CN110823939B - 一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效、快速检测α‑葡萄糖苷酶活性的方法，该方法以寡糖作为反应底物，利用1H NMR法检测α‑葡萄糖苷酶分解寡糖产生的葡萄糖的量来计算α‑葡萄糖苷酶比活力值。本发明检测α‑葡萄糖苷酶活性具有高效、快速的优点，所采用的底物和反应条件更能体现α‑葡萄糖苷酶水解反应的客观性和真实性。本发明的工艺简单、操作方便，所需材料稳定且廉价。本发明作为一种高效、快速检测α‑葡萄糖苷酶活性的方法，有望应用于α‑葡萄糖苷酶活性检测的相关科研及医疗诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析检测技术领域，更具体地，涉及一种高效、快速检测α- 葡萄糖苷酶活性的方法，具体是通过核磁共振氢谱法(1H NMR)检测α-葡萄糖苷酶分解寡糖产生的葡萄糖的量来计算α-葡萄糖苷酶比活力值。
背景技术
葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大类酶，主要功能为水解多糖或寡糖的葡萄糖苷键，释放出葡萄糖能量物质，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。由于葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，因此，葡萄糖苷酶分别被称为α-葡萄糖苷酶与β-葡萄糖苷酶。
α-葡萄糖苷酶(α-Glccosidase，EC.3.2.l.20)，即α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，主要由N-末端结构域、子结构域和C-末端结构域等组成(Tsuyoshi S.,et al. Proteins2008,73,126-133)。α-葡萄糖苷酶可以从多糖或寡糖类底物的非还原端切开α-1,4-糖苷键释放出葡萄糖，因此，α-葡萄糖苷酶能够专一性地水解含α-1,4-D-糖苷键的多糖或寡糖。由于淀粉类及寡糖类食物(例如麦芽糖等)均为α-1,4-D-糖苷键构成的碳水化合物，所以，α-葡萄糖苷酶对于为体内提供葡萄糖能量物质至关重要。此外，α-葡萄糖苷酶活性的检测对于疾病的诊断和治疗有着重要的临床意义，例如羊水细胞、成纤维细胞或尿中α-葡萄糖苷酶活力下降或缺乏，则有可能患有Ⅱ型糖原积累症(曾敏慧等.中华医学遗传学杂志,2011,3,28)。
根据对底物专一性的不同，α-葡萄糖苷酶分3种类型(Torben P.,et al.Biochemistry 2002,269,728–734)。I型α-葡萄糖苷酶容易水解芳基葡萄糖苷[如对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNP-G)]，其水解pNP-G的速率比水解麦芽糖的速率快。Ⅱ型α-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性，而对芳基葡萄糖苷活性低，即其水解麦芽糖的速率比水解pNP-G的速率快。Ⅲ型α-葡萄糖苷酶与Ⅱ型α-葡萄糖苷酶在水解麦芽糖速率方面相类似，但它水解寡糖(如麦芽糖)和淀粉的速率基本一样。目前有关α-葡萄糖苷酶活性检测的现有技术主要涉及上述不同类型α- 葡萄糖苷酶活性的检测，按照检测原理主要分为pNP-G法以及α-葡萄糖苷酶水解淀粉或寡糖的生化反应法，所采用的检测技术主要包括分光光度法、高效液相色谱法和纸色谱法。
1、pNP-G法
pNP-G法是一种常用于检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，基本原理为pNP-G 在α-葡萄糖苷酶的作用下水解产生葡萄糖和对硝基苯酚，其中对硝基苯酚在碱性环境下405nm处出现最大吸收峰(Xu P.,et al.Journal of Functional Foods 2014.6, 545-554)，根据分光光度法原理可定量检测对硝基苯酚的产生量，进而测定出α- 葡萄糖苷酶的活性。该方法原理简单、操作方便。但是，由于pNP-G为含有α-1,4- 糖苷键的葡萄糖基双糖的模型化合物，人体内并无该物质，因此，pNP-G法只是一种间接检测α-葡萄糖苷酶活性的方法。
2、α-葡萄糖苷酶水解淀粉或寡糖的生化反应法
为了能更加真实地测定α-葡萄糖苷酶生化反应中体现出的活性特征，通常根据α-葡萄糖苷酶水解淀粉或寡糖的生化反应，采用各种技术测定该反应中反应物或产物的量，进而计算出α-葡萄糖苷酶的活力单位。
刘国玉等报道了一种通过测定高效液相色谱技术测定蔗糖反应物的消耗量，进而计算出α-葡萄糖苷酶的活力单位(刘国玉等,食品与发酵工业,2017,03, 40-45)。该方法样品用量少，检测速度快，但需要配置专业Hypersil NH2S氨基色谱柱，且该方法需要做工作曲线，是一种相对测量法，存在一定的测量误差。
由于α-葡萄糖苷酶水解淀粉或寡糖生化反应的终产物是葡萄糖，因此，可以通过检测葡萄糖的产生量，进而测定出α-葡萄糖苷酶的活性。现有技术中，主要采用以下分光光度技术和纸色谱技术测定葡萄糖的产生量。
(1)过氧化物酶法(朱振元等,现代食品科技,2014,12,55-60)：麦芽糖与α-葡萄糖苷酶(酵母源)反应生成的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性4-氨基安替比林与酚偶联缩合，合成出醌类物质，通过分光光度法检测其在505nm处的特征吸收峰，便可得出葡萄糖的生成量，进而计算出α-葡萄糖苷酶的活力单位。
(2)斐林试剂法(陈健旋等,中国酿造,2008,18,43-46)：斐林试剂是二价铜离子的酒石酸钾钠配合物(深蓝色)，其与还原糖加热后可使二价铜离子还原为氧化亚铜(红色沉淀)，期间存在明显、快速的颜色变化。根据该反应原理，采用氧化-还原滴定法测定葡萄糖的含量，进一步计算α-葡萄糖苷酶的活力单位。
(3)苯胺-邻苯二甲酸盐法(马庆一等,食品研究与开发,2006,08,135-139)：将pNP-G与α-葡萄糖苷酶的反应液点于滤纸上，喷洒适量苯胺-邻苯二甲酸盐显色液，显色后剪下色斑，通过水浸提得到葡萄糖与苯胺-邻苯二甲酸盐的有色络合物，采用分光光度法测定其在300～500nm范围内出现的最大吸收峰吸光度，得出葡萄糖的生成量，进而计算出α-葡萄糖苷酶的活力单位。
尽管上述α-葡萄糖苷酶水解淀粉或寡糖的生化反应法经济实惠，但由于其检测葡萄糖产生量的反应原理较为复杂，因而，实验操作步骤繁琐，存在一定的测量误差。核磁共振氢谱(1H NMR)常用于有机化合物的结构测定，也可有效地应用于一些化合物的定量分析，但是目前还未见其在α-葡萄糖苷酶活性检测中的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种高效、快速检测α- 葡萄糖苷酶活性的方法，是通过核磁共振氢谱法(1H NMR)检测α-葡萄糖苷酶分解寡糖产生的葡萄糖的量来计算α-葡萄糖苷酶比活力值。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种高效、快速检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，包括如下步骤：
S1.将寡糖底物溶解于pH 4～8缓冲溶液中，得到寡糖底物溶液；
S2.将α-葡萄糖苷酶溶解于pH 4～8缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.取等体积比的寡糖底物溶液与α-葡萄糖苷酶溶液，混匀，20～40℃反应 1～60分钟；
S4.将步骤S3的反应溶液于沸水中煮沸1～10分钟，冷却至20～40℃，再冷冻高速离心；
S5.将S4步骤离心所得上清液装入一端封管的毛细管内，然后将另一端封端；
S6.将S5步骤所得样品毛细管装入含有内标及氘代试剂的核磁测试管中，进行NMR测试，得到反应溶液的1H NMR谱图；
S7.将S1步骤所得寡糖底物溶液重复S5和S6操作，得到寡糖底物溶液的1H NMR谱图；
S8.对步骤S6和S7所得的1H NMR谱图进行解析，以下述公式得到每毫克α-葡萄糖苷酶固体样品每分钟产生葡萄糖产物的微摩尔数即α-葡萄糖苷酶的比活力：
式中，t为反应时间(min)；w为α-葡萄糖苷酶固体样品的质量(mg)；N0为寡糖的初始物质的量(mmol)；Iβ-Ha为反应t时间后葡萄糖中β-Ha质子的峰面积积分；I内标为内标物的质子峰面积积分；I0为寡糖的初始Hb质子的峰面积积分。
本发明采用α-葡萄糖苷酶水解寡糖的生化反应，通过1H NMR法测定出寡糖反应物或葡萄产物的量，进而计算出α-葡萄糖苷酶的活力单位，可以更加真实地测定α-葡萄糖苷酶生化反应中体现出的活性特征，采用的1H NMR法高效、快速，不需要制作工作曲线，更能直接、准确地检测α-葡萄糖苷酶的活力。
作为一种优选地可实施方式，所述检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，具体包括如下步骤：
S1.称取5～500毫克寡糖底物溶解于1～1000毫升pH 4～8缓冲溶液中，溶解，得到寡糖底物溶液；
S2.称取α-葡萄糖苷酶0.1～5毫克，溶解于1～10毫升pH 4～8缓冲溶液中，溶解，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取S1所述寡糖底物溶液1～10毫升至S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，搅拌，20～40℃水浴反应1～60分钟；
S4.将步骤S3所得反应溶液放置在沸水中煮沸1～10分钟，冷却至20～40℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(-20～40℃，5000～50000转/分钟，5～ 60分钟)；
S5.将S4步骤离心所得上清液(0.1～10毫升)装入一端封管的毛细管内，然后将另一端封端；
S6.将S5步骤所得样品毛细管装入含有内标及氘代试剂的核磁测试管中，进行NMR测试，得到反应溶液的1H NMR谱图；
S7.将S1步骤所得寡糖底物溶液重复S5和S6操作，得到寡糖底物溶液的1H NMR谱图；
S8.对步骤S6和S7所得的1H NMR谱图进行解析。以α-葡萄糖苷酶水解蔗糖生成葡萄糖和果糖的反应为例，采用1H NMR积分法，根据公式(1)计算α- 葡萄糖苷酶的比活力(Specific activity)，即37℃时，在磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)pH6.8，每毫克α-葡萄糖苷酶固体样品每分钟产生葡萄糖产物的微摩尔数。
式中，t为反应时间(分钟)；w为α-葡萄糖苷酶固体样品的质量(毫克)；N0：蔗糖的初始物质的量(毫摩尔)；Iβ-Ha为反应t时间后葡萄糖中β-Ha质子的峰面积积分；I内标为内标物的质子峰面积积分；I0为蔗糖的初始Hb质子的峰面积积分。
本发明所使用的寡糖为由α-糖苷键组成的寡糖，优选地，步骤S1所述寡糖为麦芽七糖、麦芽六糖、麦芽五糖、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖或蔗糖。
本发明采用缓冲溶液为本领域常用的缓冲溶液(pH 4～8)，作为一种优选方案，步骤S1、S2、S3和S5中所述缓冲溶液(pH 4～8)为乙酸–乙酸钠缓冲液(pH 4.0)、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液(pH 4.4)、柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液(pH 5.3)、磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液(pH 5.8)、磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.2)或磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液(pH 6.8)等。
本发明采用的α-葡萄糖苷酶起到催化分解寡糖底物的作用，优选地，步骤 S2所述α-葡萄糖苷酶的来源为嗜热古菌、溶淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、玉米、大米、黑曲霉、大麦麦芽、霉白曲霉、啤酒卡尔斯伯酵母、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌或菠菜种子。
为了使寡糖溶液与α-葡萄糖苷酶溶液分别溶解及充分混合，提高酶促反应的程度，α-葡萄糖苷酶在溶液中需溶解一定时间才能使得蛋白质链段充分伸展形成有序的三维结构，作为一种优选方案，步骤S1和S2中所述溶解为室温或4℃下静置或搅拌溶解，步骤S3中所述搅拌，转速设定为10～1500转/分钟。
为了更加真实地检测α-葡萄糖苷酶的活性，本发明将S4步骤离心所得上清液装入毛细管，然后置于含有内标及氘代试剂的核磁测试管中进行1H NMR测试。优选地，步骤S5所述毛细管的内径为0.3～1.5毫米，长度为5～25厘米。
优选地，步骤S6中所述氘代试剂为氘代丙酮、氘代氯仿、氘代水、氘代乙腈、氘代二甲基亚砜或氘代苯。
优选地，步骤S6中所述内标为四甲基硅烷(Tetramethylsilane，TMS)，3-(三甲基硅基)-氘代丙酸钠(Sodium-3-(trimethylsilyl)propionate-2,2,3,3-d4，TMSP-d4) 或3-(三甲基甲硅烷基)-1-丙磺酸-d6钠盐 (2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6-sodium salt，DSS-d6)。
优选地，步骤S6中所述核磁共振波谱仪为Bruker AvanceⅡ核磁共振波谱仪、Agilent核磁共振波谱仪、Jeol Ecx核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率300～ 900MHz。
优选地，步骤S6中所述1H NMR测试温度为5～60℃，扫描次数为64～256 次。
本发明中步骤S8所述的公式(1)，以α-葡萄糖苷酶水解蔗糖生成葡萄糖和果糖的反应为例，原理如下：
α-葡萄糖苷酶催化水解蔗糖的反应方程为
葡萄糖在水溶液中存在α-及β-两个异构体，达到平衡时β-体占64％而α-体占36％(金征宇主编.碳水化合物化学.化学工业出版社，2007，p33)。在葡萄糖的1H NMR谱图(图3a)，葡萄糖还原端的Ha质子分为α和β构象(数量之比为0.36:0.64)，即1分子的葡萄糖含有0.64个β构象的Ha质子，其化学位移为5.21ppm。在蔗糖的1H NMR谱图(图3b)，蔗糖的Hb质子的化学位移为 5.37ppm，1分子的蔗糖含有1个Hb质子。蔗糖经过α-葡萄糖苷酶催化反应后的反应液中，含有未反应的蔗糖以及葡萄糖产物，在其1H NMR谱图中(图3c)，将葡萄糖和蔗糖物质的量之比的关系整理为公式(2)：
式中，NGlc为反应t时间后葡萄糖分子数；NSuc为反应t时间后蔗糖分子数；Nβ-Ha为反应t时间后葡萄糖中β-Ha质子数；NSuc-Hb为反应t时间后蔗糖中Hb质子数。
进一步根据1H NMR积分法原理(即1H NMR各信号峰强度之比等于相应的质子数之比)，以内标物(TMSP-d4)在0.00ppm处的核磁共振峰积分为归一化参比，可得出公式(3)：
式中，Iβ-Ha为反应t时间后葡萄糖中β-Ha质子的峰面积积分；ISuc-Hb为反应t 时间后蔗糖中Hb质子的峰面积积分；I内标为内标物TMSP-d4质子(0.00ppm) 的峰面积积分。
假设蔗糖的初始物质的量为N0，反应t时间后反应液中剩余蔗糖的物质的量为NSuc，则有公式(4)：
式中，I0为蔗糖的初始Hb质子的峰面积积分。
整理公式(3)和(4)，得出公式(5)：
根据α-葡萄糖苷酶比活力(Specific activity)的定义，即37℃时，在磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)pH 6.8，每毫克α-葡萄糖苷酶固体样品每分钟产生葡萄糖产物的微摩尔数)，以及公式(5)可推导出公式(1)。
本发明的1H NMR法测定α-葡萄糖苷酶活性技术，与现有测定α-葡萄糖苷酶活性的技术相比，避免工作曲线法引入的误差，更能直接、真实地检测α-葡萄糖苷酶的活力。
本发明采用的1H NMR法测定α-葡萄糖苷酶活性方法，是将反应液密封于毛细管中，置于装有氘代试剂的核磁管中进行NMR测试；与通常NMR法采用的将反应物溶于氘代试剂研究反应体系的方法相比，更能体现α-葡萄糖苷酶水解寡糖反应的客观性和真实性。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供了一种通过核磁共振氢谱法(1H NMR)检测α-葡萄糖苷酶分解寡糖产生的葡萄糖的量来计算α-葡萄糖苷酶比活力值的方法，与现有检测α-葡萄糖苷酶活性的方法相比，本发明更加真实地测定α-葡萄糖苷酶生化反应中体现出的活性特征，即采用α-葡萄糖苷酶水解寡糖的生化反应，通过1H NMR法测定出寡糖反应物或葡萄产物的量，进而计算出α-葡萄糖苷酶的活力单位。本发明采用的1H NMR法高效、快速，不需要制作工作曲线，更能直接、准确地检测α- 葡萄糖苷酶的活力，且方法简单，操作方便，核磁试剂廉价且易获取。
附图说明
图1为本发明α-葡萄糖苷酶活性检测的工艺流程图。
图2为本发明的核磁管测试装置示意图。
图3为1H NMR谱图(25℃)。其中，a为本发明葡萄糖溶液的1H NMR 谱图(25℃)：毛细管内为葡萄糖溶液(PBS，pH＝6.8)，毛细管外的核磁管中为氘代水(含TMSP-d4内标)；b为本发明蔗糖溶液的1H NMR谱图(25℃)：毛细管内为蔗糖溶液(PBS,pH＝6.8)，毛细管外的核磁管中为氘代水(含TMSP-d4内标)；c为本发明蔗糖经过α-葡萄糖苷酶催化水解产物溶液的1HNMR谱图 (25℃)：毛细管内为水解产物溶液(PBS,pH＝6.8)，毛细管外的核磁管中为氘代水(含TMSP-d4内标)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
S1.称取5mg蔗糖，室温溶解于1毫升pH 8的PBS缓冲溶液中；
S2.称取嗜热古菌源α-葡萄糖苷酶0.1毫克，溶解于1毫升pH 8的PBS缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取步骤S1的蔗糖溶液1毫升至步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，10转/分钟搅拌，40℃水浴反应1分钟；
S4.将步骤S3所得溶液放置在沸水中煮沸10分钟，冷却至20℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(-20℃，50000转/分钟，5分钟)；
S5.将步骤S4离心所得上清液，取0.1毫升，装入玻璃毛细管内(内径1.5 毫米，长度5厘米)，两端封端；
S6.将步骤S5所得样品毛细管装入含有TMS内标及氘代丙酮的核磁测试管中，在5℃下，扫描次数64次，使用Bruker Avance II核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率300MHz，进行NMR测试。
S7.称取5mg蔗糖，室温溶解于1毫升pH 8，PBS缓冲溶液中，装入玻璃毛细管内(内径1.5毫米，长度5厘米)，两端封端，重复步骤S6进行NMR测试。
S8.重复步骤S7进行5mg/mL葡萄糖NMR测试。
解析步骤S6、S7和S8所得的图3，根据公式(1)可推算出α-葡萄糖苷酶的比活力为16Units/mgα-葡萄糖苷酶固体样品。
实施例2
S1.称取200mg麦芽七糖，室温溶解于5毫升pH 4.4的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲溶液中；
S2.称取霉白曲霉源α-葡萄糖苷酶1毫克，溶解于2毫升pH 4.4的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取步骤S1的麦芽七糖溶液1毫升至步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，200转/分钟搅拌，37℃水浴反应20分钟；
S4.将步骤S3所得溶液放置在沸水中煮沸1分钟，冷却至32℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(-4℃，20000转/分钟，30分钟)；
S5.将步骤S4离心所得上清液，取0.5毫升，装入玻璃毛细管内(内径0.3 毫米，长度10厘米)，两端封端；
S6.将步骤S5所得样品毛细管装入含有DSS内标及氘代氯仿的核磁测试管中，在60℃下，扫描次数256次，使用Agilent核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率900MHz，进行NMR测试。
S7.称取200mg麦芽七糖，室温溶解于5毫升pH 4.4，柠檬酸–柠檬酸钠缓冲溶液中，装入玻璃毛细管内(内径0.3毫米，长度10厘米)，两端封端，重复步骤S6，进行NMR测试。
S8.重复步骤S7进行50mg/mL葡萄糖NMR测试。
解析步骤S6、S7和S8所得的1H NMR谱图，采用类似公式(1)的方法计算α-葡萄糖苷酶的比活力值。
实施例3
S1.称取450mg麦芽四糖，室温溶解于100毫升pH 4的乙酸–乙酸钠缓冲液缓冲溶液中；
S2.称取地衣芽孢杆菌源α-葡萄糖苷酶3毫克，溶解于5毫升pH 4的乙酸–乙酸钠缓冲液缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取步骤S1的麦芽四糖溶液2毫升至步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，1500转/分钟搅拌，35℃水浴反应35分钟；
S4.将步骤S3所得溶液放置在沸水中煮沸7分钟，冷却至30℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(4℃，20000转/分钟，5分钟)；
S5.将步骤S4离心所得上清液，取0.3毫升，装入玻璃毛细管内(内径1.5 毫米，长度15厘米)，两端封端；
S6.将步骤S5所得样品毛细管装入含有Tmsp内标及D2O的核磁测试管中，在25℃下，扫描次数64次，使用Jeol Ecx核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率 400MHz，进行NMR测试。
S7.称取450mg麦芽四糖，室温溶解于100毫升pH 4，乙酸–乙酸钠缓冲液缓冲溶液中，装入玻璃毛细管内(内径1.5毫米，长度15厘米)，两端封端，重复步骤S6，进行NMR测试。
S8.重复步骤S7进行25mg/mL葡萄糖NMR测试。
解析步骤S6、S7和S8所得的1H NMR谱图，采用类似公式(1)的方法计算α-葡萄糖苷酶的比活力值。
实施例4
S1.称取500mg麦芽六糖，室温溶解于1000毫升pH 5.3的柠檬酸–氢氧化钠 -盐酸缓冲溶液中；
S2.称取枯草杆菌源α-葡萄糖苷酶5毫克，溶解于10毫升pH 5.3的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取步骤S1的麦芽六糖溶液5毫升至步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，100转/分钟搅拌，20℃水浴反应60分钟；
S4.将步骤S3所得溶液放置在沸水中煮沸5分钟，冷却至40℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(-40℃，5000转/分钟，60分钟)；
S5.将步骤S4离心所得上清液，取0.4毫升，装入玻璃毛细管内(内径1.5 毫米，长度25厘米)，两端封端；
S6.将步骤S5所得样品毛细管装入含有Tmsp内标及氘代乙腈的核磁测试管中，在60℃下，扫描次数256次，使用Bruker AvanceⅡ核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率600MHz，进行NMR测试。
S7.称取500mg麦芽六糖，室温溶解于1000毫升pH 5.3，柠檬酸–氢氧化钠 -盐酸缓冲溶液中，装入玻璃毛细管内(内径1.5毫米，长度25厘米)，两端封端，重复步骤S6，进行NMR测试。
S8.重复步骤S7进行30mg/mL葡萄糖NMR测试。
解析步骤S6、S7和S8所得的1H NMR谱图，采用类似公式(1)的方法计算α-葡萄糖苷酶的比活力值。
实施例5
S1.称取150mg麦芽糖，室温溶解于10毫升pH 6.8的磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲溶液中；
S2.称取黑曲霉源α-葡萄糖苷酶2毫克，溶解于1毫升pH 6.8的磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取步骤S1的麦芽糖溶液2毫升至步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，500转/分钟搅拌，37℃水浴反应10分钟；
S4.将步骤S3所得溶液放置在沸水中煮沸5分钟，冷却至25℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(25℃，15000转/分钟，10分钟)；
S5.将步骤S4离心所得上清液，取0.2毫升，装入玻璃毛细管内(内径1.1 毫米，长度30厘米)，两端封端；
S6.将步骤S5所得样品毛细管装入含有DSS内标及氘代二甲基亚砜的核磁测试管中，在25℃下，扫描次数200次，使用Jeol Ecx核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率600MHz，进行NMR测试。
S7.称取150mg麦芽糖，室温溶解于10毫升pH 6.8，磷酸二氢钾–氢氧化钠中，装入玻璃毛细管内(内径1.1毫米，长度30厘米)，两端封端，重复步骤 S6.，进行NMR测试。
S8.重复步骤S7进行35mg/mL葡萄糖NMR测试。
解析步骤S6、S7和S8所得的1H NMR谱图，采用类似公式(1)的方法计算α-葡萄糖苷酶的比活力值。
实施例6
S1.称取350mg麦芽五糖，室温溶解于200毫升pH 6.2的磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲溶液中；
S2.称取大麦麦芽源α-葡萄糖苷酶4毫克，溶解于2毫升pH 6.2的磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取步骤S1的麦芽五糖溶液2毫升至步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，250转/分钟搅拌，40℃水浴反应35分钟；
S4.将步骤S3所得溶液放置在沸水中煮沸10分钟，冷却至30℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(40℃，10000转/分钟，25分钟)；
S5.将步骤S4离心所得上清液，取0.1毫升，装入玻璃毛细管内(内径1.4 毫米，长度22厘米)，两端封端；
S6.将步骤S5所得样品毛细管装入含有TMS内标及氘代苯的核磁测试管中，在20℃下，扫描次数220次，使用Agilent核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率 400MHz，进行NMR测试。
S7.称取350mg麦芽五糖，室温溶解于200毫升pH 6.2，磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲溶液中，装入玻璃毛细管内(内径1.4毫米，长度22厘米)，两端封端，重复步骤S6，进行NMR测试。
S8.重复步骤S7进行15mg/mL葡萄糖NMR测试。
解析步骤S6、S7和S8所得的1H NMR谱图，采用类似公式(1)的方法计算α-葡萄糖苷酶的比活力值。
实施例7
S1.称取20mg麦芽三糖，室温溶解于1毫升pH 5.3的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲溶液中；
S2.称取嗜热脂肪芽孢杆菌源α-葡萄糖苷酶0.5毫克，溶解于1毫升pH 5.3 的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.量取步骤S1的麦芽三糖溶液1毫升至步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中，两种溶液的体积比为1:1，800转/分钟搅拌，20℃水浴反应60分钟；
S4.将步骤S3所得溶液放置在沸水中煮沸7分钟，冷却至30℃，使α-葡萄糖苷酶失活，冷冻高速离心(15℃，15000转/分钟，3分钟)；
S5.将步骤S4离心所得上清液，取0.5毫升，装入玻璃毛细管内(内径1.5 毫米，长度25厘米)，两端封端；
S6.将步骤S5所得样品毛细管装入含有Tmsp内标及氘代乙腈的核磁测试管中，在60℃下，扫描次数256次，使用Bruker AvanceⅡ核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率900MHz，进行NMR测试。
S7.称取20mg麦芽三糖，室温溶解于1毫升pH 5.3，柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲溶液中，装入玻璃毛细管内(内径1.5毫米，长度25厘米)，两端封端，重复步骤S6，进行NMR测试。
S8.重复步骤S7进行55mg/mL葡萄糖NMR测试。
解析步骤S6、S7和S8所得的1H NMR谱图，采用类似公式(1)的方法计算α-葡萄糖苷酶的比活力值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将寡糖底物溶解于pH 4～8缓冲溶液中，得到寡糖底物溶液；
S2.将α-葡萄糖苷酶溶解于pH 4～8缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；
S3.取等体积比的寡糖底物溶液与α-葡萄糖苷酶溶液，混匀，20～40℃水浴反应1～60分钟；
S4.将步骤S3的反应溶液于沸水中煮沸1～10分钟，冷却至20～40℃，再冷冻高速离心；
S5.将S4步骤离心所得上清液装入一端封管的毛细管内，然后将另一端封端；
S6.将S5步骤所得样品毛细管装入含有内标及氘代试剂的核磁测试管中，进行NMR测试，得到反应溶液的1H NMR谱图；
S7.将S1步骤所得寡糖底物溶液重复S5和S6操作，得到寡糖底物溶液的1H NMR谱图；
S8.对步骤S6和S7所得的1H NMR谱图进行解析，以下述公式得到每毫克α-葡萄糖苷酶固体样品每分钟产生葡萄糖产物的微摩尔数即α-葡萄糖苷酶的比活力：
式中，t为反应时间(min)；w为α-葡萄糖苷酶固体样品的质量(mg)；N0为寡糖的初始物质的量(mmol)；Iβ-Ha为反应t时间后葡萄糖中β-Ha质子的峰面积积分；I内标为内标物的质子峰面积积分；I0为寡糖的初始Hb质子的峰面积积分。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述寡糖底物溶液为称取5～500毫克寡糖底物溶解于1～1000毫升pH 4～8缓冲溶液中；步骤S2所述α-葡萄糖苷酶溶液为称取α-葡萄糖苷酶0.1～5毫克，溶解于1～10毫升pH 4～8缓冲溶液中。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3为量取等体积的寡糖底物溶液1～10毫升至S2所述α-葡萄糖苷酶溶液中。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中所述寡糖为麦芽七糖、麦芽六糖、麦芽五糖、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖或蔗糖。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1或S2中所述缓冲溶液为乙酸–乙酸钠缓冲液、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液或磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2所述α-葡萄糖苷酶的来源为嗜热古菌、溶淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、玉米、大米、黑曲霉、大麦麦芽、霉白曲霉、啤酒卡尔斯伯酵母、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌或菠菜种子。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S5中所述毛细管内径为0.3～1.5毫米，长度为5～25厘米。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S6中所述氘代试剂为氘代丙酮、氘代氯仿、氘代水、氘代乙腈、氘代二甲基亚砜或氘代苯，内标为四甲基硅烷、3-(三甲基硅基)-氘代丙酸钠或3-(三甲基甲硅烷基)-1-丙磺酸-d6钠盐。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S6所述NMR的核磁共振波谱仪为BrukerAvanceⅡ核磁共振波谱仪、Agilent核磁共振波谱仪、Jeol Ecx核磁共振波谱仪，核磁质子共振频率300～900MHz；NMR测试温度为5～60℃，扫描次数为64～256次。
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