CN106701832B

CN106701832B - 运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法

Info

Publication number: CN106701832B
Application number: CN201611251251.2A
Authority: CN
Inventors: 孙坤来; 刘�文; 韩鹏杰; 韩烨华; 陈荫; 赵玉勤; 王兵
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN106701832A

Abstract

本发明提供了一种运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，即通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA（曲古抑菌素A）进行表观遗传修饰调控发酵。有益效果为：运用表观遗传修饰调控后的发酵微生物，由于激活沉默基因表达，代谢产物抑制鳗弧菌活性显著提高、次生代谢产物明显丰富。

Description

运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法

技术领域

本发明涉及生物科技领域，具体是一种运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法。

背景技术

舟山海水养殖业主要围绕大黄鱼、梭子蟹、对虾、贻贝和黑鲷等特色优势品种，以浅海养殖、围塘养殖为主。随着养殖规模的扩大，养殖强度不断增加，养殖生态环境也在不断恶化，同时，水产养殖业的病害日趋严重，给渔民造成了较大的经济损失。其中大规模水产养殖的主要病害就有由鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染引起的弧菌病，此病传染快速、感染率高，死亡率更是高达90%。目前，鳗弧菌已在欧洲、北美、日本等10多个国家肆虐，40多种海水养殖品种遭受鳗弧菌的侵袭，其中最重要的养殖品种有贝类、鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼等贝类、鱼类都受其侵害。鳗弧菌病在淡水养殖中具有同在海水养殖中同样高的发病率和高致死率，造成养殖区的严重减产和水体污染，给渔民带来巨大的经济损失。当前对于控制鳗弧菌病的应对策略主要是防重于治，如：疫苗预防、益生菌添加、非特异的免疫制剂等方式代替药物治疗，因为鳗弧菌病一旦发生，治疗有一定的困难，鱼苗和幼鱼的治疗尤为不便。而目前的化学药物主要以抗菌肽及其他抗生素药物为主，例如：在挪威，鳕鱼弧菌病的治疗主要使用奥索利酸和氟苯尼考，但效果都不理想，并会引起水环境的污染、抗生素的生物累积和致病菌耐药性的产生。因此，寻找一种高效低毒、对水环境无污染、不易产生耐药性又可以有效抑制鳗弧菌而又不对水产品产生毒副作用的药物，对海水养殖抵抗鳗弧菌病害、增加养殖品的成活率、提高产量、对实现渔民创收增收方面具有重要意义。

浒苔(Enteromorpha prolifera)为绿藻门(Chlorophyta)、石莼目(Ulvales)石莼科(Ulvaleae)浒苔属(Enteromorpha)植物，是一种药食两用的广布于近海滩涂中的天然野生大型绿藻，具有清热解毒之功效。近年来，全国多地近海水域每年都会产生大规模的浒苔爆发性生长，形成“绿潮”，给海洋水产养殖业和沿海观光业造成重大损失。但“绿潮”能向环境中分泌化学物质，从而抑制赤潮微藻的生长。浒苔共附生微生物能分泌抑藻抑菌的物质，抑制机制为通过阻断呼吸链、抑制细胞壁合成、抑制孢子的形成。但在自然发酵的情况下浒苔共附生微生物分泌抑藻抑菌的物质量少，且活性不大。

遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的传递是受一系列复杂调控因子控制的，他们主要负责调控细胞的转录和翻译过程。这些重要的调控机制在天然产物次生代谢产物合成机制中也扮演重要调控角色。微生物都具有很多次生代谢产物生物合成的编码基因，然而只有一小部分小分子产物在实验室条件下被检测到，而大多数编码基因处于沉默状态。因此，寻找新方法如基因克隆、诱变处理、菌株或种间自然接合、原生质体融合等方法激活沉默基因表达，使真核微生物代谢产物多样性和新颖性充分表达出来，是天然产物化学中的一个热门课题。

现有技术如授权公告号为CN103459592B的中国发明专利，公开了一种亚全能干细胞产品及其表观遗传修饰标签，诱导生成亚全能干细胞产品的方法以及干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签鉴定。还提供了一种亚全能性基因和/ 或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传学修饰标签的用途。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能诱导浒苔共附生微生物次生代谢产物丰富，产物活性大的运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

本发明采用的土曲霉保藏号为：No. KP295961。

运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，具体步骤为：

1）扩大培养：将土曲霉接种在灭菌后冷却的培养基中扩大培养，扩大培养基成份及其重量份为：15~25份甘露醇，2~5份酵母膏，0.1~0.8份硫酸镁，8~15份味精，9~20份葡萄糖，02~1.1份磷酸二氢钾，18~25份麦芽糖，0.8~1.5份玉米浆，30~40份海水素。培养温度为25~40℃，pH为6.5~7.5，培养时间为20~40d。上述培养基能很好的满足浒苔的共附生微生物生长繁殖所需的营养物质和生长因子，加快其生长繁殖，缩短实验所需时间；

2）表观遗传修饰调控：在真菌液体培养基中添加溶有TSA的甲醇溶液，并将步骤1得到的土曲霉接种到灭菌后冷却的真菌液体培养基中进行发酵，接种量为1~5%，真菌液体培养基成份及其重量份为：15~25份甘露醇，2~5份酵母膏，0.1~0.8份硫酸镁，8~15份味精，9~20份葡萄糖，02~1.1份磷酸二氢钾，18~25份麦芽糖，0.8~1.5份玉米浆，30~40份海水素，0.00003~0.00007份四甲基乙二胺和0.005~0.008份芹菜素。发酵温度为25~40℃，pH为6.5~7.5，发酵时间为20~40d。发酵培养在锥形瓶中进行，TSA：甲醇的质量体积比为1mg:1ml~1.2ml，甲醇溶液：真菌液体培养基体积比为1:500~700。甲醇溶液加入真菌液体培养基之前用微孔滤膜过滤到灭菌锥形瓶中，并在2~6℃条件下保存备用。上述真菌液体培养基能很好的提供浒苔的共附生微生物发酵所需的营养物质和生长因子，加快微生物发酵速度，使其分泌物质的速度加快。表观遗传修饰学是研究DNA序列没有发生变化的可遗传的基因表达的改变，真核微生物的组蛋白乙酰化、DNA去甲基化和染色质去压缩状态可促进基因活化、提高基因转录子的启动，提高沉默基因的表达率，从而获得一些结构新颖的活性代谢产物。添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA（曲古抑菌素 A）对浒苔的共附生微生物土曲霉进行表观遗传修饰调控发酵，激活沉默基因表达，代谢产物抑制鳗弧菌活性显著提高（在自然发酵培养下该菌株代谢产物种类少，生物活性低）、次生代谢产物明显丰富。

与现有技术相比，本发明的优点在于：通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA（曲古抑菌素A）对浒苔的共附生微生物土曲霉进行表观遗传修饰调控发酵，激活沉默基因表达，代谢产物抑制鳗弧菌活性显著提高（在自然发酵培养下该菌株代谢产物种类少，生物活性低）、次生代谢产物明显丰富。通过表观遗传修饰调控，激活土曲霉沉默基因的表达来制备抗菌新药，为我国水产养殖业常见病原菌—鳗弧菌的防治提供活性先导化合物及活性菌株资源，为“赤潮”防治、“绿潮”利用的研究提供科学依据，同时应用表观遗传修饰策略提高了基因的表达水平和活性产物的多样性；得到的抗菌药物高效低毒、对水环境无污染、不易产生耐药性又可以有效抑制鳗弧菌而又不对水产品产生毒副作用；将浒苔变废为宝，操作简单，成本低廉，经济价值高。

附图说明

图片为遗传信息的传递及表观遗传修饰调控过程。

具体实施例

下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，具体操作步骤为：

2）表观遗传修饰调控：在真菌液体培养基中添加溶有TSA的甲醇溶液，并将步骤1得到的土曲霉接种到灭菌后冷却的真菌液体培养基中进行发酵，接种量为1~5%，真菌液体培养基成份及其重量份为：15~25份甘露醇，2~5份酵母膏，0.1~0.8份硫酸镁，8~15份味精，9~20份葡萄糖，02~1.1份磷酸二氢钾，18~25份麦芽糖，0.8~1.5份玉米浆，30~40份海水素，0.00003~0.00007份四甲基乙二胺和0.005~0.008份芹菜素。发酵温度为25~40℃，pH为6.5~7.5，发酵时间为20~40d。发酵培养在锥形瓶中进行，TSA：甲醇的质量体积比为1mg:1ml~1.2ml，甲醇溶液：真菌液体培养基体积比为1:500~700。甲醇溶液加入真菌液体培养基之前用微孔滤膜过滤到灭菌锥形瓶中，并在2~6℃条件下保存备用。四甲基乙二胺和芹菜素能定向强化特定菌种，保持菌种优势。上述真菌液体培养基能很好的提供浒苔的共附生微生物发酵所需的营养物质和生长因子，加快微生物发酵速度，使其分泌物质的速度加快。表观遗传修饰学是研究DNA序列没有发生变化的可遗传的基因表达的改变，真核微生物的组蛋白乙酰化、DNA去甲基化和染色质去压缩状态可促进基因活化、提高基因转录子的启动，提高沉默基因的表达率，从而获得一些结构新颖的活性代谢产物。添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA（曲古抑菌素 A）对浒苔的共附生微生物土曲霉进行表观遗传修饰调控发酵，激活沉默基因表达，代谢产物抑制鳗弧菌活性显著提高（在自然发酵培养下该菌株代谢产物种类少，生物活性低）、次生代谢产物明显丰富。

实施例2：

运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，最优选步骤为：

1）扩大培养：将土曲霉接种在灭菌后冷却的培养基中扩大培养，扩大培养基成份及其最优选重量份为：20份甘露醇，3份酵母膏，0.3份硫酸镁，10份味精，12份葡萄糖，0.5份磷酸二氢钾，20份麦芽糖，1.0份玉米浆，33份海水素。培养温度为28℃，pH为7.0，培养时间为30d。上述培养基能很好的满足浒苔的共附生微生物生长繁殖所需的营养物质和生长因子，加快其生长繁殖，缩短实验所需时间；

2）表观遗传修饰调控：在锥形瓶中加入真菌液体培养基，真菌液体培养基成份及其最优选重量份为：20份甘露醇，3份酵母膏，0.3份硫酸镁，10份味精，12份葡萄糖，0.5份磷酸二氢钾，20份麦芽糖，1.0份玉米浆，33份海水素，0.00005份四甲基乙二胺和0.006份芹菜素。再加入溶有TSA的甲醇溶液，TSA：甲醇的质量体积比为1mg:1.104ml，甲醇溶液：真菌液体培养基体积比为1:600，最后得到的TSA浓度为10μM。将步骤1得到的土曲霉接种到配置好的真菌液体培养基中进行发酵，接种量为2%，发酵温度为28℃，pH为7.0，发酵时间为30d。甲醇溶液加入真菌液体培养基之前用微孔滤膜过滤到灭菌锥形瓶中，并在4℃条件下保存备用；

3）次生代谢产物的提取：用30份乙酸乙酯萃取培养液中的孢外代谢产物，再用20份丙酮对菌丝体处理后同样用30份乙酸乙酯提取孢内产物，旋转蒸发后得到粗浸膏；

4）抑菌测试：运用琼脂扩散法评价次生代谢产物对鳗弧菌的抑制活性，当粗浸膏浓度为10mg/ml时抑菌圈直径为17mm。说明添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA（曲古抑菌素A）对浒苔的共附生微生物土曲霉进行表观遗传修饰调控发酵，能激活沉默基因表达，代谢产物抑制鳗弧菌活性显著提高（在自然发酵培养下该菌株代谢产物种类少，生物活性低）、次生代谢产物明显丰富。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，其特征在于以下步骤：

1）扩大培养：将土曲霉接种在培养基中扩大培养；

2）表观遗传修饰调控：在真菌液体培养基中添加溶有TSA的甲醇溶液，并将步骤1）得到的土曲霉接种到配置好的真菌液体培养基中进行发酵；

所述的步骤2）中真菌液体培养基成份及其重量份为：15~25份甘露醇，2~5份酵母膏，0.1~0.8份硫酸镁，8~15份味精，9~20份葡萄糖，0.2~1.1份磷酸二氢钾，18~25份麦芽糖，0.8~1.5份玉米浆，30~40份海水素，0.00003~0.00007份四甲基乙二胺和0.005~0.008份芹菜素；

所述的步骤2）中TSA：甲醇的质量体积比为1mg:1ml~1 .2ml；

所述的步骤2）中甲醇溶液：真菌液体培养基体积比为1:500~700。

2.根据权利要求1所述的运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，其特征在于：所述的步骤1）中扩大培养基成份及其重量份为：15~25份甘露醇，2~5份酵母膏，0.1~0.8份硫酸镁，8~15份味精，9~20份葡萄糖，0.2~1.1份磷酸二氢钾，18~25份麦芽糖，0.8~1.5份玉米浆，30~40份海水素。

3.根据权利要求1所述的运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，其特征在于：所述的步骤2）中接种量为1~5%。

4.根据权利要求1所述的运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，其特征在于：所述的培养和发酵温度均为25~40℃，pH均为6.5~7 .5，培养和发酵时间均为20~40d。

5.根据权利要求1所述的运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，其特征在于：所述的步骤2）中的发酵培养在锥形瓶中进行。

6.根据权利要求1所述的运用表观遗传修饰调控发酵微生物的方法，其特征在于：所述的步骤2）中甲醇溶液加入真菌液体培养基之前用微孔滤膜过滤到灭菌锥形瓶中，并在2~6℃条件下保存备用。