CN102279181B - 一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法。该方法包括如下步骤：使酶活检测体系在24-26℃下反应，分别在反应t1和t2时刻测定体系在234nm处的OD值，分别记作OD(t1)和OD(t2)；根据下述公式1：A＝60s×[OD(t2)-OD(t1)]/0.01/(t2-t1)计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性；所述酶活检测体系由吐温20、亚油酸、pH值为8.0浓度为0.02mol/ml的Tris-Hcl缓冲液和待测玉米种胚脂肪氧化酶组成；其中亚油酸浓度为0.3mmol/L，吐温20浓度为0.25mmol/L，待测玉米种胚脂肪氧化酶的浓度不大于0.0167mg/3mL；酶活定义为：所述酶活检测体系每分钟增加0.01个吸光度所需要的酶量为一个酶活力单位。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法。
背景技术
酶是一种有生物催化活性的蛋白质。其活性受到温度，反应缓冲液pH值，缓冲液种类、浓度和底物浓度等条件影响，因此测量酶的活性，就需要知道酶反应的条件。
脂肪氧化氧化酶(lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)，是脂类降解的关键酶之一，以不饱和脂肪酸为底物，可以产生醛、酮等有毒害的物质。在大豆种子(David J.Parrish和A.Carl Leopold，1978；Robert L.Tilden和Sherlie H.West，1985；)，水稻种子(吴跃进，吴敬德，张瑛，2001)中均证明脂肪氧化酶与种子的耐贮藏性质相关。王镜岩，朱圣康，徐长法(2002)指出，脂肪氧化酶催化的反应需要活性氧参加，作用机理是将不饱和脂肪酸中的双键氧化断裂为小分子的醛、酮等物质，如丙二醛等，进而引起细胞膜通透性的变化或者蛋白质的变性。测量脂肪氧化酶活性的方法有很多种，其中紫外分光光度计法是最普遍的一种方法。其原理是通过反应底物亚油酸在234nm处与脂肪氧化酶反应发生散射而产生分光光度值的变化。
利用紫外分光光度计法来测量脂肪氧化酶活性，通常有两个问题需要解决。一是亚油酸在不同的pH值条件下会产生溶解度的变化，通常反应环境的pH值越低，亚油酸的溶解度越小，在未加入酶液时就会产生浑浊，从而干扰测量的灵敏性。如果采用降低亚油酸底物的方法，则会影响其测量范围。二是亚油酸在不同浓度的反应缓冲液条件下溶解度也会发生变化。其实质是反应液中离子浓度对亚油酸溶解度的影响。因此，不同的作物脂肪氧化酶测量的条件不同。
大豆种子、花生种子脂肪氧化酶的紫外分光光度计法均有报道，但是玉米种子脂肪氧化酶的紫外分光光度计法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法。
本发明所提供的测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤：使酶活检测体系在温度为24-26℃的条件下反应，分别在反应的t1时刻和t2时刻测定酶活检测体系在234nm处的OD值，分别记作OD(t1)和OD(t2)；根据下述公式1：A＝60s×[OD(t2)-OD(t1)]/0.01/(t2-t1)计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性；
所述酶活检测体系由吐温20、亚油酸、pH值为8.0浓度为0.02mol/ml的Tris-Hcl缓冲液和待测玉米种胚脂肪氧化酶组成；所述酶活检测体系中亚油酸浓度为0.3mmol/L，吐温20浓度为0.25mmol/L，待测玉米种胚脂肪氧化酶的浓度不大于0.0167mg/3mL；
玉米种胚脂肪氧化酶活性的定义为：所述酶活检测体系每分钟增加0.01个吸光度所需要的酶量为一个酶活力单位。
其中，所述t1可为反应开始时计起的第15s；所述t2可为所述反应开始时计起的第30s。
具体测定方法包括下述步骤：
1)从玉米种胚中提取脂肪氧化酶，得到玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液；
2)配制含吐温20的亚油酸溶液，其中，所述吐温20的质量浓度为8.3mmol/L，亚油酸的浓度为10mmol/L；
3)取适当体积的粗酶液和100μl步骤2)配制的含吐温20的亚油酸溶液，并加入0.02mol/L、pH值8.0的Tris-Hcl缓冲液将体积补至3ml，得到反应体系，所述反应体系中酶蛋白含量不大于0.0167mg；将所述反应体系在温度为24-26℃的条件下进行反应，用紫外分光光度计分别测定反应15秒、30秒时反应体系在234nm处的OD值，代入公式1，计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性。
其中，步骤1)中从玉米种胚中提取脂肪氧化酶可按照下述方法进行：取萌发24h的玉米种胚，加入pH值为7.0、浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行冰上研磨，磨碎后离心、收集上清液，即为玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液，其中，玉米种胚与缓冲液的质量比可为1g∶10ml。
本发明通过设计梯度实验，确定了采用紫外分光光度计法测量玉米种胚脂肪氧化酶活性适宜的反应缓冲液pH值和浓度。相对于现有的种子脂肪氧化酶的测量方法，本发明方法有四个优点，一是可以定量的测量出脂肪氧化酶活性，二是对玉米种胚脂肪氧化酶活性的测量提供了适宜的条件。三是反应步骤简单，易于操作，四是酶液和底物亚油酸用量少，节约成本。采用本发明的方法测量玉米种胚脂肪氧化酶活性，对筛选耐贮藏玉米品种和公司调控种子贮藏条件都具有重要意义。
附图说明
图1为0.02mol/L反应缓冲液PH值对脂肪氧化酶活性影响。
图2为pH8.0条件下不同反应缓冲液浓度对脂肪氧化酶活性的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的玉米自交系178在文献“许启凤，优质高产玉米新品种农大108的选育与推广[J].中国农业大学学报，2003，8(1)：25-26”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
实施例1、考察玉米种胚脂肪氧化酶酶活紫外线测定方法最适的反应缓冲液pH值和浓度
1)提取玉米种胚脂肪氧化酶液：取玉米种胚0.3g，加入3.0ml pH值为7.0，浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行冰上研磨，磨碎后离心、收集上清液，即为玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液，放入4℃储存，尽快进行测量。采用考马斯亮蓝法测定粗酶液中的可溶性蛋白的含量，标准曲线由浓度为0-0.2mg的牛血清白蛋白建立，标准曲线方程为Y＝4.964X+0.0422。
2)配制反应底物(含吐温20的亚油酸溶液)：配制10mmol/L的亚油酸溶液，内含8.3mmol/L的吐温20。
3)配制不同pH值的反应缓冲液：0.02mol/l、pH值3.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，0.02mol/l、pH值4.0醋酸-醋酸钠缓冲液，0.02mol/l、pH值5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，0.02mol/l、pH值6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，0.02mol/l、pH值7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，0.02mol/L、pH值8.0的Tris-Hcl缓冲液。
从下述三方面考察最适的反应缓冲液pH值和浓度
一、考察反应缓冲液pH值对底物亚油酸吸光度的影响
将上述2)配制的底物用3)中不同pH值的缓冲液进行不同倍数的稀释，用紫外分光光度计测定混合15s和30s时在234nm处的OD值，确定/NOD值变化范围在0到0.002之间时所需要的亚油酸浓度的范围，结果见表1。
表1
二、考察不同pH值条件下可测量的脂肪氧化酶量(即酶蛋白含量)
参照T.Kaye等人(1985)测量大豆脂肪氧化酶的方法，采用紫外分光光度计使用亚油酸为底物，24-26℃条件下分别测定反应15秒、30秒时反应体系在234nm处的OD值变化。将步骤1)中粗酶液和不同pH值的缓冲液稀释的底物溶液(经确定ΔOD值变化范围在0到0.002之间)，混合均匀，在温度为24-26℃的条件下进行反应，用紫外分光光度计分别测定反应15秒、30秒时反应体系在234nm处的OD值，代入下述公式：A＝4×[OD(30)-OD(15)]/0.01，计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性；式中OD(15)，OD(30)表示15s和30s时在234nm处的OD值；0.01为一个常数，即每分钟增加0.01个吸光度所需要的活性作为玉米种子脂肪氧化酶的活性单位。
由表1可知，各pH值条件下不干扰测定的亚油酸的终浓度。据此我们测量了在各pH值条件下，体系中可以测量的酶蛋白含量的范围，即在由酶液+底物溶液+缓冲液组成的3ml反应体系中，可以测量的蛋白含量范围。以pH值8.0的缓冲液为例，是将适量酶液与100μl反应底物混合，再加入0.02mol/L、pH值8.0的Tris-Hcl缓冲液定容至3ml，即得反应体系。结果见表2。
表2
由表2可知，反应缓冲液pH值为8.0时，3ml反应体系中亚油酸浓度为0.3mmol/L时，可以测定玉米种胚中0-16.7×10-3mg蛋白质中所含的脂肪氧化酶活性，测量范围较其它pH值大。
浓度0.02mol/L不同pH值反应缓冲液对脂肪氧化酶(0.0167mg酶蛋白)活性影响，见图1。由图1可知，pH值不同，脂肪氧化酶活性就有所不同，变化趋势如图。但是综合考虑其对底物吸光度的影响和对可测量酶蛋白含量的影响，我们选取pH值为8.0作为测量条件。
三、考察pH值8.0条件下不同反应缓冲液浓度对脂肪氧化酶活性的影响。
配制1mol/L，0.2mol/L，0.02mol/L pH值8.0的Tris-Hcl缓冲液，测量在不同反应缓冲液浓度条件下脂肪氧化酶活性的变化，结果见图2。由图2可知，在pH值8.0时，玉米种胚脂肪氧化酶活性在0.02mol/L缓冲液条件下活性最高。
综上得出采用紫外分光光度法测定玉米种胚脂肪氧化酶酶活的最佳方法如下：
取适当体积的粗酶液和100μl亚油酸底物(亚油酸浓度为10mmol/L，吐温20为8.3mmol/L)，并加入0.02mol/L、pH值8.0的Tris-Hcl缓冲液将体积补至3ml，混合均匀，将上述反应体系在温度为24-26℃的条件下进行反应，用紫外分光光度计分别测定反应15秒、30秒时反应体系在234nm处的OD值，代入公式1，计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性。上述方法可测量0-0.0167mg的玉米种胚蛋白中脂肪氧化酶的活性。
实施例2、测定不同人工老化时间玉米种子178种胚脂肪氧化酶活性
玉米自交系178在自然贮藏和人工加速老化试验中均表现出较好的耐贮藏性状。我们采用人工老化的方法得到了发芽率为90％，80％，76％，64％的178种子，利用实施例1确定的最佳方法对上述不同发芽率的种子进行脂肪氧化酶活性测量，结果见表3。
表3玉米自交系178脂肪氧化酶活性
Claims (4)
1.一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤：使酶活检测体系在温度为24-26℃的条件下反应，分别在反应的t1时刻和t2时刻测定酶活检测体系在234nm处的OD值，分别记作OD(t1)和OD(t2)；根据下述公式1：A=60s×[OD(t2)-OD(t1)]/0.01/（t2-t1）计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性；公式1中，A表示玉米种胚脂肪氧化酶活性，OD为吸光度，t1为反应开始第一个计时点的反应时间，t2为反应开始第二个计时点的反应时间，OD(t1)为反应开始第一个计时点的反应体系在234nm处的吸光度值，OD(t2)为反应开始第二个计时点的反应体系在234nm处的吸光度值；
玉米种胚脂肪氧化酶活性的定义为：所述酶活检测体系每分钟增加0.01个吸光度所需要的酶量为一个酶活力单位；
其特征在于：所述酶活检测体系由吐温20、亚油酸、pH值为8.0浓度为0.02mol/ml的Tris-Hcl缓冲液和待测玉米种胚脂肪氧化酶组成；所述酶活检测体系中亚油酸浓度为0.3mmol/L，吐温20浓度为0.25mmol/L，待测玉米种胚脂肪氧化酶的浓度不大于0.0167mg/3mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述t1为反应开始时计起的第15s；所述t2为所述反应开始时计起的第30s。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法具体包括下述步骤：1）从玉米种胚中提取脂肪氧化酶，得到玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液；
2）配制含吐温20的亚油酸溶液，其中，所述吐温20的质量浓度为8.3mmol/L，亚油酸的浓度为10mmol/L；
3）取适量粗酶液和100μl步骤2）所述含吐温20的亚油酸溶液，并加入0.02mol/L、pH值8.0的Tris-Hcl缓冲液将体积补至3ml，得到酶活检测体系，所述酶活检测体系中玉米种胚脂肪氧化酶含量不大于0.0167mg；使所述酶活检测体系在温度为24-26℃的条件下反应，用紫外分光光度计分别测定反应15秒、30秒时体系在234nm处的OD值，代入公式1，计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1）中从玉米种胚中提取脂肪氧化酶的方法如下：取萌发24h的玉米种胚，加入pH值为7.0、浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行冰上研磨，磨碎后离心、收集上清液，即为玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液，其中，玉米种胚与缓冲液的质量比为1g：10ml。
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