CN106404962B - 一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法 - Google Patents
一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种花生叶片中茉莉酸的检测方法,包括以下步骤:(1)花生叶片样品制备;(2)标准曲线样品制备;(3)制备流动相以及茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液;(4)样品的萃取与富集;(5)LC‑MS检测条件的建立;(6)样品检测。发明测试方法稳定性高,数据精确,检测结果可靠,化合物分离度较好。本发明方法能够快速检测花生叶中的茉莉酸含量,操作快速,效率高,具有重要的科学意义。
Description
技术领域
本发明涉及测定方法,具体地说是采用固相微萃取-液相色谱-质谱联用测定花生叶片茉莉酸含量的方法。
背景技术
目前,农药价格昂贵,并且过度使用农药会使害虫的抗药性增加,害虫天敌的数量不断减少甚至灭绝,还会造成环境的严重污染,农药的使用必然受到极大的限制,促使科学家找到一种方法,将农药用量降到最小化的同时达到抗虫的最佳效果,使农作物高产,高质,高营养。
茉莉酸类物质是一类新型植物激素,能使植物引起多种生理反应,能够通过植物体直接或间接诱导产生并积累,能够促进相关基因表达,诱导产生各种有特殊功能的有机物,例如某些蛋白质,达到抗击病虫害的目的。
茉莉酸是茉莉酸类化合物及其衍生物的前体,是一种内源信号分子,建立一种灵敏、稳定的花生叶中茉莉酸定量分析方法十分重要,利用高效液相色谱-质谱联用对花生叶样品进行分析,找出稳定的前处理纯化方法,建立起高效、稳定的花生叶内源茉莉酸的定量检测方法,并对方法进行优化,找到不同基因改造处理后花生叶中茉莉酸含量规律,对花生研究抗虫具有重要的科学意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的不足,提供一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是:一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,包括以下步骤:
(1)花生叶片样品制备;(2)标准曲线样品制备;(3)制备流动相以及茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液;(4)样品的萃取与富集;(5)LC-MS检测条件的建立;(6)样品检测。
作为优选,本发明包括以下步骤:
(1)取1g花生叶,加入内标200ngDHJA,用液氮研磨;
研磨物用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于15ml离心管中;
残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于10ml离心管中,重复此过程1-3次;
合并以上浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,定溶于1ml 80%甲醇中。
(2)取1g花生叶,加入内标200ngDHJA,再用10ul注射器分别加入5ng/g、10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g、200ng/g、500ng/g、1000ng/g的JA标准品溶液,得到不同浓度的标准样品;将标准样品用液氮研磨,再用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后于4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,然后用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中;
残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,于4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中,重复2-3次;
合并上述浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,将其定溶于1ml 80%甲醇中。
(3)配置流动相:95%乙腈+5%水、95%水+5%乙腈以及1‰甲酸+5%乙腈+水的制备,分别制备1ppm、100ppm、1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液,制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液,制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标;
(4)样品的萃取与富集;
(5)质谱条件的建立:使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物;
色谱条件的建立:使用上述配置的流动相作为分析所用的色谱条件;
(6)样品检测:用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描,确定其特征子离子,利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色谱图,然后加入标准品50ng,进行检测。
更进一步的是:所述样品检测还包括定量及回收率测定,包括以下步骤:使用内标法,以DHJA作为内标物,每份样品加入内标200ngDHJA,用浓度分别为:5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ng/g、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液,绘制标准曲线;
分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,进行HPLC-MS检测,计算回收率。
更进一步的是,所述样品的萃取与富集包括以下步骤:
加2mL超纯水于5mL样瓶中,将样品转移到50mL样瓶中,加入带有磁性的ZZ-SBSE-04-1型PES涂层固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h;
在2mL样瓶中加入内套管,并加入250μL丙酮,将上述固相微萃取搅拌棒放入并封口,然后放入超声仪中超声20min进行解吸。取丙酮解吸液待测。
上述中,本发明还包括花生叶干样处理过程,包括以下步骤:
第一步:向试管中的样品加入1mL甲醇,充分震荡使其溶解;
第二步:用移液枪转移至2mL PC管中;
第三步:用离心机13000r离心10分钟;
第四步:用移液枪吸取上清液,装于2mL样瓶中;
第五步:用封口膜封口,放在零下20摄氏度保存。
本发明优点在于:本发明测试方法稳定性高,数据精确,检测结果可靠,化合物分离度较好。本发明方法能够快速检测花生叶中的茉莉酸含量,操作快速,效率高。通过检测花生叶中茉莉酸含量,科研人员对花生的抗虫能力、生长过程中农药用量、产量甚至环境的保护、恢复生态平衡、保护生物多样性等进行系统的研究,其具有重要的科学意义。
附图说明
图1采用流动相体系(a)时的液相色谱图;
图2茉莉酸标准曲线;
图3JH1012ck浓度-时间曲线;
图4JH1012han浓度-时间曲线;
图5J11han浓度-时间曲线;
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本实施例使用安捷伦公司生产的型号为(Agilent)1290-6430.的液相色谱-三重四级杆质谱联用仪;Thermo公司生产的2.1mm×150mm×5μm Accucore XL C18色谱柱;安捷伦生产的2.1mm×100mm×1.8μm ZORBAX SB-Aq色谱柱;Mettle-toledo公司生产的型号为EL204-IC的电子天平;sigma公司生产的型号为1-14的小型离心机;90014-S-B手套;eppendorf、smartpipette型移液枪;江苏金坛市环宇科学仪器厂生产的型号为CJJ-931的数显四联恒温磁力搅拌器;上海思博明生产的Vortex-Genie-2型小型漩涡振荡器;昆山生产的5200E单频超声波清洗器。固相微萃取搅拌棒采用青岛贞正分析仪器有限公司生产的ZZ-SBSE-04-1型PES涂层固相微萃取搅拌棒。
选用两种花生品种,分别为J11、JH1012,利用两种不同的基因改造方法,对花生进行基因改造,分别编号为J11han、JH1012han、JH1012ck,每个实验样品做三个平行实验样品。通过本发明检测J11han,JH1012han,JH1012ck实验样品中的茉莉酸含量。
1.1样品制备及分析方案:
第一步:取1g花生叶(每份样品做3份平行实验),加入内标200ngDHJA(用10ul注射器加入2ul的100ug/ml内标溶液)。
第二步:用液氮研磨。
第三步:研磨液用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心10分钟,用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中。
第四步:残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心10min,用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中,此过程重复1次。
第五步:合并第三、四步3次浸提的上清液,4℃条件下氮气吹干。
第六步:定溶于1ml 80%甲醇中。
1.2标准曲线样品制备、分析方案:
第一步:取1g花生叶(每份样品做3份平行实验),加入内标200ngDHJA(用10ul注射器加入2ul的100ug/ml内标溶液),用10ul注射器分别加入不同量的JA标准品溶液,得到不同浓度的标准样品:
5ng/g标准样品(加入1ug/ml,5ul)
10ng/g标准样品(加入1ug/ml,10ul)
20ng/g标准样品(加入10ug/ml,2ul)
50ng/g标准样品(加入10ug/ml,5ul)
100ng/g标准样品(加入10ug/ml,10ul)
200ng/g标准样品(加入100ug/ml,2ul)
500ng/g标准样品(加入100ug/ml,5ul)
1000ng/g标准样品(加入100ug/ml,10ul)
第二步:液氮研磨。
第三步:用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心10分钟,用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中。
第四步:残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心10min,用移液枪移取2.5mL上清液放入10ml离心管中,此过程重复1次。
第五步:合并第三、四步3次浸提的上清液,4℃条件下氮气吹干。
第六步:定溶于1ml 80%甲醇中。
1.3制备流动相
95%乙腈+5%水:
第一步:用500ml量筒取475ml乙腈于流动相瓶中。
第二步:用100ml量筒取25ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中,充分震荡后放入超声波清洗器中超声20min。
95%水+5%乙腈
第一步:用500ml量筒取475ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中。
第二步:用100ml量筒取25ml乙腈于流动相瓶中,充分震荡后再用超声波清洗器中清洗二十分钟。
1‰甲酸+5%乙腈+水:
用移液枪取0.5mL甲酸,用100ml量筒取25ml乙腈,用500ml量筒取474.5ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中,充分震荡后再用超声波清洗器中清洗二十分钟。
制备完成流动相后将量筒晾干,倒置,防止污染。
1.4制备茉莉酸和/或二氢茉莉酸甲醇溶液
制备1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液
第一步:用电子天平称取10μgH2JA于100mL量筒中。
第二步:用甲醇定容,小型漩涡振荡器充分震荡后转移至棕色瓶中。
第三步:封口放于-20℃保存。
制备100ppm二氢茉莉酸甲醇溶液
第一步:用移液枪移取1000ppm二氢茉莉酸溶液于20ml样瓶中(分9次,每次1ml甲醇等比例稀释),用振荡器混匀。
第二步:用移液枪移取1ml装入2ml样瓶中小型漩涡振荡器充分震荡后转移至棕色瓶中。
第三步:封口放于-20℃保存。
制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液
方法同上,封口膜封口,-20℃保存。
制备1ppm二氢茉莉酸甲醇溶液
方法同上,封口膜封口,-20℃保存。
制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标
方法同上,封口膜封口,-20℃保存。
1.5样品的萃取与富集
采用固相微萃取搅拌棒进行萃取富集。方法如下:
第一步:加2mL超纯水于5mL样瓶中。
第二步:将样品转移到50mL样瓶中。
第三步:加入固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h。
第四步:在2mL样瓶中加入内套管,并加入250μL丙酮,将第四步搅拌棒放入,封口。
第五步:放入超声仪中超声20min,进行解吸,解吸液待测
1.6质谱条件的建立
试验使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物。分别使用10ppm茉莉酸和二氢茉莉酸,再分别于正、负电离模式下,分别确定茉莉酸和二氢茉莉酸的母离子分子量,并选择定量子离子。
1.7色谱条件的建立
比较流动相系统,选出上述配置的流动相中能使茉莉酸、二氢茉莉酸出峰效果最好的流动相系统作为分析所用的色谱条件。
1.8样品的定性检测
用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描,确定它们的特征子离子。在已经确定的离子模式(负离子模式)条件下,利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色谱图,确定分离效果。
然后加入标准品50ng,高效液相色谱检测,确定保留时间,同时用质谱得到特征子离子。
1.9定量及回收率测定
定量使用内标法,以DHJA作为内标物,每份样品加入内标200ngDHJA,用浓度分别为:5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液,绘制标准曲线。
分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,进行HPLC-MS检测,计算回收率。
本实验添加二氢茉莉酸为内标,为排除花生叶中原本存在二氢茉莉酸形成干扰,设置六个空白花生叶样品进行HPLC-MS检测。
2.0实验数据的分析
2.0.1多反应离子监测(MRM)参数优化
采用Optimizer软件自动优化MS检测条件,结果见表1:
表1 MRM检测参数设置
本实施例检测使用超高压液相色谱柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18,2.1mm×100mm×1.8μm)分离,可将茉莉酸与相邻干扰峰完全分离。本实施例质谱用负离子模式对茉莉酸(JA)和二氢茉莉酸(DHJA)检测,灵敏度较高,而且干扰峰少。
流动相的选择
由于茉莉酸和二氢茉莉酸为酸性化合物,采用C18色谱柱进行分离,通常在流动相加入0.1%甲酸,用于增加目标组分在色谱柱固定相上的保留时间,从而改善分离度。
采用超高压液相色谱柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18 2.1mm×100mm×1.8μm),对比流动相体系(a)A:水相(含0.1%甲酸和5%乙腈),B:乙腈相(含5%水)和流动相体系(b)A:水相(含5%乙腈),B:乙腈相(含5%水)的分离效果,如图1所示。结果表明:(1)采用流动相体系(a)时,JA和DHJA的保留时间均较流动相体系(b)有所增加,然而采用流动相体系(b)时,JA和DHJA也可以达到基线分离;(2)采用流动相体系(a)时,JA和DHJA的灵敏度有所下降,原因为当MS采用负离子检测模式时,流动相体系(a)中的甲酸会降低JA和DHJA的离子化效率,导致灵敏度下降。综合考虑,本检测采用不加甲酸的流动相体系(b)。
从图1中得出流动相梯度最佳为:0~8分钟,A:B比值变化情况为4:1~1:9;8~13分钟,A:B=1:9;13~14分钟,A:B比值变化情况为1:9~4:1;14~20分钟,A:B=4:1。
2.0.2标准曲线绘制
利用八种不同浓度加内标的茉莉酸样品,以JA浓度为横坐标,JA峰面积与DHJA峰面积平均值之比为纵坐标,绘制标准曲线,如图2所示,R2达到0.9988。
本发明方法评价结果,以信噪比(S/N)为3确定茉莉酸的检出限(LOD)如表2所示:
表2 方法评价结果
数据明显呈线性相关,可以根据标准曲线对花生叶样品中的茉莉酸进行定量。
2.0.3加标回收率
设置5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,花生叶内源茉莉酸的平均添加回收率在83.26%~92.57%,表明本实验检测的可靠性较高。
2.0.4实验数据
空白样品检测结果
对六个空白样品进行检测的结果,其MRM色谱图显示出空白样品中均不含有二氢茉莉酸,此方法适合用于花生叶的检测,并且大大降低了检测成本。
本实施例样品检测结果
分别对JH1012ck,JH1012han,J11han三种类型共48个样品编号进样检测,测得每个样品中茉莉酸的实际浓度,并计算平均浓度,结果见表3:
表3 实际花生叶中茉莉酸检测结果
图3是JH1012ck浓度-时间曲线图,由图3可知经过此种基因处理方法处理花生叶---JH1012ck中的茉莉酸含量,从12小时开始递减,36小时达到最低浓度,之后又逐渐升高。图4是JH1012han浓度-时间曲线图,由图4可知经过此种基因处理方法处理花生叶—JH1012han中茉莉酸含量,随处理时间变化没有明显规律,但在处理12小时时达到最低浓度,几乎为零,之后逐渐升高。图5是J11han浓度-时间曲线,由图5可知经过此种基因处理方法处理花生叶—J11han中茉莉酸含量,先随处理时间的增长而减少,在处理12小时时达到最低点,几乎为零,之后逐渐升高。对比以上两种处理的样品可知,JH1012han和J11han花生叶中茉莉酸含量在处理12小时左右会达到最低值。
表4所示,为本实施例1、2、3以及对照组的数据对比数据。其本实施例1、2、3的不同之处仅仅是样品处理中的固相微萃取搅拌棒涂层种类的不同,其余步骤及试剂均相同。而对照组没有选择萃取的过程。以上的最低检出限经过测量最高为4,最低为0.5。而对照组的最低检出限是40,与实施例对比明显。
表4 最低检出限数据比较
通过对上述花生叶片中的茉莉酸含量,科研人员可进行数据分析及结果推算,给科研人员带来极大的方便。并且,采用上述检测方法,实验数据准确,检测方法科学合理。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)花生叶片样品制备:
取1g花生叶,加入内标200ng DHJA,用液氮研磨;
研磨物用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于15ml离心管中;
残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于10ml离心管中,重复此过程1-3次;
合并以上浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,定溶于1ml 80%甲醇中;
(2)标准曲线样品制备:
取1g花生叶,加入内标200ngDHJA,再用10ul注射器分别加入5ng/g、10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g、200ng/g、500ng/g、1000ng/g的JA标准品溶液,得到不同浓度的标准样品;将标准样品用液氮研磨,再用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后于4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,然后用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中;
残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,于4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟,用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中,重复2-3次;
合并上述浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,将其定溶于1ml 80%甲醇中;
(3)制备流动相以及茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液:
配置流动相:95%乙腈+5%水、95%水+5%乙腈以及1‰甲酸+5%乙腈+水的制备,分别制备1ppm、100ppm、1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液,制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液,制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标;
(4)样品的萃取与富集:
加2mL超纯水于5mL样瓶中,将样品转移到50mL样瓶中,加入带有磁性的ZZ-SBSE-04-1型PES涂层固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h;
在2mL样瓶中加入内套管,并加入250μL丙酮,将上述固相微萃取搅拌棒放入并封口,然后放入超声仪中超声20min进行解吸,取丙酮解吸液待测;
(5)LC-MS检测条件的建立:
质谱条件的建立:使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物;
色谱条件的建立:使用流动相作为分析所用的色谱条件,所述流动相包括A:含5%乙腈的水相,B:含5%水的乙腈相,所述流动梯度为0~8分钟,A:B比值变化情况为4:1~1:9;8~13分钟,A:B=1:9;13~14分钟,A:B比值变化情况为1:9~4:1;14~20分钟,A:B=4:1;
(6)样品检测:
用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描,确定其特征子离子,利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色谱图,然后加入标准品50ng,进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:所述样品检测还包括定量及回收率测定,包括以下步骤:使用内标法,以DHJA作为内标物,每份样品加入内标200ngDHJA,用浓度分别为:5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ng/g、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液,绘制标准曲线;
分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,进行HPLC-MS检测,计算回收率。
3.根据权利要求1所述的一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:还包括花生叶干样处理过程,包括以下步骤:
第一步:向试管中的样品加入1mL甲醇,充分震荡使其溶解;
第二步:用移液枪转移至2mL PC管中;
第三步:用离心机13000r离心10分钟;
第四步:用移液枪吸取上清液,装于2mL样瓶中;
第五步:用封口膜封口,放在零下20摄氏度保存。
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