CN101528939B - 使用改良的培养基从破囊壶菌目菌群生产ω-3脂肪酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以属于破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物群中的微生物生产ω-3脂肪酸的改良方法，其使用一种改良的培养基组合物。尤其是，本发明涉及一种通过在发酵罐内培养微生物群(如Ulkenia菌、Thraustochytrium菌和/或Schizochytrium菌)生产ω-3脂肪酸的方法，该方法包括在钠离子降低、钾离子浓度升高的环境中培养破囊壶菌目微生物群的步骤。

Description

使用改良的培养基从破囊壶菌目菌群生产ω-3脂肪酸

技术领域

本发明涉及以破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物生产ω-3脂肪酸的改良方法，其使用一种改良的培养基组合物。尤其是，本发明涉及一种通过在发酵罐内培养微生物(如Ulkenia菌、Thraustochytrium菌和/或Schizochytrium菌)生产ω-3脂肪酸的方法，该方法包含在钠离子降低、钾离子浓度升高的环境中培养破囊壶菌目微生物群的步骤。

背景技术

摄入特定ω-3脂肪酸对人体或动物机体有多种益处，包含但不限于减少心血管和炎症疾病。已知在发酵罐内，破囊壶菌目的多个微生物成员是极好的多烯脂肪酸生产者，尤其是低盐水平生长时，因此它们可用来商业化生产ω-3高不饱和脂肪酸，如DHA，最重要的ω-3脂肪酸之一。

海洋来源的海洋微藻通常需要确定的条件来生长和生产脂质。例如，用于这些微生物的培养和/或发酵的培养基必须在某一盐度范围，以维持微生物生长和生产脂质。由Bahnweg，Inst.Meeresforsch.Bremerh.，17(1979)，245-268页知道，一些菌株，如Thraustochytrium aureum，在NaCl浓度为1.5％-3％之间时生长最好，且培养基中不含钾离子会减缓这些菌株的生长，但是其它的菌株，如Schizochytrium aggregatum，则不受影响。此外，培养基必须有一定的pH范围。如果这一条件没有达到，破囊壶菌目细胞停止生长和/或细胞生产较少的多烯酸。根据Bahnweg，

Inst.Meeresforsch.Bremerh.，17(1979)，245-268页，对于大多数的破囊壶菌目菌株，最佳的pH值是在6.0-8.0之间，而pH值小于5.0时，未见菌株生长。然而，发酵期间随着发酵液中养分的消耗和细胞释放废产物进入发酵液，pH值会发生变化。美国专利US 5,340,594记载了发酵期间培养基变得更呈碱性，并因此通过加酸来控制pH值。德国专利DE103 52 837A1报道正好相反，海洋微生物发酵期间如不控制pH值，培养基会变酸。

发酵破囊壶菌目常用的培养基具有相对高的氯化钠浓度。但是，从Barcley的美国专利US 6,410,281B1已知，用来发酵破囊壶菌目的培养基中如此高的氯化物浓度将促使不锈钢发酵罐腐蚀。另一个发酵破囊壶菌目遇到的问题是，尽管使用的发酵培养基具有相对高的盐浓度，但是破囊壶菌目的高密度培养或高脂质生产所必须的重要金属离子(如钾)的含量极低。

因此，本领域存在需要为破囊壶菌目的发酵提供一种改良的培养基，且还需要一种改良的方法来培养这些微藻以使破囊壶菌目细胞在发酵罐内更高密度发酵以及高不饱和脂肪酸(如DHA)的产量更高，由此而减少使用高盐度培养基的发酵方法有关的副反应，如腐蚀发酵罐。

发明内容

本发明提供破囊壶菌目微生物的发酵方法，其特征为发酵期间培养基的pH值通过加入碱来控制，尤其是氢氧化钾。另外，本发明提供了从破囊壶菌目微生物中获取脂质的方法，其特征为在这些微藻的发酵期间发酵培养基的pH值通过加入碱来控制，优选氢氧化钾。

由此，根据本发明，在破囊壶菌目菌株的发酵期间氢氧化钾作为pH值控制剂使用。发酵培养基中加入氢氧化钾防止由于某些养分的消耗以及微生物细胞生成废产物而导致培养基的pH值发生变化，因为氢氧化钾的OH^-离子中和了释放进入培养基的质子。而且，由于氢氧化钾的加入，培养基中钾离子的浓度显著升高，这对培养的微生物细胞的生长和脂质生产有着积极的、有利的作用。

此外，在发明的方法中氢氧化钾作为pH值控制剂使用有利地助于显著地降低发酵设备的腐蚀，尤其是降低不锈钢发酵罐腐蚀。现有技术常将酸作为pH值控制剂使用。例如美国专利US5,340,594。盐酸是本领域频繁作为pH值控制剂使用的酸之一。盐酸溶解后离解成带负电荷的氯离子和带正电荷的氢离子。但是，阴离子例如氯离子显著地促使不锈钢发酵罐的腐蚀。例如参见美国专利US 6,410,281。因此，在那篇专利中，推荐在发酵培养基中使用非氯化钠盐(如碳酸钠，碳酸氢纳，硫酸钠等等)以降低不锈钢发酵罐的腐蚀。然而，那篇专利未注意到，在发酵培养基中加入pH值控制剂会引入大量的离子而促使发酵罐的腐蚀。与那篇专利相反，本发明完全避免了有害阴离子(通过加入促使发酵罐腐蚀的pH值控制剂)的引入。改为氢氧化钾(KOH)作为pH值控制剂，其离解成钾离子和氢氧离子，解离后的氢氧离子立即被发酵培养基中的氢离子中和。因此，与美国专利US 6,410,281比较，本发明以本质上不同的方法解决了发酵罐的腐蚀问题。

因此，本发明一方面涉及破囊壶菌目微生物的发酵的方法，其包括在控制的条件下在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值以及收获微藻生物量的步骤。

本发明另一方面涉及在含盐发酵培养基中破囊壶菌目微生物的发酵期间降低发酵罐腐蚀的方法，其包含在控制的条件下在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的含盐发酵培养基中于发酵罐内培养微生物以及发酵期间使用碱(尤其是氢氧化钾)调节培养基pH值。本降低腐蚀的发明方法还包括在发酵后收获微生物生物量步骤以及视情况可包括从生物量中提取脂质的步骤。

本发酵微生物的发明方法以及降低发酵罐腐蚀的发明方法包括在限定条件下于培养基中培养和/或发酵破囊壶菌目微藻，如Ulkenia、Thraustochytrium、Schizochytrium、Althornia、Aplannochytrium、apanochytrium或Labyrinthuloides。

根据本发明的发明方法中使用的液体培养基包含一种适宜的碳源，如糖。碳源的优选例子包括但不限于葡萄糖、淀粉和糖蜜。本发明方法使用的发酵培养基或发酵液还包含一种适宜的氮源，如硝酸盐、氨化合物、氨基酸、酵母提取液、玉米浆等。本发明方法使用的培养基还包含浓度约为0.2g/升到约10.8g/升之间的氯离子，其大致相当于海水的钠离子浓度。此外，培养和/或发酵过程用的培养基还包含钾离子。在本发明优选的实施方式中，培养基包含浓度约为0.1g/升到约1.0g/升之间的钾离子。

通过本发明方法，微藻的生长和脂质生产可在与允许得到得到满意的微藻生长和/或细胞的高脂质生产的温度下实现，例如，在15℃到48℃之间，优选情况下在25℃到28℃之间。微藻的生长可以在适宜微藻发酵或培养的容器和槽内进行。优选的发酵设备包括但不限于搅拌的和/或通气的容器、气升式反应器、摇瓶等等。破囊壶菌目菌群培养在一个大的容器或反应器中时，优选地通过以一株或多株微藻菌株的斜面培养的一等分或者一株或多株菌株的低温保存培养的一等分接种营养的肉汤培养基生产接种物。然后连续将该接种物转移至较大的体积的液体培养基中，直至其最终达到一个适宜接种入最终生产体积的体积。

在本发明方法的一种优选的实施方式中，用来发酵的破囊壶菌目微生物属于Thraustochytrium、Schizochytrium、Ulkenia、Althornia、Aplananochytrium、Japanochytrium或Labyrinthuloides属。菌株或种的具体的优选实例包括但不限于Ulkenia SAM 2179、Thraustochytrium aureum、Schizochytrium limacinum SR21和Schizo-chytriυm aggregatum。破囊壶菌目的微藻属于异养生物群，即，它们是获取从有机底物获取能量和细胞碳的有机体，而且可以在暗处(即，没有光)生长。

根据本发明不同种的微生物的混合物也可以发酵。这意味着2种以上不同种的破囊壶菌目物种可以同时在同一个发酵罐内发酵，以生产一种混合的生物量(其包含破囊壶菌目的至少2种不同种的物种)和/或一种混合的油(其包含由两种或多种不同物种生产的脂质)。

通过同时在同一个发酵罐内培养两种或多种不同物种，可能获得一种生物量，其脂质组成与从其中单独一种物种获得生物量的脂质组成显著不同。在本发明的一种优选的实施方式中，UlkeniaSAM2179和Schizochytrium limacinum SR21一起发酵，以生产混合的生物量和混合的油。

通常发酵发生在温度为15℃以上，优选情况下在20℃以上，更优选情况下在25℃以上，如约28℃。根据本发明，发酵或培养微藻的时间超过约2天到约14天之间，优选情况下为直至发酵培养基中的养分耗尽。

根据本发明的方法，通过加入氢氧化钾，发酵培养基的pH值维持在3.5到8.0之间，优选在4.0到7.0之间。氢氧化钾可以以固体形式(如氢氧化钾片)或以水溶液形式加入培养基。

根据本发明，加入培养基氢氧化钾的量使得最终钾离子浓度至少为约0.2g/升、至少为约0.3g/升、至少为约0.4g/升、至少为约0.5g/升、至少为约0.6g/升或至少为约0.7g/升。

优选钾离子浓度的较高范围为最高约10g/升、最高约6g/升、最高约4g/升、最高约3g/升、最高约2.5g/升、最高约2g/升、最高约1.5g/升或最高约1g/升。

最优选的钾离子浓度为约1.5g/升到约3g/升，尤其是2.0g/升到2.4g/升。

发酵期间，即，破囊壶菌目细胞的生长和繁殖期间积聚脂质，尤其是ω-3高不饱和脂肪酸。这些含有脂质的细胞可以在指数生长期或之后收获，此时细胞已到达它们最大的细胞密度，可以获得富含ω-3不饱和脂肪酸的生物量。如果期望获得ω-3不饱和脂肪酸含量显著增加的生物量，破囊壶菌(Thraustochytrids)的培养可以使用有限的养分。在本发明方法的一种优选实施方式中，培养破囊壶菌，将氮限制在适宜的时间供给，例如，将培养转移至无氮的培养基。

通本发明方法，可以获得发酵培养基的生物量密度达50g/升以上，优选70g/升以上，更优选90g/升以上，最优选100g/升以上。以重量计，干的生物量含有的脂肪酸至少为20％，优选至少为30％，更优选至少为40％，最优选至少为50％。通常，本发明方法中，破囊壶菌目微藻生产的脂肪酸或脂质的至少约为20％，且生物量中含有的脂肪酸或脂质为多不饱和脂肪酸，尤其是ω-3脂肪酸，如DHA。优选情况下，生物量中含有的脂质30％以上为多不饱和脂肪酸，尤其是ω-3脂肪酸，如DHA。更优选的情况下，生物量中含有的脂肪酸40％以上或50％以上为多不饱和脂肪酸，尤其是DHA。

细胞的收获可以通过例如过滤技术、离心(使用或不使用本领域已知的方法先络合或絮凝)完成。例如，细胞可以通过带过滤、旋转滚筒过滤等收获。收获细胞后进行冲洗、冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥，于非氧化性条件下储藏。收获富含ω-3不饱和脂肪酸(尤其是富含DHA)的生物量后，也可以进行干燥处理以得到干的生物量。在干燥之前，视情况可将收获的细胞予以冲洗。此外，发酵破囊壶菌目的特定物种后获得的生物量，可以与发酵的破囊壶菌目的第二物种后获得的生物量进行混合，以得到生物量混合物。在一种优选的实施方式中，Ulkenia SAM2179生物量与Schizochytriumlimacinum生物进行混合。获得的生物量可以直接加入动物饲料或者供人类使用的食品中。

本发明应用因此也涉及通过本发明方法获取的生物量或生物量混合物及其用以生产食品和饲料组合物的用途。

本发明另一方面涉及从破囊壶菌目微生物获取脂质(尤其是ω-3不饱和脂肪酸，如DHA)的方法，其包括于控制的条件下在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值，收获微藻生物量以及从微藻生物量中提取脂质的步骤。

在本发明的这个实施方式中，如上所概述，可以完成于控制的条件下在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值以及收获微藻生物量的步骤。收获细胞后，获得湿的或干的生物量可以用本领域已知的适宜从微藻细胞中提取脂质的任何一种提取方法处理。提取方法包括但不限于超临界二氧化碳提取、HPLC提取、使用溶剂或溶剂混合物(如己烷、氯仿、乙醚和甲醇)提取。在应用上述提取方法之前，收获生物量的细胞的细胞壁可以使用超声、碾磨、冻融或酶破坏技术予以破坏。通过应用一种前述的提取方法获得的粗制油或粗制脂质可以采用本领域熟知的方法进行进步纯化，纯化方法包括但不限于精制、冷结晶等等。根据本发明，一种从发酵给定种的破囊壶菌目获得的油与从发酵破囊壶菌目的第二物种获得的第二种油予以混合是可能的。

由上获得的脂质的20％以上为多不饱和脂肪酸，尤其是ω-3不饱和脂肪酸，如DHA。优选情况下，由上获得的脂质的30％以上为多不饱和脂肪酸，尤其是ω-3不饱和脂肪酸，如DHA。更优选情况下，由上获得的脂肪酸的40％以上或50％以上为多不饱和脂肪酸，尤其是DHA。由上获得的脂质可以用来生产食品组合物、饲料组合物、药物组合物和化妆品组合物。

本发明的另一方面涉及从破囊壶菌目微生物获取脂质，尤其是是ω-3不饱和脂肪酸如DHA的方法，所述的方法包括于控制的条件下在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值，收获微藻生物量以及从微藻生物量中提取脂质的步骤。

具体实施方式

实施例1

根据如下方案制备接种培养物。

2000ml摇瓶中装有无菌预培养培养基350ml(其每1000ml蒸馏水含Tropic Marin盐16.7g、葡萄糖30g、酵母提取物10g，pH值为6)，以Ulkenia SAM 2179冷冻保存的培养物1ml进行接种。摇瓶在温度为25℃转速为160rpm(每分钟转数)的摇床上培养68小时以上。68小时后，660nm的光密度为16.1。

转移上述Ulkenia SAM 2179接种培养物135ml(3％)至含有发酵培养基的发酵罐内，发酵培养基含有如下组分：每1000ml自来水，含有右旋糖165g、磷酸钾3g、硫酸铵5g、氯化镁1g、硫酸钠1g、氯化钙0.3g、玉米浆3.75g，pH值为4。发酵罐的总容积为5升，有效容积为4.5升。

温度为28℃，转速为380rpm，发酵约166小时。通气速率为3.5升/分。发酵期间为控制pH值，配制好灭菌的20％KOH溶液。pH值予以自动控制，使得pH值不得低于4。

约155小时后，发酵培养基内的主要养分已耗尽。这时取含有微生物细胞的培养基样品，分析生物量数量和脂质含量。

冲洗所取的富含生物量的培养基样品，然后冷冻干燥。然后将生物量样品与氢氯酸甲醇进行酯交换反应。根据熟知的标准试验方案，采用气相色谱法检测样本的脂肪酸组成和脂肪酸含量。

得如下结果：生物量干重为68.7g/升。该生物量的DHA含量为16.1g/升。总脂肪酸的DHA含量为45％。DHA与DPA(一种ω-6不饱和脂肪酸)比值为3.5。

实施例2

根据如下方案制备接种培养物。

2000ml摇瓶中装有无菌预培养培养基350ml(其每1000ml蒸馏水含Tropic Marin盐16.7g、葡萄糖30g、酵母提取液10g，pH值为6)，以Ulkenia SAM 2179冷冻保存的培养物1ml进行接种。摇瓶在温度为25℃转速为160rpm(每分钟转数)的摇床上培养48小时以上。48小时后，660nm的光密度为9.5。

转移上述Ulkenia SAM 2179接种培养物300ml(3％)至含有发酵培养基的发酵罐内，发酵培养基含有如下组分：

右旋糖           165g/升

玉米浆           3.75g/升

磷酸二氢钾       3.0g/升

氯化钠           0.8g/升

七水硫酸镁       1.5g/升

二水氯化钙       0.3g/升

硫酸氨           5.0g/升

pH值为           4

发酵罐的总有效容积为10升。

温度为28℃，转速为350rpm，发酵约114小时。通气速率为7.5升/分。发酵期间为控制pH值，配制好灭菌20％KOH溶液。pH值予以自动控制，使得pH值不得低于4。

约110小时后，发酵培养基内的主要养分已耗尽。这时取含有微生物细胞的培养基样品，分析生物量数量和脂质含量。

冲洗所取的富含生物量的培养基样品，然后冷冻干燥。然后将生物量样品与氢氯酸甲醇进行酯交换反应。根据熟知的标准试验方案，采用气相色谱法检测样本的脂肪酸性质和脂肪酸含量。

得如下结果：生物量干重为62.3g/升。该生物量的DHA含量为15.8g/升。总脂肪酸的DHA含量为44.3％。DHA与DPA(一种ω-6不饱和脂肪酸)比值为3.5。

Claims (3)

1.破囊壶菌目微生物的发酵方法，其特征为微生物的发酵期间，发酵培养基的pH值通过加入氢氧化钾来控制，所述方法进一步包含在含钠浓度0.2g/升到10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值和收获微藻生物量的步骤。

2.从破囊壶菌目微生物获取脂质的方法，其特征为微生物的发酵期间，发酵培养基的pH值通过加入氢氧化钾来控制，所述方法进一步包含在含钠浓度0.2g/升到10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值，收获微藻生物量和从微藻生物量中提取脂质的步骤。

3.破囊壶菌目微生物的发酵期间降低发酵罐腐蚀的方法，所述的方法包含发酵罐内在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的含盐发酵培养基中培养微生物和发酵期间通过加入氢氧化钾调节培养基pH值。