CN104297410B - 一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种液相色谱-串联质谱法LC-MS/MS检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的分析方法，包括以下步骤：1）配制提取溶剂；2）新鲜烟叶液氮速冻，冷冻干燥并粉碎；3）粉碎好的样品加入提取溶剂，低温超声提取；4）冷冻离心，取上清液并过滤；5）LC-MS/MS进行检测。其优点在于：前处理方法简单，只需超声并过滤，无需固相萃取柱纯化处理，与现有的方法相比，本发明中所采用的LC-MS/MS法，灵敏度高，精密度好，加标回收率高，100个样品前处理耗时小于2小时，而现有文献中所述方法前处理繁琐费时，100个样品处理约需3天。因此，本发明方法能有效地提高分析效率，适合复杂基质中低含量目标物的分析。
Description
技术领域
本发明涉及烟草代谢组学新鲜烟叶样品中激素的研究，具体是一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法。
背景技术
脱落酸和茉莉酸是植物体内两种重要的生理活性物质，在烟草植物的次级代谢、胁迫耐受和信号转导中行使功能，从而影响烟草的生长发育和烟叶的品质。因此，精确可靠地对痕量的脱落酸和茉莉酸进行定性、定量分析具有重要的意义。
已有文献报道采用固相萃取-液相色谱/质谱法同时测定新鲜植物叶片中的脱落酸和茉莉酸。（1）50mg植物样品在液氮中研磨成粉末，加入1mL80%甲醇提取溶剂；（2）超声提取30min，10000rpm冷冻离心10min，取出上清液；（3）向上清液加入600μL三次水，涡旋混匀；（4）将混合液通过一装填有200mg键合硅胶的小柱进行SPE萃取、富集。具体步骤如下：①活化吸附剂：按照先后顺序分别用5mL甲醇，5mL20%甲醇活化吸附剂；②上样：将混合液倒入活化后的SPE小柱，抽真空，调整真空度，使混合液以1滴/s的速度通过SPE小柱；③清洗：依次用2mL50mM甲酸铵溶液、3mL三次水、2mL20%甲醇清洗SPE小柱；④解吸：用5mL含2%甲酸的乙腈将目标物从SPE小柱上解吸下来，用10mL离心管在出口端收集。解吸液于35℃下氮气吹干后，用5%乙腈定容至800μL，取720μL注入RPLC-MS/MS系统进行分析。此方法样品前处理十分繁琐，耗时长，不利于分析效率的提高。因此，建立一种快速、灵敏的检测新鲜植物叶片中的脱落酸和茉莉酸的检测方法十分必要。
发明内容
本发明的目的正是针对现有技术中脱落酸和茉莉酸的测定方法前处理繁琐费时的问题，提供一种简便的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法。
本发明的目的是通过以下方式技术方案来实现的：本发明的检测方法采用提取溶剂低温超声萃取，通过液相色谱-串联质谱联用仪实现新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的测定，其具体步骤如下：
1）配制提取溶剂：甲醇/水，80/20，v/v；
2）新鲜烟叶液氮速冻，冷冻干燥，粉碎机打碎；
3）粉碎好的样品加入提取溶剂和氘代内标，0-10℃低温超声提取；
4）提取完的样品冷冻离心，取上清液过0.22μm微孔滤膜；
5）LC-MS/MS对待测样品中脱落酸和茉莉酸进行检测，其液相色谱、质谱条件如下：
Agilent公司SB-C18超高压柱，规格2.1mm×100mmi.d.,1.8μm；柱温50℃；流动相为：A：含0.001%甲酸的水，B：乙腈；流速：0.2mLmin-1；梯度洗脱：0min：80%A+20%B，0.1~8min：10%A+90%B，8.1~10min：10%A+90%B，10.1~12min：80%A+20%B；进样量：5μL。
离子源：电喷雾离子源；负离子扫描；多反应监测；干燥气温度：180℃，干燥气流量：11Lmin-1，雾化器压力：20psi；鞘气温度：400℃，鞘气流量：12Lmin-1，毛细管电压：2000V，喷嘴电压：2000V，驻留时间：50ms。
表1各化合物的定量离子对、定性离子对、保留时间及碰撞能量
| 分析物 | Q1 mass m/z | Q3 mass m/z | tR min | CE V |
| ABA-d6 | 269 | 159 | 4.233 | 8 |
| 269 | 225 | 4.233 | 12 | |
| ABA | 263 | 153 | 4.247 | 8 |
| 263 | 219 | 4.247 | 12 | |
| JA | 209 | 59 | 5.283 | 12 |
| 209 | 165 | 5.283 | 8 |
在本发明中，所述的新鲜烟叶为30~60mg；所述的氘代内标为ABA-d6；所述的超声萃取时间为30min；离心时离心机转速为8000转，离心时间为5min。
采用甲醇配制氘代内标、脱落酸、茉莉酸母液以及其标准工作溶液。其中，脱落酸、茉莉酸标准工作溶液浓度范围分别为0.378~96.8ngml-1和0.156~40ngml-1。标准工作溶液含内标ABA-d6的浓度为20ngml-1。分别对标准工作溶液进行LC-MS/MS分析，并以目标化合物与内标物峰面积比对浓度比进行线性回归，得到其标准工作曲线。取最低浓度标准工作溶液，10次平行测定，计算标准偏差，3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限。脱落酸和茉莉酸的检测限为0.082ngml-1和0.027ngml-1，定量限为0.273ngml-1和0.09ngml-1。结果如表2所示。
表2脱落酸和茉莉酸的线性方程、相关系数、检测限及定量限
| 化合物 | 线性方程 | 相关系数R2 | 检测限ng ml-1 | 定量限ng ml-1 |
| ABA | Y=17.139x+0.0285 | 0.9997 | 0.082 | 0.273 |
| JA | Y=34.837x-0.0389 | 0.9991 | 0.027 | 0.09 |
将同一烟叶样品一天内进行5次平行测定及分5天测定，测定结果的相对标准偏差表示该方法的日内精密度和日间精密度，同时进行加标回收率实验，结果如表3所示。可见，本发明方法实验的精密度好、加标回收率高，适用于大批量样品的分析。
表3方法的日内精密度、日间精密度及回收率
| 化合物 | RSD（日内，%） | RSD（日间，%） | 回收率（%） |
| ABA | 3.64 | 3.86 | 98.6 |
| JA | 4.14 | 4.53 | 104 |
本发明的有益效果如下：与现有文献的方法相比，本发明中所采用LC-MS/MS法，灵敏度高，负离子检测模式选择性好，干扰小，超声过滤后可直接检测，简化了样品前处理步骤，100个样品前处理耗时小于2小时；而现有文献的方法前处理繁琐费时，100个样品处理周期约需3天。因此，本发明方法能有效地提高分析效率，非常适合复杂基质中低含量目标物的分析，经检测，正常烟叶和干旱烟叶的脱落酸含量为7.02~11.95ngmL-1，49.87~67.47ngmL-1，茉莉酸含量为0.38~0.67ngmL-1，1.04~1.81ngmL-1。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
图2为脱落酸、茉莉酸标样的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。
图3为实例1红花大金元新鲜烟叶中脱落酸、茉莉酸的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。
图4为实例2白肋烟NT90新鲜烟叶中脱落酸、茉莉酸的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。
具体实施方式
本发明通过以下具体实例作进一步描述，但并不限制本发明。
样品前处理实例1：
称取45~50mg冻干处理的新鲜烟叶于玻璃试管中，加入1mL提取溶剂于玻璃管中，内标为20ngmL-1ABA-d6，加盖密封后置于超声波清洗机内，在冰浴下超声抽提30min，超声功率为100Hz，然后在8000rpm的转速下离心5min，取上清液并过滤，进行LC-MS/MS分析。
采用该方法对烤烟红花大金元烟叶样品进行提取，通过LC-MS/MS分析，所得的总离子流TIC和提取离子流MRM如图3所示，各个定量离子对ABA-d4，269>159；ABA，263>153；JA，209>59可达到基线分离并准确定量脱落酸和茉莉酸，经检测，该大金元烟叶中所含脱落酸、茉莉酸为7.37ngmL-1和0.53ngmL-1。
样品前处理实例2：
称取20~25mg冻干处理的新鲜烟叶于玻璃试管中，加入0.5mL提取溶剂于玻璃管中，内标为20ngmL-1ABA-d6，加盖密封后置于超声波清洗机内，在冰浴下超声抽提30min，超声功率为100Hz，然后在8000rpm的转速下离心5min，取上清液并过滤，进行LC-MS/MS分析。
采用该方法对白肋烟TN90样品进行提取，通过LC-MS/MS分析，所得的总离子流TIC和提取离子流MRM如图4所示，各个定量离子对ABA-d4，269>159；ABA，263>153；JA，209>59可达到基线分离并准确定量脱落酸和茉莉酸，经检测，该白肋烟TN90中所含脱落酸、茉莉酸为10.21ngmL-1和0.67ngmL-1。
Claims (3)
1.一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法，其特征在于：是采用提取溶剂低温超声萃取，通过液相色谱-串联质谱联用实现新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的测定，具体步骤如下：
1）配制提取溶剂：甲醇/水=80/20，v/v；
2）新鲜烟叶液氮速冻，冷冻干燥，粉碎机打碎；
3）粉碎好的样品加入提取溶剂和氘代内标，0-10℃低温超声提取，所述的氘代内标为ABA-d6；
4）提取完的样品冷冻离心，取上清液过0.22μm微孔滤膜；
5）LC-MS/MS对待测样品中脱落酸和茉莉酸进行检测，其液相色谱、质谱条件如下：
Agilent公司SB-C18超高压柱，规格2.1mm×100mmi.d.,1.8μm；柱温50℃；流动相为：A：含0.001%甲酸的水，B：乙腈；流速：0.2mLmin-1；梯度洗脱：0min：80%A+20%B，0.1~8min：10%A+90%B，8.1~10min：10%A+90%B，10.1~12min：80%A+20%B；进样量：5μL；
离子源：电喷雾离子源；负离子扫描；多反应监测；干燥气温度：180℃，干燥气流量：11Lmin-1，雾化器压力：20psi；鞘气温度：400℃，鞘气流量：12Lmin-1，毛细管电压：2000V，喷嘴电压：2000V，驻留时间：50ms。
2.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法，其特征在于：所述的超声提取时间为30min。
3.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法，其特征在于：在步骤4）离心过程，离心机转速为8000转，离心时间为5min。
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