的人工合成底物进行α-淀粉酶测定的酶偶联分析方法。这类方法可以改进酶反应的化学计量关系，在加入不同工具酶后进行多步水解过程，通过测定水解终产物的吸光度值来计算α-淀粉酶的浓度。这些底物有小分子寡聚糖（含3～7个葡萄糖单位）和对-硝基苯酚-糖苷等。其中麦芽戊糖和麦芽四糖是常用的的反应底物，试剂稳定，水解产物确定，化学计量关系明确。

但是，这些传统的检测α-淀粉酶的方法需要大型的昂贵仪器，如大型全自动生化仪，通过测定水解终产物的吸光度值来计算α-淀粉酶的浓度。由于大型全自动生化仪设备价格高，操作复杂，操作人员需要相关专业知识和培训，并且该仪器使用配套条件要求高，需要专业人员定期保养，因此基层医疗机构或家庭个人没有条件购买和使用。如果我们能够利用低成本的、操作简单的便携式检测仪器，例如已经商业化的便携式血糖仪，在无需专业技术人员协助情况下就可以方便个人在家中对α-淀粉酶进行快速地检测，这对于低收入人群或不发达国家中的人们来说将具有重大意义。因此，发展一种快速的，低成本的，简单易行的α-淀粉酶检测方法将具有非常重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可快速定量检测α-淀粉酶的检测试剂，还提供一种操作简便、快速、所用仪器可便携、灵敏度高、选择性好、且无需专业培训即可快速对α-淀粉酶进行检测的α-淀粉酶的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种α-淀粉酶的检测试剂，所述检测试剂包括以下浓度的组分：

麦芽戊糖 10mmol/L～40mmol/L，

α-葡萄糖苷酶 1000U/L～5000U/L，

氯化钙 10mmol/L～30mmol/L，和

缓冲液 1mmol/L～50mmol/L。

上述麦芽戊糖、α-葡萄糖苷酶和氯化钙的浓度均指在缓冲液中的终浓度。

上述的检测试剂中，优选的，所述缓冲液的pH值为7.0～7.5。

上述的检测试剂中，优选的，所述缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液或Tris-盐酸缓冲液。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种α-淀粉酶的检测方法，包括以下步骤：将α-淀粉酶溶液加入上述的α-淀粉酶的检测试剂中进行催化反应，反应完成后，利用便携式葡萄糖检测仪对所得反应产物进行检测，记录检测仪的读数，计算α-淀粉酶溶液的浓度。

上述的检测方法中，优选的，所述便携式葡萄糖检测仪包括便携式血糖仪。

上述的检测方法中，优选的，所述催化反应的时间为5min～60min。

上述的检测方法中，优选的，所述检测方法中的所有操作过程均控制在25℃～45℃条件下进行，更优选的，所述检测方法中的所有操作过程均控制在37℃条件下进行。

上述的检测方法中，优选的，所述α-淀粉酶溶液中α-淀粉酶的浓度为20U·L^-1～1000U·L^-1。

上述的检测方法中，优选的，所述α-淀粉酶溶液的溶剂为缓冲液，所述缓冲液与所述α-淀粉酶的检测试剂中采用的缓冲液相同。

本发明中检测α-淀粉酶的原理为：

α-淀粉酶能切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等。当以麦芽戊糖作为反应底物时，α-淀粉酶能够切断麦芽戊糖分子内的α-1,4葡萄糖苷键，产生麦芽丙糖和麦芽糖。当有α-葡萄糖苷酶存在时，麦芽丙糖和麦芽糖分子酶解为葡萄糖，然后对生成的终产物葡萄糖进行直接快速检测。

本发明中，为了使α-淀粉酶、底物麦芽戊糖、辅助酶α-葡萄糖苷三者能很好地反应，酶和底物都需要缓冲液提供适宜的酶解环境，因此本发明为了提供一个适宜的酶解环境，优选将待测样品与可溶性底物在pH值为7.0～7.5、浓度为1mmol/L～50mmol/L的缓冲液中混合。

本发明中，检测试剂还包括氯化钙，这是由于α-淀粉酶具有Ca⁺结合部位，能够结合Ca⁺以保持酶结构的稳定和酶的催化活性，因此，本发明的检测试剂中加入氯化钙以保证α-淀粉酶的稳定性和催化活性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明实际提供了一种新颖的信号获取方式，可快速、简便地实现对α-淀粉酶的有效检测。本发明的检测试剂只需要进行简单的一步混合，经过催化反应后，通过对终产物葡萄糖的检测即可实现对α-淀粉酶的检测，反应过程操作简单、快速，不需要任何分离或标记等步骤。

（2）本发明的检测方法操作简便、成本低廉，只需要使用低成本的血糖仪或其它葡萄糖检测仪器就可以对α-淀粉酶进行检测，避免了使用大型、复杂、昂贵的检测仪器和设备，不需要专业技术人员的协助就可以方便个人在家中或户外对α-淀粉酶进行快速、准确地检测。

（3）本发明的检测方法利用酶催化底物具有专一性、高效率等特点，可明显地增强检测信号，从而实现α-淀粉酶的高灵敏、高选择性检测，可以真正实现在事故地点或其他场合进行快速定量检测。

（4）由于本发明创造性地利用血糖仪这种已经广泛商业化的产品实现了对α-淀粉酶的检测，使其在其它酶检测领域也具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中α-淀粉酶的检测方法的原理示意图。

图2为本发明实施例1中对不同浓度的α-淀粉酶标准溶液的检测结果图。

图3为本发明实施例2中对不同物质的特异性检测结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1：对不同浓度α-淀粉酶的检测

一种本发明的α-淀粉酶的检测试剂，由麦芽戊糖、α-葡萄糖苷酶、氯化钙和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液组成。其中，麦芽戊糖在缓冲液中的浓度为30mmol/L，α-葡萄糖苷酶在缓冲液中的浓度为2000U/L，氯化钙在缓冲液中的浓度为30mmol/L，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液的pH值为7.3，浓度为10mmol/L，即包括0.0408g磷酸氢二钠和0.2507g磷酸二氢钾。

上述α-淀粉酶的检测试剂是通过以下配制方法得到：

（1）分别配制麦芽戊糖溶液、α-葡萄糖苷酶溶液和氯化钙溶液，溶剂均为pH 7.3、10mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；将麦芽戊糖溶液与α-葡萄糖苷酶溶液置于37℃恒温箱中预热；

（2）将氯化钙溶液与预热后的麦芽戊糖溶液、α-葡萄糖苷酶溶液混合，使各成分的配比满足上述检测试剂的要求，充分混匀后置于37℃恒温箱中，得到α-淀粉酶的检测试剂。

上述本实施例的检测试剂也可以通过直接将麦芽戊糖、α-葡萄糖苷酶、氯化钙和缓冲液按所需配比进行混合制备得到。

一种利用上述本实施例的检测试剂检测α-淀粉酶的方法，其检测原理如图1所示：将α-淀粉酶溶液加入到配制好的检测试剂（即反应试剂，包含有麦芽戊糖底物和α-葡萄糖苷酶）中，催化反应（即孵育）一段时间后，α-淀粉酶能切断麦芽戊糖分子内的α-1,4葡萄糖苷键，产生麦芽丙糖和麦芽糖，α-葡萄糖苷酶又能将麦芽丙糖和麦芽糖分子分解为葡萄糖，最后利用可以检测葡萄糖的仪器（如便携式血糖仪，图1中5.0mm即5mmol/L，用于示意血糖仪的信号值）直接对生成的葡萄糖进行检测。

本实施例中，先配制α-淀粉酶的标准溶液，溶剂为pH 7.3，10mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，浓度分别为20U·L^-1，50U·L^-1，100U·L^-1，200U·L^-1，220U·L^-1，300U·L^-1，400U·L^-1，500U·L^-1，600U·L^-1，800U·L^-1和1000U·L^-1，室温保存。

将上述不同浓度的α-淀粉酶标准溶液分别加入到检测试剂中进行催化反应，检测试剂置于恒温箱中，操作温度设为37℃，催化反应的时间为15min，充分反应后，各取4μL反应产物用便携式血糖仪进行检测，25秒后记录血糖仪读数，结果如图2所示。从图2的检测结果可以看出，利用血糖仪可以检测到不同浓度的α-淀粉酶，并且随着α-淀粉酶浓度的增加，其酶催化能力越强，分解的麦芽戊糖越多，产生的葡萄糖也越多，因此在血糖仪上显示的数值也相应增加。

如图2所示，本发明可先通过检测一系列α-淀粉酶标准样品以获得标准曲线，标准曲线的回归方程：y=2.3477+0.0575x^0.7798，相关系数R²=0.9956；然后将未知浓度的α-淀粉酶待测样品溶液和检测试剂混合，在相同反应条件下进行催化反应，接着利用血糖仪对生成的葡萄糖进行检测，根据检测到的信号值对应于标准曲线上的信号值从而可以确定未知样品的α-淀粉酶浓度。

实施例2：特异性考察

本实施例采用的α-淀粉酶的检测试剂与实施例1相同。

配制50nmol/L不同物质的标准溶液（用于替代α-淀粉酶溶液），作为本实施例特异性考察的不同物质有凝血酶、血红蛋白、人血清白蛋白（HSA）和C反应蛋白（CRP）。

将50nmol/L的凝血酶溶液、血红蛋白溶液、HSA溶液、CRP溶液和α-淀粉酶溶液（AMS，即540U·L^-1）分别加入到与实施例1相同条件的反应体系中（即操作温度为37℃，催化反应时间为15min），充分反应后，各取4μL反应产物用血糖仪检测，25秒后记录血糖仪读数，结果如图3所示。从图3的检测结果可以看出，凝血酶、血红蛋白、HSA和CRP对检测结果没有影响，只有当加入α-淀粉酶后才会在血糖仪上出现读数，由此证明本实施例的检测方法对α-淀粉酶具有很好的特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种α-淀粉酶的非疾病的诊断和治疗的检测方法，包括以下步骤：将α-淀粉酶溶液加入α-淀粉酶的检测试剂中进行催化反应，反应完成后，利用便携式葡萄糖检测仪对所得反应产物进行检测，记录检测仪的读数，计算α-淀粉酶溶液的浓度；

所述催化反应的时间为5min～60min；

所述检测方法中的所有操作过程均控制在37℃～45℃条件下进行；

所述检测试剂包括以下浓度的组分：

麦芽戊糖 10mmol/L～40mmol/L，

α-葡萄糖苷酶 1000U/L～5000U/L，

氯化钙 10mmol/L～30mmol/L，和

缓冲液 1mmol/L～50mmol/L；

所述缓冲液的pH值为7.0～7.5；

所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；

所述检测试剂只需要进行一步混合，实现对α-淀粉酶的检测；

所述检测试剂不需要专业技术人员的协助；

所述便携式葡萄糖检测仪为便携式血糖仪。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中的所有操作过程均控制在37℃条件下进行。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述α-淀粉酶溶液中α-淀粉酶的浓度为20U·L^-1～1000U·L^-1。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述α-淀粉酶溶液的溶剂为缓冲液，所述缓冲液与所述α-淀粉酶的检测试剂中采用的缓冲液相同。