CN106397846A - 一种交联透明质酸钠及其制备方法与应用 - Google Patents

一种交联透明质酸钠及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种交联透明质酸钠及其制备方法与应用，所述交联透明质酸钠由包括透明质酸钠、无机盐和交联剂的原料制成；所述制备方法包括取一定量的透明质酸钠，将其溶于pH值为7.5～9.0的碱性溶液中，然后加入一定量的无机盐，搅拌至完全溶解；加热至20～60℃，然后向其中缓慢滴入一定量的交联剂溶液，搅拌并保温反应一段时间；用酸调节pH至7.1～7.5，平衡1～2小时，然后用乙醇或乙醇溶液沉淀得块状固体，即可。本发明方法可以提高交联透明质酸钠的交联效率，提高反应收率，降低副反应，减少交联剂残留；所制得交联透明质酸钠安全无毒、稳定性好，体内保留时间长，适合于注射到体内，填充效果好。

Description

一种交联透明质酸钠及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药用品技术领域，具体涉及一种交联透明质酸钠及其制备方法与应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid、HA)又名玻尿酸，是粘多糖中最具有代表性的一种，广泛分布于人体各部位，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。此外，透明质酸具有特殊的锁水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(Natural moisturizing factor，NMF)，例如：2％的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98％水分。
人类皮肤中含有大量的透明质酸，用于改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、富有弹性。但随着年龄的增长，皮肤中的透明质酸含量会逐渐降低，导致皮肤褶皱，萎缩，此时需注射透明质酸以起到填充美容的作用。但由于天然中提取的透明质酸注射于人体内时，降解非常迅速，约24小时之内完成降解，一般将透明质酸钠交联后注射于皮下，以延长降解时间，降解时间与交联度密切相关，因此，对透明质酸进行交联改性以延长其在体内的降解时间具有重要的现实意义。
目前常用的交联方法是将透明质酸钠和交联剂(如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(1,2,7,8-diepoxyoctane,DEO)、二乙烯基砜(divinyl sulfone,DVS)等)在碱性条件交联而得，区别主要集中于透明质酸钠与交联剂的比例以及交联反应的温度，通过这些条件一定程度上控制了交联度，从而控制降解时间。
由于1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)毒性相对较小，且分子中含有烷氧基键，聚合后烷氧基键聚合后可自由旋转而使材料柔软，特别适用于软组织的填充，所以目前市面上绝大多数产品都采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)作为交联剂交联而得。
现有技术公开的制备方案中，大多是透明质酸钠与交联剂在一定的碱性条件下进行交联反应，如专利CN 104086788 A公开的制备方案中，特征在，透明质酸钠与交联剂在pH>10的氢氧化钠溶液中进行交联反应，在强碱条件下反应，可能会导致透明质酸分子构型的改变，还可能引起其它副反应，导致产物杂质较多，不利于产品的生物相容性；专利CN101538377A中公开的制备方案中，亦是在浓碱条件下，将透明质酸钠与交联剂进行交联反应，反应后经过一些列的溶胀，透析等工艺去除残留交联剂，工艺复杂，产业化成本高；专利CN 101036808 B公开了一种交联透明质酸钠凝胶制剂的制备工艺，特征在于，二乙烯基砜与透明质酸钠分子的羟基发生反应，形成醚键，其步骤为：透明质酸钠原料加入碱试剂中，搅拌，使其溶解，将碱性的透明质酸钠溶液与二乙烯基砜混合，形成交联透明质酸钠凝块；专利CN 101878230 B中公开了一种乳液中的交联透明质酸的方法，其步骤为：(a)提供包含透明质酸或其盐的碱性水溶液；(b)在有机相或油相中，从步骤(a)的混合溶液中形成具有所期望尺寸的微滴，以形成有机物包水或油包水(W/O)的乳液；(c)向乳液中加入包含交联剂的溶液，由此透明质酸与所述交联剂发生反应以提供交联的透明质酸微珠；并且(d)任选地加工步骤(c)中所得的交联的透明质酸微珠的分散体。此方法不仅制备复杂，工艺繁琐，不利于产业化，而且反应体系中需要添加有机试剂，可能会带来有机试剂残留等风险；专利WO97/04012公开了一种多糖(包括透明质酸)凝胶组合物的制备方法，主要过程为：1)形成水溶性可交联的多糖水溶液；2)在多官能交联剂的存在下开始交联；3)在凝胶反应发生前，立体阻碍交联反应防止其终止(例如通过稀释溶液)；4)向所述活化的多糖中再引入未立体阻碍的条件(例如通过蒸发溶液)，继续交联反应，形成黏弹凝胶。该方法在水溶液中反应，由于透明质酸钠在水中的溶解度比较小，且大分子之间位阻较大，反应难于进行；专利2006/0194758 A1公开了将高、低分子量的透明质酸混合反应，产生一种单相的具良好机械性质的胶体，改良了可注射性，但此方法反应结束后，未经透析纯化前残留大量未反应的交联剂，其浓度超过300ppm以上，之后通过透析法以纯化试图去除交联剂，但其效果不佳，难以有效去除未反应的交联剂。
发明内容
本发明提供一种交联透明质酸钠及其制备方法，可以提高交联透明质酸钠的交联效率，提高反应收率，降低副反应，减少交联剂残留，为简化制备工艺提供了一种新的解决方案。
本发明技术方案如下：
一种交联透明质酸钠，其由包括透明质酸钠、无机盐和交联剂的原料制成。
优选地，透明质酸钠、无机盐和交联剂的质量比为(5-20)∶(0.5-50)∶(1-2)；进一步优选为(6-10)∶(0.8-1.6)∶(1-2)；更优选为10∶9∶1。
优选地，所述透明质酸钠的分子量为60-300万道尔顿，进一步优选为200万道尔顿。
优选地，所述无机盐为中性无机盐，进一步优选为NaCl，KCl，CaCl2，NaNO3，Na2SO4等中的一种或几种；更优选为NaCl。
优选地，所述交联剂为BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)、DEO(1,2,7,8-二环氧辛烷)、DVS(二乙烯基砜)等中的一种或几种；更优选为BDDE。
进一步地，上述交联透明质酸钠，其动力粘度为1300-3300mpa.s；优选为1500-2500mpa.s。
进一步地，上述交联透明质酸钠，其分子量分布为1.0-1.6，优选为1.0-1.4。
本发明还提供上述交联透明质酸钠的制备方法，包括以下步骤：
1)取一定量的透明质酸钠，将其溶于pH值为7.5～9.0的碱性溶液中，然后加入一定量的无机盐，搅拌(可用螺带桨剪切搅拌)至完全溶解；
2)将步骤1)制备的透明质酸钠碱性体系加热至20～60℃(优选45℃)，然后向其中缓慢滴入一定量的交联剂溶液，搅拌并保温(20～60℃，优选45℃)反应一段时间；
3)将步骤2)反应后体系用酸调节pH至7.1～7.5，平衡1～2小时，然后用乙醇或乙醇溶液沉淀得块状固体，即可；或者进一步将所得块状固体冷冻干燥制成交联透明质酸钠凝胶；或者更进一步再将所得干燥的交联透明质酸钠凝胶置于PBS缓冲液中透析24-36h，再次冷冻干燥。
优选地，步骤1)所述碱性溶液的浓度为0.002％-0.2％；进一步优选为0.02％。
优选地，步骤1)所述碱包括NaOH，KOH，Na2CO3，季铵碱等无机碱中的一种或几种；进一步优选为NaOH。
优选地，所述无机盐为NaCl。
优选地，步骤2)所述交联剂溶液的浓度为0.1％-5％；进一步优选地，所述交联剂为BDDE。
优选地，步骤2)所述反应时间为0.5～6小时，进一步优选为1.5～2小时。
优选地，步骤3)所述酸为稀盐酸溶液，浓度为0.001mol/L-0.1mol/L；进一步优选稀盐酸溶液浓度为0.005mol/L。
优选地，步骤3)所述乙醇溶液为体积分数90-95％的乙醇溶液，进一步优选为体积分数95％的乙醇溶液。
优选地，步骤3)所述冷冻干燥条件为在温度-50℃、压力100Pa条件下冷冻干燥12小时。
具体地，上述交联透明质酸钠的制备方法，包括以下步骤：
1)取一定量的透明质酸钠，将其溶于质量分数0.02％的NaOH溶液中，然后加入一定量的NaCl，搅拌至完全溶解；
2)将步骤1)制备的透明质酸钠碱性体系加热至20～60℃，然后向其中缓慢滴入一定量的体积分数0.4％的BDDE溶液，搅拌并保温反应1.5-2h；
3)将步骤2)反应后体系用0.005mol/L的盐酸溶液调节pH至7.2，平衡1～2小时，然后用乙醇或乙醇溶液沉淀得块状固体，即得；或者进一步将所得块状固体冷冻干燥制成交联透明质酸钠凝胶；或者更进一步将所得干燥的交联透明质酸钠凝胶置于PBS缓冲液中透析24-36h，再次冷冻干燥。
本发明还包括上述方法制备的交联透明质酸钠。
本发明还包括上述交联透明质酸钠在整形美容产品(包括皮下注射填充除皱，软组织填充，修复缺陷，外科手术防粘连，骨科注射液、眼科粘弹剂，关节腔内注射润滑减震，药物传送等)；药品或化妆品等方面的应用。
本发明所述制备方法为交联透明质酸提供了一种温和且高效的反应环境：1)弱碱环境，即在相对较低的pH值下进行反应，反应条件温和，副反应较小；2)增大了透明质酸的溶解度，且提高了反应效率，由于透明质酸钠是一类典型的聚电解质材料，当其溶于水时，由于分子间的静电排斥，导致其溶解困难，且溶解度较小；本发明通过加入中性无机盐不仅有利于破坏大分子之间的静电排斥，增加溶解度，还减小了分子间的排斥力，有利于提高交联反应的效率；3)可以通过常规透析等方法有效去除未反应的交联剂，使所得交联透明质酸钠安全无毒，可制备成适合于注射入机体的凝胶制剂。
本发明所制得的透明质酸钠交联优点是：
(1)分子量更高，提高了透明质酸分子量，显著增加了粘弹性；
(2)体内保留时间更长，延长了透明质酸在体内的半衰期，交联透明质酸钠在体内的半衰期一般则为6个月到一年；
(3)稳定性更好，增强了透明质酸的稳定性，交联透明质酸凝胶在酸性或碱性条件下较稳定，并且耐高温；
(4)拓宽了透明质酸的用途和应用效果，本发明交联透明质酸钠无毒和无抗原性，交联透明质酸钠最终产品为微粒凝胶制剂，适合于注射入机体，填充效果好；交联透明质酸钠保留了天然透明质酸的无抗原性、生物相容性和生物可降解性等特性。最终的产品为无杂质的微粒凝胶，其pH值、渗透压等指标接近人体生理值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明所描述的实施例中，在其它条件不变的情况下，通过改变交联环境来说明本发明的优越性。
1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE，纯度95％)购自百灵威科技有限公司，透明质酸钠购自山东华熙福瑞达生物科技有限公司，所用PBS缓冲液为自主配制，每1000mL中含有NaCl 17g，NaH2PO4 90mg，Na2HPO4 1.12g。可磁力搅拌器，购自上海越众仪器有限公司，型号ZNCL-500。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
以下是实施例中的各参数测试方法：
1)动力粘度的测试
测试温度：室温；仪器：旋转粘度计；规格：型号：HAAKE Viscotester D-L；
2)产率测试
称量反应后经冷冻干燥的块状固体，然后与加入的原料透明质酸钠做比例，得反应产率。
3)分子量分布测试
检测标准(方法)：中华人民共和国药典(2015年版)四部通则0514分子排阻色谱法。
4)体外细胞毒性测试
按照GB-16886.5-2003《中华人民共和国国家标准·医疗器械生物学评价》第5部分：体外细胞毒性试验进行测试评价。
以下实施例中采用的冷冻干燥工艺的具体条件参数如下：冷冻温度-50℃，冷冻压力100Pa，冷冻时间12小时。
实施例1本发明提供的环境中交联试验
1)将分子量为200万道尔顿的透明质酸钠1.0g和0.5g的NaCl加入100mL0.02％(w/w)的NaOH溶液中，室温下搅拌4小时至完全溶解。
2)取0.2mL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，用50mL蒸馏水稀释后保留备用。
3)将透明质酸钠的NaOH溶液加热至45℃，保持恒温，并将BDDE溶液滴加到体系中，30分钟滴完，滴完后继续恒温反应1.5小时。
4)加入0.005mol/L盐酸溶液调节至pH＝7.2，搅拌下平衡2小时，然后加入500mL无水乙醇，沉淀2小时，取出块状固体。
5)所得固体冷冻干燥后，按1g产品：200mL PBS缓冲液中透析24小时；将透析后的凝胶再次冷冻干燥，保留待测。
实施例2本发明提供的环境中交联试验
仅改变NaCl加入量，分别将NaCl的加入量替换为0.9g，1.5g，3.0g加入到反应体系中，其它条件不变，按实施例1中的方法进行试验。
对比例1弱碱环境中的交联试验
1)将分子量为200万道尔顿的透明质酸钠1.0g加入100mL 0.02％(w/w)的NaOH溶液中，室温下搅拌4小时至完全溶解。
2)取0.2mL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，用50mL蒸馏水稀释后保留备用。
3)将透明质酸钠的NaOH溶液加热至45℃，保持恒温，并将BDDE溶液滴加到体系中，30分钟滴完，滴完后继续超声反应1.5小时。
4)加入0.005mol/L盐酸溶液调节至pH＝7.2，搅拌下平衡2小时，然后加入500mL无水乙醇，沉淀2小时，取出块状固体。
5)所得固体冷冻干燥后，按1g产品：200mL PBS缓冲液中透析24小时；将透析后的凝胶再次冷冻干燥，保留待测。
对比例2强碱环境中的交联试验
1)将分子量为200万道尔顿的透明质酸钠1.0g加入100mL 2％(w/w)的NaOH溶液中，室温下搅拌4小时至完全溶解。
2)取0.2mL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，用50mL蒸馏水稀释后保留备用。
3)将透明质酸钠的NaOH溶液加热至45℃，保持恒温，并将BDDE溶液滴加到体系中，30分钟滴完，滴完后继续恒温反应1.5小时。
4)加入0.005mol/L盐酸溶液调节至pH＝7.2，搅拌下平衡2小时，然后加入500mL无水乙醇，沉淀2小时，取出块状固体。
5)所得固体冷冻干燥后，按1g产品：200mL PBS缓冲液中透析24小时；将透析后的凝胶再次冷冻干燥，保留待测。
实验例
分别测试实施例1-2及对比例1-2制得的交联透明质酸钠的动力粘度、分子量分布和体外细胞毒性，结果见下表1。
表1
表1结果表明，1)弱碱环境下反应收率低，分子量分布较宽；2)浓碱环境下收率有所提高，但分子量分布依然较宽，且细胞毒性较大；3)在无机盐NaCl的反应环境下，收率明显提高，分子量分布也明显变窄，且对细胞毒性无明显影响。由此可见，NaCl等无机盐对该反应具有重要的作用。
尽管以上仅给出了以BDDE为交联剂的实施例，实际上交联剂DEO、DVS也可实现类似的技术效果，但以交联剂BDDE为最佳。尽管以上仅给出了无机盐NaCl的实施例，实际上KCl，CaCl2，NaNO3，Na2SO4等中性无机盐也可实现类似的技术效果，但以NaCl为最佳。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种交联透明质酸钠，其特征在于，其由包括透明质酸钠、无机盐和交联剂的原料制成；其中所述原料透明质酸钠、无机盐和交联剂的质量比为(5-20)∶(0.5-5.0)∶(1-2)。
2.根据权利要求1所述的交联透明质酸钠，其特征在于，所述无机盐为中性无机盐，优选为NaCl，KCl，CaCl2，NaNO3，Na2SO4中的一种或几种；和/或，
所述透明质酸钠的分子量为60-300万道尔顿，优选为200万道尔顿；和/或，所述交联剂为BDDE、DEO、DVS中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的交联透明质酸钠，其特征在于，所述原料透明质酸钠、无机盐和交联剂的质量比为(6-10)∶(0.8-1.6)∶(1-2)；优选为10∶9∶1。
4.根据权利要求1或2所述的交联透明质酸钠，其特征在于，其动力粘度为1300-3300mpa.s；优选为1500-2500mpa.s；和/或，其分子量分布为1.0-1.6，优选为1.0-1.4。
5.权利要求1-4任一项所述交联透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取一定量的透明质酸钠，将其溶于pH值为7.5～9.0的碱性溶液中，然后加入一定量的无机盐，搅拌至完全溶解；
2)将步骤1)制备的透明质酸钠碱性体系加热至20～60℃，然后向其中缓慢滴入一定量的交联剂溶液，搅拌并保温反应一段时间；
3)将步骤2)反应后体系用酸调节pH至7.1～7.5，平衡1～2小时，然后用乙醇或乙醇溶液沉淀得块状固体，即可；或者进一步将所得块状固体冷冻干燥制成交联透明质酸钠凝胶；或者更进一步再将所得干燥的交联透明质酸钠凝胶置于PBS缓冲液中透析24-36h，再次冷冻干燥。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述碱包括NaOH，KOH，Na2CO3，季铵碱中的一种或几种；和/或，所述无机盐为NaCl。
7.权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述交联剂溶液的浓度为0.1％-5％；和/或，步骤2)所述反应时间为0.5～6小时，优选为1.5～2小时。
8.权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述酸为浓度为0.001mol/L-0.1mol/L的稀盐酸溶液；优选稀盐酸溶液浓度为0.005mol/L；和/或，
步骤3)所述乙醇溶液为体积分数90-95％的乙醇溶液；和/或，
步骤3)所述冷冻干燥条件为在温度-50℃、压力100Pa条件下冷冻干燥12小时。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取一定量的透明质酸钠，将其溶于质量分数0.02％的NaOH溶液中，然后加入一定量的NaCl，搅拌至完全溶解；
2)将步骤1)制备的透明质酸钠碱性体系加热至20～60℃，然后向其中缓慢滴入一定量的体积分数0.4％的BDDE溶液，搅拌并保温反应1.5-2h；
3)将步骤2)反应后体系用0.005mol/L的盐酸溶液调节pH至7.2，平衡1～2小时，然后用乙醇或乙醇溶液沉淀得块状固体，即得；或者进一步将所得块状固体冷冻干燥制成交联透明质酸钠凝胶；或者更进一步将所得干燥的交联透明质酸钠凝胶置于PBS缓冲液中透析24-36h，再次冷冻干燥。
10.权利要求1-4任一项所述的交联透明质酸钠或权利要求5-9任一项所述方法制备的交联透明质酸钠在整形美容产品、药品或化妆品方面的应用。
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