CN104188953A - 芹菜素用于在制备抑制支架蛋白表达及癌细胞转移的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种芹菜素制剂在制备用于抑制支架蛋白HEF1的表达，从而达到抑制癌细胞转移的药物中的应用，并通过实验证实无论是内源性的HEF1分子，还是人工过表达产生的HEF1分子都能够被该芹菜素制剂降解，因此本发明揭示了芹菜素可抑制HEF1的表达，从而抑制癌细胞的迁移与侵袭。

Description

芹菜素用于在制备抑制支架蛋白表达及癌细胞转移的药物中的应用

【技术领域】

本发明属于医药领域，涉及一种芹菜素用于在制备抑制支架蛋白从而抑制癌细胞转移的药物中的应用。

【背景技术】

芹菜素主要存在于瑞香科、马鞭草科、卷柏科植物中，如芫花，卷柏中含量较大。芹菜素属于黄酮类，具有抑制致癌物质的活性；作为治疗HIV和其它病毒感染的抗病毒药物；MAP激酶的抑制剂；治疗各种炎症；抗氧化剂；镇静、安神；降压。与其他黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比具有低毒、无诱变性等特点。

转移是癌症高死亡率的主要原因之一，抗转移药物的研究是抗肿瘤药物研发的重要方向。最近支架蛋白——人丝化增强子1(Human Enhancer ofFilamentation1以下简称HEF1)被鉴定为促进癌症转移的关键因子，HEF1的异常高表达是恶性黑色素瘤、细胞胶质瘤、肺癌、乳腺癌、结肠癌等转移的重要标志，也成为一个潜在的药物靶标，通过抑制HEF1的表达可以抑制癌细胞的转移。

目前还未有关于芹菜素抑制支架蛋白HEF1的表达，从而抑制癌细胞转移的报道，因此本发明首次将芹菜素应用于抑制结肠癌细胞HEF1表达从而抑制癌细胞的迁移和侵袭的作用，表明其具有很好的开发利用前景。

【发明内容】

本发明的目的在于提供芹菜素在抑制HEF1表达，从而抑制癌细胞转移药物中的应用，从而为临床上抑制癌细胞转移提供一种毒副作用小的天然药物。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

芹菜素是从日常蔬菜旱芹菜里提取的黄酮类化合物，前期动物实验中发现芹菜素能够抑制异体移植结肠癌细胞小鼠的肿瘤生长和转移，而且能特异性阻断癌症转移关键因子HEF1的表达。而小鼠结肠癌细胞水平的研究结果也表明：芹菜素特异性抑制了结肠癌细胞HEF1的表达及细胞迁移和侵袭，而HEF1的过表达则促进了结肠癌细胞的迁移和侵袭，这种促进作用能够被芹菜素所抵消，表明该药物可以作为临床上用于制备抑制HEF1表达的药物做进一步开发。

本发明公开了一种芹菜素的应用，即芹菜素溶解在5％-10％的DMSO生理盐水或细胞培养基中制成的溶液制剂，在作为抑制癌细胞转移药物中的应用，为其进一步开发应用奠定了良好的基础。

芹菜素属于黄酮类，临床上主要用于治疗和抑制各种癌症，无抗药性和副作用，而关于其在抑制HEF1表达方面还未见报道和应用，故本发明是对其新药用价值的发现，对抑制HEF1表达，从而抑制癌细胞转移提供一种新的有效药物。

目前在临床上芹菜素在治疗癌症方面主要以片剂、胶囊、试剂作用于治疗抑制癌症，结合现代常用药物制剂手段，可将其制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂，口服或注射。在用于抑制癌细胞转移的药物中可加入该药成分或在治疗过程中联合用药使用该药。

二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，以下简称DMSO)是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂，对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。因此在制备抑制HEF1转移的药物中可以结合DMSO一并使用。

本发明所述芹菜素是从日常蔬菜——芹菜中提取的黄酮类化合物，并不限于芹菜素本身，还可以是其可药用的盐、水合物或衍生物，所述芹菜素的分子式为：

本发明所述的DMSO不限于DMSO本身，还可以是其可药用的盐、水合物或衍生物，所述DMSO的分子式为：

相较于现有技术，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、该药物是一种纯天然药物，具有毒副作用小的优点；

2、可口服给药，使用方便，可抑制癌细胞中HEF1的表达，从而抑制癌细胞的迁移、侵袭与转移。

【附图说明】

图1为本发明MTT实验中不同浓度芹菜素对肠癌细胞细胞活力影响图；

图2为本发明明MTT实验中不同浓度芹菜素对肠癌细胞SW480细胞活影响图；

图3为本发明Western blot实验中芹菜素特异性的抑制HEF1分子的表达图；

图4为本发明伤口愈合实验中影像图；

图5为本发明伤口愈合实验中数据图；

图6为本发明Transwell细胞体外侵袭实验中影像图；

图7为本发明Transwell细胞体外侵袭实验中数据图。

【具体实施方式】

对本发明的目的、功能及技术手段有进一步的了解，现结合以下实验对本发明进行详细解释说明，癌细胞的迁移和侵袭是癌细胞转移的重要步骤，以下通过实验对芹菜素在抑制癌细胞的迁移和侵袭进行评估，所述实验采用含5％的DMSO生理盐水溶液稀释芹菜素至30-200uM(细胞中使用的浓度)，以下简称芹菜素。

1、通过MTT实验确定芹菜素作用浓度:

本实验选用结肠癌细胞DLD1及SW480。

实验步骤：

1)、收集对数期细胞，加入100uL适宜浓度的对数期细胞；当细胞单层培养至铺满孔底,加入浓度梯度的芹菜素,细胞贴壁后即可加药,设置4个梯度,每孔100uL芹菜素,并设4个重复孔；

2)、恒温培养箱内培养24h，用倒置显微镜观察细胞状态；

3)、每孔加入10uL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，培养4h，培养完毕，吸除培养液；

4)、每孔中加入100uL DMSO，于恒温摇床上低速振荡十分钟左右，使甲瓒充分溶解，于490nm处检测OD值；

5)、设置调零孔(10uL MTT、100uL二甲基亚砜、100uL培养基)，对照孔(细胞、100uL培养液、10uL MTT、100uL二甲基亚砜)。

经过MTT实验获得不同浓度芹菜素对结肠癌细胞DLD1及SW480活力的影响，如图1及图2。

由图1和图2可知当芹菜素浓度为40uM及以下浓度时对细胞活力的影响并不显著，60uM时细胞活力明显下降。由此可得：进行细胞的迁移及侵袭实验时，芹菜素浓度无需高于40uM，否则结果不可靠。

2、下面通过Western blot实验、伤口愈合实验、Transwell细胞体外侵袭实验对芹菜素靶向HEF1对结肠癌细胞迁移和侵袭进行解释说明。

2.1Western blot实验：

a实验材料：结肠癌细胞、芹菜素、彩色预染蛋白质分子量标准、双蒸水、2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE Sample loading buffer)、30％Acrylamide、1.5M Tris-Hcl(PH8.8)、1.5M Tris-Hcl(PH6.8)、10％SDS、10％AP(过硫酸铵)、TEMED、TBS粉末、Tween20、10×Tris-Gly电泳缓冲液(Tris：30g，Gly：144g，SDS：10g，加双蒸水至1000ml,溶解后室温保存，用时稀释成1×使用)、10×电泳转移缓冲液(Tris：30g，Gly：144g，加双蒸水至1000ml，用时稀释成1×，并加入20％的甲醇)、TBS缓冲液(在TBS粉末中加入规定体积的双蒸水)、TBST(在1×TBS缓冲液中加0.1％的Tween20)、甲醇、丽春红、脱脂牛奶、PVDF膜、滤纸、海绵、滚筒、丽春红染液(10×贮存液：丽春红2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加水至100ml，此染液室温保存，可反复回收利用)、封闭液(5％的脱脂牛奶，用TBST稀释)、一抗稀释液(5％的BSA+0.02％NaN3,用TBS稀释)、二抗稀释液(5％的脱脂奶粉，用TBST稀释)、曝光液(ECL)。

b实验器材：移液枪、电泳槽、玻璃板、BIO-RAD电泳仪、层析实验冷柜、定轨摇床/ORBITAL SHAKER(TS-2)、恒温摇床(QYC-200)、三维摇床(SK-D3309-Pro)、钳子、水浴锅

c实验过程：

1)芹菜素处理对结肠癌细胞

对结肠癌细胞(以下简称细胞)进行芹菜素(以下简称APG)浓度梯度处理。共设置五组，分别为：ct、20uM APG、40uM APG、60uM APG、100uM APG，处理24小时以及ct、2h、6h、12h、24h，40uM APG处理后，准备提取蛋白。

2)蛋白的提取

准备冰，所有步骤于冰上进行；室温溶解Western及IP裂解液；对于贴壁细胞，去除培养基，用预冷的PBS清洗两三遍；按照六孔板每空加入100ul裂解液的比例加入western及IP裂解液(用前加1mM的PMSF)，枪吹打数次使裂解液与细胞充分接触；冰上裂解10min后，用细胞刮刮下所有细胞，装入EP管；冰上裂解10-20min后，于冷冻离心机上12000rpm离心12min；取上清于新的离心管，进行之后的浓度测定。

3)BCA法测蛋白浓度

根据样品孔多少，按50:1的配比混匀BCA试剂A和BCA试剂B，作为BCA工作液，充分混匀。室温24小时内稳定；完全溶解蛋白标准品，取10ul用无菌水稀释至100ul,即终浓度为0.5mg/ml；将标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20ul依次加到96孔板的标准品孔中，加无菌水补足到20ul；加适量体积(2ul)的样品到96孔板的样品孔中，加无菌水补足到20ul；各孔加入200ul的BCA工作液，37℃放置30min；如果蛋白浓度较低，适合在较高温度下孵育，或延长孵育时间；在562nm处测定OD值，计算标准曲线，得出样品浓度。

4)Western blot:

4-1蛋白定量：根据标准曲线，算出细胞蛋白浓度,即ct、20uM APG、40uM APG、60uM APG、100uM APG五组以及时间梯度ct、2h、6h、12h、24h(40uM APG处理)五组；按照同等体积在上样蛋白中加入蛋白上样缓冲液(2X)，混匀蛋白样品与上样缓冲液(2X)；100℃或沸水浴加热3-5min,以充分变性蛋白，冷却至室温即可上样。

4-2制胶与上样：将清洗风干后的玻璃板装好，检漏；按说明书选择合适浓度的分离胶浓度，本实验选择的为10％的分离胶，最后加入AP、TEMED，摇匀后灌胶，避免产生气泡。然后用异丙醇封胶，速度不要太快，避免胶变形。30min左右，等分离胶凝好，倒去上层异丙醇，并放置一会儿使异丙醇完全挥发；配置浓缩胶，最后加入AP、TEMED，摇匀后灌胶。将剩余空间灌满，插入梳子，插梳子时先插一边再插另一边。胶凝固后(约40min),将玻璃板装入电泳槽，加入电泳缓冲液，轻轻拔出梳子准备上样；上样：在上样孔中，依次加入3ul maker，样品组蛋白(ct、20uM APG、40uM APG、60uM APG、100uM APG以及ct、2h、6h、12h、24h(40uM APG处理))，各20ul，上样时注意勿使样品溢出。

4-3电泳：电泳液加至漫过低的玻璃板，先在恒压80V的情况下，跑电泳约30min,所有样品处于同一水平线上；然后换成恒压120V，再跑1h左右，至溴酚蓝指示剂跑到胶底，即可停止电泳。

4-4转膜:用甲醇活化PVDF膜3-5min，海绵及滤纸在电转液中浸润15-20min；轻轻撬开玻璃板，切去浓缩胶部分，调整胶的大小，快速处理完毕后放入电转液中浸润；将黑板至于下方，依次放置海绵1层，滤纸两层，胶，膜一层，滤纸两层，海绵一层，每加一层都需赶走气泡，最后将白板和黑板夹住；放入电泳槽，对好电极，加入电转液，在层析冷柜中电泳，300-500mA,转膜100min。

4-5封闭:取出膜于ddH2O中清洗，丽春红染液染色3-5min(摇床上)；染色完毕后，回收丽春红染色，用ddH₂O洗去未染上的丽春红；按照不同的分子量切割PVDF膜，切割时一定注意保持膜的湿润；切割完毕，将膜至于封闭液中，摇床上封闭1h。

4-6一抗孵育:从封闭液中取出膜于1×TBST中清洗，清洗3次、每次5min；一抗按规定比例稀释后，4℃孵育过夜。

4-7二抗孵育:回收一抗，用TBST洗膜，清洗3次、每次5min；二抗按规定比例稀释后，室温摇床1h；二抗孵育完毕后，用TBST洗膜，清洗3次、每次5min。

4-8显影(ECL显色液)获得图3。

实验结果：图3A对正常结肠细胞细胞株CRL1807和3株结肠癌细胞SW480、DLD1、HCT116、进行了比较，经过比较发现在CRL1807和侵袭性较弱的HCT116(β-Catenin-/-)细胞株中HEF1水平很低，属正常状态，而两株侵袭性较强的结肠癌细胞SW480和DLD1((均为APC-/-和p53-/-)显示异常高的HEF1表达水平。由图3B可知菜素能够使HEF1分子不稳定化，特异性的促进HEF1分子的降解，即特异性得抑制HEF1的表达。由图3C可知无论是内源性的HEF1分子，还是人工过表达产生的HEF1分子都能够被芹菜素降解。

2.2伤口愈合实验：

本实验选用结肠癌细胞SW480(以下简称细胞)进行实验，通过加入不同浓度的芹菜素来观察伤口愈合率如何变化，来确定芹菜素对癌细胞迁移是否有作用。

a实验材料：芹菜素(APG)、秋水仙素、二甲基亚砜、无血清培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)。

b实验器材：移液枪、20cm直尺、水套式二氧化碳培养箱。

c实验原理：在单层培养细胞间制作一条划痕作为愈伤区域，然后观察该区域周围细胞向划痕迁移的现象，称为伤口愈合。

d实验过程：当细胞长至6cm培养皿的80％左右，换成无血清培养基(3mL)并加入3ul1mg/ml的秋水仙素；处理6小时之后，进行划痕：用1ml的移液枪枪头在单层细胞间尽量沿直径划痕，可用灭过菌的直尺作为辅助划痕，枪头尽量与平皿的底部垂直；划痕后用PBS清洗两遍，然后加入无血清培养基(3mL)、秋水仙素(3uL)；并在每盘中加入不同浓度的芹菜素，设置的浓度梯度为：对照组(ct)、10uM APG、20uM APG、30uM APG。分别在作用0h、24h、48h时进行细胞图像采集。

在伤口愈合实验中，以0h为对照，未加芹菜素的对照组，实验结果如图4及图5所示，由图可知培养24h时愈合率为42.5％，到48h时愈合率达80％，接近完全愈合，愈合率高。而处理组(20uM APG)培养24h后，愈合率仅为20％，48h后愈合率也仅为35％，愈合率很低(Fig2A、Fig2B)。实验数据可以得出，芹菜素抑制了结肠癌细胞SW480的迁移。

2.3Transwell细胞体外侵袭实验：

本实验实验对象是具有侵袭能力的细胞，用不同芹菜素浓度梯度研究芹菜素是否对SW480的侵袭具有抑制作用。在本实验中Transwell小室上室种癌细胞SW480，下室加入FBS及不同浓度的芹菜素，SW480细胞会向营养成分高的下室跑。侵袭实验时聚碳酸酯膜上室侧需铺满一层基质胶，用以模拟体内细胞外基质，SW480在进入下室前，必须分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解，才能通过膜进入下室。计数进入下室的细胞量可反映结肠癌细胞SW480的侵袭能力。

a实验材料：芹菜素、无血清培养基、牛血清白蛋白(BSA)、人工重构基底膜材料Matrigel、磷酸盐缓冲液、结晶紫。

b实验器材：Transwell小室、24孔板、移液枪、显微镜。

c实验步骤：

1)transwell小室制备：将小室放入培养板中，在上室加入300μl预热的无血清培养基，常温下静置20min，使基质胶再水化，再吸去剩余培养液。

2)制备细胞悬液：制备前可先让细胞饥饿过夜，去除血清的影响；消化细胞，终止消化后2000rpm,2min离心；弃上清液，用PBS洗2遍；然后用含BSA的培养基重悬，调整细胞密度至1-10×10⁵。

3)接种细胞：取细胞悬液150μL加入Transwell小室，不同公司的Transwell小室要求加入的细胞悬液量可能不同可参考说明书，24孔板小室一般200μL，24孔板下室一般加入500μL含FBS培养基，并设置芹菜素浓度梯度；需要特别注意的是，不要让下层培养液与小室之间出现气泡，如有气泡要及时去除。

4)培养细胞：一般培养12－48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。

结果统计(检测穿过的细胞数)采用直接计数法(取5个视野计数细胞个数。)：细胞穿过膜后，并未掉入下室培养液中，而是附着在膜的下室侧。给细胞染色处理后，可直接在显微镜下计数细胞，用棉签擦掉基质胶和上室内细胞；结晶紫染色；染色完毕可进行细胞计数：使用显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室底反过来就可清晰看出侵袭进入下室侧的附着细胞。也可用手术刀将膜切下再进行染色，置于玻片上，滴加二甲苯，盖上盖玻片，可长期保存。

经过本实验获得图6及图7，由图可知，Transwell侵袭实验中，以对照组24h时的细胞侵袭率为单位1，处理组(20uM APG)24h时的侵袭率仅为0.33；48h后，对照组的侵袭率达到1.5,而处理组的侵袭率仅为0.5。由以上实验数据可以得出，芹菜素抑制了结肠癌细胞SW480的侵袭。

需要说明的是，尽管本发明已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.芹菜素用于在制备抑制支架蛋白表达及癌细胞转移的药物中的应用。