CN106770764B - 一种血必净中间体多指标成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血必净中间体多指标成分的含量测定方法。精密度良好、重现性良好、稳定性良好，可以用来检测血必净注射液中间体中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸的含量，有助于提高产品质量，进而提升人民群众是生活质量。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种血必净中间体中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量的检测分析方法。
背景技术
血必净注射液为棕黄色至棕红色的澄明液体，主要成分为红花、川芎、丹参和当归等，功能主治为化瘀解毒，用于温热类疾病见发热、喘促、心悸、烦燥等瘀毒互结症。随着临床研究的不断深入，其应用范围也在不断拓宽，可用于肾脏、肺部、心血管、脓毒血症、弥漫性血管内凝血(DIC)、多器官功能障碍综合征(MDOS)、重症急性胰腺炎、糖尿病酮症酸中毒(DKA)等疾病。
血必净注射液包含红花、赤芍、川芎、当归、丹参五味中药材成分，由各药材饮片经适当的工艺加工，制成红花提取物、川丹当提取物、赤芍提取物，提取物经混合工序，制得血必净中间体，再配以其他辅料，经多步生产工序，最终制成血必净注射液。
血必净中间体作为制剂生产的中间环节，其质量监控一直是制剂生产的关键环节，而其中功效成分的监控既能表征工艺的稳定性，更是中间体质量优劣的直接反映。
血必净中间体包含三种功效成分——羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸，目前三种成分分别采用三种不同的液相色谱条件进行定性定量检测，功效成分含量测定无法同步进行，试剂、耗材费用消耗大、人工占用时间长、检测周期长。
本发明所建立的分析方法采用同一个液相色谱条件，通过相对校正因子的测定，以“一测多评”方法同时测定血必净中间体中所含羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量，经与原方法结果比对，准确度与精密度相当，但克服了原方法检测周期长、试剂耗材费用高等弊端，节约了试剂、耗材、人工成本，缩短了检测周期，能更为有效地控制产品质量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种快速、准确地测定血必净中间体多指标成分含量，且更加节省试剂耗材费用，节约人工成本的检测方法。
本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法，包括以下步骤：
(1)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定
a、标准溶液的制备：
分别精密称取羟基红花黄色素A对照品、芍药苷对照品、阿魏酸对照品、苯甲酸对照品适量，置V1体积容量瓶中，以50％甲醇水溶液为溶剂，溶解并定容至刻度，制得含羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸一定浓度的对照品混标浓溶液；将混标浓溶液进行七步梯度稀释，使得各步稀释后的标准溶液中各成分浓度分别在供试品限度浓度的40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％。
b、各组分校正因子计算：
采用两台不同高效液相色谱仪，取步骤a中制得的7个不同浓度的标准溶液按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，按最小二乘法进行线性回归，绘制标准曲线。将羟基红花黄色素A、阿魏酸、苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率，即为各成分相对芍药苷的校正因子。
(2)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、对照品工作溶液制备：精密称取芍药苷对照品适量，置V2体积容量瓶中，以50％甲醇水溶液为溶剂，制得含芍药苷CR的对照品工作溶液。
b、供试品溶液制备：精密移取体积V3为供试品，置体积为V4的容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，取体积为V5的此溶液，置体积为V6的容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
c、测定方法：分别精密量取体积为V7对照品混标工作溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子，按下述公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供试品中各成分的含量，mg/ml
CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度，mg/ml
AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积
AX——供试品溶液中各成分峰面积
F——各成分相对芍药苷的校正因子
(3)液相色谱条件：照高效液液色谱法测定，
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，
流动相：以甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)体积比：(10：90-30：70)，
流速：0.8-1.2ml/min，
柱温：30℃，
检测波长：230nm，
进样量：20μl，
运行时间：60min。
本发明采用一个色谱条件，只需配制一个成分的对照品溶液，根据已确定的校正因子，即可测定出供试品中其他三种成分的准确含量，节省了其他对照品的使用以及液相检测过程中有机试剂的消耗，缩短了样品的检验周期，既提高了工作效率又节约了成本。
本发明检测方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
实验一：方法精密度实验
精密称取芍药苷对照品适量，以50％甲醇水溶液为溶剂，制得含芍药苷0.4mg/ml的对照品工作溶液。精密移取供试品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按上述方法平行制备6份供试品溶液。精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按已确定的色谱条件进样，记录色谱图。根据已确定的各成分相对芍药苷的相对校正因子，按校正因子法计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。6份供试品溶液羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量测定结果的相对标准偏差应小于5.0％。试验结果见下表：
表1对照品溶液响应因子测试结果
表2羟基红花黄色素A含量测定重复性试验结果(试验人员A)
表3芍药苷含量测定重复性试验结果
表4阿魏酸含量测定重复性试验结果
表5苯甲酸含量测定重复性试验结果
结论：由上表可知，6份供试品溶液羟基红花黄色素A测定结果的相对标准偏差为2.3％，芍药苷测定结果的相对标准偏差为1.8％、阿魏酸测定结果的相对标准偏差为1.0％，苯甲酸含量测定结果的相对标准标准偏差为2.0％，小于规定的5.0％，重复性符合验证要求。
实验二：方法准确度实验
回收率样品溶液1的制备：取已知羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸浓度的血必净中间体0.5ml，置10ml量瓶中，分别加入1.6mg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液、8.0mg/ml芍药苷对照品溶液、0.16mg/ml阿魏酸对照品溶液、0.16mg/ml苯甲酸对照品溶液各0.5ml，加50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，作为回收率样品溶液1，按上述方法平行制备3份。
回收率样品溶液2的制备：取已知羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸浓度的血必净中间体0.5ml，置10ml量瓶中，分别加入2.0mg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液、1.2mg/ml芍药苷对照品溶液、0.2mg/ml阿魏酸对照品溶液、0.2mg/ml苯甲酸对照品溶液各0.5ml，加50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，作为回收率样品溶液2，按上述方法平行制备3份。
回收率样品溶液3的制备：取已知羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸浓度的血必净中间体0.5ml，置10ml量瓶中，分别加入2.5mg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液、1.3mg/ml芍药苷对照品溶液、0.25mg/ml阿魏酸对照品溶液、0.25mg/ml苯甲酸对照品溶液各0.5ml，加50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，作为回收率样品溶液3，按上述方法平行制备3份。
将这9份回收率样品溶液按精密度实验测定方法进行测定，计算测定结果的回收率和相对标准偏差。要求回收率应在90.0％-110.0％之间，结果的相对标准偏差应小于5.0％。计算公式如下：
公式一：
公式二：
式中：CR——对照品溶液的浓度，μg/ml
AR——对照品溶液中主成分峰面积
AX——供试品溶液中各成分的峰面积
F——各成分相对芍药苷的校正因子(羟基红花黄色素A1.28，阿魏酸2.46，苯甲酸4.03)
CX——回收率样品溶液中各成分浓度，μg/ml
C1——配制回收率样品溶液所用的相应对照品溶液浓度，μg/ml
C2——血必净中间体中各成分的浓度，μg/ml
试验结果见下表：
表6对照品溶液响应因子试验结果
表7羟基红花黄色素A含量测定准确度试验结果
表8芍药苷含量测定准确度试验结果
表9阿魏酸含量测定准确度试验结果
表10苯甲酸含量测定准确度试验结果
结论：由上表可知，9份样品的回收率均在90.0％-110.0％之间，羟基红花黄色素A测定结果的RSD为2.0％，芍药苷测定结果的RSD为3.0％，阿魏酸测定结果的RSD为3.5％，苯甲酸测定结果的RSD为2.7％，各成分结果的相对标准偏差均小于规定的5.0％，准确度测定结果符合验证要求。
实验三：待测溶液稳定性实验
按本发明已确定的含量测定方法制备对照品溶液及供试品溶液，将供试品溶液在室温下放置0天、2天、4天后取样，按给定色谱条件进样，以芍药苷为基准物按相对校正因子法计算各成分含量，各时间点羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量测定结果的相对标准偏差应小于5.0％。试验结果见下表：
表11羟基红花黄色素A含量测定溶液稳定性试验结果
表12芍药苷含量测定溶液稳定性试验结果
表13阿魏酸含量测定溶液稳定性试验结果
表14苯甲酸含量测定溶液稳定性试验结果
结论：由上表可知，供试品溶液在室温下放置0天、2天、4天后，各成分含量测定结果的相对平均偏差分别为：羟基红花黄色素A为2.6％，芍药苷为1.6％，阿魏酸为2.6％，苯甲酸为3.0％，小于规定的5.0％，符合验证要求。
附图说明
附图1：对照品混合溶液典型图谱
附图2：实施例1供试品溶液检测结果典型图谱，出峰顺序：羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸
附图3：实施例2供试品溶液检测结果典型图谱，出峰顺序：羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸
附图4：实施例3供试品溶液检测结果典型图谱，出峰顺序：羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法，包括以下步骤：
(1)液相色谱条件：
照高效液液色谱法测定：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)(20：80)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：230nm；
进样量：20μl；
运行时间：60min，
(2)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定：
a、标准曲线溶液的制备：
羟基红花黄色素A标准曲线溶液制备：取羟基红花黄色素A对照品约20mg、精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含羟基红花黄色素A约2.0mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羟基红花黄色素A的标准曲线溶液；
芍药苷标准曲线溶液制备：取芍药苷对照品约200mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含芍药苷约2.0mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml芍药苷的标准曲线溶液；
阿魏酸标准曲线溶液制备：取阿魏酸对照品约10mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含阿魏酸约0.1mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml阿魏酸的标准曲线溶液；
苯甲酸标准曲线溶液制备：取苯甲酸对照品约10mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含苯甲酸约0.1mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml苯甲酸的标准曲线溶液；
b、采用两台不同高效液相色谱仪，取步骤a中制得的7个不同浓度的标准曲线溶液按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，按最小二乘法进行线性回归，绘制标准曲线，结果见表15—表22；将羟基红花黄色素A、阿魏酸、苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率，即为各成分相对芍药苷的校正因子，结果见表23。
表15羟基红花黄色素A标准曲线制备试验结果(仪器1)
表16羟基红花黄色素A标准曲线制备试验结果(仪器2)
表17芍药苷标准曲线制备试验结果(仪器1)
表18芍药苷标准曲线制备试验结果(仪器2)
表19阿魏酸标准曲线制备试验结果(仪器1)
表20阿魏酸标准曲线制备试验结果(仪器2)
表21苯甲酸标准曲线制备试验结果(仪器1)
表22苯甲酸标准曲线制备试验结果(仪器2)
表23各成分以芍药苷为内参物的校正因子测定结果汇总
(3)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、对照品工作溶液制备：精密称取芍药苷对照品适量，以50％甲醇水溶液为溶剂，制得含芍药苷0.4mg/ml的对照品工作溶液。
b、供试品溶液制备：精密移取供试品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
c、测定方法：精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子，按下述公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供试品中各成分的含量，mg/ml
CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度，mg/ml
AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积
AX——供试品溶液中各成分峰面积
F——各成分相对芍药苷的校正因子
结论：
1、校正因子确定后，进行血必净中间体羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸含量测定时，则无需采用三种不同的液相条件，分别配制对照品溶液，仅需配制一份供试品溶液，一份单一成分的对照品溶液，即可完成中间体中四种成分的含量测定，简化了试验步骤，克服了原方法的弊端。
实施例2
本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法，包括以下步骤：
(1)液相色谱条件：
照高效液液色谱法测定：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)(10：90)；
流速：0.8ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：230nm；
进样量：20μl；
运行时间：60min，
(2)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定：
a、标准曲线溶液的制备：
羟基红花黄色素A标准曲线溶液制备：取羟基红花黄色素A对照品约20mg、精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含羟基红花黄色素A约2.0mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羟基红花黄色素A的标准曲线溶液；
芍药苷标准曲线溶液制备：取芍药苷对照品约200mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含芍药苷约2.0mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml芍药苷的标准曲线溶液；
阿魏酸标准曲线溶液制备：取阿魏酸对照品约10mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含阿魏酸约0.1mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml阿魏酸的标准曲线溶液；
苯甲酸标准曲线溶液制备：取苯甲酸对照品约10mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含苯甲酸约0.1mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml苯甲酸的标准曲线溶液；
b、采用两台不同高效液相色谱仪，取步骤a中制得的7个不同浓度的标准曲线溶液按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，按最小二乘法进行线性回归，绘制标准曲线；将羟基红花黄色素A、阿魏酸、苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率，即为各成分相对芍药苷的校正因子，结果见表24。
表24各成分以芍药苷为内参物的校正因子测定结果汇总
(3)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、对照品工作溶液制备：精密称取芍药苷对照品适量，以50％甲醇水溶液为溶剂，制得含芍药苷0.4mg/ml的对照品工作溶液。
b、供试品溶液制备：精密移取供试品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
c、测定方法：精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子，按下述公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供试品中各成分的含量，mg/ml
CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度，mg/ml
AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积
AX——供试品溶液中各成分峰面积
F——各成分相对芍药苷的校正因子
结论：
1、校正因子确定后，进行血必净中间体羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸含量测定时，则无需采用三种不同的液相条件，分别配制对照品溶液，仅需配制一份供试品溶液，一份单一成分的对照品溶液，即可完成中间体中四种成分的含量测定，简化了试验步骤，克服了原方法的弊端。检测结果色谱图见：附图3
实施例3
本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法，包括以下步骤：
(1)液相色谱条件：
照高效液液色谱法测定：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)(30：70)；
流速：1.2ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：230nm；
进样量：20μl；
运行时间：60min，
(2)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定：
a、标准曲线溶液的制备：
羟基红花黄色素A标准曲线溶液制备：取羟基红花黄色素A对照品约20mg、精密称定，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含羟基红花黄色素A约2.0mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羟基红花黄色素A的标准曲线溶液；
芍药苷标准曲线溶液制备：取芍药苷对照品约200mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含芍药苷约2.0mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml芍药苷的标准曲线溶液；
阿魏酸标准曲线溶液制备：取阿魏酸对照品约10mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含阿魏酸约0.1mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml阿魏酸的标准曲线溶液；
苯甲酸标准曲线溶液制备：取苯甲酸对照品约10mg、精密称定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含苯甲酸约0.1mg的对照品贮备溶液；分别精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml苯甲酸的标准曲线溶液；
b、采用两台不同高效液相色谱仪，取步骤a中制得的7个不同浓度的标准曲线溶液按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，按最小二乘法进行线性回归，绘制标准曲线；将羟基红花黄色素A、阿魏酸、苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率，即为各成分相对芍药苷的校正因子，结果见表25。
表25各成分以芍药苷为内参物的校正因子测定结果汇总
(3)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、对照品工作溶液制备：精密称取芍药苷对照品适量，以50％甲醇水溶液为溶剂，制得含芍药苷0.4mg/ml的对照品工作溶液。
b、供试品溶液制备：精密移取供试品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
c、测定方法：精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按步骤(1)给定色谱条件进样，记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子，按下述公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供试品中各成分的含量，mg/ml
CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度，mg/ml
AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积
AX——供试品溶液中各成分峰面积
F——各成分相对芍药苷的校正因子
结论：
1、校正因子确定后，进行血必净中间体羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸含量测定时，则无需采用三种不同的液相条件，分别配制对照品溶液，仅需配制一份供试品溶液，一份单一成分的对照品溶液，即可完成中间体中四种成分的含量测定，简化了试验步骤，克服了原方法的弊端。检测结果色谱图见：附图4
实施例4、实施例1-3校正因子法(一测多评法)与外标法、原标准方法结果比对：
选取10份不同批号的血必净中间体，分别采用实施例1-3校正因子法(一测多评法)，外标法(各成分分别制备对照品溶液)、原标准方法测定其中的羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量，结果见表26-29。
表26羟基红花黄色素A方法比对试验结果
表27药苷方法比对试验结果
表28阿魏酸方法比对试验结果
表29苯甲酸方法比对试验结果
从上表可以看出，采用本发明所确定的校正因子法(一测多评法)与现有质量标准中方法对同一样品中所含的羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的测定结果的相对平均偏差均小于5.0％，即无明显偏差，校正因子法(一测多评法)法这一替代方案能实现对样品中多指标成分的准确定量。
Claims (4)
1.一种血必净中间体有效成分的含量测定方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一：以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定
a、标准溶液的制备：
分别精密称取羟基红花黄色素A对照品、芍药苷对照品、阿魏酸对照品、苯甲酸对照品适量，置容量瓶中，以50％甲醇水溶液为溶剂，溶解并定容至刻度，制得含羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸一定浓度的对照品混标浓溶液；将混标浓溶液进行七步梯度稀释，使得各步稀释后的标准溶液中各成分浓度分别在供试品限度浓度的40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％；
b、各组分校正因子计算：
采用两台不同高效液相色谱仪，取步骤a中制得的7个不同浓度的标准溶液进样，记录色谱图，分别以各成分相对应的浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，按最小二乘法进行线性回归，绘制标准曲线，将羟基红花黄色素A、阿魏酸、苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率，即为各成分相对芍药苷的校正因子；
步骤二：按校正因子法测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、对照品工作溶液制备：精密称取芍药苷对照品适量，置容量瓶中，以50％甲醇水溶液为溶剂，制得含芍药苷浓度为CR的对照品工作溶液；
b、供试品溶液制备：精密移取供试品，置容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度摇匀，作为供试品溶液；
c、测定方法：分别精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，根据步骤一中确定的校正因子，按下述公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量，
式中：X——供试品中各成分的含量，mg/ml
CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度，mg/ml
AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积
AX——供试品溶液中各成分峰面积
F——各成分相对芍药苷的校正因子
其中，液相色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，
流动相：甲醇：醋酸水溶液，1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml，体积比10：90-30：70，
流速：0.8-1.2ml/min，
柱温：30℃，
检测波长：230nm，
进样量：20μl，
运行时间：60min；
所述血必净中间体多指标成分为羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸。
2.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，液相色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，
流动相：甲醇：醋酸水溶液，1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml，体积比：20：80
流速：1.0ml/min，
柱温：30℃，
检测波长：230nm，
进样量：20μl，
运行时间：60min。
3.如权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，液相色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，
流动相：甲醇：醋酸水溶液，1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml，10：90
流速：0.8ml/min，
柱温：30℃，
检测波长：230nm，
进样量：20μl，
运行时间：60min。
4.如权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，液相色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，
流动相：甲醇：醋酸水溶液，1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml，体积比：30：70，
流速：1.2ml/min，
柱温：30℃，
检测波长：230nm，
进样量：20μl，
运行时间：60min。
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