CN102648701A - 一种脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变动物模型的建立方法 - Google Patents
一种脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变动物模型的建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变动物模型的建立方法。该方法基于现有脾虚证大鼠模型和慢性萎缩性胃炎大鼠模型,利用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮水加饥饱失常和耗气泻下法联合复制,其具体步骤如下:先用灭菌自来水配制10mg/L的MNNG储存液,临用时配成80~200μg/mL的MNNG溶液饮用液代替饮用水由大鼠自由饮用,以MNNG自由饮用作为造模的开始;然后以饥饱失常加改良耗气泻下法复制脾虚证,即造模后第5周开始隔日禁食喂饲,第7周加用小承气汤灌胃1~3ml/只/d;连续造模12周。本发明方法所构建的动物模型与慢性萎缩性胃炎中晚期病变临床症状与体征相同或相近,并经重复建模验证,其重得性和稳定性好,适用于中医健脾治法治疗慢性萎缩性胃炎的中药的筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种胃炎胃癌前病变动物模型的建立方法,特别涉及一种脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变动物模型的建立方法,属于中医脾虚证慢性萎缩性胃炎基础研究和实验动物学领域。
背景技术
慢性萎缩性胃炎(CAG)是以胃黏膜局部性或广泛性的固有腺体萎缩、数量减少或消失、黏膜层变薄、黏膜肌层变厚的消化系统疾病,其发病率高、易反复发作、难以治愈。研究表明:CAG癌变发生率是10%-19%;而绝大多数胃癌患者均有CAG病史,故CAG是胃癌癌前病变主要状态之一。临床上CAG可分为三个时期,即早期、中期和晚期。早期主要由于炎性损伤与修复的反复,胃黏膜上皮损伤性修复不足以修复炎性损伤,胃黏膜日益萎缩,少部分患者可发生小肠上皮化生;中期则由于持续性炎症或炎症反复发作,而修复功能的持续性损伤,胃黏膜萎缩进行性加重,胃黏膜萎缩基础上的肠上皮化生成为主要的病变,且胃黏膜肠上皮化生由小肠上皮化生向大肠上皮化生演变;晚期则由于病程过长,胃功能长期受损,食物消化吸收功能低下,加上疾病的消耗,免疫功能,尤其是细胞免疫功能低下,难以根除炎性反应,胃组织自身修复功能严重不足,加上成熟及较为成熟的胃黏膜上皮细胞较未成熟或低成熟细胞更易受损(死亡或凋亡),胃黏膜上皮细胞分化度不断降低,新生细胞难以正常分化成熟,转而化生为成熟度更低的大肠型上皮细胞,低分化细胞的增殖调控能力日益丧失,在分化受到抑制、增殖失常的情况下极易发展为不典型增生,此外由于细胞免疫功能失常,不典型增生难以诱发免疫效应,不典型增生最终恶变为胃癌。因此CAG防治的重点在于逆转胃黏膜萎缩与肠上皮化生,阻断肠上皮化生基础之上不典型增生的恶变,而肠上皮化生基础之上的不典型增生作为CAG向胃癌转变的关键时期,是胃癌预防的最后一道防线。
目前,临床治疗CAG的主要药物为中药,一方面是由于临床缺乏治疗CAG的西药,另一方面,中药具有可逆转胃黏膜萎缩与肠上皮化生、阻断不典型增生等优点,因此开发CAG防治效应的中药制剂,具有重大意义。然而由于CAG发病机制,尤其是对中医病因病机缺乏系统研究,因此,其发病机制尚未完全阐明,目前仍缺乏符合中药辩证用药特点的、病与证相结合的动物模型,严重制约了抗CAG中药的开发。考虑到临床CAG患者主要以中晚期为主,而中晚期肠上皮化生基础上的不典型增生是胃癌预防的关键时期,因此,在进行CAG的相关研究时,复制肠上皮化生伴不典型增生为特征的CAG胃癌前病变模型尤为重要。
现代医学表明,胃癌的发生与化学致癌物关系密切,长期低剂量接触致癌物,可诱导胃癌的发生,以特定剂量持续给药,在特定时期,致癌剂可诱发胃黏膜的萎缩、肠上皮化生和不典型增生。如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),无论以何种方式摄入体内,均可诱发胃黏膜萎缩和肠上皮化生,可以模拟CAG早、中和晚期整个病变进程,MNNG自由饮用所诱导的CAG模型与临床相似度大,且成本低,复制方法简单,模型稳定、动物个体差异小、动物死亡率低等特点,是目前CAG动物模型复制的主要方法之一。CAG属中医学“胃痞”等范畴。较为公认的观点认为是本虚标实之证,其中脾虚是CAG的根本病机,决定CAG发生、发展和预后等全部临床过程,因此有必要构建一种脾虚证CAG动物模型,供健脾益气为主要治法治则组方中药的筛选。而中医证侯动物模型的复制要尽量相似于临床脾虚证,需要综合劳倦、寒冷、噪音、生化乏源四个致虚要素,其中耗气破气加饥饱失常模型造模方法最为成功。
综上所述,MNNG自由饮用是复制CAG大鼠模型、耗气破气加饥饱失常是复制脾虚证大鼠模型较为成熟可行的方法,但上述方法综合应用能否复制出脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变大鼠模型,以及模型时间如何确定,以保证动物处于胃癌前病变期(PLGC,肠上皮化生不典型增生期)目前仍未见报道。此外,鉴于慢性萎缩性胃炎的研究已深入到分子和信号转导水平,如何选择正确的指标从各层次、各指标检测上全面反映脾虚证CAG-PLGC的特征,同样也是需解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变动物模型的建立方法,拟采用MNNG自由饮用复制CAG-PLGC动物模型,并在此基础上结合耗气破气加饥饱失常脾虚证动物模型复制方法,建立一种符合慢性萎缩性胃炎致病机理及病程进展,且与中医临床最常见中医辩证分型相似的症证结合的脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变动物模型,该模型重得性和稳定性好,可适用于中医健脾治法治疗慢性萎缩性胃炎的中药的筛选。
为了解决上述问题,本发明基于现有脾虚证大鼠模型和慢性萎缩性胃炎大鼠模型,利用MNNG溶液自由饮用加饥饱失常和耗气泻下法联合复制,所采用的技术方案如下:
(1) 以MNNG自由饮用作为造模的开始:用灭菌自来水将MNNG配制成10 mg/L的储存液,避光冷藏保存,临用时将其配成80~200μg/mL的饮用液,装入200mL的饮水瓶中代替饮用水,外贴黑色避光纸(整个配制过程全部避光操作),每天更换,让大鼠自由饮用;
(2) 以饥饱失常加改良耗气泻下法复制脾虚证:于造模后第5周开始隔日喂饲,即一日不限制喂饲,次日禁食;第7周后,100g/ml的小承气汤(大黄12克、炙厚朴6克、枳实9克)水煎液灌胃,1~3ml/只/d,1次/d;
(3) 连续造模12周,对照组予正常饮食。
本发明相对于现有技术的有益效果如下。
(1)采用长期接触低剂量亚硝胺类化合物造成胃黏膜损伤,并发持续性炎症,导致胃黏膜萎缩,并在萎缩基础上发生肠上皮化生及继发性不典型增生,从而复制出慢性萎缩性胃炎胃癌前病变的特有病变。
(2)根据中医理论复制脾虚证大鼠模型,具有脾虚证侯群,如体温降低、毛发枯黄、食欲低下、便溏及免疫功能低下等表现。
(3)与现有技术相比,本发明方法所构建的动物模型与慢性萎缩性胃炎中晚期病变临床症状与体征相同或相近,并经重复建模验证,其重得性和稳定性好,适用于中医健脾治法治疗慢性萎缩性胃炎的中药的筛选,可为开展相关的新药研发提供实验依据。
附图说明
附图1为实施例4中造模后大鼠胃黏膜经AB-PAS染色后胃黏膜小肠上皮化生病变图(图1-1为正常组,图1-2为模型组,图1-3为维酶素组,图1-4为正常组)。
附图2为实施例4中造模后大鼠胃黏膜经HID-AB-PAS染色后胃黏膜大肠上皮化生病变图(图2-1为正常组×8K,图2-2为模型组×8K,图2-3为维酶素组,图2-4为正常组)。
附图3为实施例3中造模后大鼠胃黏膜超微组织病变图(图3-1为正常组,图3-2为模型组,图3-3为维酶素组,图3-4为正常组)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明,这些实施例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围。
实施例1 用灭菌自来水将MNNG配制成10 mg/L浓度的储存液,避光冷藏保存,配成80μg/mL的饮用液,装入200mL的饮水瓶中代替饮用水(外贴黑色避光纸,且整个配制过程全程避光操作),由大鼠自由饮用;MNNG溶液自由饮用后第5周开始隔日禁食饲养,即一日不禁食,次日禁食(不禁水),再次日不禁食,如此反复;MNNG溶液自由饮用后第7周加用小承气汤灌胃1ml/只/d,1次/d,连续造模12周。
实施例2 将配制好的10 mg/L浓度的MNNG储存液配成150μg/mL的饮用液,装入200mL的饮水瓶中代替饮用水(外贴黑色避光纸,且整个配制过程全程避光操作),由大鼠自由饮用;MNNG溶液自由饮用后第5周开始隔日禁食饲养,即一日不禁食,次日禁食(不禁水),再次日不禁食,如此反复;MNNG溶液自由饮用后第7周加用小承气汤灌胃2ml/只/d,1次/d,连续造模12周。
实施例3 将配制好的10 mg/L浓度的MNNG储存液配成200μg/mL的饮用液,装入200mL的饮水瓶中代替饮用水(外贴黑色避光纸,且整个配制过程全程避光操作),由大鼠自由饮用;MNNG溶液自由饮用后第5周开始隔日禁食饲养,即一日不禁食,次日禁食(不禁水),再次日不禁食,如此反复;MNNG溶液自由饮用后第7周加用小承气汤灌胃3ml/只/d,1次/d,连续造模12周。
实施例4 动物实验一。
实验材料:实验动物为SPF级SD大鼠28只,60~80 g,雌雄各半,由广州中医中医药大学实验动物中心中心提供。
实验药品:胃痞消(太子参15g,、黄芪30g、白术15g、丹参20g、蛇舌草30g等)和小承气汤(大黄12g、炙厚朴6g、枳实9g)中药饮片由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供并鉴定;维酶素由北京长城制药厂生产(0.2 g/片);N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),由日本东京株氏会社提供;淋巴细胞分离液,由华美生物工程公司提供;红细胞溶解液,由广州军区总医院检验中心提供;鼠抗大鼠CD3、CD4、CD8单抗及羊抗鼠Ig G FITC购自美国Sigma公司。
主要仪器:流式细胞仪(Fac-star-plus型,美国Becton Dickinson公司)。日立透射电镜,日本;莱卡病理分析前处理设备,美国;奥林巴斯显著镜,日本。
1实验方法:实验方法如下。
1.1 脾虚型CAG-PLGC动物模型的复制 将大鼠随机分为对照组(10只)、模型组(15只)、胃痞消组(13只)和维酶素组(13只),先用灭菌自来水将MNNG配制成10 mg/L浓度的储存液,避光冷藏保存,临用时将其配成150μg/mL的饮用液,装入200mL的饮水瓶中代替饮用水,外贴黑色避光纸(整个配制过程全部避光操作),每天更换,让大鼠自由饮用,在此基础上采用经典的饥饱失常加改良耗气泻下法复制脾虚证,具体方法为:实验第5周开始模型组采用隔日喂食,自由饮用MNNG饮用液。实验第7周开始,小承气汤100g/ml的小承气汤(大黄12g、炙厚朴6g、枳实9g)水煎液灌胃,2ml/只/d,连续造模到第12周,对照组予正常饮食。
1.2 给药方法 对照组和模型组灌服等容量灭菌自来水;维酶素组(0.27g/kg/d)和中药组(15 g/kg/d)于造模后第8周经口灌服等容量药物溶液。
1.3 标本制备 于实验第8周末,从模型组中随机取2只大鼠,取胃组织,常规HE染色,确认光镜下2只大鼠均有胃黏膜萎缩性病变后,于第12周末,禁食禁水12h后,取全部抗凝血后。脱颈椎处死动物,剖取全胃,沿大弯剪开,取胃体窦交界处组织两块,一块用10%中性甲醛固定,另一块胃组织立即投入3%戊二醛溶液固定。
1.4 病理切片制备及组织形态学观察 取10%中性甲醛固定胃组织,常规石蜡切片,切片厚度4~5μm,取连续切片行苏木精-伊红(HE)、AB(阿尔辛蓝)-PAS(schiff氏液)和HID(高铁二胺)-AB-PAS特殊化学染色,光镜观察组织病理改变,取HE染色切片,光镜观察胃黏膜萎缩、炎性反应和肠化生等病变,5个视野/只,测微器测胃黏膜平均厚度;胃黏膜慢性炎症及萎缩病理诊断标准参照2000年全国慢性胃炎研讨会病理学标准。
1.3.1 AB-PAS染色 切片脱蜡至水;在AB染液中染10-50min;蒸馏水洗;1%高碘酸水溶液氧化10min;自来水洗,蒸馏水洗,擦干切片;于schiff氏液中浸染(避光)20min;用亚硫酸水洗2-3次;流水冲洗 5min;天青石蓝液染3min;Mayer氏苏木素染3min;流水冲洗5min;0.5%桔黄G水溶液等30s;系列酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。小肠上皮化生后酸性粘液物呈绿蓝色。
1.3.2 HID-AB-PAS特殊化学染色 取切片先滴高铁二胺于第一块组织上过夜,第2天滴pH 2.5的AB液,再做PAS(0.5%过碘酸氧化液及Schiff液)染色,滴加2%亚甲约l0min,流水冲洗,脱水,透明封固。小肠型上皮化生表现为蓝色,大肠型上皮化生成为黑色。
1.5 电镜切片制备与超微组织观察 取3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定胃组织,置4℃冰箱中固定3 h,0.1 mol磷酸缓冲液充分漂洗,再用1%锇酸后固定1.5h,0.1 mol磷酸缓冲液充分漂洗,丙酮梯度脱水,Epon812包埋,标本经半薄切片、光镜定位后,再做超薄切片,厚度70 nm,经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,透射电镜下观察、摄影。
1.6 外周血淋巴细胞CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值的测定与计算 取24 h内外周抗凝血,Ficoll法将外周血用PBS稀释1倍,置淋巴细胞分离液中,以2000r/min离心25 min,取出淋巴细胞并用红细胞溶解液3mL,溶解5 min,离心弃上清液,调整细胞数为0.5×106/mL,枸橼酸钠抗凝后取50μL分别加入5个流式细胞仪检测专用试管中。A、B管中先加入抗鼠CD3单克隆抗体的同型对照异硫氰酸荧光素(FITC)Mouse(BALB/c)IgG 3,1μg,再分别加入抗鼠CD4单克隆抗体、抗鼠CD8单克隆抗体的同型对照磷脂酰乙醇胺(PE)Mouse(BALB/c)IgG2a、PE Mouse(BALB/c)IgG各1μg。C、D、E管中先各加入FITC标记的抗鼠CD3单克隆抗体1μg,再分别加入PE标记的抗鼠CD4单克隆抗体、抗鼠CD8单克隆抗体各1μg,振荡混匀后避光室温孵育15 min,1200 r/min离心7 min,弃上清液,每管加入PBS溶液0.8 mL重悬后,流式细胞仪检测和分析。激光:氩离子Innova95-5。激光功率:200mW,波长:488 nm。利用CELLQUEST软件,先用同型对照管A、B对仪器条件进行优化设置,再以每管不少于10000个细胞的条件收集C、D、E管中的细胞。用CELLQUEST软件结合“画门”(gating)技术对收集的数据进行统计、分析。
1.7 胃黏膜上皮细胞单细胞悬液的制备 取新鲜胃黏膜组织约4g,除去表面粘液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,尽量洗尽组织中的血液,在平面皿上剪成肉糜状,置300目铜网一边用眼科镊手柄侧轻轻摩擦组织于铜网表面,一边收集PBS冲洗下的细胞到试管内,在37℃、体积分数5%CO2、95%相对湿度下孵育4h。在4℃,1500r/min条件下,离心7min,弃上清液,重复2次,调整细胞数为106/mL,制成单细胞悬液。
1.8 诱导胃癌前病变组织细胞凋亡实验 将上述制备的单细胞悬液,用体积分数为70%的乙醇固定,进行流式细胞仪分析,上机前离心去除固定液,采用溴化乙啶(EthidiumBromide,EB)一步插入法,DNA定量荧光染色,染液含EB10ug/mL、核糖核酸酶(RNA酶)10μg/mL和10mg/mL曲里通X-100(Triton X-100),每份样品细胞调至106/mL,4℃染色30min后,用流式细胞仪进行检测,观察细胞周期分布。
1.9 p53、Bcl-2和Bax表达的检测 采用间接荧光流式细胞术检测,取1mL细胞悬液,体积分数75%冷乙醇固定,过夜。PBS清洗2次,加单克隆抗体(McAb)p53(第一抗体)、McAb-Bcl-2或McAb-Bax1μL,4℃反应45min。PBS清洗2次,加第二抗体羊抗小鼠FITC-IgG50μL(1:200稀释),4℃反应45min,PBS清洗2次。每组样品均设非特异对照,以PBS代替第一抗体,其余步骤同上。用流式细胞仪检测和分析,记录p53、Bcl-2和Bax蛋白表达阳性细胞的百分率,减去非特异对照值,即为蛋白表达水平。
1.10统计方法 数据以均值加减标准差表示( )表示,组间均值的比较用单因素方差分析,方差齐时组间均值两两比较采用SNK法,方差不齐时组间均值两两比较用Duun’s法。以上数据采用SPSS 11.5统计软件进行数据统计;有序分类资料以频数和平均Radit值表示(,),进行多组间Radit比较,由DPS6.55进行统计分析,α=0.05。
2实验结果如下。
2.1一般情况 脾虚证CAG胃癌前病变模型大鼠精神萎靡、眼睛无神、活动缓慢,爱聚成堆,毛发杂乱无光泽、疏松粗糙、易脱落,食量减少,便溏、形体偏小,耳色淡白,体重增加缓慢。正常组无上述症状,中药组有较大改善,维酶素组未见明显改善。
2.2胃大体情况 正常组胃黏膜呈粉红色,容积较小,胃壁厚、弹性好、皱襞表面光滑、排列规整、粘液多、有光泽,且无出血点;模型组黏膜色泽淡白或灰白、容积多有扩张、胃壁变薄、弹性差、胃内容物增多、壁少且小或消失、排列紊乱、粘液少,且有散在出血点;中药组可改善CAG胃癌前病变大鼠胃上述大体病变,而维酶素组则无明显改善。
2.3对胃黏膜病理形态的影响 正常组胃黏膜层较厚,上皮细胞及腺体排列整齐、大小形状一致,细胞呈单层柱状、胞质透明或空泡状,腺上皮与腺管分界清楚,固有腺及黏膜无扩张瘀血、偶见炎性细胞浸润,黏膜肌层无增生。模型组胃黏膜层变薄、多灶性萎缩、腺体排列紊乱、变小、数量减少,上皮细胞形态大小不一,间质有多种炎性细胞,可见明显肠上皮化生(胃黏膜细胞体积小、空泡样变性、边缘呈不规则多边形、胞浆皱缩、排列不整,细胞间隙增大,核浆比相对增大),腺腔增宽;中药干预后大鼠胃黏膜固有层淋巴细胞和浆细胞浸润有不同程度的减轻,萎缩程度、上皮化生亦有明显改善。中药组和维酶素组则无明显改善。
2.3.1AB-PAS染色 由图1-1至1-4可知,正常组大鼠胃黏膜上皮细胞呈现红色,未见有蓝色,黏膜肠腔侧蓝色可能为酸性胃液;模型组可见分布不匀的蓝染灶,弥漫于胃黏膜全层,其中其底侧有较多蓝染灶,提示新生胃黏膜上皮细胞亦有小肠化生演变发生;维酶素组可见蓝染灶主要集中在黏膜基底侧,而肠腔侧黏膜上皮较为正常,提示维酶素可有助于细胞分化成熟,表现为肠腔侧胃黏膜上皮细胞分化较为成熟,肠上皮化生较少;而中药组胃黏膜较为正常,可见散在分布蓝染灶,但与模型组和维酶素组有较大差异,与正常组相似。
2.3.2HID-AB-PAS特殊化学染色 由图2-1至2-4知,正常组大鼠胃黏膜上皮细胞呈现红色,无未见有蓝色和黑色染色;模型组可见分布不匀的蓝染灶,弥漫于胃黏膜基底侧,肠腔侧主要为大肠型上皮化生,提示新生胃黏膜上皮细胞以小肠化生为主,而近肠腔侧以大肠型上皮化生为主;维酶素组表现同模型组,但与模型组相比,小肠型上皮化生多,而大肠型上皮化生较少,提示维酶素具有一定的促分化作用,可阻止小肠上皮化生向大肠型上皮化生的转化,抑制细胞低分化返祖病变;而中药组胃黏膜较为正常,可见散在分布蓝染小肠化生灶,而大肠型化生则可见诸肠腔侧,但与模型组和维酶素组有较大差异,与正常组s相似。
2.4对胃粘平均膜厚度的影响 由表1可知,与模型组相比,正常组胃黏膜平均厚度有显著性增加(P<0.01),维酶素组胃黏膜平均厚度无显著性差异(P>0.05),中药组则有显著性减小(P<0.01);与维酶素组相比,中药组则有显著性增加(P<0.01)。
表1 对CAG胃癌前病变大鼠胃黏膜平均厚度(μm)的影响()
分组 | 动物数(只) | 胃黏膜平均厚度 |
正常组 | 10 | 510.02±32.45** |
模型组 | 13 | 363.44±22.51 |
维酶素组 | 13 | 323.14±31.45 |
中药组 | 13 | 487.87±30.02**## |
注:与模型组比较,** P<0.01;与维酶素组比较,##P<0.01。
2.5对胃黏膜萎缩程度和炎症程度的影响 由表2可知,模型组胃黏膜萎缩程度与炎症程度较正常组有显著性改善(均有P<0.01);维酶素组胃黏膜萎缩程度与炎症程度与模型组无显著性差异(均有P>0.05),中药组则有显著性改善(均有P<0.01)。
表2 中药对CAG大鼠胃黏膜萎缩程度和炎症程度的影响(??,)
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01:与维酶素组比较,#P<0.05,## P<0.01。
2.6超微结构观察 正常情况下,胃黏膜上皮由主细胞、壁细胞和胃粘液上皮细胞三类组成,其中主细胞分布在胃腺体及底部,细胞核为圆形或椭圆形,核膜厚度不均匀,核内染色质密度不均匀。胞质丰富,有大量平行排列的粗面内质网、大量的分泌颗粒、发达的高尔基体和散在的线粒体(见图3-1)。壁细胞较大呈圆锥形,锥顶端向腺腔,核在细胞中心,胞质内充满小泡状光滑内质网、细胞内小管和丰富的线粒体。粘液细胞是覆盖于胃腺颈或胃腔表面和胃小凹内面的柱状上皮细胞,细胞核较大圆形或半月形,位于细胞底部,胞质内有大小不等的黏液颗粒(因切片过程中溶解而呈空泡状),较发达的高尔基体、大量的粗面内质网和散在的线粒体,细胞顶部有微绒毛。
模型组:主细胞内可见大小不一的空泡,空泡有完整的包膜,相邻空泡因发生整合,窕泡包膜整合而形成更大的空泡,细胞内细胞器少见,粗面内质网大量减少,胞核缩小边集,染色质浓缩(见图3-2)。
维酶素组:可见主细胞内偶见单个小空泡或发生整合的的大空泡,空泡有完整的包膜,但空泡所占细胞质比例较模型组小,且大空泡较模型组小,且数量较少,细胞内细胞器较模型多见,病变程度界于模型组与中药组之间,有较多较为粗面内质网,少见形态较正常的线粒体,胞核无明显缩小,染色质浓缩,电子密度较中药组高,但低于模型组。(见图3-3)。
中药组:可见主细胞内有散在分布的的小空泡和部分发生融合的窕,空泡有完整的界限,提示有包膜存在,细胞内细胞器较模型多见,与正常组较接近,有大量较为分散的粗面内质网,线粒体形态较正常,胞核无明显缩小,染色质浓缩,但浓缩的染色体电子密度较模型组低,与正常组相仿(见图3-4)。
2.7对外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值的影响 由表3可知,与对照组相比,模型组外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均有显著性降低(均有P<0.01)。与模型组相比,中药组外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均有显著性升高(P<0.01);维酶素组外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值有显著性升高(P<0.01),而CD8则无显著性差异(P>0.05)。与维酶素组相比,中药组外同血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均有显著性升高(P<0.01)。
表3 中药对脾虚型CAG大鼠T细胞亚群比例的影响(,%)
组别 | 动物数 | CD3 | CD4 | CD8 | CD4/CD8 |
对照组 | 10 | 72.8±4.2** | 52.3±2.2** | 20.1±1.8** | 2.6±0.6** |
模型组 | 13 | 36.6±3.7 | 18.9±3.3 | 12.9±1.3 | 1.3±0.5 |
维酶素组 | 13 | 66.4±2.4**## | 48.9±2.9**## | 16.2±1.7**## | 3.0±0.2**## |
中药组 | 13 | 47.2±5.8** | 36.4±2.7** | 14.0±1.9 | 2.1±0.5** |
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与维酶素组比较,#P<0.05,##P<0.01。
2.8各组对脾虚型CAG-PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞增殖周期分布的影响
注:与模型组比较,**P<0.01;与维酶素组比较,##P<0.01。
由表4可知,与正常对照组相比,模型组细胞凋亡率有显著性降低(P<0.01);与模型组相比,中药组和维酶素组细胞凋亡率均有显著性增加(均有P<0.01);与维酶素组相比,中药细胞凋亡率均有显著性增加(均有P<0.01)。与模型组相比,正常对照组G0/G1、G2+M期细胞百分率均有显著性增加(均有P<0.01),而S期细胞百分率则有显著性降低(P<0.01);与模型组相比,中药G0/G1期细胞百分率有显著性增加(P<0.01),S期细胞百分率有显著性降低(P<0.01),G2+M期细胞百分率则无显著性差异(P>0.05);与维酶素组相比,中药G0/G1期细胞百分率有显著性增加(P<0.01),S期细胞百分率有显著性降低(P<0.01),G2+M期细胞百分率有显著性减少(P<0.01)。
2.9各组对对脾虚型CAG-PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡调控基因p53、Bcl-2、Bax表达的影响 由表5可知,与模型组相比,正常组、中药组和维酶素组p53 和Bcl-2表达均有显著性降低(均有P<0.01),正常组、中药组和维酶素组Bax表达均有显著性降低(P<0.01,0.05,0.05);与维酶素组相比,中药组p53和Bcl-2表达均有显著性增加(均有P<0.01),而Bax表达无显著性减少(P>0.01)。
表5各组脾虚型CAG-PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞p53、Bcl-2、Bax表达比较()
组别 | N | p53 | Bcl-2 | Bax |
正常组 | 10 | 12.36±4.39** | 11.44±3.02** | 24.55±9.61** |
模型组 | 13 | 47.52±5.36 | 26.52±4.92 | 42.32±11.22 |
中药组 | 13 | 20.82±7.68**## | 14.26±3.35**## | 30.46±12.20* |
维酶素组 | 13 | 33.75±8.19** | 21.15±3.43** | 38.27±5.48* |
注:与模型组比较,*P<0.015,**P<0.01;与维酶素组比较,#P<0.05,##P<0.01。
3小结 上述结果表明,以SPF级SD大鼠为实验动物,采用本发明所建立的脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变大鼠模型是成功的,具休表现在胃黏膜上皮的萎缩、小肠型和大肠型上皮化生,以及上皮细胞超微结构的窕样变,细胞免疫功能低下,尤其是以CD8为主的细胞免疫功能低下,而免疫功能低下一般认为是脾虚证的主要表现之一,加上与之相关的动物一般症状及胃黏膜表现,健脾化瘀解毒中药可以改善上述症状,也反证脾虚证模型的成功复制。总之,上述指标可以确认脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变肠上皮化生的存在,但未证实是否存在不典型增生。
实施例5 动物实验二。
实验动物:清洁级Wistar大鼠100只,由中国科学院上海实验动物中心提供,许可证号:SCXK(沪)2002-0010,体重120~140 g,雄性。
药品与试剂:胃痞消(太子参15g、黄芪30g、白术15g、丹参20g、蛇舌草30g等)和小承气汤(大黄12克、炙厚朴6克、枳实9克)中药饮片由南京中医药大学植物药深加工中心提供并鉴定;维酶素,由张家港制药厂生产,批号:国药准字,H46020296;N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),由日本东京株氏会社提供。
1 实验方法。
1.1脾虚型CAG-PLGC动物模型的复制 将大鼠随机分为对照组(10只)、模型组(15只)、中药组(15只)和维酶素组(15只),先用灭菌自来水将MNNG配制成10 mg/L浓度的储存液,避光冷藏保存,临用时将其配成150μg/mL的饮用液,装入200mL的饮水瓶中代替饮用水,外贴黑色避光纸(整个配制过程全部避光操作),每天更换,让大鼠自由饮用],在此基础上采用经典的饥饱失常加改良耗气泻下法复制脾虚证,具体方法为:实验第5周开始模型组采用隔日喂食,自由饮用MNNG饮用液。实验第7周开始,小承气汤100g/ml的小承气汤(大黄12g、炙厚朴6g、枳实9g)水煎液灌胃,2ml/只/d,连续造模到第12周,对照组予正常饮食。
1.2给药方法 对照组和模型组灌服等容量灭菌自来水;维酶素组(0.27g/kg/d)和中药组(15 g/kg/d)于造模后第8周经口灌服等容量药物溶液。
1.3 标本制备 于实验第8周末,从模型组中随机取2只大鼠,取胃组织,常规HE染色,确认光镜下2只大鼠均有胃黏膜萎缩性病变后,于第12周末,禁食禁水12h后,取抗凝血后。脱颈椎处死动物,剖取全胃,沿大弯剪开,剪取胃体窦交界处组织两块,一块用10%中性甲醛固定,另一块胃组织立即投入3%戊二醛溶液固定。
1.4病理切片制备及组织形态学观察 取10%中性甲醛固定胃组织,常规石蜡切片,切片厚度4~5μm,取连续切片行苏木精-伊红(HE)、AB(阿尔辛蓝)-PAS(schiff氏液)特殊化学染色,OLYMPUS-BX60常规光学显微镜下行切片观察,包括:胃黏膜萎缩、肠化生。萎缩、肠化生等病理学诊断由南京市脑科医院病理科高年资病理医师盲法作出。
1.5 PCNA、CyclinE检测 采用ABC免疫组织化学(streptavidiin/peroxidase,S-P)法检测。切片脱蜡后,经0.6%过氧化甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶,抗原修复(0.01M枸椽酸盐缓冲PH6.0),98℃10min,冷却至室温,1∶20正常血清封闭,37℃,45min,滴加兔抗鼠一抗(PCNA、CyclinE1∶100单克隆抗体),37℃,60min,转入4℃冰箱过夜,继用羊抗兔二抗1∶200单克隆抗体,37℃,45min,ABC标记物,DBA(0.04%Tris-HCl,0·01%H2O2)显色,苏木素复染,每步前用0·05mmol/LPBS(PH6.0)洗3×5min,脱水,透明,封片,同时用PBS和兔血清代替一抗作空白和替代对照。细胞核染色呈棕黄色为PCNA、CyclinE蛋白阳性染色,光镜下计数PCNA、CyclinE阳性细胞数。
1.6胃黏膜上皮细胞凋亡、Caspase-3的检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记(TdT-mediated Dutp nick endlabeling,TUNEL)法。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性。于凋亡阳性细胞分布区域,光镜200倍下随机选择5个视野,计数每100个细胞中凋亡细胞数,并进行计算机图像分析,做半定量测定。采用ABC免疫组化法检测细胞核染色呈棕黄色为Caspase-3蛋白阳性染色,光镜下计数Caspase-3的阳性细胞数。
1.7统计方法 数据以均值加减标准差表示()表示,组间均值的比较用单因素方差分析,方差齐时组间均值两两比较采用SNK法,方差不齐时组间均值两两比较用Duun’s法。以上数据采用SPSS 11.5统计软件进行数据统计;有序分类资料以频数和平均Radit值表示(,),进行多组间Radit比较,由DPS6.55进行统计分析,α=0.05。
2实验结果:2.1.对胃黏膜萎缩程度分级的比较 由表1可知,与模型组相比,正常组和中药组胃黏膜萎缩程度分级有显著性改善(均有P<0.01),而维酶素组则无显著性差异(P>0.05);与维酶素组相比,中药组胃黏膜萎缩程度分级有显著性改善(P<0.01)。
注:与模型组比较,**P<0.01;与维酶素组比较,##P<0.01。
2.2对动物胃黏膜萎缩阳性率及肠化生阳性率的比较 由表2可知,与模型组相比,正常组和中药组胃黏膜萎缩阳性率及肠化生阳性率均有显著性改善(均有P<0.01),而维酶素组则均无显著性差异(均有P>0.05);与维酶素组相比,中药组胃黏膜萎缩阳性率及肠化生阳性率均有显著性改善(均有P<0.01)。
注:与模型组比较,**P<0.01;与维酶素组比较,##P<0.01。
2.3各组大鼠胃黏膜上皮细胞的CyelinE的表达 由表3可知,与模型组相比,正常组、中药组和维酶素组胃黏膜上皮细胞PCNA和CyclinE阳性细胞计数均有显著性减少(均有P<0.01);与维酶素组相比,中药组胃黏膜上皮细胞PCNA阳性细胞计数有显著性胃黏膜萎缩程度分级减少(P<0.01),中药组胃黏膜上皮细胞CyclinE阳性细胞计数无显著性减少(P<0.01)。
表3 各组胃黏膜上皮细胞PCNA和CyclinE阳性细胞计数()
组别 | 动物数 | PCNA阳性细胞计数 | Cvclinl,阳性细胞数 |
正常组 | 10 | 26.31±2.52** | 12.62±1.54** |
模型组 | 15 | 47.57±6.01 | 50.80±6.37** |
中药组 | 15 | 28.25±4.53**## | 14.31±3.54** |
维酶素组 | 15 | 42.33±4.25** | 16.39±4.35** |
注:与模型组比较,**P<0.01;与维酶素组比较,##P<0.01。
2.4胃黏膜上皮细胞凋亡情况 由表4可知,与模型组相比,正常组、中药组组胃黏膜上皮细胞凋亡率、Cbpase-3阳性率和P53阳性率均有显著性减少(均有P<0.01),维酶素组胃黏膜上皮细胞凋亡率、Cbpase-3阳性率和P53阳性率均有显著性减少(P<0.05,0.01,0.01);与维酶素组相比,中药组胃黏膜上皮细胞凋亡率、Cbpase-3阳性率和P53阳性率均有显著性减少(P<0.01)。
表4 胃痞消抑制CAG脾虚大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡、调控蛋白Caspase-3和P53表达
分组 | 动物数 | 凋亡阳性率(%) | Cbpase-3阳性率(%) | P53阳性率(%) |
正常组 | 10 | 21.00±3.64** | 8.62±1.64** | 19.15±3.61** |
模型组 | 15 | 41.29±6.85 | 30.80±5.37** | 45.67±4.39** |
中药组 | 15 | 25.19±5.49**## | 12.31±3.51**## | 18.81±4.67**## |
维酶素组 | 15 | 36.77±4.89* | 27.02±2.23** | 38.44±5.34** |
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与维酶素组比较,##P<0.01。
3小结 上述结果表明,以清洁级Wistar大鼠为实验动物,采用本发明所建立的脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变大鼠模型是成功的,具休表现在胃黏膜上皮的萎缩、肠型上皮化生,胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡紊乱,胃黏膜上皮细胞增殖过度、细胞增殖周期失常用、细胞凋亡增加,可能是增殖与凋亡调控蛋白表达失常有关。本实例虽未直接证实脾虚证的存在,但中药组采用健脾化瘀解毒中药可以改善上述症状,也反证脾虚证模型的存在。上述指标可以确认脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变肠上皮化生伴增生与细胞凋亡异常的存在。
Claims (11)
1.一种脾虚证慢性萎缩性胃炎胃癌前病变动物模型的建立方法,其特征在于该动物模型由N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用加饥饱失常和耗气泻下法联合复制。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述动物模型以N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用作为造模开始。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述动物模型以饥饱失常加改良耗气泻下法复制脾虚证。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述动物为维斯塔尔(Wistar)种或泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)种大鼠。
5.根据权利要求4所述的大鼠,其特征在于所述大鼠是体重为60-80g或120~140g的大鼠。
6.根据权利要求2所述的N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用,其特征在于其具体步骤如下:用灭菌自来水将N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)配制成10 mg/L浓度的储存液,避光冷藏保存,临用时配成80~200μg/mL的饮用液,装入200mL的饮水瓶中代替饮用水(外贴黑色避光纸,且整个配制过程全程避光操作),由大鼠自由饮用。
7.根据权利要求3所述的饥饱失常加改良耗气泻下法复制脾虚证,其特征在于所述的饥饱失常具体步骤如下:在N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用后第5周开始隔日禁食饲养,即一日不禁食,次日禁食(不禁水),再次日不禁食,如此反复。
8.根据权利要求3所述的饥饱失常加改良耗气泻下法复制脾虚证,其特征在于所述的改良耗气泻下法具体步骤如下:N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用后第7周加用小承气汤灌胃1~3ml/只/d,1次/d。
9.根据权利要求1~8所述方法,其特征在于所述造模方法持续到N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用后第12周末。
10.根据权利要求1~8所述方法,其特征在于所述大鼠为清洁级和SPF级。
11.根据权利要求1所述方法,其特征在于该方法适用于中医健脾治法治疗慢性萎缩性胃炎的中药的筛选。
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