CN106526023B - 一种快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸的方法 - Google Patents

一种快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸的方法 Download PDF

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N30/02—Column chromatography

Abstract

本发明公开了一种快速检测白酒中丙氨酰‑酪氨酸的方法，其特征在于：利用超高效液相色谱串接三重四级杆质谱仪对白酒中的丙氨酰‑酪氨酸进行检测，待测白酒酒样经旋蒸去醇后，采用ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色谱柱，以流动相A(乙腈：水：三氟乙酸的体积比为80：20：0.1)+流动相B(0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液)进行梯度洗脱，样品经超高效液相色谱分离后，再通过三重四级杆质谱仪进行检测。本发明的方法简单，能够准确地对白酒中的丙氨酰‑酪氨酸进行定性、定量，为白酒中丙氨酰‑酪氨酸的准确判定、快速检测提供科学依据。

Description

一种快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的方法，属于酒类分析技术领域。
背景技术
肽(丙氨酰-酪氨酸)是构成人体一切细胞的基本材料，在调节生理激素、运输氧、抗拒病菌等方面具有重要的功能。功能如下：(1)丙氨酰-酪氨酸因其结构简单、分子量小、不饱和，所以能够通过细胞膜的渗透以原形直接进入细胞内，而不需要再次消化，也不需要耗费能量。(2)丙氨酰-酪氨酸以原形直接进入细胞内，是其生物活性的重要体现。众所周知，很多营养物质和药物尚且不能直接进入细胞内，对于大多数细胞病变医学还无能为力。小分子肽却可以轻而易举地直接进入细胞内，并且透过皮肤屏障、透过血脑屏障、透过胎盘屏障、透过肠胃粘膜屏障。(3)丙氨酰-酪氨酸参与酶的合成，激发酶的活性，强化酶的功能，维持酶的稳定。(4)丙氨酰-酪氨酸改善中间代谢膜(肠胃粘膜、毛细血管壁、肺泡、脑脊膜、红细胞壁、肾小球基底膜)的通透性，能够有效的吸收营养、排泄毒素，并能防御病原体的入侵。(5)丙氨酰-酪氨酸通过控制DNA的转录，保持细胞优势信息的遗传。(6)丙氨酰-酪氨酸通过合成特异蛋白质，产生特殊的生理效应。(7)丙氨酰-酪氨酸对于细胞的作用是双重的，即可以补充营养需求修复缺损，又可以改善功能状态；同时具备承载工具和材料的双重职责。鉴于丙氨酰-酪氨酸(AY)的种种功能，研究丙氨酰-酪氨酸(AY)的检测方法迫在眉睫，尤其在白酒行业，对其所含丙氨酰-酪氨酸进行检测可作为其品质的判断依据。
目前行业内对丙氨酰-酪氨酸(AY)的检测普遍采用比色法和色谱法检测。其中，比色法只能半定量，液相色谱法不稳定，操作费时、检测时间较长，检测效率较低。
发明内容
为避免上述现有技术所存在的不足之处，本发明提供了一种快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的方法，旨在利用超高效液相色谱仪串接三重四级杆质谱仪对白酒中的丙氨酰-酪氨酸(AY)进行快速、准确的检测。
本发明解决技术问题，采用如下技术方案：
本发明快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸的方法,其特点在于：利用超高效液相色谱串接三重四级杆质谱仪对白酒中的丙氨酰-酪氨酸进行检测；
所用仪器为配有三重四级杆质谱仪的超高效液相色谱仪；
所述方法包括如下步骤：
(1)对待测白酒酒样进行前处理：
准确量取50mL待测白酒酒样于100mL旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至3-5mL，去除待测白酒酒样中的醇类物质，然后用超纯水定容至10mL，最后经0.22μm滤膜针头过滤器过滤，获得待测样品；
(2)设定超高效液相色谱仪的条件为：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色谱柱；
柱温为30～45℃；
样品室温度为10～25℃
流动相：A相由乙腈、水和三氟乙酸按体积比为80：20：0.1构成；B相为体积浓度为0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液；
流速为0.2～0.5mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱；
进样量为1-5μL；
检测所用时间为4min；
其中，所述梯度洗脱的方法为：梯度洗脱初始时，流动相A和流动相B的体积比为(90～85):(10～15)，保持0.5min；从0.5min到3.0min，流动相A和流动相B的体积比按照梯度曲线6由初始比例降至为(40～50):(60～50)；3.0min到4.0min，流动相A和流动相B的体积比按照梯度曲线6由3.0min时的比例升至为(90～85):(10～15)，维持1min，即完成整个梯度洗脱；
三重四级杆质谱仪的条件设定为：
离子化方式：ESI-；
监测方式：SIR；
锥孔电压：25-40V
毛细管电压：3.00-5.00kV
脱溶剂气温度：400-600℃
脱溶剂气流量：500-1000L/h
锥孔气流量：50-100L/h
离子源温度：100-400℃
质谱方法参数表如表1：
表1：质谱方法参数表
(3)丙氨酰-酪氨酸的标准曲线的绘制
取丙氨酰-酪氨酸配制质量浓度范围在50～500ng/mL的一系列标准工作溶液，然后按照步骤(2)所设定的条件取1.5mL各标准工作溶液进样、用超高效液相色谱分离、质谱检测，以待测物在质谱中的响应值对其所相应的质量浓度进行线性回归，获得丙氨酰-酪氨酸的线性回归方程，所述线性回归方程所对应的曲线即为相应的丙氨酰-酪氨酸的标准曲线；丙氨酰-酪氨酸的线性回归方程及相关系数r2见表2，其中X为丙氨酰-酪氨酸的质量浓度，Y为对应的待测物在质谱中的响应值。
表2：丙氨酰-酪氨酸的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限
(4)待测白酒酒样的检测
将待测白酒酒样按步骤(1)的方式进行前处理后，取1.5mL按步骤(2)的条件进行检测，通过使用质谱仪检测，获得待测样品的色谱图，对待测样品根据母离子进行定性分析，然后根据丙氨酰-酪氨酸的标准曲线对待测白酒进行定量分析。
对本发明方法作如下灵敏度测试：灵敏度测试包括仪器的灵敏度与方法的灵敏度，仪器的灵敏度用仪器的检出限表示，取信噪比≥3的丙氨酰-酪氨酸的标准溶液的最小浓度为仪器检出限；方法的灵敏度用方法的定量限表示，取信噪比≥9的丙氨酰-酪氨酸标准溶液的最小浓度为方法定量限。所得的相关数据见表2。
对本发明方法作如下准确性及重现性实验：选用同一个白酒样品经前处理后作为空白样品，分为3份，分别加入高、中、低三个浓度的标准工作溶液进行加标回收实验，计算回收率；选取1个白酒样品按照上述前处理方法处理6个，分别进行实验，通过计算其相对标准偏差(RSD)的范围来判断分析方法的重现性。所述的准确性用回收率来表示，见表3，方法的重现性用相对标准偏差(RSD)来表示，见表4。可以看出回收率在80～120％，RSD<10％。
表3：丙氨酰-酪氨酸(AY)的加标回收率实验
表4：丙氨酰-酪氨酸(AY)的重现性实验
本发明的有益效果体现在：
1、本发明建立了一种利用超高效液相色谱串接质谱法快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的方法，能够准确地对白酒中的丙氨酰-酪氨酸(AY)进行定性、定量，为白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的准确判定、快速检测提供科学依据。
2、本发明超高效液相色谱串接三重四级杆质谱仪操作简单快捷、准确可靠、重复性好(相比其他的方法，效率提高10倍以上，由45min提高到现在的4min)。
3、本发明ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色谱柱与流动相(A相为乙腈：水：三氟乙酸的体积比为80：20：0.1，B相为0.01％～0.1％三氟乙酸水溶液)的选择对白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)达到了优异的分离效果，峰型较好，能够与基线完全分离，分离效果较好。
4、本发明的操作步骤少，从而降低了实验误差并提高了数据的准确性。
5、本发明通过降低检测时间可以节约人力、物力以及财力,提高了工作效率。
附图说明
图1为丙氨酰-酪氨酸(AY)标准溶液的离子流图。
具体实施方式
为阐明对本发明的理解，下面结合实例对本发明做进一步的阐述。
本实施例按如下步骤对某白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)进行测定，所用仪器为：超高效液相色谱仪(配有三重四级杆质谱仪TQD)。
(1)对待测白酒酒样进行前处理：
准确量取50mL待测白酒酒样于100mL旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至4mL，去除待测白酒酒样中的醇类物质，然后用超纯水定容至10mL，最后经0.22μm滤膜针头过滤器过滤，获得待测样品；
(2)设定超高效合相色谱仪的条件为：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色谱柱；
柱温为30℃；
样品室温度为20℃；
流动相：A相由乙腈、水和三氟乙酸按体积比为80：20：0.1构成；B相为体积浓度为0.01％的三氟乙酸水溶液；
流速为0.3mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱；
进样量为2μL；
检测所用时间为4min；
三重四级杆质谱检测器的条件设定为：
离子化方式：ESI-；
监测方式：SIR；
锥空电压：30V
毛细管电压：3.00kV
脱溶剂气温度：400℃
脱溶剂气流量：1000L/h
锥空气流量：50L/h
离子源温度：150℃
质谱方法参数表如表1：
表1：质谱方法参数表
(3)丙氨酰-酪氨酸的标准曲线的绘制
取丙氨酰-酪氨酸，配制2.5mg/L的储备液，然后分别将其稀释，配制成50、100、200、400、500ng/mL的5个不同的标准工作溶液，然后按照步骤(2)所设定的条件取1.5mL各标准工作溶液进样、用超高效液相色谱分离、质谱检测(谱图如图1所示，谱图对应的是浓度为200ng/mL工作溶液)，以待测物在质谱中的响应值对其所相应的质量浓度进行线性回归，获得丙氨酰-酪氨酸的线性回归方程(见表2)，线性回归方程所对应的曲线即为相应的丙氨酰-酪氨酸的标准曲线；
(4)待测白酒酒样的检测
将待测白酒酒样按步骤(1)的方式进行前处理后，取1.5mL按步骤(2)的条件进行检测，通过使用质谱仪检测，获得待测样品的色谱图，对待测样品根据母离子进行定性分析，然后根据丙氨酰-酪氨酸的标准曲线对待测白酒进行定量分析，即获得待测白酒中所含有的丙氨酰-酪氨酸(AY)及相应含量。
(5与现有标准方法(液相方法)的数据对比如下：
配置丙氨酰-酪氨酸配制质量浓度为50ng/mL、200ng/mL以及400ng/mL的三中样品，分别通过本发明方法和国家标准方法进行检测，监测数据见表5。
表5：使用两种检测方法检测数据比对

Claims (1)

1.一种快速检测白酒中丙氨酰-酪氨酸的方法,其特征在于：利用超高效液相色谱串接三重四级杆质谱仪对白酒中的丙氨酰-酪氨酸进行检测；
所用仪器为配有三重四级杆质谱仪的超高效液相色谱仪；
所述方法包括如下步骤：
(1)对待测白酒酒样进行前处理：
准确量取50mL待测白酒酒样于100mL旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至3-5mL，去除待测白酒酒样中的醇类物质，然后用超纯水定容至10mL，最后经0.22μm滤膜针头过滤器过滤，获得待测样品；
(2)设定超高效液相色谱仪的条件为：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色谱柱；
柱温为30～45℃；
样品室温度为10～25℃；
流动相：A相由乙腈、水和三氟乙酸按体积比80：20：0.1构成；B相为体积浓度0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液；
流速为0.2～0.5mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱；
进样量为1-5μL；
检测所用时间为4min；
其中，所述梯度洗脱的方法为：梯度洗脱初始时，流动相A和流动相B的体积比为(90～85):(10～15)，保持0.5min；从0.5min到3.0min，流动相A和流动相B的体积比按照梯度曲线6由初始比例降至为(40～50):(60～50)；3.0min到4.0min，流动相A和流动相B的体积比按照梯度曲线6由3.0min时的比例升至为(90～85):(10～15)，维持1min，即完成整个梯度洗脱；
三重四级杆质谱仪的条件设定为：
离子化方式：ESI-；
监测方式：SIR；
锥孔电压：25-40V；
毛细管电压：3.00-5.00kV；
脱溶剂气温度：400-600℃；
脱溶剂气流量：500-1000L/h；
锥孔气流量：50-100L/h；
离子源温度：100-400℃；
质谱方法参数表如表1：
表1：质谱方法参数表
(3)丙氨酰-酪氨酸的标准曲线的绘制
取丙氨酰-酪氨酸配制质量浓度范围在50～500ng/mL的一系列标准工作溶液，然后按照步骤(2)所设定的条件取1.5mL各标准工作溶液进样、用超高效液相色谱分离、质谱检测，以待测物在质谱中的响应值对其所相应的质量浓度进行线性回归，获得丙氨酰-酪氨酸的线性回归方程，所述线性回归方程所对应的曲线即为相应的丙氨酰-酪氨酸的标准曲线；
(4)待测白酒酒样的检测
将待测白酒酒样按步骤(1)的方式进行前处理后，取1.5mL按步骤(2)的条件进行检测，通过使用质谱仪检测，获得待测样品的色谱图，对待测样品根据母离子进行定性分析，然后根据丙氨酰-酪氨酸的标准曲线对待测白酒进行定量分析。
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