CN103782959B

CN103782959B - 一种建立脾虚水湿不化证动物模型的方法

Info

Publication number: CN103782959B
Application number: CN201410072183.8A
Authority: CN
Inventors: 王世军; 韩冰冰; 赵文晓; 崔宁; 高洁; 韩旭
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: CN103782959A

Abstract

本发明公开了一种建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，包括以下步骤：将Wistar大鼠置于净化笼中，饲以高脂低蛋白饲料，自由进食、饮水，每日力竭游泳，经过40～45天造模后，通过检测大鼠一般状况，消化吸收功能（血清胃泌素、尿D-木糖排泄率、胃排空率和肠推进率），血清学指标（主要是血清白蛋白及血脂），以及水负荷试验测定体重指数和尿量，证明该法成功的建立了脾虚水湿不化证动物模型。本发明解决了目前没有脾虚水湿不化证动物模型的不足，为规范、标准、科学的评价中医药提供了一种新方法，具有造模方法简单、易于操作和推广，贴近临床特点。

Description

一种建立脾虚水湿不化证动物模型的方法

技术领域

本发明涉及一种建立脾虚水湿不化证动物模型的方法。

背景技术

中医认为脾位于中焦，主运化，统摄血液。脾运化食物和水液，把水谷精微和津液吸收、转运到全身各脏腑，从而维持人体的生命活动，若脾失健运则影响食物的消化和水谷精微的吸收而出现腹胀、消瘦、食欲不振、倦怠、气血衰少，口唇淡白不泽等。《素问》云：“诸湿肿满，皆属于脾”，脾气在水液的升降布散运动中发挥着重要的作用，以维持水液代谢平衡，若脾气运化水液的功能障碍，必然会导致水液在体内停滞，产生水湿痰饮等病理产物，甚至导致水肿，即所谓“脾生湿”，而水湿产生之后，反过来困遏脾气，成为“湿困脾”。外在湿邪侵入机体，困遏脾气，致使脾气不生，影响正常功能发挥。

脾虚水湿不化证是临床常见证型，许多慢性疾病均伴有脾虚水湿不化证，其主要致病因素有外湿和内湿。气候炎热、潮湿，涉水淋雨，久居潮湿之地等可使湿邪入侵导致外湿。《脾胃论》说：“饮食失节，甘肥过度，脾胃乃伤”，“形体劳役则脾病”。恣食生冷，过食肥甘、劳倦忧思等内伤脾胃，脾失健运，水谷运行受阻，津气不布，困阻于中焦，停留体内可聚成内湿，内湿产生，脾失健运，内湿素盛，也易招致外湿入侵。

为进一步深入探讨脾虚水湿不化证本质及探寻其有效治疗中药，很有必要进行脾虚水湿不化证动物模型复制的研究。理想的证型动物模型复制方法要求简单、客观、稳定性及重复性好，病因、表现、疗效等符合中医理论的指导。模型复制时需考虑动物的生物学特性，尽量选择与人生理、代谢、疾病特点相似，符合试验目的的动物。由于动物症状、体征采集的复杂性，故理性的动物模型不仅要求在症状体征上与人相近或相同，更希望用量化的客观指标来准确评价。

目前，还未见有脾虚水湿不化证动物模型的报道。仅见有学者采用单纯外湿或外湿加内湿方法进行脾虚湿阻动物模型复制的报道，其方法是提高动物生活环境中的温度、湿度，制造外湿，采用高脂饮食，游泳、过量饮水等方法损伤脾胃，制造内湿，使动物出现纳呆少饮、体重下降、稀便、毛发粗糙等表现，此类模型还存在以下明显不足之处：第一，模型制造方法的可重复性及稳定性差，缺乏统一的造模标准，不可控制因素太多，客观性和标准性差。第二，造模时间短，一般5～7天。脾虚的形成是一个长期、慢性的过程，如此短的时间不能形成脾虚证型，虽然出现湿阻表现，也只能是一种短期的状态，易于自然恢复，与中医证型有很大的差距。第三，中医认为机体出现困倦乏力、精神萎靡等症状即可为湿，故湿不易判断。上述脾虚湿阻模型主要以食少纳呆、蜷缩、体重下降等一般状况作为评价指标，不具特异性，难以客观化，但若为水湿则即符合中医脾虚时水湿不化的病机，又易于判断。第四，与临床有差距。比如，单纯制造外湿，提高空气的湿度，模拟出脾虚湿阻的症状，但临床上单纯外湿致病的情况较少见，而是与多因素及体质有关。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种脾虚水湿不化证动物模型的复制方法，设计了AIN-76A纯化饲料改良的高脂低蛋白饲料，发明了高脂低蛋白饲料加力竭游泳的方法模拟中医饮食失节、劳倦内伤，并设计专门时序，用4周龄大鼠诱导42天，建立了一种脾虚水湿不化证的模型，并从脾虚和水湿两个方面进行评价，结果表明该方法可成功复制脾虚水湿不化证动物模型，而且该复制方法稳定性、重复性好，简单、客观，符合中医理论的指导。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，该方法包括以下步骤：将大鼠置于IVC独立送回风净化笼中，饲以高脂低蛋白饲料，自由进食、饮水，每日力竭游泳，经过40～45天（优选42天）造模时间的培养即得。

其中，所述高脂低蛋白饲料依据该模型特定病因设计，在AIN-76A纯化饲料的基础上减少酪蛋白含量，增加猪油和胆固醇配制而成。其配方及各组分的质量百分比为：氯化胆碱0.2%，蛋氨酸0.3%，淀粉15%，蔗糖47.5%，纤维素5%，酪蛋白7%，玉米油5%，猪油15%，胆固醇0.5%，多矿3.5%，多维1%。

所述力竭游泳的具体方法为：使大鼠在游泳缸中强迫负重游泳，游泳至力竭为止。

所述力竭游泳具体方式为：每日下午大鼠尾部以10%体重负重，放于高60cm、直径100cm的圆桶中游泳，水温20±2℃，水深50cm，使大鼠不能触及圆筒底部，以大鼠入水到游至力竭，鼻尖没入水中10s时停止。

优选的，选用SPF级Wistar大鼠，4周龄，体重150±20g。

造模完成后，进行各项指标检测，如血生化检查、胃肠功能检查、水负荷试验等。

为实现本发明目的，主要选用以下指标从脾虚和水湿两方面对脾虚水湿不化证大鼠模型进行评价：大鼠一般状况指标即神态（1正常，2神倦萎靡）、倦怠懒动（1无变化，2动作迟缓）、活动状态（1正常，2迟钝）、皮毛光泽（1正常，2无光泽）及体重等；血清胃泌素、尿D-木糖排泄率、胃排空率和肠推进率等反映消化吸收功能指标；血清学指标，尤其是血清白蛋白及血脂；水负荷试验测定体重指数。试验结束后对以上指标进行统计学分析，模型组大鼠（即通过本发明的建立脾虚水湿不化证动物模型的方法得到的大鼠）与对照组大鼠（对照组大鼠采用正常饲料饲养，且不进行力竭游泳，其它同模型组大鼠）相比，若差异有统计学意义，说明造模成功。

本发明解决了目前没有脾虚水湿不化证动物模型的不足，为规范、标准、科学的评价中医药提供了一种新方法，具有造模方法简单、易于操作和推广，贴近临床特点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1建立脾虚水湿不化证动物模型

1.材料

1.1动物SPF级Wistar大鼠40只，雌雄各半，4周龄，体重150±20g，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，试验动物许可证编号：SCXK（京）2012-0001。动物饲养条件：按昼夜节律自然照明，于IVC独立送回风净化笼饲养，温度23±2℃，相对湿度30±3%。动物自由饮水、进食，适应性饲养三天后进行试验。

1.2饲料

正常饲料：AIN-76A纯化饲料。（成分：氯化胆碱0.2%，蛋氨酸0.3%，淀粉15%，蔗糖50%，纤维素5%，酪蛋白20%，玉米油5%，多矿3.5%，多维1%）。

高脂低蛋白饲料：在AIN-76A纯化饲料的基础上减少酪蛋白含量，增加猪油和胆固醇配制而成。（成分：氯化胆碱0.2%，蛋氨酸0.3%，淀粉15%，蔗糖47.5%，纤维素5%，酪蛋白7%，玉米油5%，猪油15%，胆固醇0.5%，多矿3.5%，多维1%）。

1.3仪器I5型IVC独立送回风净化笼（苏州市苏杭科技器材有限公司）；GL－20A型全自动高速冷冻离心机（湖南离心机厂）；RT－2100C型多功能全自动酶标仪（深圳雷杜公司）；YLS-1B多功能大鼠自主活动记录仪（山东省医学科学院）；HLD-B型电子天平（杭州友恒称重设备有限公司）；UV-2201微量紫外分光光度计（日本），编号1999008800。

1.4试剂蓝色葡聚糖2000（Pharmacia，17036001），购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；D-木糖测试盒（批号20130702），购自南京建成生物工程研究所；甲醛溶液（批号2013050402)，购自莱阳市康德化工有限公司。大鼠胃泌素酶联免疫检测试剂盒，购自北京方程生物公司。

2.方法

2.1动物分组及模型建立动物随机分为2组，每组20只，5只一笼，试验过程中给予正常饮水，不限制进食量。造模时间为6周。

2.1.1对照组：Wistar大鼠20只，纯化饲料AIN-76A喂养。

2.1.2游泳+高脂低蛋白饮食组：Wistar大鼠20只，给予特定的高脂低蛋白饲料，自由进食、饮水，每日下午尾部以10%体重负重游泳至力竭。造模时间为6周，试验开始后次日即进行一般状况指标的观察，第43天开始检测各项指标。

2.2观察指标

2.2.1一般状况观察每天仔细观察大鼠的神态、毛发洁净度、皮毛光泽、爪色等情况，每周将观察到的结果计入一般状况表。

2.2.2体重测试每周用电子天平称量大鼠体重。

2.2.3自主活动测定试验前在记录仪上设定时间，将大鼠放入自主活动桶，按下开始按钮，记录10min内大鼠活动数。

2.2.4尿D-木糖检测禁食12小时后用3%D-木糖灌胃，1ml/100g，收集5小时尿液，然后按D-木糖试剂盒说明书进行测试。

2.2.5血生化指标检测下腔静脉取血8-10ml，室温静置0.5-1小时，离心，制备血清，低温保存，进行血生化指标检测。

2.2.6水负荷试验禁食12小时，称量体重，作为正常对照值，然后每只大鼠腹腔注射10%体重的生理盐水，水负荷后分别称量0时、1时、2时、4时、6时体重及6小时尿量，期间禁食、禁水。水负荷差值=水负荷后体重-水负荷前体重。分别以单位体重水负荷差值描记曲线，曲线下面积表示单位体重所负荷的水在体内的潴留时间。

2.2.7胃排空率检测①大鼠用2%DB-2000灌胃，0.4ml/只；②30min后处死，打开腹腔，用止血钳分别夹住胃贲门、幽门、小肠色素运行最前端部分以及回肠末端，将胃及小肠（贲门至回肠末端）从腹腔取出；③贲门至幽门括约肌处取胃，沿胃大弯侧将胃剪开，将胃中残留物充分溶于4.0ml去离子水中，以12000r/min离心5min，取上清液；④将2%DB-2000溶液0.4ml溶于4.0ml去离子水中，并以同法离心，作为基准液；⑤上述两种溶液分别于分光光度计620nm处测吸光度值。计算公式为：胃排空率（%）=1-A1/A2（A1：胃内DB-2000吸光度值，A2：基准DB-2000吸光度值）。

2.2.8肠推进试验①同胃排空率检测步骤1、2；②取幽门括约肌至回肠末端小肠，用生理盐水润湿后置于平板上，不加牵引力使其平铺，分别量取幽门括约肌至色素最前端及幽门括约肌至盲肠距离，二者之百分比为小肠推进率。小肠推进率=小肠内色素推进距离/全小肠长度×100%。

2.3数据分析各组数据采用SPSS17.0或origin pro8软件进行统计学分析，p<0.05为差异有统计学意义，p<0.01为差异有显著统计学意义。

3.结果

3.1一般状况指标观察

试验开始后即观察大鼠一般状况指标，每周记录入一般状况表，对结果进行卡方检验。造模第6周结果显示，模型组与对照组比，大鼠神态萎靡（p<0.01），倦怠懒动(p<0.05)，活动迟钝(p<0.05)，被毛散乱、缺少光泽（p<0.01），消瘦且体重下降（p<0.01，见表1）。

表1高脂低蛋白饮食结合游泳对大鼠体重的影响

t=4.932，**P<0.01，与对照组比

3.2胃肠功能评价指标

表2高脂低蛋白饮食结合游泳对大鼠胃泌素的影响

t=8.372，**P<0.01，与对照组比

表3高脂低蛋白饮食结合游泳对大鼠胃排空率和肠推进率的影响

*P<0.05，与对照组比

表4高脂低蛋白饮食结合游泳对大鼠尿D-木糖的影响

t=2.456，*P<0.05，与对照组比

表2、表3显示，模型组与对照组比，模型组大鼠血清胃泌素水平显著降低（P<0.01），胃排空率和肠推进率下降（P<0.05）。从中医理论上讲，脾虚即胃肠功能紊乱，脾运化升清功能障碍，饮食消化不良，气血生化乏源，血不足则营养运化功能减弱，故胃肠激素等分泌减少，这与现代医学认为的脾虚与胃泌素分泌减少有关相一致，脾气不足则气推动乏力，胃肠运动减慢，胃排空率和肠推进率下降。D-木糖排泄率是反映小肠吸收功能的指标之一，临床研究表明，多数患者D-木糖排泄率降低，表4结果显示，模型组与对照组比，尿-木糖排泄率下降（P<0.05）。以上说明本发明造模动物吸收功能降低，造模成功。

3.3血生化指标

表5高脂低蛋白饮食结合游泳对大鼠血生化指标的影响

*P<0.05，**p<0.01，与对照组比

表5显示，模型组与对照组比，模型组大鼠血清总蛋白下降（P<0.05），白蛋白下降（P<0.05），总胆固醇升高，低密度脂蛋白升高（P<0.05），高密度脂蛋白下降（P<0.01），这都说明脾虚运化失司，水谷精微生化乏源，水液运化障碍。

3.4水湿评价指标

表6高脂低蛋白饮食结合游泳对大鼠6小时体重指数的影响

F=13.726，**p<0.01，与对照组比，以注水量为协变量采用协方差分析。

表7高脂低蛋白饮食结合游泳对大鼠尿量的影响

t=2.535，*P<0.05，与对照组比

6小时体重指数是给予水负荷后，在不同时间点以体重下降值描记曲线，计算曲线下面积，从整体观察动物所负荷水液在体内的潴留时间，表6显示，模型组和对照组相比，模型组大鼠6小时体重指数显著增加（P<0.01），尿量减少（P<0.05）（见表7），说明水液在体内留存时间延长，机体水液运化障碍。

由上述结果得知，模型组大鼠一般状况指标可以体现脾虚水湿不化证动物精神萎靡、倦怠懒动、被毛散乱、失去光泽、形体消瘦的表现，同时胃肠功能指标、血清生化指标及水负荷试验指标更客观的表明模型动物脾虚时胃肠功能消化吸收功能下降，水谷精微吸收障碍以及水液运化障碍，体内停滞的情况。故脾虚水湿不化证动物模型成功建立。

Claims

1. 一种建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：将大鼠置于净化笼中，饲以高脂低蛋白饲料，自由进食、饮水，每日力竭游泳，经过 40～45 天造模时间的培养即得；

其中，所述高脂低蛋白饲料,依据模型诱导的关键因素设计，在 AIN-76A 纯化饲料的基础上减少酪蛋白含量，增加猪油和胆固醇配制而成；其配方及各组分的质量百分比为：氯化胆碱 0.2%，蛋氨酸 0.3%，淀粉 15%，蔗糖 47.5%，纤维素 5%，酪蛋白 7%，玉米油 5%，猪油 15%，胆固醇 0.5%，多矿 3.5%，多维 1%。

2. 根据权利要求 1 所述的建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，其特征在于：所述力竭游泳的具体方法为：使大鼠在游泳缸中强迫负重游泳，游泳至力竭为止。

3. 根据权利要求 2 所述的建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，其特征在于：所述力竭游泳具体方式为：每日下午大鼠尾部以 10%体重负重，放于高 60cm、直径 100cm 的圆桶中游泳，水温 20±2℃，水深 50cm，使大鼠不能触及圆筒底部，以大鼠入水到游至力竭，鼻尖没入水中 10s 时停止。

4. 根据权利要求 1 所述的建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，其特征在于：所述大鼠选用 SPF 级 Wistar 大鼠，4 周龄，体重 150±20g。

5. 根据权利要求 1 所述的建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，其特征在于：所述净化笼为 IVC 独立送回风净化笼。

6. 根据权利要求 1 所述的建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，其特征在于：所述造模时间为 42 天。

7. 根据权利要求 1～6 中任一项所述的建立脾虚水湿不化证动物模型的方法，其特征在于：所述造模完成后，选用以下指标从脾虚和水湿两方面对脾虚水湿不化证大鼠模型进行评价：大鼠一般状况指标即神态：1 正常，2 神倦萎靡；倦怠懒动：1 无变化，2 动作迟缓；活动状态：1 正常，2 迟钝；皮毛光泽：1 正常，2 无光泽及体重；血清胃泌素、尿 D-木糖排泄率、胃排空率和肠推进率；血清学指标；水负荷试验测定体重指数；对以上指标进行统计学分析，模型组大鼠与对照组大鼠相比，若差异有统计学意义，说明造模成功。