CN106508684B - 一种南非伯利恒之星离体培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种南非伯利恒之星离体培养方法，包括鳞片外植体的预处理过程、不定芽的诱导培养过程、不定芽的增殖培养过程和不定芽的生根培养过程。本发明提供的适合南非伯利恒之星组织培育的方法，能够解决种球培育容易腐烂，其繁殖系数低、繁殖周期长，无法短时间内获得足量优质南非伯利恒之星种苗的问题，本发明方法具备南非伯利恒之星种苗繁殖系数高、培育周期短、可常年培育的特点，能够为其种植户提供足量优质的种苗，增加其生产效益，为大规模推广种植南非伯利恒之星奠定坚实基础。

Description

一种南非伯利恒之星离体培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种南非伯利恒之星离体培养方法。

背景技术

南非伯利恒之星(Ornithogalum Sauderside)是一种原产南非的多年生球根花卉，花卉市场上俗称天鹅绒。因其花茎细长坚硬，花期持久，花瓣白色、造型高雅而被广泛用于各种庆典、节日的花艺作品，倍受消费者的喜爱。自2007年由云南芊卉、联合、采辰三家花卉企业引入少量种子及鳞茎试种获得成功后，由于具有栽培简单、成本低、见效快、效益显著等优点，近几年来一直在云南省元江县进行鳞茎的扩繁和切花种植。目前，云南斗南花卉市场12月到翌年5月份的南非伯利恒之星切花几乎全为云南省元江县生产，单支切花售价高达3～6元，效益高达3万元/亩。

南非伯利恒之星属百合科植物，主要依靠种球进行扩大繁殖，其种球的生产方式有花后养球、小鳞茎繁殖、鳞片扦插、播种及组织培养等。目前，国内南非伯利恒之星切花生产大多使用花后鳞茎分生种球进行扩繁，然而，因其种球在种植中极易腐烂，成活率低，仅为70％左右，且种子繁殖生产周期长，种子繁殖周期大多需要8个月左右，造成种球生产成本高，市场风险大，严重影响了切花生产的效益。2014年李云生等对南非伯利恒之星鳞片扦插快繁技术进行研究，使繁殖系数有一定程度提高，达到了原先的3.5倍左右，但其繁殖周期相对较长，需要一年左右，且对鳞片的选择及扦插管理的要求较严。

植物组织培养既是改良品种、培育新品种的一种手段，又是快速繁殖良种，以获得大量优质苗木的一种有效方法。用该技术能够解决很多用传统方法难以解决的问题，更多、更好、更快地培育出各种农业作物和园艺植物的新品种、新类型、新种质和足量优质苗木。据此，能否建立一种植物组织培养技术，用于大量繁殖南非伯利恒之星，解决其种球种植中易腐烂、种子繁殖周期长、繁殖系数较低的问题，成为云南省大面积开发种植南非伯利恒之星亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种南非伯利恒之星离体培养方法，解决其繁殖系数低、繁殖周期长，无法短时间内获得足量优质的南非伯利恒之星种苗的问题，为其种植户提供足量优质的苗木，增加其生产效益，为云南省大规模推广种植南非伯利恒之星奠定坚实基础。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种南非伯利恒之星离体培养方法，包括以下步骤：

1)灭菌处理：选取南非伯利恒之星健康、饱满的鳞茎，挑选出内部干净、完整的鳞片，对鳞片进行灭菌处理；

2)诱导培养：将经步骤1)处理过的鳞片切成2～3cm×3～4cm的小方块，然后接种于诱导培养基上，光照条件下进行诱导培养40～45天，获得不定芽；所述诱导培养基组成为：MS培养基、激动素0.4～0.8mg/L、萘乙酸0.2～0.6mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、白砂糖20～30g/L和琼脂5～7g/L；

3)增殖培养：将经步骤2)诱导培养所得不定芽离体后接种于增殖培养基上，光照条件下进行增殖培养45～50天；所述增殖培养基组成为：MS培养基、萘乙酸0.3～0.8mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、白砂糖30～35g/L和琼脂5～7g/L；

4)生根培养：将经步骤3)增殖培养所得高度为3.0～5.0cm的不定芽转接到生根培养基中，光照条件下进行生根培养45～50天，获得南非伯利恒之星种苗；所述生根培养基组成为：1/2MS培养基、萘乙酸0.5～1.0mg/L、吲哚乙酸0.2～0.8mg/L、白砂糖10～15g/L、琼脂5～7g/L和活性炭0.5～1.0g/L。

本发明提供的南非伯利恒之星离体培养方法，是以其鳞片为外植体，通过外殖体的不定芽诱导培养过程、不定芽的增殖过程和不定芽的生根过程，不定芽的增殖系数高达8倍以上，在短时间内可获得大量的南非伯利恒之星种苗，且种苗的生根率高达95％以上、移栽成活率高达97.5％，生产成本低，经济效益显著。

本发明根据南非伯利恒之星不定芽生长的特性，制备出了适合其生长的诱导培养基和增殖培养基，本发明的诱导培养基可促使外植体短时间内诱导生出不定芽，不定芽在增殖培养基中经离体增殖培养后，获得了大量长势极好、生长健壮的不定芽，不定芽生长整齐，抽生的叶片较长、叶片均为嫩绿色。

本发明还配制出了适合南非伯利恒之星不定芽生根的生根培养基，将增殖获得的高度为3.0～5.0cm的不定芽转接到生根培养基上，只需培养15～20天，大部分的不定芽基部均会出现愈伤，愈伤表面已有不定根生成，待继续培养至45～50天左右时，不定芽上生成了较多量的不定根。

本发明选择高度为3.0～5.0cm的不定芽进行生根培养，是因为研究者发现只有在该高度范围内的不定芽诱导生根后得到的种苗质量较好，移栽后容易成活，且生产成本低。而高度低于3.0cm的不定芽诱导得到的种苗质量较差，不定根较短，细弱，移栽后成活率极低；高度大于5.0cm的不定芽诱导生根得到的种苗质量较好，但培养出高于5.0cm的不定芽所需周期很长，不利于节约成本。

进一步的是，上述方法中所述步骤1)灭菌处理的操作为：将鳞片洗净后再用质量分数为75％的乙醇处理30秒以上，无菌水冲洗掉乙醇，再用质量分数为0.1～0.15％的氯化汞水溶液灭菌处理10～20min，然后用无菌水冲洗5～6次。

鳞片的灭菌必须彻底，否则在诱导培养过程中很容易污染，严重影响不定芽的诱导。本发明的灭菌处理方法使得鳞片的灭菌完全，在诱导培养时鳞片上获得的不定芽数量多。

进一步的是，所述步骤2)中诱导培养的培养温度为26～27℃，该培养温度下最适合外植体鳞片经诱导后生出不定芽。

进一步的是，所述步骤2)中光照条件为：光照时长10h·d^-1，光照强度800～1000lx，该光照条件能够充分满足诱导培养时的光照需求，适合不定芽的生成。

进一步的是，所述步骤3)中增殖培养的培养温度为26～27℃，该培养温度范围下最适合不定芽进行增殖。

进一步的是，所述步骤3)中光照条件为：光照时长10h·d^-1，光照强度800～1000lx，选取的光照条件能够满足不定芽增殖时的能量需求，适合不定芽进行大量增殖。

进一步的是，所述步骤4)中生根培养的培养温度为26～27℃，所选温度下不定芽的生根状况达到最佳。

进一步的是，所述步骤4)中光照条件为：光照时长10h·d^-1，光照强度500～800lx，该光照条件适合对不定芽进行生根培养，能够生成大量新根。

进一步的是，所述步骤4)中还包括对高度为3.0～5.0cm的不定芽进行切除叶片和茎后，再接种至增殖培养基上，其目的是可以常年进行培苗，通过不断增殖和生根，从而获得大量的可再生循环的伯利恒之星种苗，且不会影响种苗的质量。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)提供了一种南非伯利恒之星的离体培养方法，以鳞片为外植体，通过组织培养的方法，可在130～145天内获得大量优质的种苗，解决种球极易腐烂、繁殖周期长的问题；

(2)本方法整个培育过程可在人工化恒定环境中完成，不受季节和天气的影响，可常年培育种苗；

(3)本发明的培养方法繁殖系数高达8.32倍、生根率高达95％以上，种苗移栽成活率高达97.5％，且生产成本低，经济效益显著，可大面积推广种植。

附图说明

图1为本发明实施例1中获得的不定芽示意图；

图2为本发明实施例1中获得的南非伯利恒之星种苗示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

一种南非伯利恒之星离体培养方法，包括以下步骤：

1)鳞片的预处理：于晴天到云南省南非伯利恒之星种苗基地采回其鳞茎，选取健康、饱满的鳞茎，剖去表面腐烂干枯的鳞片，挑选出内部干净、完整的鳞片，将鳞片放入滴加1滴洗涤剂的水中浸泡3min，用清水冲洗10min，再用纯净水冲洗2次，再转入超净工作台上用质量分数为75％的乙醇处理30秒，无菌水冲洗掉乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞水溶液灭菌处理20min，灭菌过程中可用镊子反复搅动鳞片，使其彻底灭菌，然后用无菌水冲洗5次；

2)诱导培养：将经步骤1)处理过的鳞片切成2cm×3cm的小方块，然后接种于诱导培养基上，光照条件下进行诱导培养40天，培养温度为26℃，光照时长10h·d^-1，光照强度800lx，获得不定芽(如图1所示)；所述诱导培养基组成为：MS培养基、激动素0.4mg/L、萘乙酸0.2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、白砂糖20g/L和琼脂5g/L；

3)增殖培养：将经步骤2)诱导培养所得不定芽离体后接种于增殖培养基上，光照条件下进行增殖培养45天，培养温度为26℃，光照时长10h·d^-1，光照强度800lx；所述增殖培养基组成为：MS培养基、萘乙酸0.3mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、白砂糖30g/L和琼脂5g/L；

4)生根培养：将经步骤3)增殖培养所得高度为3.0cm的不定芽转接到生根培养基中，光照条件下进行生根培养45天，培养温度为26℃，光照时长10h·d^-1，光照强度500lx，获得南非伯利恒之星种苗(如图2所示)；所述生根培养基组成为：1/2MS培养基、萘乙酸0.5mg/L、吲哚乙酸0.2mg/L、白砂糖10g/L、琼脂5g/L和活性炭0.5g/L。

实验过程中统计步骤3)中的不定芽增殖数量，并观察增殖芽的生长情况，发现增殖培养45天后，不定芽增殖系数达到8.32倍，不定芽生长整齐，抽生的叶片较长、嫩绿，长势很好。

进一步统计步骤4)中不定芽的生根情况，发现生根培养45天后，生根率达95％，且不定根粗壮，平均不定根数为4条。

将步骤4)所得种苗进行炼苗15天后将其移栽，待移栽苗成活后统计其成活率为96％，无变异植株出现。

实施例2

一种南非伯利恒之星离体培养方法，包括以下步骤：

1)鳞片的预处理：选取南非伯利恒之星健康、饱满的鳞茎，挑选出内部干净、完整的鳞片，将鳞片洗净后用质量分数为75％的乙醇处理45秒，无菌水冲洗掉乙醇，再用质量分数为0.15％的氯化汞水溶液灭菌处理10min，然后用无菌水冲洗6次；

2)诱导培养：将经步骤1)处理过的鳞片切成2cm×4cm的小方块，然后接种于诱导培养基上，光照条件下进行诱导培养45天，培养温度为27℃，光照时长10h·d^-1，光照强度1000lx，获得不定芽；所述诱导培养基组成为：MS培养基、激动素0.8mg/L、萘乙酸0.6mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖30g/L和琼脂7g/L；

3)增殖培养：将经步骤2)诱导培养所得不定芽离体后接种于增殖培养基上，光照条件下进行增殖培养50天，培养温度为27℃，光照时长10h·d^-1，光照强度1000lx；所述增殖培养基组成为：MS培养基、萘乙酸0.8mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖35g/L和琼脂7g/L；

4)生根培养：将经步骤3)增殖培养所得高度为5.0cm的不定芽转接到生根培养基中，光照条件下进行生根培养50天，培养温度为27℃，光照时长10h·d^-1，光照强度800lx，获得南非伯利恒之星种苗；所述生根培养基组成为：1/2MS培养基、萘乙酸1.0mg/L、吲哚乙酸0.8mg/L、白砂糖15g/L、琼脂7g/L和活性炭1.0g/L。

实验过程中统计步骤3)中的不定芽增殖数量，并观察增殖芽的生长情况，发现增殖培养50天后，不定芽增殖系数达到8.36倍，不定芽生长整齐，抽生的叶片较长、嫩绿，长势很好。

进一步统计步骤4)中不定芽的生根情况，发现生根培养50天后，生根率达96％，且不定根粗壮，平均不定根数为5条。

将步骤4)所得种苗进行炼苗15天后将其移栽，待移栽苗成活后统计其成活率为96.3％，无变异植株出现。

实施例3

一种南非伯利恒之星离体培养方法，包括以下步骤：

1)鳞片的预处理：选取南非伯利恒之星健康、饱满的鳞茎，挑选出内部干净、完整的鳞片，将鳞片放入滴加2滴洗涤剂的水中浸泡4min，用清水洗净后再用质量分数为75％的乙醇处理60秒，无菌水冲洗掉乙醇，再用质量分数为0.15％的氯化汞水溶液灭菌处理15min，然后用无菌水冲洗6次；

2)诱导培养：将经步骤1)处理过的鳞片切成3cm×4cm的小方块，然后接种于诱导培养基上，光照条件下进行诱导培养42天，培养温度为26℃，光照时长10h·d^-1，光照强度900lx，获得不定芽；所述诱导培养基组成为：MS培养基、激动素0.6mg/L、萘乙酸0.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.4mg/L、白砂糖25g/L和琼脂6g/L；

3)增殖培养：将经步骤2)诱导培养所得不定芽离体后接种于增殖培养基上，光照条件下进行增殖培养48天，培养温度为26℃，光照时长10h·d^-1，光照强度900lx；所述增殖培养基组成为：MS培养基、萘乙酸0.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L和白砂糖32g/L、琼脂6g/L；

4)生根培养：将经步骤3)增殖培养所得高度为4.0cm的不定芽转接到生根培养基中，光照条件下进行生根培养46天，培养温度为27℃，光照时长10h·d^-1，光照强度700lx，获得南非伯利恒之星种苗；所述生根培养基组成为：1/2MS培养基、萘乙酸0.8mg/L、吲哚乙酸0.6mg/L、白砂糖12g/L、琼脂6g/L和活性炭0.8g/L。

实验过程中统计步骤3)中的不定芽增殖数量，并观察增殖芽的生长情况，发现增殖培养48天后，不定芽增殖系数达到8.27倍，不定芽生长整齐，抽生的叶片较长、嫩绿，长势很好。

进一步统计步骤4)中不定芽的生根情况，发现生根培养46天后，生根率达96.1％，且不定根粗壮，平均不定根数为4条。

将步骤4)所得种苗进行炼苗20天后将其移栽，待移栽苗成活后统计其成活率为97.1％，无变异植株出现。

实施例4

一种南非伯利恒之星离体培养方法，包括以下步骤：

1)鳞片的预处理：选取南非伯利恒之星健康、饱满的鳞茎，挑选出内部干净、完整的鳞片，将鳞片洗净后再用质量分数为75％的乙醇处理30秒，无菌水冲洗掉乙醇，再用质量分数为0.12％的氯化汞水溶液灭菌处理15min，然后用无菌水冲洗5次；

2)诱导培养：将经步骤1)处理过的鳞片切成3cm×3cm的小方块，然后接种于诱导培养基上，光照条件下进行诱导培养40天，培养温度为27℃，光照时长10h·d^-1，光照强度1000lx，获得不定芽；所述诱导培养基组成为：MS培养基、激动素0.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖20g/L和琼脂5g/L；

3)增殖培养：将经步骤2)诱导培养所得不定芽离体后接种于增殖培养基上，光照条件下进行增殖培养45天，培养温度为27℃，光照时长10h·d^-1，光照强度1000lx；所述增殖培养基组成为：MS培养基、萘乙酸0.6mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖30g/L和琼脂6g/L；

4)生根培养：将经步骤3)增殖培养所得高度为3.0～5.0cm的不定芽转接到生根培养基中，光照条件下进行生根培养45天，培养温度为27℃，光照时长10h·d^-1，光照强度800lx，获得南非伯利恒之星种苗；所述生根培养基组成为：1/2MS培养基、萘乙酸0.6mg/L、吲哚乙酸0.5mg/L、白砂糖10g/L、琼脂7g/L和活性炭1.0g/L；其中将一部分高度为3.0～5.0cm范围内的不定芽进行切除叶片和茎后，再接种至增殖培养基上进行增殖培养。

实验过程中统计步骤3)中的不定芽增殖数量，并观察增殖芽的生长情况，发现增殖培养45天后，不定芽增殖系数达到8.28倍，不定芽生长整齐，抽生的叶片较长、嫩绿，长势很好。

进一步统计步骤4)中不定芽的生根情况，发现生根培养45天后，生根率达95.3％，且不定根粗壮，平均不定根数为5条。

将步骤4)所得种苗进行炼苗20天后将其移栽，待移栽苗成活后统计其成活率为97.5％，无变异植株出现。

对比实施例1

参照实施例1的方法，除步骤1)中不经氯化汞灭菌之外，其余步骤与实施例1一致，统计步骤3)中的不定芽增殖数量，并观察增殖芽的生长情况，发现增殖培养45天后，不定芽增殖系数为4.01倍，不定芽生长不整齐，抽生的叶片较短、发白，长势较差。

进一步统计步骤4)中不定芽的生根情况，发现生根培养45天后，生根率为80％左右，且不定根较细小，平均不定根数为2条。

将步骤4)所得种苗进行炼苗15天后将其移栽，待移栽苗成活后统计其成活率为78％，有变异植株出现。

对比实施例2

参照实施例2的方法，除步骤3)增殖培养基中萘乙酸浓度为1.2mg/L，步骤3)生根培养基中不添加活性炭之外，其余步骤与实施例2一致，统计步骤3)中的不定芽增殖数量，并观察增殖芽的生长情况，发现增殖培养50天后，不定芽增殖系数仅为3.63倍，不定芽生长不整齐，抽生的叶片较短、发黄，长势较差。

进一步统计步骤4)中不定芽的生根情况，发现生根培养50天后，生根率为76％，且不定根较舅小，平均不定根数为2条。

将步骤4)所得种苗进行炼苗15天后将其移栽，待移栽苗成活后统计其成活率为76.7％，有变异植株出现。

Claims (8)

1.一种南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤

1)鳞片的预处理：选取南非伯利恒之星健康、饱满的鳞茎，挑选岀内部干浄、完整的鳞片，对鳞片进行灭菌处理；

2)诱导培养：将经步骤1)处理过的鳞片切成2～3cm×3～4cm的小方块，然后接种于诱导培养基上，光照条件下进行诱导培养40～45天，获得不定芽；所述诱导培养基组成为：MS培养基、激动素0.4～0.8mg/L、萘乙酸0.2～0.6mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、白砂糖20～30g/L和琼脂5～7g/L；所述光照条件为：光照时长10h·d^-1，光照强度800～1000lx；

3)增殖培养：将经步骤2)诱导培养所得不定芽离体后接种于增殖培养基上，光照条件下进行增殖培养45～50天；所述增殖培养基组成为：MS培养基、萘乙酸0.3～0.8mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、白砂糖30～35g/L和琼脂5～7g/L；

4)生根培养：将经步骤3)增殖培养所得高度为3.0～5.0cm的不定芽转接到生根培养基中，光照条件下进行生根培养45～50天，获得南非伯利恒之星种苗；所述生根培养基组成为：1/2MS培养基、萘乙酸0.5～1.0mg/L、吲哚乙酸0.2～0.8mg/L、白砂糖10～15g/L、琼脂5～7g/L和活性炭0.5～1.0g/L。

2.根据权利要求1所述的南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述步骤1)灭菌处理的操作为：将鳞片洗净后用质量分数为75％的乙醇处理30秒以上，无菌水冲洗掉乙醇，再用质量分数为0.1～0.15％的氯化汞水溶液灭菌处理10～20min，然后用无菌水冲洗5～6次。

3.根据权利要求1所述的南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述步骤2)中诱导培养的培养温度为26～27℃。

4.根据权利要求1所述的南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述步骤3)中增殖培养的培养温度为26～27℃。

5.根据权利要求1所述的南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述步骤3)中光照条件为：光照时长10h·d^-1，光照强度800～1000lx。

6.根据权利要求1所述的南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述步骤4)中生根培养的培养温度为26～27℃。

7.根据权利要求1所述的南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述步骤4)中光照条件为：光照时长10h·d^-1，光照强度500～8001x。

8.根据权利要求1所述的南非伯利恒之星离体培养方法，其特征在于，所述步骤4)中还包括对高度为3.0～5.0cm的不定芽进行切除叶片和茎后，再接种至增殖培养基上。