CN106573974A

CN106573974A - 靶向骨桥蛋白的截短变体的疫苗和单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN106573974A
Application number: CN201580045200.1A
Authority: CN
Inventors: G.施塔夫勒; C.兰德林格; M.勒布拉斯
Original assignee: Affiris AG
Current assignee: Affiris AG
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2017-04-19
Also published as: AU2015282637A1; EP3160488A1; JP2017525670A; AR101019A1; US20170137509A1; WO2016001140A1; TW201623329A

Abstract

本发明提供了对人骨桥蛋白的一种或多种截短变体特异性的单克隆抗体和包含至少一种分离的骨桥蛋白肽的疫苗，以及用于制造所述抗体和疫苗的方法。此外，提供了利用所述抗体的诊断方法。所述抗体和疫苗用于治疗，特别是用于治疗和/或预防2型糖尿病和心血管疾病。

Description

靶向骨桥蛋白的截短变体的疫苗和单克隆抗体及其用途

本发明涉及疫苗和单克隆抗体(mAb)，特别适用于治疗和/或预防慢性炎性疾病，如2型糖尿病(T2D)和心血管疾病(CVD)。本发明的另一方面涉及使用mAb的诊断方法。

主要肥胖相关疾病的社会学和经济影响。

肥胖是从医疗和经济角度看挑战我们的社会的流行病。与心脏代谢风险相关的肥胖的增加的流行导致预期寿命降低(由于T2D和CVD)。例如，在英国，在过去十年中，肥胖率(体重指数≥30kg/m2)在女性中增加了30％，在男性中增加了40％，在儿童中增加了50％，导致在2007年23％的成年人是肥胖的，预测在2050年50％。根据疾病控制中心(CDC)估计全球1.5亿人(仅美国2100万人)受T2D影响，这个数字预计在未来二十年将增长到2.5亿。目前，T2D药物的费用超过欧盟国家年度医疗保健预算的4％。这些成本预计在未来几年将大幅增加。造成肥胖流行病的原因还不完全清楚，但其后果已经很明显，例如T2D的大量增加，现在甚至发生在儿童和青少年中。

CVD是世界卫生组织(WHO)欧洲区域(由53个国家组成)的主要死亡原因，每年死亡人数超过430万。虽然量化发病率负担困难得多，但是2006年估计CVD使欧盟的医疗保健系统花费了1100亿欧元。

降低心脏代谢风险的当前预防和治疗策略是不充分的，并且研究团体(学术界和工业界)需要开发新的健康护理干预以解决这种重要的生物医学挑战。因此，相对便宜并且确保患者顺应性的用于T2D和CVD的治疗和预防策略存在巨大的社会学和经济学影响。研究已经确定由肥胖引起的慢性低度炎症是一种常见的机制，其在原因上涉及肥胖相关的胰岛素抗性和动脉粥样硬化，这是T2D和CVD的基础。这通过依靠免疫治疗消除慢性炎症中牵涉的关键因素为这些疾病提供了常见的治疗策略。

炎症作为连接肥胖，T2D和血管疾病的机制。

肥胖症，特别是中枢性肥胖，是胰岛素抗性的显著基础，所述胰岛素抗性成为代谢综合征，包括血脂异常和高血压的特征的基础。代谢综合征包括这些因素的可变组合，它们一起增加了显著的心脏代谢风险，即发展T2D和动脉粥样硬化CVD。胰岛素抗性定义为对其主要靶器官(即脂肪组织，肝脏和肌肉)的胰岛素的敏感性受损。胰岛素调节葡萄糖摄取和循环游离脂肪酸(FFA)浓度。在脂肪组织中，胰岛素刺激葡萄糖摄取和脂肪生成，同时抑制脂肪分解，从而减少FFA流出；在肝脏中，胰岛素通过降低关键酶活性来抑制糖异生；并且在骨骼肌中胰岛素大大增强葡萄糖摄取。因此，脂肪组织胰岛素抗性导致增加的循环FFA浓度和异位脂肪积累，其阻碍胰岛素在肝和骨骼肌中的作用。最后，由胰岛素抗性诱导的葡萄糖和脂毒性损害了导致明显T2D的胰腺β细胞的胰岛素分泌。

近年来，已经积累了证据，即肥胖与低度炎症相关，所述低度炎症明显引起胰岛素抗性的发展。脂肪组织和肝脏是肥胖中损害胰岛素敏感性的循环炎症标志物的主要来源。在这些器官内，可能由免疫系统的其它细胞引发的巨噬细胞驱动由于尚未完全理解的机制所致的这种炎症。最近的临床数据强烈支持这样的实验发现：脂肪组织巨噬细胞关键地参与胰岛素抗性的发展。

胰岛素抗性和T2D的肥胖相关病症的特征是加速的动脉粥样硬化，这是大多数血管疾病的根本特征。这种关系是最关键的，要记住，80％具有T2D的人会死于动脉粥样硬化性CVD的并发症，其导致的增加的死亡风险相当于15年的衰老，而肥胖本身也与相当于超过10年的衰老的心肌梗死的风险增加相关。

动脉粥样硬化曾经被鉴定为脂质储存疾病，但现在被认为是血管壁的炎性病症，其特征在于巨噬细胞和T细胞的浸润，它们彼此相互作用并与动脉壁的细胞相互作用。因此，动脉粥样硬化的病理机制重演了在肥胖症中观察到的炎症过程的许多特征。此外，最近的实验动物研究直接将肥胖诱导的脂肪组织炎症与加速的动脉粥样硬化联系起来，表明了T2D和CVD二者的共同致病原因。

基于共同的炎症机制，同时靶向肥胖相关的脂肪组织炎症和动脉粥样硬化最近已在动物模型中证明。例如，脂肪细胞和巨噬细胞脂肪酸结合蛋白(aP2)的小分子抑制剂有效治疗T2D和动脉粥样硬化，并且在LDL受体敲除中已证明炎症细胞因子MIF的缺乏减少了慢性脂肪组织炎症和胰岛素抗性以及动脉粥样硬化。相反，抗炎脂联素(adiponectin)和胆固醇酯水解酶在巨噬细胞中的转基因过表达显示类似的效果。因此，同时靶向肥胖症的主要并发症(即通过慢性炎症密切相关的胰岛素抗性和动脉粥样硬化)的尖端方法是可行的和非常有吸引力的(Olefsky JM，Glass CK.Annu Rev Physiol 2010；72：219-246，PMID：20148674；Rocha VZ，Libby P.Nat Rev Cardiol 2009；6：399-409，PMID：19399028)。

因此，总的来说，本发明的目的是提供化合物，其适用于预防和治疗，特别是预防和治疗慢性炎性疾病如T2D和CVD或所选择的与这些相关的病症和/或症状，如肥胖相关的胰岛素抗性和/或动脉粥样硬化。

因此，本发明的另一个目的是提供用于制备所述化合物的方法和使用所述化合物的诊断方法。

因此，本发明的一个方面提供了对人骨桥蛋白(Opn)的一种或多种截短变体特异的单克隆抗体(mAb)，

其中所述抗体对所述一种或多种截短变体比对于全长Opn(flOpn；SEQ ID NO:15)更具反应性；和

其中所述抗体对以下是特异性的：

(A)基质金属蛋白酶截短的Opn(MmpOpn；SEQ ID NO：16)，其中所述抗体对MmpOpn比对flOpn(SEQ ID NO:15)和凝血酶截短的Opn(ThrOpn；SEQ ID NO:17)中的每一种更具反应性；或

(B)MmpOpn和ThrOpn两者，其中所述抗体对于MmpOpn和ThrOpn中的每一种比对flOpn更具反应性；或

(C)ThrOpn，其中所述抗体对具有选自VVYGLR，SVVYGLR和DSVVYGLR(SEQ ID NO:1-3)的肽序列的ThrOpn表位具有特异性，其中如果所述抗体对具有肽序列SVVYGLR(SEQ IDNO:2)的表位是特异的，那么抗体的重链可变域(V_H)和抗体的轻链可变域(V_L)包含具有以下序列的互补决定区(CDR)：

V_H CDR1 GFSLSTYGLG(SEQ ID NO:18)，

V_H CDR2 IYWDDNK(SEQ ID NO:19)，

V_H CDR3 ARGTSPGVSFPY(SEQ ID NO:20)，

V_L CDR1ENIYSY(SEQ ID NO:21)，

V_L CDR2 NAK(SEQ ID NO:22)，

V_L CDR3 QHHYGTPLT(SEQ ID NO:23)，

并且其中所述抗体对ThrOpn比对flOpn和MmpOpn中的每一种更具反应性，并且优选地其中V_H包含或具有SEQ ID NO:24的序列，并且V_L包含或具有SEQ ID NO:25的序列。

本发明的抗体特别适用于治疗，特别是用于治疗和/或预防T2D，特别是肥胖相关的胰岛素抗性，和/或CVD，特别是动脉粥样硬化，如下所述。

Opn作为有希望的分子靶标

Opn，也称为分泌的磷蛋白-1和唾液蛋白-1，由SPP1基因编码。Opn是在活化的巨噬细胞和T细胞，破骨细胞，肝细胞，平滑肌，内皮和上皮细胞中表达的多功能蛋白，并且归类为炎性细胞因子。Opn在细胞迁移，特别是单核细胞/巨噬细胞中起作用。Opn对单核细胞粘附到内皮的作用看起来主要由其对单核细胞的作用介导，因为内皮细胞的主要粘附机制不被Opn改变。此外，Opn可诱导多种其它炎性细胞因子和趋化因子以及基质金属蛋白酶的表达，以诱导基质降解并促进细胞运动。Opn的这些功能基于其结合粘附分子如整联蛋白和CD44的能力，如下文详述。除粘附(其是免疫细胞功能的必要组成部分，对于受损和发炎组织的趋化性和侵袭是必需的)外，整联蛋白和CD44转导信号，导致免疫细胞迁移，生长，存活，分化以及炎症和适应性免疫应答的激活。

如以下段落中详细描述的，Opn为一种治疗肥胖症相关疾病的靶标分子，所述肥胖相关疾病系基于代谢组织及血管壁的慢性低度发炎，且造成心血管代谢风险。多克隆抗体已成功地用于被动免疫治疗以阻断Opn功能和治疗炎性疾病，包括肥胖症诱导的胰岛素抗性(Kiefer FW等人，Diabetes 2010；59：935-946；PMID：20107108)。

Yan等人，(Yan，Xiaoxiang等人；Cardiovasc Diabetol 9.1(2010)：70-78)公开了骨桥蛋白而不是凝血酶切割的骨桥蛋白的血浆浓度与具有2型糖尿病的患者的肾病和冠状动脉疾病的存在和严重程度相关。

Opn在肥胖相关的胰岛素抗性和动脉粥样硬化中的作用。

已经证明，Opn在人和不同鼠模型中的肥胖症中高度上调(Gomez-Ambrosi J等人JClin Endocrinol Metab 2007；92:3719-3727.PMID:17595250.Kiefer FW等人Endocrinology 2008；149:1350-1357.PMID:18048491)。几个最近的研究表明，Opn成因性地涉及肥胖诱导的脂肪组织炎症和胰岛素抗性，以及密切关联地涉及肝脏皮脂腺病(steatosis)(例如Kiefer FW等人,Diabetes 2010；59：935-946；PMID：20107108)。引人注目的是，可以通过小鼠的被动免疫证明体内Opn作用的抗体介导的中和显著改善胰岛素信号传导并因此通过减少脂肪组织和肝脏中的肥胖相关炎症而降低肥胖症中的胰岛素抗性。

这些结果显示巨噬细胞活化作为在肥胖诱导的脂肪组织炎症期间脂肪组织内的Opn作用的机制。

过量的Opn丰度不仅在肥胖的脂肪组织中发现。Opn在巨噬细胞，平滑肌和动脉粥样硬化斑块和主动脉瓣膜病变的内皮细胞中高度富集。血浆Opn是在具有血管疾病的患者中的预后标记物，并且与类风湿性关节炎患者的动脉僵硬相关。敲除研究显示Opn直接参与血管紧张素II诱导的动脉粥样硬化和动脉瘤形成(Bruemmer D等人J Clin Invest 2003；112:1318-1331.PMID:14597759)。依靠正常食物的在脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)及Opn上同时缺陷的混合遗传背景上的雌性小鼠显著受到保护而免于动脉粥样硬化。。还有，与ApoE和LDLR双敲除相比，对ApoE，LDL受体(LDLR)和Opn三重阴性的雌性小鼠发展显著更小的损伤和减少的内侧增厚。反之亦然，Opn在高脂肪高胆固醇饲养的C57BL/6小鼠中的转基因过表达导致加剧的动脉粥样硬化病变形成，增加的内侧增厚和新内膜形成。此外，Opn还已经由于其牵涉糖尿病大血管和微血管疾病以及在链激酶诱导的Opn缺乏的糖尿病小鼠中保留的心脏功能而与同T2D有关的血管疾病联系起来(例如在Subramanian V等人Am JPhysiol Heart Circ Physiol 2007；292：H673-683.PMID：16980342)。

Opn在其它疾病中的作用

Opn还涉及系统性炎症或自身免疫疾病的发病机理。除了在上述病症中的作用，Opn已显示在类风湿性关节炎，心脏纤维化，多发性硬化等的发病机制中起作用，并且有助于实验性自身免疫性脑脊髓炎的发展。此外，Opn还在许多恶性肿瘤，如乳腺癌和前列腺癌，骨肉瘤，胶质母细胞瘤，鳞状细胞癌和黑素瘤中表达，并且在促进肿瘤生长和确定其转移潜力中起关键作用。

Opn的结构和功能

Opn是高度带负电荷的细胞外基质蛋白，由约314个氨基酸(在人中，在小鼠中为297个)组成，并表达为33-kDa新生蛋白。预测的骨桥蛋白的二级结构由八个α-螺旋和六个β-片段组成。导致细胞类型和条件特异性变异的翻译后修饰可以解释已知的分子量差异性。

整联蛋白和CD44结合功能结构域

Opn通过结合和连接整联蛋白来调节多种细胞活性。位于中心的159RGD161序列和αvβ3整联蛋白(其在巨噬细胞和破骨细胞中高度表达)之间的相互作用已经被充分证明。相应的磷酸化位点不存在于RGD区域。与RGD序列邻接，通过凝血酶切割暴露的162SVVYGLR168(SEQ ID NO:2)隐蔽整联蛋白结合位点被由白细胞表达的α4β1和α9β1整联蛋白识别。此外，金属蛋白酶MMP3、MMP7和MMP9切割Opn，导致隐藏的整联蛋白结合位点162SVVYG166的轻微截短形式，其再次被由白细胞表达的α4β1和α9β1整联蛋白识别。

CD44已经被鉴定为Opn的受体，通过该受体控制巨噬细胞的趋化性和细胞因子应答。然而，其它研究(包括我们未发表的实验)相矛盾，并对CD44是Opn的粘附受体提出质疑。

蛋白水解产物

Opn展现出功能上重要的切割位置。全长的Opn可以经由凝血酶切割以暴露隐蔽的整联蛋白结合序列162SVVYGLR168(SEQ ID NO:2)。该隐蔽结构域的小鼠同源物(SLAYGLR(SEQ ID NO:46所示))，被认为在实验性关节炎(experimental arthritis)的形成中是必要的(Yamamoto N等人J Clin Invest 2003；112:181-188.PMID:12865407)。目前几乎没有关于Opn切割的调控的资料，然而，经凝血酶切割的Opn大量存在于风湿病患的关节液中，以及类风湿关节炎病患的尿液中。Sharif等人(Sharif,Shadi A.等人"Thrombin-activatable carboxypeptidase B cleavage of osteopontin regulates neutrophilsurvival and synoviocyte binding in rheumatoid arthritis."Arthritis&Rheumatism 60.10(2009):2902-2912.)提及在类风湿关节炎中，经凝血酶切割的Opn(该期刊论文中简称“OPN-R”，本发明中则简称为“ThrOpn”)，以及OPN-R经由可被凝血酶活化的羧肽酶B(thrombin-activatable carboxypeptidase B，简称CPB)加工而产生OPN-L。为了研究OPN-R及OPN-L在类风湿关节炎中的重要性，而发展出了特别针对这些经切割的Opn形式的ELISA(该期刊论文的第2903页第2栏第2节)。简言之，产生针对缀合有KLH的Opn肽(KLH-conjugated Opn peptides)，特别是SVVYGL的兔多克隆抗体(该期刊论文的第2903页第2栏第2节)。对抗体进行表位定位(该期刊论文的第2904页第1栏第2节，及第1图)。后藉由免疫吸附反应进行纯化，去除交叉反应(cross-reactive)的抗体(该期刊论文的第2905页第1栏第1节)。这些经纯化的多克隆抗体用于测量在骨性关节炎(osteoarthritis)、牛皮癣性关节炎(psoriatic arthritis)及类风湿关节炎病患的关节液中OPN-R(ThOpn)、OPN-L及OPN的水平(该期刊论文第2图)，并用于针对关节滑膜的样品进行免疫染色反应(该期刊的图4)。该期刊论文仅发表抗Opn抗体作为类风湿关节炎的研究工具的用途，而未提及抗Opn抗体或抗Opn疫苗用于治疗的用途。

一个非常近的人类研究显示凝血酶和凝血酶切割的Opn，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)从组织提取物测定的，与非钙化区域相比富含狭窄主动脉瓣的钙化区域。

Opn也是基质金属蛋白酶，MMP-3，MMP-7，MMP-2和MMP-9的底物。值得注意的是，11种MMP的蛋白酶活性涉及动脉粥样硬化形成，并且已经证明在鼠和人肥胖中增加了几种MMP(包括MMP-7和-9)的表达(Unal R等人J Clin Endocrinol Metab 2010；95：2993-3001。PMID：20392866)。这些MMP中的许多由巨噬细胞的表面分泌或表达，并且MMP-9活性甚至可以由Opn诱导。值得注意的是，MMP-9、-7和-3的166GL167切割位点位于最接近168RS169凝血酶切割位点附近。因此，MMP切割暴露了类似于凝血酶的隐蔽整联蛋白结合位点。这通过研究显示，(显示Opn的MMP-3或MMP-7切割分别增强了Opn作为鼠肿瘤细胞和巨噬细胞的粘附剂和迁移刺激物的功能。此外，通过分析重组肽的作用，提示162SVVYG166区域足以介导与β1整联蛋白的结合。

靶向中和Opn功能的表位

除了在治疗肥胖相关的炎症和胰岛素抗性和例如肾小球纤维化中成功应用多克隆抗Opn抗体外，几种mAb已经在被动免疫研究中使用以成功阻断Opn功能：

抗SLAYGLR(SEQ ID NO:46)(与人162SVVYGLR168-SEQ ID NO:2的小鼠同源物)抗体M5消除了单核细胞迁移并抑制了小鼠关节炎关节中滑膜，骨侵蚀和炎性细胞浸润的增殖(Yamamoto N,等人J Clin Invest 2003；112:181-188.PMID:12865407)。在非人灵长类动物类风湿关节炎模型(Yamamoto N等人，Int Immunopharmacol 2007；7：1460-1470.PMID：17761350)中成功测试了嵌合抗SVVYGLR mAb(C2K1，SEQ ID NO:2)。

mAb53通过仅在凝血酶切割前存在的表位抑制RGD依赖性细胞对Opn的粘附(Bautista DS，等人J Biol Chem 1994；269：23280-23285.PMID：8083234)。另一种MAb(Opn1.2)通过与Asp113-Arg128结合而抑制RGD功能，从而诱导分子内改变(Yamaguchi Y,Hanashima S,Yagi H,等人NMR characterization of intramolecular interaction ofosteopontin,an intrinsically disordered protein with cryptic integrin-bindingmotifs.Biochem Biophys Res Commun 2010；393:487-491.PMID:20152802)。

这些抗体的体内应用从未被公开过。

已经证明针对212NAPSD216的人源化mAb有效抑制人乳腺癌细胞系的细胞粘附，迁移，侵袭和集落形成，并且在人乳腺癌的小鼠肺转移模型中显著抑制原发性肿瘤生长和自发转移(Dai J，等人Cancer Immunol Immunother 2010；59：355-366，PMID：19690854)。

对Opn的N-末端41ATWLNPDPSQKQ52基序特异性的mAb 23C3降低炎症细胞因子的产生并促进胶原诱导的关节炎中活化的T细胞的凋亡(Fan K等人，Arthritis Rheum 2008；58：2041-2052.PMID：18576331)。31QLYNKYP37是由mAb(F8E11)靶向的另一N末端序列，其在体外阻断Opn诱导的T细胞活化和迁移(Dai J等人Biochem Biophys Res Commun 2009；380：715-720.PMID：19285028)。

总之，从这些发现得出结论，通过针对小的但功能相关的Opn表位的mAb的被动免疫有效干扰慢性炎症反应。

此外，从以下文献中已知抗Opn的mAb：

Kon等人(Kon,Shigeyuki等人"Mapping of functional epitopes ofosteopontin by monoclonal antibodies raised against defined internalsequences."Journal of Cellular Biochemistry 84.2(2002):420-432)公开了来自用偶联于甲状腺球蛋白(p.423，col 1)的各种Opn肽(参见文献的图1)免疫的小鼠获得的脾细胞杂交瘤的5个mAb。mAb用于分析来自健康男性(文献的图3)的尿样品和来自肿瘤细胞系的上清液(文献的图4)中所选择的Opn表位的存在。该文献仅将抗Opn mAbs建立为与Opn相关的生理和病理过程中的研究工具(也参见文献中讨论部分的最后三个句子)。甚至建议不使用抗Opn mAb(或抗Opn疫苗)的单一治疗用途。

针对Opn的预期疫苗接种的安全性考虑。

Opn(Spp1)敲除的表型

安全性是在具有相当大的心脏代谢风险但仍然没有急剧患病的患者中的重要问题。值得注意的是，针对靶向Spp1缺失而纯合的两个独立的小鼠品系是可存活的，可繁殖的，大小正常，并且不显示任何显著的物理或行为异常(Liaw L等人J Clin Invest 1998；101：1468-1478.PMID：9525990.Rittling SR等人，Journal of Bone and MineralResearch 1998；13：1101-1111.PMID：9661074)。

Opn作为免疫治疗的靶标的结论

T2D和CVD共有共同的炎症基础，并且Opn是已经在体外和体内在胰岛素抗性和动脉粥样硬化形成中显示功能影响的关键分子。因此，Opn是对功效和安全性具有合理考虑的免疫治疗的靶标。

疫苗接种策略是人类历史上最有效的医学干预的一。虽然在上个世纪期间针对传染病的预防性接种的开发主导这一领域，但近年来已经越来越多地关注开发被动和主动的治疗性疫苗。最近已经在临床医学中引入了许多抗体，以靶向在炎性和肿瘤性疾病中的关键分子，提供非凡的特异性和功效。除了这种被动免疫治疗方法，主动疫苗接种方法看起来是有效的，因为在许多动物研究和第一临床试验中，治疗性B细胞疫苗显示出作为治疗各种非感染性人类疾病的可负担和有效的治疗选择的潜力。因此，主动治疗疫苗接种的概念代表了被认为待应用于被动免疫治疗方法已经成功的几乎所有疾病的免疫治疗策略。原理是设计一种疫苗，其可以触发针对在给定疾病中是致病性和过表达的内源性蛋白质的免疫应答。大多数目前可用的治疗性疫苗使用自身蛋白或衍生自这种蛋白的自身表位，或与载体偶联的表位的修饰形式(通常称为模拟表位)，这两种均被工程化改造以诱导针对靶蛋白强体液免疫应答以中和其致病作用。

包括受体结合位点，通过蛋白水解切割诱导的推定的新表位和其结合诱导功能性构象改变的表位的几种替代Opn表位是用于针对Opn的成功的免疫治疗策略的靶序列。

在本发明的过程中，评估了许多Opn表位(特别是在表1中列出的所有表位)的免疫原性，以及针对其产生的血清/抗体对Opn的特定截短变体的选择性，以及所述血清的功能/抗体(图1-5)。发现存在这样的表位，其可用于产生对人骨桥蛋白(Opn)的一个或多个截短变体特异的mAb，其中令人惊讶地，抗体对一个或多个截短变体的反应性(和特异性)显著高于针对全长Opn(flOpn)的反应性。(例如参见图3)。

因此，本发明的一个方面提供了对人骨桥蛋白(Opn)的一种或多种截短变体特异的mAb，所述mAb对所述一种或多种截短变体比对于全长Opn(flOpn)更具反应性。

所述抗体对以下是特异性的：

(A)基质金属蛋白酶截短的Opn(MmpOpn；SEQ ID NO：16)，其中所述抗体针对MmpOpn比针对(SEQ ID NO:15)和凝血酶截短的Opn(ThrOpn；SEQ ID NO:17)中的每一种更具反应性；或

(C)ThrOpn，其中所述抗体对具有选自VVYGLR，SVVYGLR和DSVVYGLR(SEQ ID NO:1-3)的肽序列的ThrOpn表位是特异性的，其中如果所述抗体对具有肽序列SVVYGLR(SEQ IDNO:2)的表位是特异的，那么抗体的重链可变域(V_H)和抗体的轻链可变域(V_L)包含具有以下序列的互补决定区(CDR)(即在本发明的过程中产生的mAb 4-4-2的CDR，参见表2)：

V_H CDR1 GFSLSTYGLG(SEQ ID NO:18)，

V_H CDR2 IYWDDNK(SEQ ID NO:19)，

V_H CDR3 ARGTSPGVSFPY(SEQ ID NO:20)，

V_L CDR1ENIYSY(SEQ ID NO:21)，

V_L CDR2 NAK(SEQ ID NO:22)，

V_L CDR3 QHHYGTPLT(SEQ ID NO:23)，

并且其中所述抗体对ThrOpn比对flOpn和MmpOpn中的每一种更具反应性，并且优选地其中V_H包含或具有SEQ ID NO:24的序列，并且V_L包含或具有SEQ ID NO:25的序列。抗体的优选同种型是免疫球蛋白G(IgG)，优选的轻链类型是κ。

CDR代表抗体的可变区，抗体用其结合它的特异性表位。重链的类型和数量决定了抗体的类别，即分别为IgA，IgD，IgE，IgG和IgM抗体。抗体还含有两条相同的轻链，其可以是λ或κ型的。

对Opn(MmpOpn，ThrOpn或两者)的截短变体特异的，同时对全长蛋白(flOpn)显示较小的反应性允许在治疗中的非常靶向性的方法。这将减少经历用本发明的抗体治疗的患者的副作用。仔细选择本发明的抗体以显示这种有益的特异性(也参见实施例)。

对于在本发明的过程中研究的表位，参见表1。

对包含SVVYGLR(SEQ ID NO:2)的肽特异性的抗体例如从WO 2009/023411A1，US2007/0274993A1，US 2006/0002923A1和US 2004/0234524A1中已知。然而，所有这些文献在提供针对SVVYGLR(SEQ ID NO:2)特异性的mAb的发明特征方面是沉默的，其中mAb对ThrOpn比对flOpn和MmpOpn中的每一种更具反应性。此外，所有这些文献在针对MmpOpn特异的或针对MmpOpn和ThrOpn二者特异的抗体方面完全是沉默的。

其它单克隆抗Opn抗体也是已知的，然而，它们不具有本文所述的本发明抗体的有利性质(特别是对MmpOpn或ThrOpn或两者的强反应性，而对flOpn较少反应性)：

2K1，C2K1(Yamamoto N等人Int Immunopharmacol 2007；7：1460-1470.PMID：17761350)：针对人Opn肽VDTYDGRGDSVVYGLRS(SEQ ID NO:48)产生鼠mAb克隆2K1。在体外，克隆2K1显示抑制RGD依赖性细胞粘附到全长Opn以及RGD非依赖性细胞粘附到重组N末端Opn(等同于ThrOpn，aa1-168)。此外，它抑制α9介导的向全长，凝血酶切割和重组N端Opn的细胞迁移。因此，克隆2K1能够识别人Opn的隐蔽表位，SVVYGLR(SEQ ID NO:2)。后来开发的mAb C2K1是嵌合抗体，其中2K1的可变区与人IgG1恒定区融合。在体外，C2K1显示分别抑制人和猴单核细胞向人和猴N末端Opn的迁移。在治疗性体内方法中，C2K1可以减轻非人灵长类动物中建立的胶原诱导的关节炎。2K1和C2K1识别Opn的隐蔽表位并且是功能性的，但它们不区别地区分flOpn和ThrOpn。没有公开它们对MmpOpn的反应性和功能。

mAb53，mAb87-B(Bautista DS等人J Biol Chem 1994；269：23280-23285.PMID：8083234)：针对通过细菌产生的重组GST-人Opn(GST-hOpn)而产生的mAb mAb53和mAb87-B。因为它们是针对全长蛋白质产生的，所以它们不具有本发明抗体的有益性质。

34E3：针对人Opn肽CSVVYGLR(SEQ ID NO:49)产生的鼠mAb克隆34E3，并特异性识别C-末端氨基酸序列YGLR(SEQ ID NO:50)。34E3与凝血酶切割的鼠Opn，兔Opn和人Opn交叉反应，但不与未切割的Opn交叉反应。34E3能够抑制鼠黑素瘤细胞系B16.F10针对鼠Opn肽VDVPNGRGDSLAYGLR(SEQ ID NO:47)和SLAYGLR(SEQ ID NO:46)而不针对GRGDS的粘附，表明针对α4-和α9-整联蛋白特异的粘附抑制。没有显示针对人Opn序列的功能数据。针对MmpOpn也都不具有反应性和功能性(参见US 2011/312000A1)。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述抗体对具有选自GDSVVYG，RGDSVVYG和DGRGDSVVYG(SEQ ID NO:7-9)的肽序列的MmpOpn表位或对于具有选自TYDGRGDSVVYG(SEQID NO:10)和PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)的肽序列的MmpOpn/ThrOpn表位具有特异性。

从最适于本发明的表位产生的血清进一步研究它们的生物学功能(图2)。使用特别合适的三个表位来产生选择性mAb(在图3-5中表征；也参见表2和实施例)。因此，本发明的其它实施方案公开了特别合适的抗体，特别是其CDR序列或其V_H或V_L序列(上文公开了本发明的对SVVYGLR(SEQ ID NO:2)特异的抗体的序列)：

这些优选实施方案之一是对具有肽序列GDSVVYG的表位具有特异性的抗体，并且该抗体的CDR包含以下序列(即在本发明的过程中产生的mAb7-5-4和mAb 9-3-1的CDR，参见表2；mAb 7-5-4和mAb 9-3-1证明是相同的)：

V_H CDR1 GITFNTNG(SEQ ID NO:26),

V_H CDR2 VRSKDYNFAT(SEQ ID NO:27),

V_H CDR3 VRPDYYGSSFAY(SEQ ID NO:28),

V_L CDR1 QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:29),

V_L CDR2 KVS(SEQ ID NO:30),

V_L CDR3 FQGSHVPWT(SEQ ID NO:31),

并且优选地其中V_H包含或具有SEQ ID NO:32的序列，VL包含或具有SEQ ID NO:33的序列。抗体的优选同种型是免疫球蛋白G(IgG)，优选的轻链类型是κ。

这些优选实施方案中的另一个是对具有肽序列TYDGRGDSVVYG的表位特异的抗体，并且所述抗体的CDR包含以下序列(即在本发明的过程中产生的mAb 21-5-4的CDR，参见表2)

V_H CDR1 GFSLSTSGLG(SEQ ID NO:34),

V_H CDR2 ISWDDSK(SEQ ID NO:35),

V_H CDR3 ARSGGGDSD(SEQ ID NO:363),

V_L CDR1 SSVNS(SEQ ID NO:37),

V_L CDR2 DTS(SEQ ID NO:38),

V_L CDR3 FQGSGYPLT(SEQ ID NO:39)

并且优选地其中V_H包含或具有SEQ ID NO:40的序列，且V_L包含或具有SEQ ID NO:41的序列。抗体的优选同种型是免疫球蛋白G(IgG)，优选的轻链类型是κ。

尽管CDR中的突变可导致亲和力或选择性降低，但是有限量的突变在亲和力或选择性方面可以是可耐受的或甚至有益的。因此，在本发明的另一个优选实施方案中，在本发明的抗体中，CDR或V_H或V_L中的三个，优选两个，更优选一个氨基酸突变为任何其它氨基酸。

如果本发明的抗体具有低交叉反应性，则是特别有益的，因此本发明的另一个优选实施方案提供了本发明的抗体，其中

-在抗体对MmpOpn特异的情况下，所述抗体对MmpOpn的反应性比对flOpn和ThrOpn中的每一种反应性多超过N倍；和

-在抗体对MmpOpn和ThrOpn两者都是特异的情况下，所述抗体对于MmpOpn和ThrOpn中的每一种的反应性比对flOpn的反应性多超过N倍；和

-在抗体对ThrOpn特异的情况下，抗体对ThrOpn的反应性比对flOpn和MmpOpn中的每一种的反应性多超过N倍；和

其中N大于1.5，优选大于2，更优选大于3，甚至更优选大于5，最优选大于10。

用于测试抗体(或血清)的(交叉)反应性的ELISA测定在本领域中广泛使用。因此，优选地，在分别用MmpOpn，ThrOpn和flOpn包被的平板上，在用1％BSA封闭后，通过ELISA测量抗体分别对MmpOpn，ThrOpn和flOpn的反应性，包括以下条件：

抗体浓度：0.25μg/ml，

HRP偶联的二抗的浓度：0.1μg/ml，

HRP底物：ABTS和0.1％过氧化氢，

读数：405nm处的吸光度。

抗体可以通过其关于各个表位(或配体)的解离常数K_d(其也称为“亲和力”)以及通过它们对各个表位(或配体)的解离速率值来分类。这两个术语(以及它们如何被测量)在本领域中是公知的。如果不考虑其它参数，则抗体的亲和力越高(即Kd越低)和/或解离速率值越低，其越合适。

因此，在本发明的另一个优选实施方案中，抗体相对于各个表位和/或关于各个Opn蛋白的解离常数K_d低于50nM，优选低于20nM，更优选低于10nM，甚至更优选低于5nM，最优选低于2nM。此外，在本发明的另一个优选实施方案中，关于各个表位和/或关于各个Opn蛋白的抗体的解离速率值低于5×10^-3s^-1，优选低于3×10^-3s^-1，更优选低于1×10^-3s^-1，甚至更优选低于1×10^-4s^-1。表3列出了所选择的本发明抗体的测定的解离速率和解离速率值。

本发明的抗体优选是人源化的。获得此类抗体的方法是本领域熟知的。一种方法是将本文公开的可变区插入人抗体支架(参见例如Hou S，等人，J Biochem 2008，PMID：18424812)。

“人源化抗体”指嵌合抗体，其包含来自非人类HVR的氨基酸残基及来自人类Fr(固定区)的氨基酸残基。“框架”或“FR”指除了高变区(hypervariable region)残基以外的可变域残基。可变域的FR通常由四个FR域所组成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常以下述顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。在某些实施方案中，人源化抗体大致上会包含至少一个可变域的全部，典型地包含二个可变域的全部，其中全部或大致上全部的HVR(例如，CDR)对应非人类抗体的HVR，且全部或大致上全部的FR对应人类抗体的FR。人源化抗体任选地包含衍生自人类抗体的抗体恒定区的至少部分。在一个优选的实施方案中，将鼠HVR嫁接入人类抗体的框架区域，以制备“人源化抗体”。将鼠可变区的氨基酸序列与人类种系(germline)抗体V基因的集合比对，并依据序列同一性(sequence identity)及同源性(homology)分类。受体序列的选择，考虑总体序列同源性较高者，并且，任选地参考受体序列中已存在的正确的规范残基(canonical residue)。种系V基因仅编码用以形成重链的HVR3的起始部分，至轻链的HVR3的中段。因此，种系V基因的基因序列并未与整个V结构域对齐。人源化构建体(humanized construct)分别包含该人类框架1至3、鼠HVR及衍生自人类JK4的人类框架4序列，以及用以形成轻链及重链的JH4序列。在挑选一个特定的受体序列之前，可以先决定供体抗体(donor antibody)中所谓的规范环形结构(canonical loop structure)。这些规范环形结构是由出现在所谓的规范位置(canonical position)的残基类型所决定。这些位置(部分)位于HVR区域外，且在最终构建体中应维持其功能相等，以维持亲本(供体)抗体(parental antibody)的HVR构象。在WO2004/006955 A1中，报告了将抗体人源化的方法，包含辨识非人类成熟抗体的HVR的规范HVR结构类型(canonical HVR structure type)；获取人类抗体可变区的肽序列文库；决定该文库中可变区的规范HVR结构类型；及选择在非人类与人类可变区的对应位置中，规范HVR结构类型与该非人类抗体的规范HVR结构类型相同的该人类序列。归纳上述，具有潜力的受体序列的选择，考虑总体序列同源性较高者，并且，可以选择参考受体序列中已存在的正确的规范残基。在某些情况下，单纯嫁接HVR将导致仅部分保留该非人类抗体的结合特异性。目前已发现至少一些特定的非人类框架残基对于重建其结合特异性是必要的，且必须嫁接入人类框架中，即，在引入非人类HVR外，添加必须做出所谓的”回复突变(backmutation)”(例如，请见Queen等人,PNAS 86(1989),10029-10033)。这些特定的框架氨基酸残基会参与FR-HVR相互作用，并稳定HVR构象(环)。在某些情况下，也会引入正向突变(forward mutation)，以更接近人类种系序列。因此，“本发明的人源化抗体”(例如来源为小鼠)指抗体，其以小鼠抗体序列为基础，并藉由如上所述的标准技术以人源化该抗体的VH及VL(包含嫁接HVR及后续任选地框架区域及HVR-H1、HVR-H2、JVR-L1或HVR-L2的某些氨基酸的诱变，而其中HVR-H3及HVR-L3则维持未经修饰)。

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如US 4,816,567A；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的多种技术产生。人抗体可以通过对已经被修饰以响应于抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。这样的动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125，描述了XENOMOUSE^TM技术的US 6,075,181和6,150,584；描述技术的US 5,770,429A；描述K-M技术的US 7,041,870A和描述技术的US 2007/0061900A1。来自这样的动物产生的完整抗体的人可变区可以进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合。

“人抗体”是这样的抗体，其具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或衍生自利用人抗体全集的非人来源或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat，E.A等人Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th ed.,Bethesda MD(1991),NIH Publication91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是Kabat等人，同上中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人，同上中的亚组III。

人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等，PNAS 103(2006)3557-3562中描述。其它方法包括例如在US 7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)或由Trioma技术制备的那些。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列来产生人抗体。然后可将这种可变域序列与所需的人恒定结构域组合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。

也可以通过筛选具有所需活性的抗体的组合文库来分离根据本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并对文库筛选具有所需结合特性的抗体。这样的方法进一步描述于例如Fellouse，PNAS(2004)12467-12472中。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的全集，并随机重组在噬菌体文库中，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如从人)克隆未免疫的(naive)全集以提供针对广泛范围的非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，而不进行任何免疫。最后，也可以通过从干细胞克隆非重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，来合成性地制备未免疫的文库。描述人抗体噬菌体文库的其它出版物包括例如：US 5,750,373A，US 2005/0079574A1，US 2005/0119455A1，US 2005/0266000A1，US 2007/0117126 A1，US 2007/0160598 A1，US 2007/0237764 A1，US 2007/0292936A1和US 2009/0002360 A1。从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为是本文的人抗体或人抗体片段。

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是针对本文提及的表位，另一种结合特异性针对本文提及的另一表位或任何其它抗原。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(WO 93/08829A，US5,731,168A)。也可以如下制备多特异性抗体：通过工程化改造静电操纵效应用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A)；交联两种或更多种抗体或片段(例如US 4,676,980A)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(例如，Holliger等人，PNAS 90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(sFv)二聚体；和制备三特异性抗体。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼(Octopus)抗体”(例如US 2006/0025576 A1)。本文中的抗体或片段还包括包含结合本文提及的表位以及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用Fab”或“DAF”(例如参见US2008/0069820 A1)。本文的抗体或片段还包括在WO 2009/080251 A,WO 2009/080252 A,WO2009/080253 A,WO 2009/080254 A,WO 2010/112193 A,WO 2010/115589 A,WO 2010/136172 A,WO 2010/145792 A,和WO 2010/145793 A中描述的多特异性抗体。

抗体的功能片段是也能够结合各个表位的片段。由于诸如化学稳定性，药物半衰期，给药或更简单的生产等考虑因素，它们提供了优于完全尺寸抗体的优点。这样的片段是例如Fab片段，单结构域抗体和衍生自抗体恒定区的结合结构域(如Fcab^TM)。

因此，本发明的另一个优选实施方案是抗体片段，优选单结构域抗体，其中所述片段对以下是特异性的：

(A)MmpOpn(SEQ ID NO：16)，其中所述片段针对MmpOpn比针对flOpn(SEQ ID NO:15)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种更具反应性；或

(B)MmpOpn和ThrOpn两者，其中所述片段针对MmpOpn和ThrOpn中的每一种比针对flOpn更具反应性；或

(C)ThrOpn，其中所述片段针对ThrOpn比针对flOpn和MmpOpn中的每一种更具反应性。

本发明的片段还包括：“Kappa bodies”(III等人,Protein Eng.10:949-57(1997)),“微型抗体(Minibodies)”(Martin等人,EMBO J.13:5303-9(1994)),“双抗体(Diabodies)”(Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))，或“Janusins”(Traunecker等人,EMBO J.10:3655-3659(1991)和Traunecker等人,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52(1992))。它们可以根据说明书的教导使用标准分子生物学技术制备。

Hollinger和Hudson(Nat Biotechnol.2005，PMID：16151406)中也给出了适合本发明的这种工程化改造抗体片段的概述。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明抗体(或抗体片段)的至少一个氨基酸残基，N末端和/或C末端根据本领域已知的方法进行化学修饰。这样的修饰包括糖基化，聚乙二醇化，生物素化，烷基化，羟基化，腺苷酸化，磷酸化，琥珀酰化，氧化或酰化中的一种或多种，特别是乙酰化。这改善了本发明的抗体的药物性质(如溶解度，半衰期，活性)。

在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如从抗体的氨基酸序列中的残基的缺失和/或对残基的插入和/或取代。可以进行缺失，插入和取代的任何组合以得到最终构建体，只要最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合。

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目的位点包括HVR和FR。保守取代显示在表1中“优选取代”标题下。下面提供了关于氨基酸侧链类别的更实质性的改变。可以将氨基酸取代引入目标抗体，并筛选所需活性的产物，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：

(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性：Asp，Glu；

(4)碱性：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。

非保守取代将需要用这些类别之一的成员交换另一类别。一种类型的取代变体包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体具有某些生物学性质的修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学性质。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(例如本文所述的那些)来产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体展示在噬菌体上并筛选特定的生物活性(例如结合亲和力)。可以在HVR中进行改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲和力。这种改变可在HVR“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子编码的残基，和/或SDR(a-CDR)，其中测定所得变体VH或VL的结合亲和力。亲和力成熟通过构建二级文库和从其重新选择进行。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向的方法，其中几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，可以特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别地，靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，取代，插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变不显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不显著降低结合亲和力的保守性改变(例如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或含有不超过一个，两个或三个氨基酸取代。用于鉴定可靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，鉴定残基或目标残基组(例如，带电荷的残基，如Arg，Asp，His，Lys和Glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多聚丙氨酸)替换，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可以在显示对初始取代的功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以作为取代的候选物靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的性质。氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如针对ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽融合。

在药物组合物中提供本发明的抗体是有利的，例如以增加抗体在储存中的稳定性。因此，另一个优选的实施方案提供了包含本发明的抗体或片段的药物组合物，其还包含一种或多种赋形剂。

术语“药物组合物”是指含有如上定义的抗体的任何组合物或制剂，其改善，治愈或预防本文所述的病症。具体地，表述“药物组合物”是指包含根据本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物。合适的赋形剂是本领域技术人员已知的，例如水(特别是注射用水)，盐水，林格氏溶液，右旋糖溶液，缓冲液，Hank溶液，形成囊泡的化合物(例如脂质)，不挥发油，油酸乙酯，盐水中5％右旋糖，增强等渗性和化学稳定性的物质，缓冲液和防腐剂。其它合适的赋形剂包括本身在患者中不诱导产生对患者有害的抗体的任何化合物。实例是良好耐受的蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸和氨基酸共聚物。本发明的这种药物组合物或抗体可以(作为药物)通过本领域技术人员已知的适当程序施用于有需要的患者(即患有或具风险形成本文提及的疾病或病症的患者)。患者优选是人。

本发明组合物的优选施用途径是肠胃外施用，特别是通过静脉内或皮下施用。对于胃肠外施用，本发明的药物组合物提供为与上述定义的药学上可接受的赋形剂一起配制的可注射剂量单位形式，例如作为溶液，悬浮液或乳液。然而，施用的剂量和方法取决于待治疗的个体患者。

根据本发明的抗体可以以从其它mAB剂量方案已知的或对于给定个体具体评价和优化的任何合适剂量施用。例如，根据本发明的mAB可以以1mg至10g，优选50mg至2g，特别是100mg至1g的量提供为剂型(或作为剂量应用)。通常的剂量也可以基于患者的kg体重来确定，例如优选的剂量在0.1mg至100mg/kg体重，特别是1至10mg/体重的范围内(每次施用期)。

由于本发明组合物的优选施用方式是肠胃外施用，根据本发明的药物组合物优选为液体或即将溶于液体如无菌，去离子或蒸馏水或无菌等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)。优选地，1000μg(干重)的这种组合物包含或组成为0.1-990μg，优选1-900μg，更优选10-200μg根据本发明的抗体，任选地1-500μg，优选1-100μg，更优选5-15μg(缓冲液)盐(优选在最终体积中产生等渗缓冲液)和任选0.1-999.9μg，优选100-999.9μg，更优选200-999μg其它赋形剂。优选地，将100mg的这样的干燥组合物溶解在无菌的去离子/蒸馏水或无菌等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，得到0.1-100ml，优选0.5-20ml，更优选1-10ml的最终体积。

由于在本发明过程中发现和/或表征的一些表位证明异常适合于抗体产生(在选择性和免疫原性方面)，本发明的另一方面涉及在主动免疫方法中使用相同的表位(即疫苗接种)。

因此，本发明的这个方面提供了疫苗，其包含至少一种分离的Opn肽：

(A)所述肽具有选自GDSVVYG，RGDSVVYG和DGRGDSVVYG(SEQ ID NO:7-9)和GRGDSVVYG(SEQ ID NO:55)的一个或多个序列；和/或

(B)所述肽具有选自(SEQ ID NO:10)，VDTYDGRGDSVV(SEQ ID NO:13)，PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)和DTYDGRGDSVVY(SEQ ID NO:56)和TVDTYDGRGDSV(SEQ IDNO:57)的一个或多个序列，其中所述肽，特别是具有序列VDTYDGRGDSVV(SEQ ID NO:13)或PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)的肽优选在其C末端酰胺化(产生R-COO-NH₂，其中R是不具有其C-末端羧基的肽)和/或

(C)所述肽具有一个或多个选自VVYGLR，SVVYGLR和DSVVYGLR(SEQ ID NO:1-3)和GDSVVYGLR(SEQ ID NO:58)的序列；

并且其中所述肽与药学上可接受的载体偶联。这些表位是高度合适的，因为它们可以预期在患者中引起针对ThrOpn，MmpOpn或两者的强烈和选择性应答，同时引起对flnOpn的较低应答。

在本发明之前，没有特异性靶向Opn的隐蔽结构域的接种方法使得通过Thr-或MMP-切割或两者可接近，或在隐蔽结构域的背景下解决RGD区域是本领域普通技术人员已知的。

WO 02/25285 A1涉及用于转移的预后指示剂，其包含针对Opn的抗体。该文件在p.6ff上教导了包含抗原肽的疫苗将产生针对Opn的抗体。该文献仅涉及癌症的治疗。此外，该文献仅明确提到N-末端Opn序列为肽可以来源的序列，其距本发明疫苗的肽超过100个氨基酸残基。特别地，该文献教导肽优选衍生自N-末端，“因为氨基末端在细胞外暴露”–看起来忘记了Opn被分泌并任选地由蛋白酶如凝血酶加工的事实。

此外，由本发明的疫苗诱导的免疫血清在本文中显示对Opn(MmpOpn，ThrOpn或两者)的截短变体特异，同时对全长蛋白(flOpn)显示较小的反应性(参见例如图1和实施例1)。这允许在治疗中的非常靶向性的方法，其将减少经历用本发明的疫苗治疗的患者的副作用。

因此，根据本发明的“疫苗”组合物也可以被认为是“免疫原性组合物”，即在应用该组合物的人类个体中引发免疫应答的组合物。然而，已知人类个体中引发免疫应答的能力在群体内可能显著不同，因此，对于本发明的目的，如果在至少10％，优选在至少20％，更优选至少30％，特别是至少50％的给定群体的个体中，递送根据本发明的免疫原性组合物后的免疫反应是可检测的，例如特异性地针对所递送的肽的抗体由个体的免疫系统形成，那么它称为“免疫原性组合物”。

优选地，本发明的疫苗的一种或多种肽，特别是具有序列TYDGRGDSVVYG和PTVDTYDGRGDS的肽，在其C-末端被酰胺化，以便将抗体应答引导至用于免疫的肽的更中心的部分。在另一个优选的实施方案中，本发明的疫苗的一种或多种肽以其它方式修饰，如本领域中已知的。这样的修饰包括糖基化，聚乙二醇化，生物素化，烷基化，羟基化，腺苷酸化，磷酸化，琥珀酰化，氧化或酰化中的一种或多种，特别是乙酰化。这改善了本发明的疫苗的药物性质。

根据本发明，肽与药学上可接受的载体偶联或融合。优选地，药学上可接受的载体是KLH(匙孔血蓝蛋白)，破伤风类毒素，白蛋白结合蛋白，牛血清白蛋白，树枝状聚合物(dendrimer)(MAP；Biol.Chem.358：581)以及在Singh&O'Hagan,1999中描述的佐剂物质(特别是该文件的表1中的那些)和O'Hagan&Valiante,2003中描述的佐剂物质(特别是其中描述的先天免疫增强化合物和递送系统或其混合物，如可以使用低溶解性铝组合物(例如氢氧化铝)，MF59磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡核苷酸，IC31，LPS，MPL，角鲨烯，D,L-α-生育酚(例如在具有磷酸盐缓冲盐水的水包油系统中混合)，聚磷腈，乳剂(例如弗氏，SAF)，脂质体，病毒体，iscoms，螺旋物(cochleate)，PLG微粒，泊洛沙姆颗粒，病毒样颗粒，热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，突变毒素(例如LTK63和LTR72)，微粒和/或聚合脂质体)。在本发明的一个优选实施方案中，疫苗组合物含有氢氧化铝。优选地，所述肽与载体共价偶联或融合。

在特别优选的实施方案中，本发明疫苗的至少一种肽具有在其N末端和/或C末端添加的额外半胱氨酸残基，并且至少一种肽通过额外的半胱氨酸残基共价偶联至蛋白质载体或与其偶联的接头，优选其中接头含有与肽的半胱氨酸反应的马来酰亚胺基团或卤代乙酰基。

有利的是提供本发明的疫苗以及另外的赋形剂，例如以提高抗体在储存中的稳定性。因此，另一个优选的实施方案提供了本发明的疫苗，其还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

合适的赋形剂是本领域技术人员已知的，例如水(特别是注射用水)，盐水，林格氏溶液，右旋糖溶液，缓冲液，Hank溶液，形成囊泡的化合物(例如脂质)，不挥发油，油酸乙酯，盐水中的5％左旋糖，增强等渗性和化学稳定性的物质，缓冲液和防腐剂。其它合适的赋形剂包括本身不诱导在患者中产生对患者有害的抗体的任何赋形剂。实例是良好耐受的蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸和氨基酸共聚物。该疫苗可以(作为药物)通过本领域技术人员已知的适当程序施用给有需要的患者(即患有或有风险形成本文提及的疾病或病症的患者)。患者优选是人。

根据本发明的疫苗优选与佐剂，更优选低溶解性铝组合物，特别是氢氧化铝一起配制。当然，也可以使用佐剂如MF59，磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(例如IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡核苷酸，LPS，MPL，聚磷腈，乳剂(例如弗氏佐剂，SAF)，脂质体，病毒体，iscoms，螺旋物，PLG微粒，泊洛沙姆颗粒，病毒样颗粒，热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，突变毒素(例如LTK63和LTR72)，微粒和/或聚合脂质体)。

合适的佐剂是可商购的，如例如AS01B，AS02A，AS15，AS-2及其衍生物(GlaxoSmithKline，Philadelphia，PA)；CWS，TDM，Leif，铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙，铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解微球；单磷酰脂质A和醌A(quil A)。细胞因子，如GM-CSF或白细胞介素-2，-7或-12也可用作佐剂。

另一种优选的佐剂是皂苷或皂苷模拟物或衍生物，优选QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.)，其可以单独使用或与其它佐剂组合使用。例如，增强的系统涉及单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合(诸如如WO 94/00153中所述的QS21和3D-MPL的组合)或较低反应原性的组合物(reactogenic composition)，其中QS21用胆固醇淬灭，如在WO96/33739中所描述的。其它优选的制剂包括水包油乳剂和生育酚。在WO 95/17210中描述了特别有力的佐剂制剂，其涉及在水包油乳液中的QS21，3D-MPL和生育酚。用于本发明的其它皂苷佐剂包括QS7(描述于WO 96/33739和WO 96/11711中)和QS17(描述于US 5,057,540和EP 0 362 279 B1中)。

其它优选的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic,France),SAF(Chiron,California,United States),ISCOMS(CSL),MF-59(Chiron),SBAS佐剂系列(例如SBAS-2,AS2',AS2,SBAS-4,或SBAS6,可购自GlaxoSmithKline),Detox(Corixa),RC-529(Corixa,Hamilton,MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGP)。另外的实例佐剂包括合成的MPL和基于志贺毒素B亚基的佐剂(参见WO 2005/112991)。

本发明的疫苗可以通过任何合适的应用方式施用，例如真皮内(i.d.)，腹膜内(i.p.)，肌肉内(i.m.)，鼻内，经口，皮下(s.c.)等以及在任何合适的递送装置中(O'Hagan等人,Nature Reviews,Drug Discovery 2(9),(2003),727-735)施用。本发明的疫苗优选配制用于真皮内，皮下或肌内施用。用于获得相应制剂的手段和方法是本领域技术人员已知的(参见例如“Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations”，SarfarazNiazi，CRC Press Inc，2004)。

本发明的疫苗以可注射剂量单位形式提供，例如提供为溶液，悬浮液或乳液，优选与上述定义的药学上可接受的赋形剂和/或佐剂一起配制。然而，施用的剂量和方法取决于待治疗的个体患者。

通常，疫苗含有各为0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg，或者，例如，100fmole至10μmole，优选10pmole至1μmole，特别是100pmole至100nmole的量的一种或多种根据本发明的肽。

疫苗还可以包含典型的辅助物质，例如，缓冲剂，稳定剂等。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的肽的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。疫苗的剂量可根据例如个体的疾病状态，年龄，性别和重量以及抗体在个体中引起所需反应的能力等因素而变化。可以调节剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以每天，每周或每月或以其它选定的间隔施用几个分开的剂量，或者如治疗情况的紧急情况所示，剂量可以按比例减少。疫苗的剂量也可以变化以根据情况提供最佳的预防剂量反应。例如，本发明的肽和疫苗可以以几天，一或两周或甚至数月的间隔施用于个体，这总是取决于针对相应抗原的抗体的水平。

由于优选的施用方式是通过注射施用，根据本发明的疫苗优选为液体或即将溶于液体如无菌，去离子或蒸馏水或无菌等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。优选地，1000μg(干重)的这种疫苗包含或组成为0.1-990μg，优选1-900μg，更优选10-200μg肽，任选地1-500μg，优选1-100μg，更多优选5-15μg(缓冲液)盐(优选在最终体积中产生等渗缓冲液)和任选0.1-999.9μg，优选100-999.9μg，更优选200-999μg其它赋形剂。优选地，将1mg的这种干燥疫苗溶解于无菌的去离子/蒸馏水或无菌等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，得到终体积为0.1-100ml，优选0.5-20ml，更优选1-10ml。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，疫苗可以包含两种或多种以下组分/特征：

Opn，MmpOpn和ThrOpn参与人体的致病过程，如在上面的部分中详细得多描述的。此外，实施例和图显示本发明的疫苗和抗体是功能性的。因此，本发明的组合物或疫苗优选用于治疗，特别是用于治疗和/或预防CVD，特别是动脉粥样硬化或T2D，特别是肥胖相关的胰岛素抗性。

在本发明的另一方面，提供了制备本发明抗体的方法，其包括：

-在细胞培养物中表达抗体

-纯化抗体。

mAb的表达和纯化都是本领域公知的。对于大规模的抗体生产(表达和纯化)的概述，参见例如Birch&Racher，Adv Drug Deliv Rev 2006，PMID：16822577。技术包括常规mAb方法，例如和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞细胞杂交技术。也可以使用用于产生mAb的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。

在本发明的另一方面，提供了制备本发明疫苗的方法，其包括：

-提供肽

-将肽偶联至载体，优选KLH蛋白

-任选地，添加药学上可接受的赋形剂。

用于化学合成存在于本发明疫苗中的肽的方法是本领域熟知的。当然，也可以使用重组方法产生肽。肽可以在微生物，如细菌，酵母或真菌中，在真核细胞，如哺乳动物或昆虫细胞中或在重组病毒载体，如腺病毒，痘病毒，疱疹病毒，Simliki森林病毒，杆状病毒，噬菌体，辛德毕斯(sindbis)病毒或仙台病毒中产生。用于产生肽的合适细菌包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或能够表达这些肽的任何其它细菌。用于表达本发明的肽的合适的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，假丝酵母(Candida)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或任何其它能够表达肽的酵母。相应的装置(means)和方法是本领域公知的。用于分离和纯化重组产生的肽的方法也是本领域公知的，并且包括例如凝胶过滤，亲和层析，离子交换层析等。有利地，将半胱氨酸残基添加到表位肽以促进与载体的偶联，特别是在N-和/或C-端。

为了促进所述肽的分离，可以制备融合多肽，其中所述肽与异源多肽在翻译上融合(共价连接)，使得能够通过亲和层析进行分离。典型的异源多肽是His-Tag(例如His6；6个组氨酸残基)，GST-Tag(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不仅促进肽的纯化，而且还可以防止肽在纯化步骤中的降解。如果希望在纯化后除去异源多肽，则融合多肽可以在肽和异源多肽之间的接合处包含切割位点。切割位点可以由用对该位点处氨基酸序列特异性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列组成。

在本背景中，偶联/缀合化学(例如通过异双功能化合物如GMBS，当然还有如“Bioconjugate Techniques”，Greg T.Hermanson中所述的其它化合物)可以选自本领域技术人员已知的反应。药学上可接受的赋形剂在上面详细讨论并且也是本领域已知的。

本发明的抗体也适合于诊断和/或预后疾病，所述疾病涉及在患者体内ThrOpn或MmpOpn水平或两者的水平的改变(如图6和实施例6所示)。因此，在本发明的另一方面，提供了一种诊断方法，其包括：

-提供患者的分离的样品，优选来自血液和/或脂肪组织，特别是来自皮下脂肪组织的样品

-使用权利要求1至10中任一项所述的抗体测量样品中ThrOpn，MmpOpn的水平和/或ThrpOpn和MmpOpn的聚集水平，优选通过ELISA或Western印迹

-将这些水平与健康对照群体的水平和/或在较早时间点的患者水平相比较

-创建疾病或病症的诊断或预后或所述疾病或病症(优选心血管疾病，特别是动脉粥样硬化或2型糖尿病，特别是肥胖相关的胰岛素抗性)的进展的诊断或预后。患者优选是人。

在Western印迹中，与适当的对照相比，来自待诊断患有所述疾病或病症(即涉及切割的骨桥蛋白的异常水平的疾病，特别是肥胖相关的胰岛素抗性和/或动脉粥样硬化)的患者的样品的条带强度显著增加(参见图6和实施例6)。通常，与适当的对照相比，条带强度高至少25％，特别地高50％，或甚至高75％。本领域技术人员理解，与对照相比，来自诊断为具有所述疾病或病症的患者的样品的实际差异取决于许多因素，例如测量抗体结合，样品处理等的方式，并且可以容易地使本发明的方法适应所述因素，包括测量抗体结合的其它方式(例如通过ELISA)。

该方法不在患者身体中或患者身体上进行。

优选地，该方法用于监测本文所述的任何治疗的功效。

通常，产生本发明抗体的肽或作为本发明疫苗组分的肽可以在其C-末端酰胺化或以其它方式修饰，如本领域已知的。特别地，具有序列TYDGRGDSVVYG和PTVDTYDGRGDS的肽可以在其C-末端酰胺化，以便将抗体应答引导至用于免疫的肽的更中心的部分。

此外，本发明的抗体和疫苗以分离的形式提供，即在动物和/或人体外部提供。

本文中，如果没有另外说明，骨桥蛋白，Opn，flOpn，MmpOpn和ThrOpn的表达分别总是指人骨桥蛋白，人Opn，人flOpn，人MmpOpn和人ThrOpn。

如本文所用，术语赋形剂比术语载体宽，即每种载体是赋形剂，但反之则不是如此。

如本文所用的“治疗”是指治愈已存在的疾病状态或病症。治疗还可以包括抑制，即阻止疾病状态或病症的发展，以及改善，即引起疾病消退。

如本文所用的术语“预防”是指完全或几乎完全阻止疾病状态或病症在患者或受试者中发生，特别是当患者或受试者对患上疾病状态或状况的风险易感时。

如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域的每个区域，其是在序列中高度可变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)，和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文公开了示例性HVR。

本文中，术语“Ab”是指抗体，而术语“mAb”是指单克隆抗体。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生产期间产生)之外，这样的变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体，酵母或哺乳动物细胞展示方法，以及使用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法。

对于本发明，术语“药物制剂”和“药理学组合物”可互换使用，是指旨在并适于递送至人类个体的组合物。这样的制剂或组合物已根据GMP(良好的制造实践)制造，并且充分无菌并包装以符合EMA和FDA，特别是EMA所需的前提条件。

通过以下实施例和附图进一步描述本发明，但不限于此。

附图简述

图1：疫苗诱导的血清对全长Opn(flOpn)，凝血酶切割的Opn(ThrOpn)或金属蛋白酶切割的Opn(MmpOpn)的免疫反应性。使用ELISA测试免疫反应性。(A)含有肽序列SEQ IDNO:1-5的疫苗主要引发针对ThrOpn的血清。(B)含有肽序列SEQ ID NO:6-9的疫苗主要引发结合MmpOpn的血清。虽然肽序列SEQ ID NO:10以与肽SEQ ID NO:6-9相同的氨基酸结束，所有这些都代表Mmp-切割位点，含有SEQ ID NO:10的疫苗诱导了识别所有测试的Opn变体的免疫血清。(C)含有肽序列SEQ ID NO:11-14的疫苗诱导结合所有测试的Opn变体的血清。

图2：疫苗诱导的抗体的功能活性的评估。(A)由全长Opn诱导的细胞粘附可以仅使用由含有SEQ ID NO:12或14的疫苗引起的血清阻断，所述血清疫苗包含显示与包括flOpn的所有Opn变体结合。所有其它血清不显示这种抑制潜力。由ThrOpn(B)或MmpOpn(C)诱导的细胞粘附可被以下阻断：针对ThrOpn特异性的血清(由SEQ ID NO:1或2引起)或针对MmpOpn特异性的血清(由SEQ ID NO:7或8引起)和由含有SEQ ID NO:12或14的疫苗诱导的血清(所述血清显示针对所测试的所有Opn变体的泛(pan)反应性)。对照血清在所有情况下都不显示对细胞粘附的任何影响。

图3：mAb针对全长Opn(flOpn)，凝血酶切割的Opn(ThrOpn)或金属蛋白酶切割的Opn(MmpOpn)的免疫反应性。使用ELISA测试免疫反应性。(A)mAb4-4-2仅显示与ThrOpn结合。(B)和(C)mAb 7-5-4和9-3-1显示对ThrOpn的次要交叉反应性，但对MmpOpn高度反应性。(D)21-5-4mAb结合所有Opn形式，但对切割的Opn变体更具反应性。

图4：mAb在Western印迹分析中针对flOpn(泳道1-4)，ThrOpn(泳道5-6)或MmpOpn(泳道7-8)的免疫反应性。(A)mAb 4-4-2显示与ThrOpn的弱但排他性的结合。(B)和(C)mAb7-5-4和9-3-1显示对两种切割的Opn形式的结合，但显然对MmpOpn更具反应性。(D)21-5-4mAb结合所有Opn形式，但对切割的Opn变体更具反应性。(E)描绘了使用的标记。(F)加载方案。

图5：mAb的功能活性的评估。(A)通过ThrOpn诱导的细胞粘附可以被mAb 21-5-4，mAb 4-4-2阻断，尽管针对ThrOpn的特异性，在这种背景下看起来没有抑制能力。(B)由MmpOpn诱导的细胞粘附可被对MmpOpn更具反应性的mAb，如mAb 7-5-4和9-3-1以及泛反应性mAb 21-5-4阻断。

图6：人脂肪组织(AT)中切割的OPN的测定。(A)使用mAb 9-3-1对皮下AT裂解物进行免疫印迹。(B)与调查的所有瘦(n＝6)和肥胖(n＝6)供体的b-肌动蛋白相关的25kD条带的定量。该图显示平均值+/-SE。**，p<0.01(Student氏T检验)。

图7：mAb 4-4-2的CDR环测序结果的图示。(A)V_H区的CDR环(B)V_L区的CDR环。根据Lefranc等人(Nucleic Acids Research 1999，PMID：12477501)的表示/IMGT编号系统。蓝色阴影圆圈是在大多数抗体中疏水的位点中的框架1-3中的疏水(非极性)残基。黄色阴影圆圈是脯氨酸残基。正方形是CDR的起始和结束处的关键残基。框架中的红色氨基酸是结构上保守的氨基酸。

图8：mAb 7-5-4(和相同的克隆mAb 9-3-1)的CDR环测序结果的图示。(A)V_H区的CDR环，(B)V_L区的CDR环。根据Lefranc等人(Nucleic Acids Research1999，PMID：12477501)的表示/IMGT编号系统。蓝色阴影圆圈是在大多数抗体中疏水的位点中的框架1-3中的疏水(非极性)残基。黄色阴影圆圈是脯氨酸残基。正方形是CDR的起始和结束处的关键残基。框架中的红色氨基酸是结构上保守的氨基酸。

图9：mAb 21-5-4的CDR环测序结果的图示。(A)V_H区的CDR环(B)V_L区的CDR环。根据Lefranc等人(Nucleic Acids Research 1999，PMID：12477501)的表示/IMGT编号系统。蓝色阴影圆圈是在大多数抗体中疏水的位点中的框架1-3中的疏水(非极性)残基。黄色阴影圆圈是脯氨酸残基。正方形是CDR的起始和结束处的关键残基。框架中的红色氨基酸是结构上保守的氨基酸。

实施例

材料与方法

主动疫苗接种方法

用KLH-缀合的肽疫苗(在磷酸盐缓冲液pH7.4中，200μl经皮下)将雌性BALB/c小鼠(6-8周)引发并每两周间隔加强免疫四次。使用氢氧化铝作为佐剂。使用六只小鼠来注射各自的KLH-缀合的肽疫苗。重复实验，其代表如下所示。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析小鼠血清的抗体滴度。滴度计算为给出半数最大结合的血清稀释度(即OD max/2)，并且呈现了每组5至6只小鼠的中值滴度。通过葡糖醛酸糖苷酶酶释放测定评估诱导的抗体的功能活性。

单克隆抗体生产

用于免疫的抗原

用缀合物注射小鼠，所述缀合物在于通过含有马来酰亚胺基团的接头(N-甲基吡咯烷酮，NMP)与载体蛋白KLH(MP Biomedicals)偶联的肽。我们使用三种不同的肽：SEQ IDNo.2(序列SVVYGLR-COOH)，SEQ ID No.7(序列GDSVVYG-COOH)和SEQ ID No.12(序列C-TYDGRGDSVVYG-CO-NH2)。序列C-SVVYGLR-COOH用于诱导并最终产生特异性靶向ThrOpn的抗体，而以产生特异性结合MmpOpn的抗体而目的使用序列C-GDSVVYG-COOH。相反，序列C-TYDGRGDSVVYG-CO-NH2用于免疫，目的是诱导结合RGDSVVYG基序，并且因此对ThrOpn和MmpOpn两者都是特异性的的抗体。

肽的缀合通过接头与N-末端半胱氨酸的SH-基团的结合而发生，并且是两步法。首先，将KLH马来酰化(maleoylated)；将1mg接头(50mg/ml NMP)添加1ml的KLH溶液(在0.1mMNaHCO3，pH＝8.3中的10mg/ml)中并在室温(RT)下温育1小时。接下来，使用PBS平衡的Sephadex G50柱(1.5×14cm)将KLH-接头溶液脱盐。在第二步中，将马来酰化的KLH与肽偶联；将100μl肽溶液(10mg/ml，在水中(in aqua bidest))与1ml的马来酰化的KLH溶液(2mg/ml，在PBS中)混合，并在室温下温育2小时。为了封闭不反应的马来酰亚胺基团，向溶液中添加2-巯基乙醇(直到10nM的浓度)，并在4℃温育过夜。然后将缀合物在4℃下对PBS透析(更换缓冲液三次，分子量截止值设定为10.000)。

用于分析的抗原

为了排除在小鼠血清和杂交瘤上清液中的NMP-和KLH-特异性抗体，根据以上描述的方案，使用了用于各自ELISA分析的肽(参见“免疫”和“脾细胞与骨髓瘤细胞的融合”)，不同的接头(SMPH，琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸(Succinimidyl-6-[(β-maleimidopropioamido)hexanoat)]，Sigma)-载体蛋白(BSA，Sigma))的组合。

免疫

在39天的时间段内，通过腹膜内注射用缀合物免疫雌性8周龄BALC/c小鼠(Janvier，France)。在免疫接种时间期间收集血清样品，并在ELISA中作为成功抗体诱导的对照进行测试。

脾细胞和骨髓瘤细胞的融合

在39天的时间段内，通过腹膜内注射用缀合物免疫雌性8周龄BALC/c小鼠(Janvier，France)。在免疫时间期间收集血清样品，并在ELISA中作为成功的抗体诱导的对照进行测试。

脾细胞和骨髓瘤细胞的融合

根据以下方案通过将脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，其产生针对三种骨桥蛋白肽的抗体。通常，细胞在完全DMEM培养基(PAN Biotech)中培养，所述培养基补充有抗生素(10000L.E青霉素，10000μg/ml链霉素，25μg/ml两性霉素，100x，PAA)，2-巯基乙醇(Sigma)，L-谷氨酰胺100X，PAA)，稳定谷氨酰胺(100x，PAA)，HT-补充剂(50x，GIBCO/BRL)，MEM非必需氨基酸(100x，PAA)和10、15或20％FCS(PAA)。取出免疫的小鼠的脾脏，使用匀浆器和细胞滤器处理成单细胞悬浮液。骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(SP2/0)从“DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)”订购，在完全DMEM培养基(10％FCS)中培养，并定期测试支原体污染。脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0用DMEM洗涤并用聚乙二醇3350(1ml 50％w/v，Sigma)融合。将所产生的杂交瘤重悬于完全DMEM培养基(20％FCS)和氨基喋呤(50x，Sigma)(HAT培养基)中，并接种在96孔组织培养板(Corning Costar)中的腹膜饲养细胞上。将杂交瘤在37℃，5％CO₂下孵育10天。

用于筛选小鼠血清和杂交瘤上清液的ELISA

用在100mM NaHCO₃pH＝9.6中的4μg/ml肽-BSA缀合物(参见下表)包被ELISA板(PAA，Cat#PAA38096X)。然后用TBS(10mM Tris，200mM NaCl，pH＝7.8)和0.01％Triton X-100洗涤平板，并用在TBS中的2％FCS(v/v)封闭。将杂交瘤上清液(未稀释的)和血清(1:100)在封闭缓冲液中稀释，并应用到包被的平板上。将SP2/0细胞的细胞上清液用作阴性对照。然后洗涤平板，并用AP-缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma)检测结合的抗体。使用4-硝基苯基磷酸盐(4-Nitrophenylphosphat)(2mM，在5％二乙醇胺，1mM MgCl2，Fluka中)作为碱性磷酸酶(AP)的底物。使用微板读板仪(Dynex Opsys MR)在405nm读取吸光度。通过血清滴定测定小鼠血清中的抗体滴度。为了筛选杂交瘤上清液，当信号是405nm处平均ELISA板值的两倍高时，将克隆宣布为阳性。

合成所有以下肽，其在N-末端具有用于偶联的另外的半胱氨酸残基

抗体产生克隆的选择阶段

将在ELISA中测试为阳性的细胞转移到48孔板中并培养几天。在该时间段中，通过ELISA再次测试上清液与各个相关肽的反应性。选择期短，以避免非特异性克隆的过度生长。

克隆

在选择阶段之后，进行第一次克隆，主要目的是分离产生抗体的细胞与非产生细胞。第二次克隆确保所选择的克隆是单克隆的。在两种情况下，通过有限稀释进行克隆，并在24孔板中转移细胞。6-8天后，在显微镜下分析单克隆细胞生长。再过3天后，通过ELISA分析上清液。选择显示最佳生长和ELISA信号的亚克隆用于第二次克隆，并进一步用于冷冻保存。测试亚克隆上清液的支原体污染(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)，并通过市售试剂盒(Serotec)测定单克隆抗体的同种型。

单克隆抗体序列测定

单克隆抗体测序通过Fusion Antibodies Ltd(Springbank Industrial Estate，Pembroke Loop Road，Belfast，N.Holland，BT17 0QL)进行。

在10/10/13从杂交瘤细胞沉淀中提取mRNA。使用Fusion Antibodies Ltd内部RNA提取方案从沉淀中提取总RNA。

RT-PCR

用寡聚物(dT)引物通过逆转录从RNA产生cDNA。以S.N.A.P纯化cDNA，并且使用5’RACE试剂盒进行通过TdT对cDNA加尾。使用AAP和可变域反向引物建立PCR反应，以扩增单克隆抗体DNA的VH和VL区两者。

将VH和VL产物克隆到Invitrogen测序载体pCR2.1中并转化到TOP10细胞中，通过PCR筛选阳性转化体。挑取选择的菌落，并通过在ABI3130xl基因分析仪上通过DNA测序分析，结果可见于下文。

重组人Opn蛋白的克隆，产生和生产

表达和纯化包括指示的标签(Strep，6xHis)的Opn的3种重组形式：

a)Strep-314AA(全长Opn)-6xHis

b)6xHis-166AA(N-末端MMP-切割的Opn)

c)6xHis-168AA(N-末端凝血酶切割的Opn)

使用cDNA克隆BC017387(Thermo Scientific)作为模板。

使用相同的正向引物(5’-AGCGGCTCTTCAATGATACCAGTTAAACAGGCTGATTC-3’；SEQID NO:42)和以下反向引物扩增DNA序列：

a)Strep-314AA(5’-AGCGGCTCTTCTCCCATTGACCTCAGAAGATGCA CT-3’；SEQ ID NO:43)，

b)6xHis-166AAA(5’-AGCGGCTCTTCTCCCCTATCCATAAACCACACT ATCACC-3’；SEQ IDNO:44)(仅包含N-末端标记形式的166AA后的终止密码子)

c)6xHis-168AAA(5’-AGCGGCTCTTCTCCCCTACCTCAGTCCATAAAC CACAC-3’；SEQ IDNO:45)(仅对于N-末端加标签的形式，在168AA后包含终止密码子)。

使用StarGate Entry Cloning系统(IBA，)将扩增子克隆到pENTRY-IBA51质粒中，然后亚克隆到pCSG-IBA142或pCSG-IBA144质粒(全部IBA)中，引入N端6x组氨酸标签，N末端标签，C末端6x组氨酸标签，按照制造商的说明书进行。

通过使用Lipofectamine 2000(Life Technologies，Carlsbad)转染来诱导在HEK293c18细胞系(ATCC，CRL-10852)中的瞬时表达，然后用Ni-NTA树脂(Merck，Darmstadt)或Strep-Tactin(IBA，)包装的重力流动柱纯化。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化的蛋白质，并针对PBS透析。

用于单克隆抗体与重组Opn蛋白的交叉反应性的ELISA

用在100mM NaHCO₃pH＝9.2中的1μg/ml重组人Opn蛋白(自制或来自PeproTech，Cat#120-35作为对照)包被ELISA板(Nunc，Cat#439454)，并用在1x PBS中的1％BSA包被。使用HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson Laboratory,Cat#115-035-068,0.2μg/ml)检测结合的小鼠抗人单克隆抗体(BioGenes，1μg/ml)和用作阳性对照的小鼠血清。使用ABTS(0.1M柠檬酸中的0.68mM ABTS，pH＝4.3)和0.1％过氧化氢作为辣根过氧化物酶(HRP)的底物。通过向孔中添加1％SDS溶液终止底物反应。使用微板读板仪(TECAN Sunrise)在405nm读取吸光度。

凝胶电泳和Western印迹

对于凝胶电泳，使用4-20％Criterion TDX预制凝胶(BioRad，Cat#567-1095)。将重组人Opn蛋白(自制或来自PeproTech，Cat#120-35)在还原性加载缓冲液(4x LDS-缓冲液，Invitrogen，Cat#NP0007，补充有0.1％(v/v)β-巯基乙醇)在70℃变性10min。每孔加载的蛋白质的量为0.6μg。使用Precision Plus Protein Dual(Biorad，Cat#161-0374)作为蛋白梯和1×Tris/甘氨酸/SDS缓冲液作为运行缓冲液(Biorad，Cat#161-0732)。使用Transfer Turbo印迹转移包(Biorad，Cat#170-4159)将蛋白质转移到0.2μm硝酸纤维素膜上。用市售封闭溶液(Thermo scientific，#37515)封闭膜。抗体在1:10封闭溶液中稀释。首先将膜与小鼠抗人单克隆抗体(BioGenes，1μg/ml)孵育1小时，并用0.1％PBST洗涤。为了检测，将HRP缀合的IgG抗体(Southern Biotech，Cat#1034-05,1：40.000)孵育45分钟。然后用洗涤缓冲液和dH₂O洗涤膜。最后将膜与底物(ECL Clarity Western，Biorad#170-5061)孵育5分钟。使用LabWorks软件4.6进行图像采集。

功能测定-粘附测定

用0、10或30nM重组人Opn蛋白(1小时，37℃)包被具有V形底部的微板(Greiner，Cat#651161)，并用1％BSA/1×PBS(1小时，37℃)封闭。用1×PBS洗涤后，向孔中添加5μg/ml封闭抗体(在37℃下1小时)。使用小鼠抗人单克隆抗体(BioGenes)和IgG1同种型对照(Sigma，Cat#M9269)。接下来，洗涤板，并向孔中添加20.000个预先用CMFDA标记的HEK293细胞(30分钟，37℃)。短暂地，用0.02％EDTA(Versene，GIBCO，Cat#15040)收获HEK293细胞，并重悬于补充有10％FCS，1％青霉素/链霉素(GIBCO，Cat#15140)和4mM L-谷氨酰胺(GIBCO，Cat#25030)且不含酚红的DMEM(Sigma，Cat#D5921)中。为了标记，将1.5μM CMFDA细胞示踪剂(Molecular Probes，Cat#C7025)添加到HEK293细胞中(30分钟，37℃，500rpm)。将细胞用不含酚红的DMEM洗涤两次，然后添加孔中。在板上温育细胞后，将板在100g离心5分钟。当非粘附细胞移动到V形孔的底部时，通过底部读数(Genios微板读板仪，激发485nm，发射535nm)测量荧光强度来量化它们。

表面等离振子共振(SPR)

在Biacore 2000上进行结合分析。将代表不同Opn产物的不同生物素化的肽配体分别以30μl/min的流速固定在一个流动池中的链霉亲合素芯片上。第四个流动池是没有肽的参考池。将肽溶解于DMSO溶液中并进一步在HBS缓冲液(0.01M Hepes，0.1M NaCl，0.004MEDTA，0.05％P2O，pH＝7.4)中稀释。固定后，用1μM D-生物素饱和每个流动池中的芯片。作为对照，将非特异性血清注射到所有细胞。在2μg/ml的浓度下，抗体的流速为30μl/min，注射体积100μl。解离时间设定为500秒。用60μl 50mM HCl再生芯片。使用Biocore SPR软件计算解离速率值和KD值。

本发明的mAb作为诊断工具-测定人样品中的OPN浓度(也参见实施例6)

皮下脂肪组织(AT)活检获自年龄在20和65岁之间严重肥胖(BMI≥40kg/m2)或年龄和性别匹配的瘦至超重对照(BMI≤30)的非糖尿病患者[空腹血浆葡萄糖<126mg/dL；和在75-g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后2-h血浆葡萄糖<200mg/dL]，所述患者经历选择性肥胖症治疗剂(elective bariatric)或其它腹腔镜腹部手术。在以下的病例中排除患者：过去2周内急性疾病；已知的糖尿病或使用抗糖尿病药物；获得性免疫缺陷(HIV感染)；肝炎或其它重大肝病；严重或未治疗的心血管，肾或肺部疾病；未治疗或未充分治疗的临床重大甲状腺疾病；贫血；活动性恶性疾病；先天性或获得性出血性疾病，包括华法林(warfarin)治疗；怀孕或哺乳。

将50mg冷冻的AT在210μl裂解缓冲液中匀浆，所述210μl裂解缓冲液含有20mMTris，140mM NaCl，1％Triton-X，完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和原钒酸钠(sodium-orthovanadate)(1mM)，调整到pH 7.4。随后将样品在还原样品上样缓冲液中在95℃煮沸10分钟，并在4℃下以10k U/min离心。取脂肪层下面的流体相，重复离心，并使用600nm蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific)测量蛋白质浓度。使用12％聚丙烯酰胺凝胶在SDS-PAGE上分离每个样品的10μg蛋白质，并根据标准Western印迹程序印迹到硝酸纤维素膜上。使用20μg/ml的mAb CMI 9-3和HRP标记的山羊抗小鼠(BioRad#170-6516)检测25kDa处的OPN片段。抗b-肌动蛋白(Novus Biologicals#AC-15)充当加载对照。使用Fusion-FX成像仪器(Peqlab)和ImageJ软件(ImageJ，美国国立卫生研究院)对印迹进行可视化并且对条带强度进行定量。

主动接种

实施例1：诱导特异性结合凝血酶切割的或MMP3/7/9切割的OPN形式的抗体免疫应答，以及在隐蔽结构域的背景下诱导结合159QGD161区域的抗体应答，从而结合所有OPN形式(全长，凝血酶切割的和MMP3/7/9切割的OPN)。

在该研究中，用含有如表1所列抗原肽之一的缀合疫苗免疫小鼠。本研究的目的是鉴定具有诱导特异性结合Opn的截短形式，凝血酶切割的或MMP3/7/9切割的Opn形式的抗体应答的能力的抗原肽。此外，该研究旨在鉴定在Opn的隐蔽结构域的背景下诱导结合159RGD161基序(motive)的抗体应答的抗原肽，因此是Opn特异性的，但不区分不同Opn形式(全长，凝血酶切割的，和MMP3/7/9切割的Opn)。

为了鉴定能够诱导特异性靶向由凝血酶切割产生的新表位的抗体应答的肽，使用在其长度上不同的肽(SEQ ID NO:1-5)用于免疫。所有这些肽在其C-末端以代表凝血酶-切割位点的精氨酸(R)结束。这些肽在其C-末端不被酰胺化。

为了鉴定能够诱导特异性靶向由MMP3/7/9切割产生的新表位的抗体应答的肽，再次使用在其长度上不同的肽(SEQ ID No.6-10)用于免疫。所有这些肽在其C-末端以代表MMP-切割位点的甘氨酸(G)结束。这些肽在其C-末端不被酰胺化。

为了鉴定在Opn的侧翼氨基酸(包括隐蔽结构域)的背景下能够诱导特异性靶向Opn的RGD区(位于位置159-161)的抗体应答的肽，将肽SEQ ID No.11-14用于免疫。这些肽已经以如下方式设计，使得用于免疫的抗原肽穿过(walk over)RGD基序。这些肽在其C-末端被酰胺化，以将抗体应答引导至用于免疫的肽的更中心的部分。

表1.本发明中用于基于活性肽的缀合疫苗以诱导靶向Opn的抗体免疫应答的肽序列。肽SEQ ID No.1-SEQ ID No.10具有游离羧基末端(COO^-)，而肽SEQ ID No.11-14的C末端优选被酰胺化(COO-NH₂)(并且在本文所述的实验中被酰胺化)

用指定的肽免疫小鼠，并且诱导的针对不同的重组产生的Opn形式((全长[flOpn]，以凝血酶切割位点1-Opn-168结束的截短Opn[ThrOpn]，以Opn MMP切割位点1-Opn-166结束的截短Opn[MmpOpn]))的抗体的中值滴度显示于图1中。尽管所有测试的肽能够诱导以相同量值结合注射肽(数据未显示)的抗体，但是由这些肽引发的血清在它们对flOpn，ThrOpn和MmpOpn的反应性方面非常大地变化。

令人惊奇的是，肽SEQ ID No.1(尽管免疫应答的量级与SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3相比更低)，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3诱导几乎特异性针对凝血酶切割的Opn形式的免疫应答。而SEQ ID No.4和SEQ ID No.5诱导的抗体看起来也结合MmpOpn。

相比之下，肽SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9诱导以高特异性和高量级靶向MMP-切割的Opn形式的抗体应答(图1B)。当分析已经由其它蛋白质引起的血清时，情况不是这样。

有趣的是，肽SEQ ID No.10、SEQ ID No.12和SEQ ID No.14诱导了与所有形式的Opn反应的血清(图1C)。重要的是，引发的血清对Opn是特异性的，并且因此在侧翼Opn特异性氨基酸的背景下抗体的结合需要氨基酸159RGD161。

重要的是，用作对照的疫苗不诱导结合Opn形式之一的抗体应答(数据未显示)。

实施例2：疫苗诱导的免疫血清的功能评价

为了评估疫苗引发的血清(如实施例1所述)阻断不同形式的Opn(全长，Thr-切割的或MMP-切割的Opn)活性的潜力，如在材料和方法部分详细描述地进行功能性粘附测定。短暂地，用重组产生的全长Opn，用以凝血酶切割位点(ThrOpn或1-Opn-168)结束的截短的重组Opn蛋白或用以MMP3/7/9切割位点结束的截短的重组Opn蛋白(MmpOpn或1-Opn-166)包被96孔板。随后，将自如实施例1中所述的免疫动物衍生的血清和用荧光染料标记的HEK293细胞添加板。如材料和方法部分所述测量和计算粘附。

从图2中可以看出，肽序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2引起的血清(已经显示特异性靶向Opn的Thr-切割形式(图1A))，仅阻断HEK293细胞对ThrOpn的粘附(图2B)，而不干扰HEK293细胞与其它Opn形式的粘附(图2A和2C)，证实了SEQ ID No.1和SEQ ID No.2诱导的血清的特异性(图1)。重要的是，当与由SEQ ID No.2肽引发的血清相比时，在使用由SEQ IDNo.1引起的血清时抑制HEK293细胞对ThrOpn包被的平板的粘附更不明显。这与这些诱导的血清对Thr-Opn的反应性一致(图1A)。

与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2相反，显示特异性靶向MmpOpn(图1B)的SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8仅在已经用以MMP-切割位点结束的截短的Opn(MmpOpn)包被的板上阻断HEK293细胞的粘附(图2C)。这些数据再次证实了诱导的血清对MmpOpn的特异性。

显示结合Opn的所有形式(图1)的SEQ ID No.12和SEQ ID No.14具有阻断HEK293细胞对所有不同Opn形式的粘附的能力(图2A-2C)，再次确认它们的泛-反应性。

作为对照，使用由不相关的肽序列引发的血清(对照序列1和2)。如所预期的，这些血清不干扰HEK293细胞对每个Opn形式的粘附。

单克隆抗体的产生和这些mAb的评价

实施例3：单克隆抗体的产生和纯化以及通过ELISA和Western印迹测定针对不同OPN产物的结合特性

为了产生特异性靶向并因此区分不同Opn产物(全长，ThrOpn和MmpOpn)的mAb，用显示为诱导特异性抗体应答的不同肽序列免疫小鼠(图1和图2)。

如表2中概述，为了产生特异性结合Thr-切割的Opn产物的抗体，将SEQ ID No.2用于免疫。为了产生特异性结合MMP-切割的Opn产物的抗体，将SEQ ID No.7用于免疫，并且为了产生结合所有Opn产物(无论是否全长或切割的)的抗体，将SEQ ID No.12用于免疫。

如材料和方法部分所述产生，选择和纯化产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。审慎地筛选和分析大量产生mAb的杂交瘤细胞系，并最终选择四种不同的产生抗体的杂交瘤细胞系，如表2中所列的。通过在蛋白A柱上亲和纯化从细胞培养上清液纯化单克隆Ab，并并如表2所述进行表征和分类。

表2：单克隆抗体的特征

为了更详细地表征mAb的结合能力，进行了ELISA研究和Western印迹分析。

首先，使用ELISA测试不同mAb特异性识别不同Opn产物(全长或截短的Opn片段)的能力。

如图3所示，测定了单个单克隆抗体对天然全长和蛋白酶切割的Opn的特异性。图3A显示mAb 4-4-2与ThrOpn特异性相互作用，而mAb 7-5-4和mAb9-3-1特异性结合MmpOpn(分别为图3B和3C)。由已知将抗体应答指向RGD区的SEQ ID No.12引起的mAb 21-5-4的反应性显示于图3D中。该mAb看起来结合所有Opn产物，尽管对切割的Opn形式的反应性更加显著。

在下一组实验中，通过Western印迹分析确定不同mAb明显结合蛋白酶切割的Opn片段和/或全长Opn蛋白的能力(图4)。单克隆Ab 4-4-2以低信号强度与ThrOpn反应(图4A，泳道5和6)，而mAb 7-5-4和mAb 9-3-1以高强度与MmpOpn特异性相互作用(图4B和4C；泳道7和8)。如从ELISA数据预期的，mAb 21-5-4使所有Opn形式染色(图4D；全长Opn-泳道1-4，蛋白水解切割的Opns-泳道5-8)。再一次，在Western印迹上全长Opn比切割的Opn形式以更低的强度检出。因为应用于泳道1-4的重组产生的全长Opn蛋白包含不同的标签系统，所以这些蛋白在其大小上不同，因此出现在凝胶和/或印迹上的不同位置。图4E表示在这些实验中使用的标记物M1，并且图4F描述不同的Opn产物如何应用于凝胶。

实施例4：使用粘附测定法对所选mAb 4-4-2、7-5-4、9-3-1和21-5-4的功能评价

在下一组实验中，进行进一步分析以就在所述基于细胞的测定中抑制HEX293细胞对相应Opn片段的粘附而言表征抗体的功能活性。ThrOpn和MmpOpn用于该目的。图5A描绘了单克隆抗体抑制HEK293细胞粘附到凝血酶切割的Opn(ThrOpn)的能力。尽管mAb 4-4-2已经显示与ThrOpn特异性相互作用(图3和4)，但其在该功能测定中没有阻断ThrOpn的能力(图5A)。在ELISA和Western印迹中抗体与Opn的结合和在基于细胞的测定中缺失功能活性之间的这种差异可以通过其对靶蛋白的相当低的亲和力(特别是高解离速率)来解释(表3)。相反，mAb 21-5-4强烈降低HEK293细胞与ThrOpn的结合。此外，该mAb还抑制HEK细胞与MmpOpn的结合(图5B)，再次证实其对不同Opn产物的泛反应性。MMP切割位点特异性mAb 7-5-4和9-3-1专门抑制MmpOpn诱导的HEK细胞粘附(图5B)，在这种情况下也证实了自ELISA和Western印迹分析导出的数据，从而证明了它们的特异性。mAb

实施例5：使用SPR进行mAb 4-4-2、7-5-4、9-3-1和21-5-4的亲和力测定

为了限定所选mAb对其各自靶标的结合强度，使用代表不同Opn产物的肽进行SPR分析。单克隆Ab 4-4-2表现出13,9nM的对ThrOpn的亲和力和2,79E^-3sec^-1的解离速率值(描述了一旦形成，抗体-靶标复合物的稳定性)。这个解离速率值相当高，表明靶标-抗体复合物的稳定性是适度的。因此，在包括多个洗涤步骤的情况下(例如在所使用的基于细胞的功能粘附测定中)，抗体将从其靶标被洗去。这预期是这种抗体在功能测定中不显示对HEK293粘附的抑制的原因。另一方面，mAb 4-4-2显示出中等至良好的亲和力(KD 13,9nM)，因此该抗体显示出高的结合速率能力，其代表识别和结合其靶标的能力和速度。在较为生理的情况下(其中抗体持久性不受消耗抗体的步骤的影响)，预期mAb 4-4-2也显示功能活性。

单克隆抗体7-5-4和9-3-1显示几乎相同的解离速率和KD值。在两种情况下，KD值在最低nM或甚至高pM范围内，代表了高亲和力。mAb 21-5-4显示出优异的解离速率值。该抗体还显示对靶区域的最高亲和力。

表3.mAb对其靶标的亲和力测定

总结mAb结果

单克隆Ab 4-4-2特异性识别天然(图3A)以及其变性(图4A)形式的ThrOpn。

单克隆抗体7-5-4和9-3-1特异性识别其天然(图3B和C)以及其变性(图4B和C)形式的MmpOpn并且是功能活性的，导致明显抑制MmpOpn诱导的HEK293细胞的粘附(图5B)。

单克隆抗体21-5-4识别其天然(图3D)以及其变性(图4D)形式的所有Opn片段。此外，它是功能活性的，因为它导致对MmpOpn-和ThrOpn诱导的HEK293细胞粘附两者的明显抑制。

实施例6：本发明的MAB用于诊断的用法

为了测试Opn和MMP增加的基因表达是否反映在人脂肪组织(AT)中的Opn蛋白和Opn片段丰度中，我们通过凝胶电泳分离来自肥胖和对照的AT蛋白溶胞物，并使用mAb 9-3-1探测Opn。这些mAb显示主要识别Mmp切割的Opn。我们发现相对于β肌动蛋白表达标准化的对应于C末端切割产物的25kD条带的显著增加的强度(图6)。

实施例7：单克隆抗体测序

从杂交瘤细胞沉淀中提取mRNA。从沉淀中提取总RNA。通过用寡聚物(dT)引物逆转录从RNA产生cDNA。对cDNA进行S.N.A.P纯化，并且使用5’RACE试剂盒进行通过TdT对cDNA加尾。使用AAP和可变域反向引物建立PCR反应，以扩增单克隆抗体DNA的VH和VL区两者。将VH和VL产物克隆到Invitrogen测序载体pCR2.1中并转化到TOP10细胞中，并通过PCR筛选阳性转化体。挑取选择的菌落，并通过在ABI3130xl遗传分析仪上进行DNA测序来分析，结果显示在图7(mAb 4-4-2)，图8(mAb 7-5-4和9-3-1，其证明与mAb7-5-4相同)和图9(mAb 21-5-4)中。

本发明通过(但不限于)以下实施方案进一步举例说明：

1.对人骨桥蛋白(Opn)的一种或多种截短变体特异性的单克隆抗体，

其中所述抗体对所述一种或多种截短变体比对全长Opn(flOpn；SEQ ID NO:15)更具反应性；且

其中所述抗体对以下是特异性的：

(A)基质金属蛋白酶截短的Opn(MmpOpn；SEQ ID NO:16)，其中所述抗体对MmpOpn(SEQ ID NO:16)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和凝血酶截短的Opn(ThrOpn；SEQ ID NO:17)中的每一种更具反应性；或

(B)MmpOpn(SEQ ID NO:16)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)两者，其中所述抗体对MmpOpn(SEQ ID NO:16)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种比对flOpn(SEQ ID NO:15)更具反应性；或

(C)ThrOpn(SEQ ID NO:17)，其中所述抗体对具有选自VVYGLR，SVVYGLR和DSVVYGLR(SEQ ID NO:1-3)的肽序列的ThrOpn表位是特异性的，其中如果所述抗体对具有肽序列SVVYGLR的表位是特异性的，那么所述抗体的重链可变域(V_H)和所述抗体的轻链可变域(V_L)包含具有以下序列的互补决定区(CDR)：

并且其中所述抗体对ThrOpn(SEQ ID NO:17)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和MmpOpn(SEQ ID NO:16)中的每一种更具反应性，并且优选地其中V_H包含SEQ ID NO:24的序列，并且V_L包含SEQ ID NO:25的序列。

2.实施方案1(A)的抗体，其中所述抗体对具有选自GDSVVYG，RGDSVVYG和DGRGDSVVYG(SEQ ID NO:7-9)的肽序列的MmpOpn表位是特异性的。

3.实施方案1(B)的抗体，其中所述抗体对具有选自TYDGRGDSVVYG(SEQ ID NO:10)和PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)的肽序列的MmpOpn/ThrOpn表位是特异性的。

4.实施方案2的抗体，其中所述抗体对具有肽序列GDSVVYG的表位是特异性的，并且所述抗体的CDR包含以下序列：

并且优选地其中V_H包含SEQ ID NO:32的序列，并且V_L包含SEQ ID NO:33的序列。

5.实施方案3的抗体，其中所述抗体对具有肽序列TYDGRGDSVVYG的表位是特异性的，并且所述抗体的CDR包含以下序列：

并且优选地其中V_H包含SEQ ID NO:40的序列，并且V_L包含SEQ ID NO:41的序列。

6.实施方案1(C)，4或5的抗体，其中所述CDR或V_H或V_L中的氨基酸中的三个，优选两个，更优选一个是突变成任何其它氨基酸的。

7.实施方案1至6中任一项的抗体，其中

-在所述抗体对MmpOpn(SEQ ID NO:16)特异性的情况下，所述抗体对MmpOpn(SEQID NO:16)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种更具超过N倍的反应性；和

-在所述抗体对MmpOpn(SEQ ID NO:16)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)两者都是特异性的情况下，所述抗体对MmpOpn(SEQ ID NO:16)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种比对flOpn(SEQ ID NO:15)更具超过N倍的反应性；以及

-在所述抗体对ThrOpn(SEQ ID NO:17)特异性的情况下，所述抗体对ThrOpn(SEQID NO:17)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和MmpOpn(SEQ ID NO:16)中的每一种更具超过N倍的反应性(more than N times more reative)；且

其中N大于1.5，优选大于2，更优选大于3，甚至更优选大于5，最优选大于10，且

优选地其中在分别用MmpOpn(SEQ ID NO:16)、ThrOpn(SEQ ID NO:17)和flOpn(SEQ ID NO:15)包被的平板上，在用1％BSA封闭后，通过ELISA测量抗体分别对MmpOpn(SEQID NO:16)、ThrOpn(SEQ ID NO:17)和flOpn(SEQ ID NO:15)的反应性，包括以下条件：

所述抗体的浓度：0.25μg/ml，

偶联有HRP的二抗的浓度：0.1μg/ml，

HRP底物：ABTS和0.1％过氧化氢，

读数：405nm处的吸光度。

8.实施方案1至7中任一项的抗体，其中关于相应的表位和/或关于相应的Opn蛋白的解离常数K_d低于50nM，优选低于20nM，更优选低于10nM，甚至更优选低于5nM，最优选低于2nM。

9.实施方案1至8中任一项的抗体，其中关于相应的表位和/或关于相应的Opn蛋白的解离速率值低于5×10^-3s^-1，优选低于3×10^-3s^-1，更优选低于1×10^-3s^-1，甚至更优选低于1×10^-4s^-1。

10.实施方案1至9中任一项的抗体，其中所述抗体是人源化的。

11.实施方案1至10中任一项的抗体的片段，优选单结构域抗体，其中所述片段对以下是特异的：

(A)MmpOpn(SEQ ID NO:16)，其中所述片段对MmpOpn(SEQ ID NO:16)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种更具反应性；或

(B)MmpOpn(SEQ ID NO:16)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)两者，其中所述片段对MmpOpn(SEQ ID NO:16)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种比对flOpn(SEQ ID NO:15)更具反应性；或

(C)ThrOpn(SEQ ID NO:17)，其中所述片段对ThrOpn(SEQ ID NO:17)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和MmpOpn(SEQ ID NO:16)中的每一种更具反应性。

12.药物组合物，其包含至少一种实施方案1至10中任一项的抗体和/或至少一种实施方案11的片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。

13.疫苗，其包含至少一种分离的Opn肽：

(B)所述肽具有选自TYDGRGDSVVYG(SEQ ID NO:10)，VDTYDGRGDSVV(SEQ ID NO:13)，PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)和DTYDGRGDSVVY(SEQ ID NO:56)和TVDTYDGRGDSV(SEQID NO:57)一个或多个序列，其中所述肽，特别是具有序列VDTYDGRGDSVV(SEQ ID NO:13)或PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)的肽优选在其C末端酰胺化；和/或

并且其中所述肽与药学上可接受的载体，优选蛋白质载体偶联或融合，并且优选其中所述肽与所述载体共价偶联。

14.实施方案13的疫苗，其中所述载体是蛋白质，优选选自匙孔血蓝蛋白(KLH)，破伤风类毒素(TT)，蛋白D或白喉毒素(DT)，特别是KLH。

15.实施方案14的疫苗，其中所述至少一种肽具有在其N末端和/或C末端的额外半胱氨酸残基，并且至少一种肽通过所述额外的半胱氨酸残基共价偶联至所述蛋白质载体或与其偶联的接头，优选其中所述接头含有与所述肽的半胱氨酸反应的马来酰亚胺基团或卤代乙酰基基团。

16.实施方案13至15中任一项的疫苗，所述疫苗还包含至少一种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

17.实施方案12的组合物或实施方案13至16中任一项的疫苗，其用于治疗。

18.实施方案12的组合物或实施方案13至16中任一项的疫苗，用于治疗和/或预防心血管疾病，特别是动脉粥样硬化。

19.实施方案12的组合物或实施方案13至16中任一项的疫苗，用于治疗和/或预防2型糖尿病，特别是肥胖相关的胰岛素抗性。

20.用于制备实施方案1至10中任一项所述的抗体的方法，其包括：

-在细胞培养物中表达抗体；并且

-纯化所述抗体。

21.用于制备实施方案13至16中任一项的疫苗的方法，其包括：

-提供所述肽；并且

-将所述肽偶联至所述载体，优选KLH蛋白；并且

-任选地，添加药学上可接受的赋形剂。

22.诊断方法，其包括：

-提供患者的分离的样品，优选来自血液和/或脂肪组织，特别是来自皮下脂肪组织的样品；并且

-使用实施方案1至10中任一项所述的抗体测量所述样品中ThrOpn，MmpOpn的水平和/或ThrpOpn和MmpOpn的聚集水平，优选通过ELISA或Western印迹；并且

-将这些水平与健康对照群体的水平和/或在较早时间点的患者水平相比较；并且

-创建疾病或病症的诊断或预后或所述疾病或病症，优选心血管疾病，特别是动脉粥样硬化或2型糖尿病，特别是肥胖相关的胰岛素抗性的进展的诊断或预后。

23.实施方案22的方法用于监测根据实施方案17至19中任一项的治疗的效力的用途。

序列表

<110> 阿费里斯股份公司

<120> 靶向骨桥蛋白截短变体的疫苗和单克隆抗体及其用途

<130> R67614

<150> EP 14175005.9

<151> 30.06.2014

<160> 58

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 1

Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 2

Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 3

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 4

Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 5

Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 6

Asp Ser Val Val Tyr Gly

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 7

Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 8

Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 9

Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 10

Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 11

Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 12

Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 13

Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 14

Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 314

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<223> 骨桥蛋白 (Opn)

<400> 15

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

35 40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg

165 170 175

Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His

180 185 190

Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala

195 200 205

Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser

210 215 220

Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His

225 230 235 240

Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu

245 250 255

His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu

260 265 270

Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp

275 280 285

Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His

290 295 300

Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn

305 310

<210> 16

<211> 166

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<223> MmpOpn

<400> 16

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

35 40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly

165

<210> 17

<211> 168

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<223> ThrOpn

<400> 17

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

35 40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

165

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VH CDR1

<400> 18

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Leu Gly

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VH CDR2

<400> 19

Ile Tyr Trp Asp Asp Asn Lys

1 5

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VH CDR3

<400> 20

Ala Arg Gly Thr Ser Pro Gly Val Ser Phe Pro Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VL CDR1

<400> 21

Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

1 5

<210> 22

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VL CDR2

<400> 22

Asn Ala Lys

1

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VL CDR3

<400> 23

Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 24

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VH

<400> 24

Met Asn Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Thr Tyr Gly Leu Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asn Lys Arg Tyr

65 70 75 80

Lys Ser Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser

85 90 95

Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ser Pro Gly Val Ser Phe Pro Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro

130 135 140

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala

145 150

<210> 25

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 4-4-2 VL

<400> 25

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr

100 105 110

Gly Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Lys

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VH CDR1

<400> 26

Gly Ile Thr Phe Asn Thr Asn Gly

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VH CDR2

<400> 27

Val Arg Ser Lys Asp Tyr Asn Phe Ala Thr

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VH CDR3

<400> 28

Val Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VL CDR1

<400> 29

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 30

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VL CDR2

<400> 30

Lys Val Ser

1

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VL CDR3

<400> 31

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 32

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VH

<400> 32

Met Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly

1 5 10 15

Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Lys Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Phe

35 40 45

Asn Thr Asn Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Arg Val Arg Ser Lys Asp Tyr Asn Phe Ala Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Ala

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr

130 135 140

Pro Pro Pro Val Tyr Pro Leu Ala Pro

145 150

<210> 33

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 7-5-4 VL

<400> 33

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile

35 40 45

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Phe

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

165

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VH CDR1

<400> 34

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Leu Gly

1 5 10

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VH CDR2

<400> 35

Ile Ser Trp Asp Asp Ser Lys

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VH CDR3

<400> 36

Ala Arg Ser Gly Gly Gly Asp Ser Asp

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VL CDR1

<400> 37

Ser Ser Val Asn Ser

1 5

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VL CDR2

<400> 38

Asp Thr Ser

1

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VL CDR3

<400> 39

Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 40

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VH

<400> 40

Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Leu Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Ser Trp Asp Asp Ser Lys Tyr Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg

85 90 95

Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Gly Thr Ala Asp Ser Ala

100 105 110

Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Gly Gly Asp Ser Asp Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro

145

<210> 41

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 21-5-4 VL

<400> 41

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Ala Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Asn

35 40 45

Ser Ser Val Asn Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser

50 55 60

Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

100 105 110

Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Lys

<210> 42

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 42

agcggctctt caatgatacc agttaaacag gctgattc 38

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 43

agcggctctt ctcccattga cctcagaaga tgcact 36

<210> 44

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 44

agcggctctt ctcccctatc cataaaccac actatcacc 39

<210> 45

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 45

agcggctctt ctcccctacc tcagtccata aaccacac 38

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠衍生的肽表位

<400> 46

Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg

1 5

<210> 47

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠衍生的肽表位

<400> 47

Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg

1 5 10 15

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 48

Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5 10 15

Ser

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 49

Cys Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5

<210> 50

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 50

Tyr Gly Leu Arg

1

<210> 51

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 51

Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys

1 5

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 52

Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 53

Thr Tyr Asp Gly Ala Ala Ala Ser Val Val Tyr Gly

1 5 10

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 54

Thr Ala Ala Ala Arg Gly Asp Ala Ala Ala Tyr Gly

1 5 10

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 55

Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly

1 5

<210> 56

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 56

Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr

1 5 10

<210> 57

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 57

Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val

1 5 10

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽表位

<400> 58

Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5

Claims

其中所述抗体对以下是特异性的：

(A)基质金属蛋白酶截短的Opn(MmpOpn；SEQ ID NO:16)，其中所述抗体对MmpOpn(SEQID NO:16)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和凝血酶截短的Opn(ThrOpn；SEQ ID NO:17)中的每一种更具反应性；或

并且其中所述抗体对ThrOpn(SEQ ID NO:17)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和MmpOpn(SEQID NO:16)中的每一种更具反应性，并且优选地其中V_H包含SEQ ID NO:24的序列，并且V_L包含SEQ ID NO:25的序列。

2.权利要求1(A)的抗体，其中所述抗体对具有选自GDSVVYG，RGDSVVYG和DGRGDSVVYG(SEQ ID NO:7-9)的肽序列的MmpOpn表位是特异性的。

3.权利要求1(B)的抗体，其中所述抗体对具有选自TYDGRGDSVVYG(SEQ ID NO:10)和PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)的肽序列的MmpOpn/ThrOpn表位是特异性的。

4.权利要求2的抗体，其中所述抗体对具有肽序列GDSVVYG的表位是特异性的，并且所述抗体的CDR包含以下序列：

5.权利要求3的抗体，其中所述抗体对具有肽序列TYDGRGDSVVYG的表位是特异性的，并且所述抗体的CDR包含以下序列：

6.权利要求1(C)，4或5的抗体，其中所述CDR或V_H或V_L中的氨基酸中的三个，优选两个，更优选一个是突变成任何其它氨基酸的。

7.权利要求1至6中任一项的抗体，其中

-在所述抗体对MmpOpn(SEQ ID NO:16)特异性的情况下，所述抗体对MmpOpn(SEQ IDNO:16)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种更具超过N倍的反应性；和

-在所述抗体对ThrOpn(SEQ ID NO:17)特异性的情况下，所述抗体对ThrOpn(SEQ IDNO:17)比对flOpn(SEQ ID NO:15)和MmpOpn(SEQ ID NO:16)中的每一种更具超过N倍的反应性；且

优选地其中在分别用MmpOpn(SEQ ID NO:16)、ThrOpn(SEQ ID NO:17)和flOpn(SEQ IDNO:15)包被的平板上，在用1％BSA封闭后，通过ELISA测量抗体分别对MmpOpn(SEQ ID NO:16)、ThrOpn(SEQ ID NO:17)和flOpn(SEQ ID NO:15)的反应性，包括以下条件：

所述抗体的浓度：0.25μg/ml，

偶联有HRP的二抗的浓度：0.1μg/ml，

HRP底物：ABTS和0.1％过氧化氢，

读数：405nm处的吸光度。

8.权利要求1至7中任一项的抗体，其中关于相应的表位和/或关于相应的Opn蛋白的解离常数K_d低于50nM，优选低于20nM，更优选低于10nM，甚至更优选低于5nM，最优选低于2nM；和/或

其中关于相应的表位和/或关于相应的Opn蛋白的解离速率值低于5×10^-3s^-1，优选低于3×10^-3s^-1，更优选低于1×10^-3s^-1，甚至更优选低于1×10^-4s^-1；和/或

其中所述抗体是人源化的。

9.权利要求1至8中任一项的抗体的片段，优选单结构域抗体，其中所述片段对以下是特异的：

(A)MmpOpn(SEQ ID NO:16)，其中所述片段对MmpOpn(SEQ ID NO:16)比对flOpn(SEQID NO:15)和ThrOpn(SEQ ID NO:17)中的每一种更具反应性；或

(C)ThrOpn(SEQ ID NO:17)，其中所述片段对ThrOpn(SEQ ID NO:17)比对flOpn(SEQID NO:15)和MmpOpn(SEQ ID NO:16)中的每一种更具反应性。

10.药物组合物，其包含至少一种权利要求1至8中任一项的抗体和/或至少一种权利要求9的片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。

11.疫苗，其包含至少一种分离的Opn肽：

(B)所述肽具有选自TYDGRGDSVVYG(SEQ ID NO:10)，VDTYDGRGDSVV(SEQ ID NO:13)，PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)和DTYDGRGDSVVY(SEQ ID NO:56)和TVDTYDGRGDSV(SEQ IDNO:57)一个或多个序列，其中所述肽，特别是具有序列VDTYDGRGDSVV(SEQ ID NO:13)或PTVDTYDGRGDS(SEQ ID NO:14)的肽优选在其C末端酰胺化；和/或

并且其中所述肽与药学上可接受的载体，优选蛋白质载体偶联或融合，并且优选其中所述肽与所述载体共价偶联；优选地，其中所述载体是蛋白质，优选选自匙孔血蓝蛋白(KLH)，破伤风类毒素(TT)，蛋白D或白喉毒素(DT)，特别是KLH，和

尤其是其中所述至少一种肽具有在其N末端和/或C末端的额外半胱氨酸残基，并且至少一种肽通过所述额外的半胱氨酸残基共价偶联至所述蛋白质载体或与其偶联的接头，优选其中所述接头含有与所述肽的半胱氨酸反应的马来酰亚胺基团或卤代乙酰基基团；和/或

优选地其中所述疫苗还包含至少一种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

12.权利要求10的组合物或权利要求11中的疫苗，其用于治疗，

优选地用于治疗和/或预防心血管疾病，特别是动脉粥样硬化；

或优选地用于治疗和/或预防2型糖尿病，特别是肥胖相关的胰岛素抗性。

13.用于制备权利要求1至8中任一项所述的抗体的方法，其包括：

-在细胞培养物中表达抗体；并且

-纯化所述抗体。

14.用于制备权利要求11的疫苗的方法，其包括：

-提供所述肽；并且

-将所述肽偶联至所述载体，优选KLH蛋白；并且

-任选地，添加药学上可接受的赋形剂。

15.诊断方法，其包括：

-使用权利要求1至9中任一项所述的抗体测量所述样品中ThrOpn，MmpOpn的水平和/或ThrpOpn和MmpOpn的聚集水平，优选通过ELISA或Western印迹；并且

-创建疾病或病症的诊断或预后或所述疾病或病症，优选心血管疾病，特别是动脉粥样硬化或2型糖尿病，特别是肥胖相关的胰岛素抗性的进展的诊断或预后，

特别地，所述方法用于监测根据权利要求12中治疗的效力。