CN106234298A - 一种短期内建立高脂血症大鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短期内建立高脂血症大鼠模型的方法。所用动物为雄性Sprague Dawley大鼠，体重150±20g；高脂日粮配方为23.31%酪蛋白、0.35%L‑胱氨酸、8.48%玉米淀粉、11.65%麦芽糊精、20.17%蔗糖、5.83%纤维素、2.91%大豆油、20.68%猪油、5.23%复合矿物质、1.16%复合维生素、0.23%酒石酸氢胆碱。脂肪乳配方为20%吐温80、20%猪油、10%胆固醇、2%胆酸钠、20%丙二醇、20%葡萄糖、1%丙基硫氧嘧啶。操作方法为连续给大鼠饲喂上述高脂日粮21天，自由采食；同时每天将按配方配制的脂肪乳灌胃给大鼠，剂量为2mL/kg.day。采用上述方法诱导建立大鼠高脂血症动物模型周期短，费用低，重现性好，能较好的模拟人类发病状态，因此，即可用于预防高脂血症功能性食品的研究，也可用于降低血脂药物的筛选。
Description
技术领域
本发明属于实验动物技术领域，具体涉及一种短期内使大鼠具有高脂血症病理特征的方法；该模型可用于预防高脂血症功能性食品的研究，也可用于降低血脂药物的筛选、药效评价及药理研究等领域。
背景技术
随着人们饮食结构的改变，高脂血症的发病率在逐年上升。高脂血症是脂质代谢或运转异常的一种全身性疾病，即血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的增高以及高密度脂蛋白的降低，是脂代谢紊乱的标志，也是动脉粥样硬化、心脏病、中风和脂肪肝的主要诱因之一，严重威胁人类健康。寻找安全有效的降血脂药物一直是药学领域的研究重点，如何通过合理的膳食配方来预防高脂血症也是营养学领域始终关注的问题，而动物模型在上述研究中必不可少。目前，临床上根据血脂水平可将高脂血症分为以下四类：①高胆固醇血症：血清总胆固醇水平增高；②混合型高脂血症：血清总胆固醇与甘油三酯水平均增高；③高甘油三酯血症：血清甘油三酯水平增高；④低高密度脂蛋白血症：血清高密度脂蛋白胆固醇水平减低。在目前应用的高血脂症模型动物中，主要有先天性、转基因和化学物质诱导三大类实验性动物模型。先天性和转基因动物模型稳定性较好，比较接近人类发病机制，但由于成模较难，生产周期长，价格昂贵，限制了这两类模型的应用；而化学物质诱导的实验动物模型，尤其是高脂饲料饲养或脂肪乳灌胃形成的实验动物模型在国内应用展为广泛。化学物质诱导的高脂血症模型主要考虑两个关键因素：一是肝脏合成胆固醇的量占胆固醇总合成量的比例越小越好；二是增加饲料中胆固醇含量不引起胆汁酸合成增加，不扩充胆固醇代谢池，也不因此抑制低密度脂蛋白受体活性，甚至完全抑制肝胆固醇的合成。由高脂饲料或者脂肪乳剂喂养形成的模型是经消化道给予，形成时间相对较长，与人类由于膳食结构改变而形成的高脂血症相似，对于研究营养因素对高血脂症形成的影响以及调血脂药物的开发具有很高的应用价值。但是，目前以高脂饲料饲喂形成高脂血症大鼠模型一般需要6-8周的饲养时间，周期过长，相对费用也高；脂肪乳灌胃形成的高脂血症大鼠模型则存在血清总胆固醇波动性下降等不稳定情况。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种短期内建立高脂血症大鼠模型的方法，该方法建模周期短、成本相对低。
一种短期内建立高脂血症大鼠模型的方法，连续给大鼠饲喂高脂日粮21天，自由饮水；同时每天将按配方配制的脂肪乳按照2mL/100gday剂量灌胃给大鼠；
所述的大鼠为雄性Sprague Dawley大鼠，体重150±20g；
所述的脂肪乳配方按质量体积比为20%吐温80、20%猪油、10%胆固醇、2%胆酸钠、20%丙二醇、20%葡萄糖、1%丙基硫氧嘧啶，余量为水。
所述的脂肪乳配制方法如下所述：
1）首先将猪油在80℃水浴中搅拌加热融化；
2）于液体状的猪油中加入胆固醇、丙基硫氧嘧啶和葡萄糖，充分搅拌溶解；
3）再加入胆酸钠和适量蒸馏水，充分搅拌使胆盐溶解；
4）再加入丙二醇和吐温80，充分搅拌直至产生乳化现象；
5）缓慢加入37℃的温水稀释至100mL。
所述的高脂日粮配方按质量百分比为23.31%酪蛋白、0.35% L-胱氨酸、8.48%玉米淀粉、11.65%麦芽糊精、20.17%蔗糖、5.83%纤维素、2.91%大豆油、20.68%猪油、5.23%复合矿物质、1.16%复合维生素、0.23%酒石酸氢胆碱。
在大鼠饲喂开始后第10天，大鼠即出现了以血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇升高、高密度脂蛋白胆固醇降低的症状，该症状一直持续到开始后的第14天~第21天；同时，伴随血清中载脂蛋白A1的降低和载脂蛋白B的升高；并且在大鼠饲喂开始后的第21天，大鼠肝脏出现以弥漫性脂质变性和脂肪空泡为特征的病理改变。
本发明的有益效果：
短期内即可形成混合型高脂血症病理症状，其症状可持续稳定三周以上的高脂血症大鼠模型形成方法，克服了传统方法建模所需时间长、费用过高、血脂水平参差不齐等缺点。采用上述方法诱导建立大鼠高脂血症动物模型周期短，费用低，重现性好，能较好的模拟人类发病状态，因此，即可用于预防高脂血症功能性食品的研究，也可用于降低血脂药物的筛选。
附图说明
图1 是试验期内大鼠生长曲线；
图2 是大鼠血清中总胆固醇浓度；
图3 是大鼠血清中甘油三酯浓度；
图4 是大鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇浓度；
图5 是大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇浓度；
图6 是大鼠血清中载脂蛋白A1浓度；
图7 是大鼠血清中载脂蛋白B浓度；
图8 是大鼠肝脏颜色及组织HE染色切片，其中A部分为对照组和模型组大鼠肝脏颜色，B部分为对照组和模型组大鼠肝脏组织切片HE染色（×200）。
具体实施方式
设计饲料配方：对照组和模型组大鼠饲喂的饲料分别为正常饲料和高脂饲料，具体组分按照表1所列比例进行配制。
设计脂肪乳配方：模型组大鼠灌胃用脂肪乳根据表2所列比例进行配制。具体配制方法①购买市售猪油，经高温炼制后，冷却低温保存备用；配制脂肪乳时，首先将猪油在80℃水浴中搅拌加热融化；②于液体状的猪油中加入胆固醇、丙基硫氧嘧啶和葡萄糖，充分搅拌溶解；③再加入胆酸钠和适量蒸馏水，充分搅拌使胆盐溶解；④再加入丙二醇和吐温80，充分搅拌直至产生乳化现象；⑤缓慢加入37℃的温水稀释至100mL，即可成为稳定的脂肪乳剂。保存于-20℃冰箱中备用，大鼠灌胃前于80℃水浴中加热融化。
建模方法：大鼠在温度22±2℃、湿度52±10%，12h光照与12h黑暗交替的清洁级环境中饲养，自由饮水和采食。对照组大鼠饲喂正常日粮；模型组大鼠饲喂高脂日粮，同时按2mL/100g.day的剂量进行脂肪乳灌胃；饲养期为21天。
实施例1 大鼠生长性能测定
饲养期内，每天对各组中的大鼠进行称重，计算并记录每组大鼠体重平均值，绘制体重增长曲线，并计算饲养期内大鼠的体增重百分比。在整个试验期（21天）内，随着饲养时间延长，对照组和模型组中大鼠的体重均呈增长趋势；在实验第1~14天期间，两组大鼠体重保持相对一致的增长速度；但从第14天开始，对照组大鼠体重继续保持原有速度增长；而模型组大鼠的体重增速开始减缓（图1）。根据整个试验期内大鼠的平均体重可知，在试验第1天、第10天、第14天时，对照组和模型组大鼠的平均体重没有显著差异，而在试验第21天时，对照组大鼠的平均体重显著高于模型组大鼠；整个试验期内，对照组大鼠平均体增重百分比为48.26%，显著高于模型组的40.42%（表3）。模型组大鼠在14天后体重增速减慢的原因，可能是大鼠体内高脂的环境影响了脂代谢和血糖的吸收，导致大鼠血脂代谢紊乱，血糖被脂肪团包裹难以吸收，并可能诱发糖尿病等因素有关。
表3 大鼠平均体增重百分比
实施例2 大鼠血清中总胆固醇浓度检测
饲养期内，分别在饲养开始第10天、14天和21天采用眼眶后静脉丛取血方法取各组大鼠血液，静置凝固后，3000-5000r/min离心10min，取上层血清置于另一离心管中冷冻保存待测；根据血清中总胆固醇的说明书，采用生化法在全自动生化分析仪上检测各血清样本的吸光度，根据公式计算样本中总胆固醇浓度。由图2可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型组大鼠血清中总胆固醇浓度均显著高于对照组；第10天、第14天和第21天时，模型组大鼠血清中总胆固醇的浓度比对照组大鼠分别提高了2.96倍、3.14倍和6.33倍。
实施例3 大鼠血清中甘油三酯浓度检测
根据血清中甘油三酯测定试剂盒的说明书，采用生化法在全自动生化分析仪上检测各血清样本的吸光度，根据公式计算样本中甘油三酯浓度。由图3可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型组大鼠血清中甘油三酯浓度均显著高于对照组；第10天、第14天和第21天时，模型组大鼠血清中甘油三酯浓度比对照组大鼠分别提高了80%、81%和98%。
实施例4 大鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇浓度检测
根据血清中低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒的说明书，采用生化法在全自动生化分析仪上检测各血清样本的吸光度，根据公式计算样本中低密度脂蛋白胆固醇浓度。由图4可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型组大鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇浓度均显著高于对照组；第10天、第14天和第21天时，模型组大鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇浓度比对照组大鼠分别提高了12.83倍、8.26倍和21.52倍。
实施例5 大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇浓度检测
根据血清中高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒的说明书，采用生化法在全自动生化分析仪上检测各血清样本的吸光度，根据公式计算样本中高密度脂蛋白胆固醇浓度。由图5可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型组大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇浓度均显著低于对照组；第10天、第14天和第21天时，模型组大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇浓度分别比对照组大鼠降低了18%、42%和25%。
实施例6 大鼠血清中载脂蛋白A1浓度检测
根据血清中高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒的说明书，采用生化法在全自动生化分析仪上检测各血清样本的吸光度，根据公式计算样本中载脂蛋白A1浓度。由图6可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型组大鼠血清中载脂蛋白A1浓度均低于对照组；第10天、第14天和第21天时，模型组大鼠血清中载脂蛋白A1浓度分别比对照组大鼠降低了1%、15%和5%。
实施例7 大鼠血清中载脂蛋白B浓度检测
根据血清中高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒的说明书，采用生化法在全自动生化分析仪上检测各血清样本的吸光度，根据公式计算样本中载脂蛋白B浓度。由图7可知，在第10天、第14天以及第21天取的大鼠血清中，模型组大鼠血清中载脂蛋白B浓度均显著高于对照组；第10天、第14天和第21天时，模型组大鼠血清中载脂蛋白B浓度分别比对照组大鼠提高了12%、10%和18%。
实施例8 大鼠肝脏组织形态学观察
肝脏石蜡切片制作：饲养期结束后，将大鼠麻醉腹主动脉取血后，解剖取大鼠肝脏，观察其外形、质地和色泽情况，剪取1×1cm肝脏组织置于4%多聚甲醛固定24h。将组织从固定液取出，在通风橱内将肝脏组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水：75%酒精4h→85%酒精2h→90%酒精2h→95%酒精1h→无水乙醇I 30min→无水乙醇II 30min→醇苯5-10min→二甲苯I 5-10min→二甲苯II 5-10min→蜡I 1h→蜡II 1h蜡III 1h。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋：先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签；于-20°冰箱冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃ 温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。
肝脏组织切片HE染色：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ20min→无水乙醇Ⅰ10min→无水乙醇Ⅱ10min→95%酒精5min→90%酒精5min-80%酒精5min→70%酒精5min-蒸馏水洗。切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染细胞质，染色1-3min。将切片依次放入95%酒精I 5min→95%酒精II 5min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→二甲苯Ⅰ5min →二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
肝组织切片的形态学观察：采用光学显微镜对染色好的肝脏组织切片进行观察。由图2中结果可知，对照组中大鼠肝脏成暗红色褐色，表面光滑，色泽光亮；模型组大鼠肝脏颜色泛白，表面不光滑（图8A部分）。在光学显微镜下观察肝脏组织切片，经HE染色，细胞浆呈红色，细胞核呈蓝紫色；对照组中大鼠肝脏的细胞浆和细胞核分布均匀，肝细胞的大小一致，肝索排列整齐，肝窦清晰呈长条状；模型组大鼠肝细胞肿胀，有大量大小不一的空泡状脂肪滴，将细胞核推挤到一侧，肝索排列紊乱，肝窦变小或消失（图8B部分）。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术进行的若干改进与润饰，均视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种短期内建立高脂血症大鼠模型的方法，其特征在于，连续给大鼠饲喂高脂日粮21天，自由饮水；同时每天将按配方配制的脂肪乳按照2mL/100gday剂量灌胃给大鼠；
所述的大鼠为雄性Sprague Dawley大鼠，体重150±20g；
所述的脂肪乳配方按质量体积比为20%吐温80、20%猪油、10%胆固醇、2%胆酸钠、20%丙二醇、20%葡萄糖、1%丙基硫氧嘧啶，余量为水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪乳配制方法如下所述：
1）首先将猪油在80℃水浴中搅拌加热融化；
2）于液体状的猪油中加入胆固醇、丙基硫氧嘧啶和葡萄糖，充分搅拌溶解；
3）再加入胆酸钠和适量蒸馏水，充分搅拌使胆盐溶解；
4）再加入丙二醇和吐温80，充分搅拌直至产生乳化现象；
5）缓慢加入37℃的温水稀释至100mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高脂日粮配方按质量百分比为23.31%酪蛋白、0.35% L-胱氨酸、8.48%玉米淀粉、11.65%麦芽糊精、20.17%蔗糖、5.83%纤维素、2.91%大豆油、20.68%猪油、5.23%复合矿物质、1.16%复合维生素、0.23%酒石酸氢胆碱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在大鼠饲喂开始后第10天，大鼠即出现了以血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇升高、高密度脂蛋白胆固醇降低的症状，该症状一直持续到开始后的第14天~第21天；同时，伴随血清中载脂蛋白A1的降低和载脂蛋白B的升高；并且在大鼠饲喂开始后的第21天，大鼠肝脏出现以弥漫性脂质变性和脂肪空泡为特征的病理改变。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |