CN103212065A - 一种脲酶纳米反应器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种脲酶纳米反应器，其有效组成为紫外光引发叠氮基交联的羧甲基壳聚糖衍生物和脲酶，其制备方法是：在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶，按照羧甲基壳聚糖的结构单元与4-叠氮苯甲醛的摩尔比为1：（0.1～10），将4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液加入到含酶羧甲基壳聚糖的水溶液中，于常温下避光搅拌，得可光交联的羧甲基壳聚糖两亲性聚合物，在自组装成空心纳米囊的同时，对脲酶实现原位封装；然后该纳米囊溶液经紫外光引发壳中叠氮基交联，得到酶包囊的生物纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器。本发明中脲酶纳米反应器的制备方法简便，具有较好的稳定性和半透性，这种类似细胞膜的特性使其在仿生纳米器件等应用领域显示出强烈的诱人潜力。

Description

一种脲酶纳米反应器及其制备方法

技术领域

本发明涉及仿生材料领域，特别是一种脲酶纳米反应器及其制备方法。

背景技术

酶纳米反应器是一类具有仿生细胞结构及酶代谢功能的纳米反应系统。它是将酶包封在特定结构的纳米级聚合物中，该聚合物具有空心囊结构，其外层壳类似细胞膜，可允许某些小分子（如酶底物）的自由透过，但却可避免包裹的大分子（如酶和基因等）向外泄露，也可阻止环境中的活性大分子（如酶等）向内渗透。它不仅可用于病人体内某种酶缺失的替补治疗，还可用于体内毒物的催化代谢，从而延长病人的生存期。这些特性使得酶纳米反应器在仿生材料和生物医学领域显示出广泛的应用潜能。鉴于脲酶能高度专一性地催化人体体内的尿素水解生成氨和二氧化碳，并能用于清除慢性肾衰竭病患者体内血液中过量的尿素，故构造脲酶纳米反应器可以起到模拟“人造肾”作用。

脂质体和聚质体纳米囊由于它们具有类似于细胞膜的双分子层结构，因而常被用作酶纳米反应器。但前者稳定性差，包囊的酶容易泄露；后者虽然具有较高的稳定性，但其双层膜中疏水链段形成的疏水层较厚，不利于亲水性小分子（如酶的底物及产物）自由透过。空心构造的壳交联纳米凝胶囊或纳米笼是一类由亲水性聚合物交联网络构成的中空纳米球，其在水溶液中有更大的溶胀体积或直径。这种独特的构造赋予其形态较高的体内外稳定性和较大的内腔空间，有利于包囊酶在体循环过程中的生物活性，网络的完全亲水性也有利于环境中亲水性小分子即酶的底物直接进入内腔发生酶催化反应，生成的产物也可透过网络回归到环境之中。因此，壳交联纳米凝胶囊特别适合用作酶纳米反应器。

壳聚糖(chitosan)是由几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，其化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。因其具有良好的生物相容性和生物可降解性，在医药、生化和生物医学工程等诸多领域备受关注，常用作药用载体材料。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖的一种水溶性衍生物，除具有良好的生物相容性和生物可降解性外，它还是一种两性聚电解质，其上的羧基可赋予羧甲基壳聚糖pH敏感性，是制备响应环境pH的酶纳米反应器的优良材料，但目前未见有关于用羧甲基壳聚糖制备酶纳米反应器的报道。

目前国内外有关酶纳米反应器的研究比较少，大多数包裹酶的载体材料为嵌段共聚物，其中最常用的是双亲性ABA型三嵌段共聚物聚甲基噁唑啉-聚二甲基硅油-聚甲基噁唑啉(PMOXA-PDMS-PMOXA)，它自组装成纳米粒子时其表面具有亲水性、生物相容性以及良好的力学性能和热稳定性，其内部空腔可以包裹亲水性底物，但需要在膜中镶嵌通道蛋白以利于底物的穿透。也有采用二嵌段共聚物来制备酶纳米反应器，如文献（Nano Letters，2005；1（5）：45-48）报道了采用聚丙烯酸酯与聚二甲基硅氧烷经紫外光诱导的自由基聚合反应制备酶纳米反应器，通过包裹过氧化物酶来催化氧化偶联反应。关于酶包裹的研究，只有少数几例报道酶是包裹在纳米反应器的水相中，包裹的酶主要为模仿体内细胞中的活性酶（如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等）和用于催化化学反应过程的酶（如乳糖酶，过氧化物酶等），如文献（Angewandte Chemie International Edition，2007；46：7378-7382）报道了通过聚苯乙烯与聚异氰基丙酰胺形成二嵌段共聚物，由于聚异氰基化合物的刚性和聚苯乙烯的柔性，使该嵌段共聚物形成聚合物囊泡结构，并包裹了南极假丝酵母脂肪酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；美国专利US2012/0148670公开了一种纳米反应器的制备方法，并可以包裹酶、药物、激素等，采用葫芦脲衍生物或复杂的平面分子通过均相聚合反应，以及采用葫芦脲衍生物或复杂的平面分子与其它活性化合物发生共聚反应来制备纳米反应器，包裹天冬酰胺酶、褐藻酸酶、过氧化物歧化酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或者是以上酶的任意组合。

上述方法制备酶纳米反应器的主要缺陷在于：

（1）采用上述方法制备的酶纳米反应器其组成材料大都没有生物可降解性，生物相容性差，不利于酶纳米反应器在体内的代谢，这使酶纳米反应器的应用受到了很大限制。

（2）采用上述方法制备的酶纳米反应器的制备过程都相当复杂（自由基聚合反应、均相聚合反应），且过程需要用到有机溶剂和苛刻的反应条件，不利于酶活性的保持。

（3）由于上述方法制备的酶纳米反应器大多利用双亲性嵌段共聚物在水溶液中自组装制备，其双层膜中疏水链段形成的疏水层较厚，不利于亲水性小分子（酶的底物）的渗透，在用作酶纳米反应器时需要在膜中插入通道蛋白。

（4）采用上述方法制备的酶纳米反应器，稳定性不高，在体内易过早崩解，造成酶泄露。

除制备方法外，酶纳米反应器需要解决的另一个关键问题是活性大分子酶的封装问题。由于受活性大分子酶稳定性及尺度等条件限制，纳米反应器包载活性酶存在一定难度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种新型的脲酶纳米反应器的制备方法，以解决现有技术存在的不足和缺陷。该方法制备的脲酶纳米反应器结构均匀，稳定性高，可实现在制备的同时完成对酶的原位封装，为新型酶纳米反应器在生物医学疾病治疗等方面的发展提供理论基础和技术支撑。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的脲酶纳米反应器，其有效组成为紫外光引发叠氮基交联的羧甲基壳聚糖衍生物和脲酶，该脲酶纳米反应器由以下方法制成：在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶得含酶羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖的结构单元与4-叠氮苯甲醛的摩尔比为1：（0.1～10），将4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液加入到羧甲基壳聚糖的水溶液中，于常温下避光搅拌混合均匀，生成可光交联的羧甲基壳聚糖两亲性聚合物，在自组装成空心纳米囊的同时，对脲酶实现原位封装；然后该纳米囊溶液经紫外光引发壳中叠氮基交联，得到所述酶包囊的生物纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器。

所述羧甲基壳聚糖水溶液的重量浓度可以为≤5%。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液可以是乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺单组份溶剂的溶液。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液可以是乙醇和丙酮组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比可以为任意比例。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液可以是乙醇和二甲基甲酰胺组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比可以为任意比例。

所述4-叠氮苯甲醛的重量浓度可以为1%～90%。

所述含酶羧甲基壳聚糖水溶液中脲酶的重量浓度可以为≤5%。

本发明提供的脲酶纳米反应器的制备方法，其步骤包括：

（1）羧甲基壳聚糖水溶液的制备：把羧甲基取代度为0.1～1.8的羧甲基壳聚糖加入到去离子水中，室温下搅拌使之溶解；

（2）可光交联的纳米酶包囊的制备：在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶得含酶羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖的结构单元与4-叠氮苯甲醛的摩尔比为1：（0.1～10），将4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液加入到羧甲基壳聚糖的水溶液中，于常温下避光搅拌混合均匀，生成可光交联的羧甲基壳聚糖两亲性聚合物，在自组装成空心纳米囊的同时，对脲酶实现原位封装，得到可光交联的纳米酶包囊；

（3）脲酶纳米反应器的制备：将可光交联的纳米酶包囊混合溶液经紫外光辐射引发叠氮基交联，获得原位包封酶的光交联纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器；所述的紫外光波长是190nm～400nm。

本发明采用生物可降解性和生物相容性良好的羧甲基壳聚糖与疏水性4-叠氮苯甲醛在室温下反应生成具有两亲性的可光交联的羧甲基壳聚糖，其在水溶液中自组装形成可光交联纳米囊，同时实现对脲酶的原位封装，经紫外光照射引发叠氮基交联制备脲酶纳米反应器，其与现有技术相比具有以下的主要优点：

（1）采用一锅法构建具有仿生细胞膜功能的壳交联纳米凝胶囊，制备过程简单，且无需加入表面活性剂和有毒的有机溶剂，也无需使用模板核等其它物质。

（2）特别适合脲酶等活性大分子的封装，酶包裹和囊组装同时完成，即只要在自组装前的水溶液中加入酶等活性大分子，就可以得到包囊酶的纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器。

（3）通过紫外光引发叠氮基交联，从而锁定脲酶纳米反应器的形态，而且获得的脲酶纳米反应器具有很好的稳定性。

（4）采用原位交联方式可实现酶的原位负载，而且由于整个交联过程可在室温或室温以下进行，壳交联反应迅速，非常有利于保持包囊酶的活性。

（5）酶纳米反应器表面带有羧基，因而具有pH敏感性，其负电荷可降低体内循环过程中蛋白质的调理性，延长循环时间。

（6）载体基质材料具有无毒和可生物降解性。

附图说明

图1为本发明制备的可光交联的纳米酶包囊的透射电镜图。

图2为本发明制备的光交联后的脲酶纳米反应器透射电镜图。

图3为本发明制备的脲酶纳米反应器在pH=7.4缓冲溶液中的荧光照片。

图4为本发明制备的脲酶纳米反应器在pH=4.0缓冲溶液中的荧光照片。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但并不局限于下面所述内容。

实施例1：脲酶纳米反应器

该脲酶纳米反应器有效组成为紫外光引发叠氮基交联的羧甲基壳聚糖衍生物和脲酶，该脲酶纳米反应器由以下方法制成：在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶得含酶羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖的结构单元与4-叠氮苯甲醛的摩尔比为1：（0.1～10），将4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液加入到羧甲基壳聚糖的水溶液中，于常温下避光搅拌混合均匀，生成可光交联的羧甲基壳聚糖两亲性聚合物，在自组装成空心纳米囊的同时，对脲酶实现原位封装；然后该纳米囊溶液经紫外光引发壳中叠氮基交联，得到所述酶包囊的生物纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器。

所述的羧甲基壳聚糖水溶液的重量浓度为≤5%。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺单组份溶剂的溶液。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇和丙酮组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比为任意比例。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇和二甲基甲酰胺组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比为任意比例。

所述4-叠氮苯甲醛的重量浓度为1%～90%。

所述含酶羧甲基壳聚糖水溶液中脲酶的重量浓度为≤5%。

本发明提供的脲酶纳米反应器，其制备方法包括以下步骤：

（1）羧甲基壳聚糖水溶液的制备：把羧甲基取代度为0.1～1.8的羧甲基壳聚糖加入到去离子水中，室温下搅拌使之溶解；

（2）可光交联的纳米酶包囊的制备：在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶得含酶羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖的结构单元与4-叠氮苯甲醛的摩尔比为1：（0.1～10），将4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液加入到羧甲基壳聚糖的水溶液中，于常温下避光搅拌混合均匀，生成可光交联的羧甲基壳聚糖两亲性聚合物，在自组装成空心纳米囊的同时，对脲酶实现原位封装，得到可光交联的纳米酶包囊；

（3）脲酶纳米反应器的制备：将可光交联的纳米酶包囊混合溶液经紫外光辐射引发叠氮基交联，获得原位包封酶的光交联纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器；所述的紫外光波长是190nm～400nm。

方法实施例1：

将羧甲基取代度为0.8的羧甲基壳聚糖溶于去离子水，制备重量百分比浓度为0.08%的羧甲基壳聚糖水溶液。在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶使其重量百分比浓度为0.5%，再按照羧甲基壳聚糖结构单元与4-叠氮苯甲醛摩尔比为1:1.2，向羧甲基壳聚糖水溶液中滴加4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液（4-叠氮苯甲醛与乙醇体积比为1:1），避光搅拌使其混合均匀，获得平均粒径为198nm可光交联的纳米酶包囊溶液（图1）。然后，该混合溶液经紫外灯光（20W，260nm）照射引发叠氮基交联、透析除去乙醇即得平均粒径为116nm的酶纳米反应器溶液（图2）。

调节溶液的pH=3.0，使酶纳米反应器从溶液中析出，用pH=3.0的缓冲溶液洗涤三次后，一部分分散于pH=7.4的缓冲溶液中，由于交联网络（羧基的Pka＜3.0）和脲酶（5.0＜等电点＜6.0）均带负电荷，二者相互排斥，酶均匀分布于腔内（见图3）；另一部分分散于pH=4.0的缓冲溶液中，交联网络和脲酶带有相反电荷，二者相互吸引，酶吸附于壳上，且体积缩小（见图4）。由于囊外未显示荧光，表明酶不会从囊内泄露出来。

取10ml浓度为0.20mg/ml上述酶纳米反应器缓冲溶液（pH=7.4）置于透析袋中，然后将透析袋分别浸入100ml浓度为0.01g/ml尿素及EDTA缓冲溶液（pH=7.4）中，2h后取少量透析袋外的溶液，采用纳氏试剂比色法（Nessler’s method）检测溶液中尿素水解产物氨的含量为0.278mol/L。以不含尿素且酶含量相同的溶液为空白对照组，按相同方法测定溶液中不含有氨。

方法实施例2：

将羧甲基取代度为1.0的羧甲基壳聚糖溶于去离子水，制备重量百分比浓度为0.05%的羧甲基壳聚糖水溶液。在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶使其重量百分比浓度为0.5%，再按照羧甲基壳聚糖结构单元与4-叠氮苯甲醛摩尔比为1:1.0，向羧甲基壳聚糖水溶液中滴加4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液（4-叠氮苯甲醛与乙醇体积比为1:1），避光搅拌使其混合均匀，获得平均粒径为228nm可光交联的纳米酶包囊溶液。然后，该混合溶液经紫外灯光（20W，260nm）照射引发叠氮基交联、透析除去乙醇即得平均粒径为145nm的酶纳米反应器溶液。

调节溶液的pH=3.0，使酶纳米反应器从溶液中析出，用pH=3.0的缓冲溶液洗涤三次后，取10ml浓度为0.20mg/ml上述酶纳米反应器缓冲溶液（pH=7.4）置于透析袋中，然后将透析袋浸入100ml浓度为0.01g/ml尿素及EDTA缓冲溶液（pH=7.4）中，2h后取少量透析袋外的溶液，采用纳氏试剂比色法（Nessler’s method）检测溶液中尿素水解产物氨的含量为0.281mol/L。以不含尿素且酶含量相同的溶液为空白对照组，按相同方法测定溶液中不含有氨。

方法实施例3：

将羧甲基取代度为1.2的羧甲基壳聚糖溶于去离子水，制备重量百分比浓度为0.05%的羧甲基壳聚糖水溶液。在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶使其重量百分比浓度为0.5%，再按照羧甲基壳聚糖结构单元与4-叠氮苯甲醛摩尔比为1:0.8，向羧甲基壳聚糖水溶液中滴加4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液（4-叠氮苯甲醛与乙醇体积比为1:1），避光搅拌使其混合均匀，获得平均粒径为246nm可光交联的纳米酶包囊溶液。然后，该混合溶液经紫外灯光（20W，260nm）照射引发叠氮基交联、透析除去乙醇即得平均粒径为165nm的酶纳米反应器溶液。

调节溶液的pH=3.0，使酶纳米反应器从溶液中析出，用pH=3.0的缓冲溶液洗涤三次后，取10ml浓度为0.20mg/ml上述酶纳米反应器缓冲溶液（pH=7.4）置于透析袋中，然后将透析袋浸入100ml浓度为0.01g/ml尿素及EDTA缓冲溶液（pH=7.4）中，2h后取少量透析袋外的溶液，采用纳氏试剂比色法（Nessler’s method）检测溶液中尿素水解产物氨的含量为0.288mol/L。以不含尿素且酶含量相同的溶液为空白对照组，按相同方法测定溶液中不含有氨。

方法实施例4：

将羧甲基取代度为1.0的羧甲基壳聚糖溶于去离子水，制备重量百分比浓度为0.08%的羧甲基壳聚糖水溶液。在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶使其重量百分比浓度为1%，再按照羧甲基壳聚糖结构单元与4-叠氮苯甲醛摩尔比为1:0.05，向羧甲基壳聚糖水溶液中滴加4-叠氮苯甲醛的二甲基甲酰胺溶液（4-叠氮苯甲醛与二甲基甲酰胺体积比为1:1），避光搅拌使其混合均匀，获得平均粒径为238nm可光交联的纳米酶包囊溶液。然后，该混合溶液经紫外灯光（20W，260nm）照射引发叠氮基交联、透析除去二甲基甲酰胺即得平均粒径为154nm的酶纳米反应器溶液。

调节溶液的pH=3.0，使酶纳米反应器从溶液中析出，用pH=3.0的缓冲溶液洗涤三次后，取10ml浓度为0.20mg/ml上述酶纳米反应器缓冲溶液（pH=7.4）置于透析袋中，然后将透析袋浸入100ml浓度为0.01g/ml尿素及EDTA缓冲溶液（pH=7.4）中，2h后取少量透析袋外的溶液，采用纳氏试剂比色法（Nessler’s method）检测溶液中尿素水解产物氨的含量为0.285mol/L。以不含尿素且酶含量相同的溶液为空白对照组，按相同方法测定溶液中不含有氨。

方法实施例5：

将羧甲基取代度为1.0的羧甲基壳聚糖溶于去离子水，制备重量百分比浓度为0.05%的羧甲基壳聚糖水溶液。在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶使其重量百分比浓度为1%，再按照羧甲基壳聚糖结构单元与4-叠氮苯甲醛摩尔比为1:0.8，向羧甲基壳聚糖水溶液中滴加4-叠氮苯甲醛的乙醇:丙酮（体积比1:1）溶液（4-叠氮苯甲醛与乙醇：丙酮溶液体积比为1:1），避光搅拌使其混合均匀，获得平均粒径为232nm可光交联的纳米酶包囊溶液。然后，该混合溶液经紫外灯光（20W，260nm）照射引发叠氮基交联、透析除去乙醇和丙酮即得平均粒径为149nm的酶纳米反应器溶液。

调节溶液的pH=3.0，使酶纳米反应器从溶液中析出，用pH=3.0的缓冲溶液洗涤三次后，取10ml浓度为0.20mg/ml上述酶纳米反应器缓冲溶液（pH=7.4）置于透析袋中，然后将透析袋浸入100ml浓度为0.01g/ml尿素及EDTA缓冲溶液（pH=7.4）中，2h后取少量透析袋外的溶液，采用纳氏试剂比色法（Nessler’s method）检测溶液中尿素水解产物氨的含量为0.290mol/L。以不含尿素且酶含量相同的溶液为空白对照组，按相同方法测定溶液中不含有氨。

本发明提供的脲酶纳米反应器的制备方法，还可以采用以下原料：

所述羧甲基壳聚糖水溶液的重量浓度为≤5％。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺单组份溶剂的溶液。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇和丙酮组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比为任意比例。

所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇和二甲基甲酰胺组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比为任意比例。

所述4-叠氮苯甲醛的重量浓度为1%～90%。

所述含酶羧甲基壳聚糖水溶液中脲酶的重量浓度为≤5%。

Claims (8)

1.一种脲酶纳米反应器，其特征是该脲酶纳米反应器有效组成为紫外光引发叠氮基交联的羧甲基壳聚糖衍生物和活性酶，该脲酶纳米反应器由以下方法制成：在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶得含酶羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖的结构单元与4-叠氮苯甲醛的摩尔比为1：（0.1～10），将4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液加入到羧甲基壳聚糖的水溶液中，于常温下避光搅拌混合均匀，生成可光交联的羧甲基壳聚糖两亲性聚合物，在自组装成空心纳米囊的同时，对脲酶实现原位封装；然后该纳米囊溶液经紫外光引发壳中叠氮基交联，得到所述酶包囊的生物纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器。

2.根据权利要求1所述的脲酶纳米反应器，其特征在于所述的羧甲基壳聚糖水溶液的重量浓度为≤5%。

3.根据权利要求1所述的脲酶纳米反应器，其特征在于所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺单组份溶剂的溶液。

4.根据权利要求1所述的脲酶纳米反应器，其特征在于所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇和丙酮组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比为任意比例。

5.根据权利要求1所述的脲酶纳米反应器，其特征在于所述4-叠氮苯甲醛的有机溶液是乙醇和二甲基甲酰胺组成的多组分溶剂的混合溶液，二者重量配比为任意比例。

6.根据权利要求1所述的脲酶纳米反应器，其特征在于所述4-叠氮苯甲醛的重量浓度为1%～90%。

7.根据权利要求1所述的脲酶纳米反应器，其特征在于所述含酶羧甲基壳聚糖水溶液中酶的重量浓度为≤5%。

8.一种脲酶纳米反应器的制备方法，其特征是采用以下方法制备脲酶纳米反应器，其步骤包括：

（1）羧甲基壳聚糖水溶液的制备：把羧甲基取代度为0.1～1.8的羧甲基壳聚糖加入到去离子水中，室温下搅拌使之溶解；

（2）可光交联的纳米酶包囊的制备：在羧甲基壳聚糖水溶液中加入脲酶得含酶羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖的结构单元与4-叠氮苯甲醛的摩尔比为1：（0.1～10），将4-叠氮苯甲醛的乙醇溶液加入到羧甲基壳聚糖的水溶液中，于常温下避光搅拌混合均匀，生成可光交联的羧甲基壳聚糖两亲性聚合物，在自组装成空心纳米囊的同时，对脲酶实现原位封装，得到可光交联的纳米酶包囊；

（3）脲酶纳米反应器的制备：将可光交联的纳米酶包囊混合溶液经紫外光辐射引发叠氮基交联，获得原位包封酶的光交联纳米凝胶囊即脲酶纳米反应器；所述的紫外光波长是190nm～400nm。

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