CN106580925B - 一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106580925B
CN106580925B CN201611194345.0A CN201611194345A CN106580925B CN 106580925 B CN106580925 B CN 106580925B CN 201611194345 A CN201611194345 A CN 201611194345A CN 106580925 B CN106580925 B CN 106580925B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
nanocapsule
rgd
lysine
mass concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611194345.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106580925A (zh
Inventor
张振中
张俊利
史进进
张红岭
岳娅乐
吴思璇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN201611194345.0A priority Critical patent/CN106580925B/zh
Publication of CN106580925A publication Critical patent/CN106580925A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106580925B publication Critical patent/CN106580925B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5015—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5089—Processes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤治疗药物的问题；技术方案是：培养市售人正常乳腺细胞，取200‑250ml传代培养液离心弃上清，加入生理盐水1.5‑3.5ml，混匀过滤，加入质量浓度5mg/ml的RGD‑赖氨酸‑（十八碳烷酸）2溶液80‑120μl，混匀，在37℃下孵育2‑4h，用PBS缓冲液透析除去游离的RGD‑赖氨酸‑（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体；本发明制备的仿生细胞纳米囊结合了细胞与纳米载体的双重优势，制备简便、免疫效应低，具有良好的生物相容性、可降解性、长循环特性、靶向性，提高药物的生物利用率。

Description

一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及化工与医药领域，特别是一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病。目前对恶性肿瘤的三大主要治疗手段是外科手术、化学治疗和放射治疗。应用以细胞毒为主的抗肿瘤药进行化学治疗仍然是肿瘤综合治疗的重要手段。但是小分子药物半衰期短，为了达到治疗效果需要频繁给药，而且小分子药物对肿瘤细胞的选择性低，在损伤肿瘤细胞的同时，对正常的组织细胞也有一定程度的损伤。此外，在化疗过程中肿瘤细胞也会对药物产生耐药性，导致治疗效果大打折扣。
针对直接给药方式存在的严重不足，药物载体成为热点被广泛研究。其中备受关注的一类载体是纳米给药系统。纳米给药系统是纳米技术在医学领域的应用成果，是指粒子直径在10～1000nm之间的给药系统，这种药物传递系统能够增强药效、降低药物毒性以及改变药物的体内过程，进而实现药物的特异靶向性和药物的释放可控性。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤治疗药物的问题。
本发明解决的技术方案是：（1）乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞（Hs578Bst，细胞购自北京北纳创联生物技术研究院）在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次，具体细胞传代培养步骤如下：①将购买的装在细胞培养瓶中的人正常乳腺细胞弃去原培养基，每次用5ml pH6.5-7.5PBS缓冲液冲洗三遍；②加入胰蛋白酶2ml，在37℃培养箱中放置1.5-2min，然后在倒置显微镜下观察，待细胞退缩变圆，立即加入5ml培养基；③用5ml移液枪轻柔吹打，并按照从左至右或从右至左，从上到下的规则吹打；④将吹打下来的细胞放入10ml离心管中，在转速为1000r条件下离心5min；⑤弃去上清液，加入2-4ml培养基轻轻吹打，细胞悬浮后，将细胞悬液分装至2-3瓶新的传代培养瓶中，每瓶加入培养基10-12ml，混匀，放入37℃，气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，得传代培养液；
（2）制备仿生细胞纳米囊：取200-250ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水1.5-3.5ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3）配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液80-120μl，混匀，在37℃下孵育2-4h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用150-250ml pH6.5-7.5的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
所述方法制备的仿生细胞纳米囊载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明制备的仿生细胞纳米囊结合了细胞与纳米载体的双重优势，制备简便、免疫效应低，具有良好的生物相容性、可降解性、长循环特性、 靶向性等优势，可以提高药物的生物利用率；以所述仿生纳米囊为载体的载药纳米囊，在体内可实现药物的缓慢释放，长时间维持药效，提高药物的生物利用率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时，由以下步骤实现：
（1）乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞（Hs578Bst，细胞购自北京北纳创联生物技术研究院）在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次，具体细胞传代培养步骤如下：①将购买的装在细胞培养瓶中的人正常乳腺细胞弃去原培养基，每次用5ml pH6.5PBS缓冲液冲洗三遍；②加入胰蛋白酶2ml，在37℃培养箱中放置1.5min，然后在倒置显微镜下观察，待细胞退缩变圆，立即加入5ml培养基；③用5ml移液枪轻柔吹打，并按照从左至右或从右至左，从上到下的规则吹打；④将吹打下来的细胞放入10ml离心管中，在转速为1000r条件下离心5min；⑤弃去上清液，加入2ml培养基轻轻吹打，细胞悬浮后，将细胞悬液分装至2瓶新的传代培养瓶中，每瓶加入培养基10ml，混匀，放入37℃，气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，得传代培养液；
（2）制备仿生细胞纳米囊：取200ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水1.5ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3）配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液80μl，混匀，在37℃下孵育2h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用150ml pH6.5的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
实施例2
本发明在具体实施时，由以下步骤实现：
（1）乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞（Hs578Bst，细胞购自北京北纳创联生物技术研究院）在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次，具体细胞传代培养步骤如下：①将购买的装在细胞培养瓶中的人正常乳腺细胞弃去原培养基，每次用5ml pH7.5PBS缓冲液冲洗三遍；②加入胰蛋白酶2ml，在37℃培养箱中放置2min，然后在倒置显微镜下观察，待细胞退缩变圆，立即加入5ml培养基；③用5ml移液枪轻柔吹打，并按照从左至右或从右至左，从上到下的规则吹打；④将吹打下来的细胞放入10ml离心管中，在转速为1000r条件下离心5min；⑤弃去上清液，加入4ml培养基轻轻吹打，细胞悬浮后，将细胞悬液分装至3瓶新的传代培养瓶中，每瓶加入培养基12ml，混匀，放入37℃，气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，得传代培养液；
（2）制备仿生细胞纳米囊：取250ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水3.5ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3）配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液120μl，混匀，在37℃下孵育4h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用250ml pH7.5的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
实施例3
本发明在具体实施时，由以下步骤实现：
（1） 乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞（Hs578Bst，细胞购自北京北纳创联生物技术研究院）在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次，具体细胞传代培养步骤如下：①将购买的装在细胞培养瓶中的人正常乳腺细胞弃去原培养基，每次用5ml pH7.0PBS缓冲液冲洗三遍；②加入胰蛋白酶2ml，在37℃培养箱中放置2min，然后在倒置显微镜下观察，待细胞退缩变圆，立即加入5ml培养基；③用5ml移液枪轻柔吹打，并按照从左至右或从右至左，从上到下的规则吹打；④将吹打下来的细胞放入10ml离心管中，在转速为1000r条件下离心5min；⑤弃去上清液，加入3ml培养基轻轻吹打，细胞悬浮后，将细胞悬液分装至3瓶新的传代培养瓶中，每瓶加入培养基11ml，混匀，放入37℃，气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，得传代培养液；
（2）制备仿生细胞纳米囊：取220ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水2ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3）配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液100μl，混匀，在37℃下孵育3h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用200ml pH7.0的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
本发明提供了一种生物来源的细胞纳米囊，并提供了所述细胞压制纳米囊的制备方法。本发明提供的仿生细胞纳米囊结合了细胞与纳米载体的双重优势，制备简便、免疫效应低，具有良好的生物相容性、可降解性、长循环特性、 靶向性等优势，可以提高药物的生物利用率。经多次反复试验取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：
实验1 仿生细胞纳米囊-RGD/IR783的制备及形态观察
（1）在培养箱中培养人正常乳腺细胞（Hs578Bst，细胞购自北京北纳创联生物技术研究院），培养箱的条件设置为37℃、5%CO2，所用的培养基为含10%的胎牛血清、1%青链霉素混合液的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代一次；具体细胞传代培养步骤如下：①将购买的装在细胞培养瓶中的人正常乳腺细胞弃去原培养基，每次用5ml pH6.5-7.5PBS缓冲液冲洗三遍；②加入胰蛋白酶2ml，在37℃培养箱中放置1.5-2min，然后在倒置显微镜下观察，待细胞退缩变圆，立即加入5ml培养基；③用5ml移液枪轻柔吹打，并按照从左至右或从右至左，从上到下的规则吹打；④将吹打下来的细胞放入10ml离心管中，在转速为1000r条件下离心5min；⑤弃去上清液，加入2-4ml培养基轻轻吹打，细胞悬浮后，将细胞悬液分装至2-3瓶新的传代培养瓶中，每瓶加入培养基10-12ml，混匀，放入37℃，气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，得传代培养液；
（2）近红外荧光染料IR783溶液的配制：称取1mg IR783，加生理盐水溶解，转移至1ml容量瓶中，加生理盐水稀释至刻度，混匀，即得500μg/ml的IR783溶液；
（3）制备包载有IR783的仿生细胞纳米囊：取225ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入500μg/ml的IR783溶液2ml，混匀，使用脂质体挤出器依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得到包载有IR783的仿生细胞纳米囊；
（4）配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（5）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（3）所得包载有IR783的仿生细胞纳米囊中加入步骤（4）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液100μl，混匀，在37℃下孵育3h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用200ml pH7.0的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得包载有IR783的仿生细胞纳米囊载体；
（6）取包载有IR783的仿生细胞纳米囊载体，滴于铜网表面，待样品挥干后置于透射电子显微镜下观察仿生细胞纳米囊的形态并拍摄形貌图。实验结果表明，RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2的仿生细胞纳米囊呈球形形态，粒径分布在50—60nm。
实验2
一、S180荷瘤小鼠模型的建立
取健康昆明小鼠（购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK（豫）2015-0004），将100μl S180腹水瘤细胞混悬液接种到小鼠右前肢的腋下皮肤下，并且定期用游标卡尺测量其肿瘤的长径（A）与短径（B），按下述公式计算肿瘤体积：
当按照上述公式计算得到昆明小鼠的瘤体积≥100mm3时，则认为S180荷瘤小鼠模型构建成功，可应用于以后各项实验。
二、仿生细胞纳米囊-RGD/IR783在小鼠各组织器官中的分布
（1）随机取两只S180荷瘤小鼠，禁食12h，自由饮水；
（2）通过尾静脉注射将0.2ml近红外荧光染料IR783溶液注射进一只荷瘤小鼠体内作为对照组，同法将0.2ml仿生细胞纳米囊/IR783溶液注射进另一只荷瘤小鼠体内作为实验组；
（3）将50μl水合氯醛溶液（10%）注射进小鼠腹腔内将其麻醉，然后将其四肢展开进行固定；
（4）分别在注射后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h用小动物活体成像系统采集两只荷瘤小鼠的近红外光成像图，记录IR783/RGD-仿生细胞纳米囊组、IR783组在荷瘤小鼠体内各组织器官中的分布情况，实验结果表明IR783组注射后的0.25h到12h，荷瘤小鼠的肿瘤组织几乎没有近红外光信号，但其肾脏的近红外光信号很强，到24h时小鼠体内IR783基本代谢完全；而IR783/RGD-仿生细胞纳米囊组在注射后的0.5h到12h，荷瘤小鼠肿瘤组织始终保持非常强的荧光，到24h时肿瘤组织荧光强度减弱。结果表明，由于肿瘤组织的EPR效应，纳米级IR783/RGD-仿生细胞纳米囊在肿瘤组织蓄积，且不易被清除出体外，实现了长循环，该给药系统可将更多药物递送到肿瘤组织；而游离IR783随血液主要富集在肝脏、肾脏中，而被清除出体外。IR783/RGD-仿生细胞纳米囊将更多药物递送到肿瘤组织，增强药物的治疗效果，减轻药物的全身毒副作用，以达到最佳治疗效果。
本发明具有以下突出优点：
1. 本发明仿生细胞纳米囊结合了细胞与纳米载体的双重优势，既保留了细胞的生物相容性、长循环特性等优势， 又兼具纳米粒子的靶向性等特点，开发出了基于仿生细胞的纳米药物递送系统， 并探索其在抗肿瘤等方面的治疗价值。
2. 本发明仿生细胞纳米囊载体来源于细胞，具有降解不会产生有毒或有害物质、无免疫原性、半衰期长、具有较大的比表面积等许多良好的特性。除此之外，其还具备纳米粒子的靶向性、缓释性等优势。
3. 本发明仿生细胞纳米囊载体可以增加药物的稳定性，使药物缓慢持续释放。仿生细胞纳米囊载体包裹在小分子药物表面起到屏障作用， 可以使药物缓慢持续释放，延长药物有效作用时间，提高药物疗效。

Claims (5)

1.一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次，细胞传代培养方法是：①将购买的装在细胞培养瓶中的人正常乳腺细胞弃去原培养基，每次用5ml pH6.5-7.5PBS缓冲液冲洗三遍；②加入胰蛋白酶2ml，在37℃培养箱中放置1.5-2min，然后在倒置显微镜下观察，待细胞退缩变圆，立即加入5ml培养基；③用5ml移液枪轻柔吹打，并按照从左至右或从右至左，从上到下的规则吹打；④将吹打下来的细胞放入10ml离心管中，在转速为1000r条件下离心5min；⑤弃去上清液，加入2-4ml培养基轻轻吹打，细胞悬浮后，将细胞悬液分装至2-3瓶新的传代培养瓶中，每瓶加入培养基10-12ml，混匀，放入37℃，气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，得传代培养液；
（2） 制备仿生细胞纳米囊：取200-250ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水1.5-3.5ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3） 配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液80-120μl，混匀，在37℃下孵育2-4h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用150-250ml pH6.5-7.5的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
2.根据权利要求1所述仿生细胞纳米囊载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1） 乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次；
（2） 制备仿生细胞纳米囊：制备仿生细胞纳米囊：取200ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水1.5ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3） 配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液80μl，混匀，在37℃下孵育2h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用150ml pH6.5的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
3.根据权利要求1所述仿生细胞纳米囊载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次；
（2）制备仿生细胞纳米囊：取250ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水3.5ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3）配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液120μl，混匀，在37℃下孵育4h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用250ml pH7.5的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
4.根据权利要求1所述仿生细胞纳米囊载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）乳腺细胞培养：将市售人正常乳腺细胞在温度37℃、气体体积浓度为5%CO2，饱和湿度下置于培养基中进行培养，所用的培养基为含质量浓度10%胎牛血清、质量浓度1%青链霉素的RPMI Medium1640培养基，每3天对细胞传代培养一次；
（2）制备仿生细胞纳米囊：取220ml传代培养液离心后弃去上清液，得对数生长期的人正常乳腺细胞，加入生理盐水2ml，混匀，依次过0.5μm滤膜20次、0.05μm滤膜20次，得仿生细胞纳米囊；
（3）配制质量浓度为5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液：称取RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2 固体5mg，加水1ml混匀，即得5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液，所述RGD为氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽；
（4）仿生细胞纳米囊载体的制备：在步骤（2）所得仿生细胞纳米囊中加入步骤（3）制备的质量浓度5mg/ml的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2溶液100μl，混匀，在37℃下孵育3h，装入截留分子量为3500的透析袋中，用200ml pH7.0的PBS缓冲液透析除去游离的RGD-赖氨酸-（十八碳烷酸）2，即得仿生细胞纳米囊载体。
5.权利要求1～4任何一项所述方法制备的仿生细胞纳米囊载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
CN201611194345.0A 2016-12-21 2016-12-21 一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用 Active CN106580925B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611194345.0A CN106580925B (zh) 2016-12-21 2016-12-21 一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611194345.0A CN106580925B (zh) 2016-12-21 2016-12-21 一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106580925A CN106580925A (zh) 2017-04-26
CN106580925B true CN106580925B (zh) 2019-02-22

Family

ID=58602463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611194345.0A Active CN106580925B (zh) 2016-12-21 2016-12-21 一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106580925B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101401792A (zh) * 2008-09-01 2009-04-08 中国人民解放军第二军医大学 一种纳米囊及纳米囊复合微球的制备方法
CN103006491A (zh) * 2011-09-23 2013-04-03 深圳市金因生物技术有限公司 一种祛除生长纹的生物护肤制品及其制备方法
CN103212065A (zh) * 2013-04-02 2013-07-24 武汉理工大学 一种脲酶纳米反应器及其制备方法
CN105902517A (zh) * 2016-05-31 2016-08-31 华南理工大学 一种硫化铜纳米囊颗粒的制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101401792A (zh) * 2008-09-01 2009-04-08 中国人民解放军第二军医大学 一种纳米囊及纳米囊复合微球的制备方法
CN101401792B (zh) * 2008-09-01 2010-12-01 中国人民解放军第二军医大学 一种纳米囊及纳米囊复合微球的制备方法
CN103006491A (zh) * 2011-09-23 2013-04-03 深圳市金因生物技术有限公司 一种祛除生长纹的生物护肤制品及其制备方法
CN103212065A (zh) * 2013-04-02 2013-07-24 武汉理工大学 一种脲酶纳米反应器及其制备方法
CN105902517A (zh) * 2016-05-31 2016-08-31 华南理工大学 一种硫化铜纳米囊颗粒的制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
新型抗菌纳米复合HA-Gel骨修复材料的仿生合成及细胞相容性研究;窦晓晨等;《上海口腔医学》;20100630;第19卷(第3期);文章摘要，第285页左栏第1段至第287页右栏最后一段

Also Published As

Publication number Publication date
CN106580925A (zh) 2017-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104225609B (zh) 一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用
CN107802646A (zh) 一种肿瘤治疗药物
CN113456613B (zh) 一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构建及其应用
CN108066317B (zh) 纳米药物控释体系的制备方法及其产品与应用
CN106137967A (zh) 靶向脑胶质瘤的双重修饰脂质体给药系统的制备和应用
CN110408047A (zh) 纳米配位聚合物及其制备方法和应用
CN113952461B (zh) 一种仿中性粒细胞纳米递药系统及其制备方法和应用
CN108653733A (zh) 具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡与制备
CN113633625B (zh) 一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法
CN111346070A (zh) 一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂及其在制药中的用途
CN112516109A (zh) 一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒及其制备方法
CN110025593A (zh) 细胞微囊、载有抗癌药物的细胞微囊、其制备方法和应用
CN110960688A (zh) 用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统及制备方法
CN104208704B (zh) 一种pH敏感的碳纳米管靶向递药体系的制备方法
Liu et al. Self-delivery nanomedicine for vascular disruption-supplemented chemo-photodynamic tumor therapy
CN105477633A (zh) 一种竹红菌素阳离子脂质体制剂及其制备方法与应用
CN108653743A (zh) 一种心脑双靶向脂质体及其制备方法和应用
CN108143719A (zh) 一种携载多肽的纳米脂质体及其制备方法和应用
CN108186571A (zh) 可逆交联不对称囊泡在制备治疗急性白血病药物中的应用
CN106606783B (zh) 一种靶向共递释光敏剂与化疗药物的药物递释系统
CN106580925B (zh) 一种仿生细胞纳米囊载体的制备方法及其应用
CN105997892A (zh) 一种微球生物新材料包裹sod活性药物载体制备方法
CN105770912A (zh) 具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药atp敏感脂质体及其制备方法
CN113456587B (zh) 一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用
Wang et al. Preparation and preliminary evaluation of hepatitis B core antigen virus like nanoparticles loaded with indocyanine green

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant