CN112616777A - 一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法 - Google Patents

一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡腺肌胃炎模型的快速构建方法，该方法直接在鸡的饮水中添加大黄和醋酸或者聚乙二醇‑400即可构建鸡腺肌胃炎模型。该方法构建的模型临床症状明显、剖检特征典型，适合于预防和治疗鸡腺肌胃炎药物的研究。该方法也为鸡腺肌胃炎模型的构建提供了一种独特的方法和思路。

Description

一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法
技术领域
本发明涉及一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，属于动物疾病模型构建技术领域。
背景技术
鸡腺肌胃炎是一种以鸡腺胃肿大、肌胃糜烂溃疡为主要特征的疾病，可发于不同品种的蛋鸡、肉鸡和土鸡，以雏鸡多发。发病原因包括病毒、细菌、饲养管理不当及饲料霉变、换料应激、水质问题。治疗方法有抗病毒、控制霉菌和中药治疗等。目前该病在肉鸡养殖业中呈上升趋势，已成为危害家禽养殖业生产最为常见的疾病之一，给不少养殖户带来严重的经济损失。本病中兽医辨证为湿热困脾所致的脾胃瘀滞证至脾胃虚寒证，遵循清热燥湿、理气化瘀健脾的治疗原则，科学配伍组成复方即可预防和治疗该证。
鸡腺肌胃炎病因病机分析：鸡腺胃炎和肌胃炎(腺肌胃炎)是一种多病因的消化系统综合症，主要表现消化不良、生长迟缓、饲料报酬低、腺胃肿大、肌胃糜烂溃疡等。由于病因复杂，模型构建尚无好的方法，虽然有用霉菌毒素构建腺肌胃炎的方法，但我们进行试验后发现其模型构建不稳定。如何快速构建鸡腺肌胃炎模型已成为严重制约其发病机理研究以及药物研发的瓶颈。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种鸡腺肌胃炎模型的快速构建方法，该方法直接在鸡的饮水中添加大黄和醋酸或者聚乙二醇-400即可构建鸡腺肌胃炎模型。该方法构建的模型临床症状明显、剖检特征典型，适合于预防和治疗鸡腺肌胃炎药物的研究。该方法也为鸡腺肌胃炎模型的构建提供了一种独特的方法和思路。
本发明的技术方案是：一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，其特征是，可以采用以下三种方法中的任一种：
方法一：50日龄SPF公鸡的饮水中添加13.5～6.75g/kg.w(千克体重)大黄和1.0～0.5％醋酸，自由饮水，连续添加10～15日；
方法二：50日龄SPF公鸡的饮水中添加6.5～9.0g/kg.w大黄和1.0～0.5％聚乙二醇-400，自由饮水，连续添加10～15日；
方法三：20日龄杂交肉鸡的饮水中添加2.5g/kg.w大黄和1.0％聚乙二醇-400，自由饮水，连续添加10～15日。
其中大黄以生药计，使用时制成水煎液，优选制成生药比1:1的水煎液。
方法一的优选方案是：在50日龄SPF公鸡的饮水中添加6.75g/kg.w大黄和0.5％醋酸，连续添加15日，上午饮用，下午换自来水。
方法二的优选方案是：在50日龄SPF公鸡的饮水中添加6.5g/kg.w大黄和1.0％聚乙二醇-400，连续添加15日，上午饮用，下午换自来水。
方法三的优选方案是：在20日龄杂交肉鸡的饮水中添加2.5g/kg.w大黄和1.0％聚乙二醇-400，连续添加10日，上午饮用，下午换自来水。
模型构建成功的判断标准：模型鸡出现精神萎靡、排土黄色混有未消化饲料残渣的稀便。剖检腺胃肿大，腺胃壁增厚，腺胃黏膜水肿，腺胃乳头肿大、突出，甚者模糊不清或溃疡出血；肌胃角质层颜色减退为淡黄色、表面粗糙、无光泽，弥散分布大小不一、形状不规则的溃疡灶，甚者角质层下出现大小不一的溃疡灶。其他器官无明显病理变化。
除上述症状外，模型鸡一般还会出现采食、饮水量减少，生长缓慢等症状。
本发明的有益效果是：该方法简单、快速，构建的模型临床症状明显、剖检特征典型，适合于预防和治疗鸡腺肌胃炎药物的研究。该方法也为鸡腺肌胃炎模型的构建提供了一种独特的方法和思路。
附图说明
图1为实施例1的模型组和空白组粪便、剖检的图片，其中A-C图分别为模型组粪便、腺胃、肠道图片；D-E图为空白组粪便和腺胃剖检的图片；
图2为实施例1的模型1组(A图)、模型2组(B组)和空白组(C图)的腺肌胃剖检的图片；其中模型组腺胃黏膜卡他性炎症、出血，肌胃角质层淡黄色、粗糙、无光泽(A-B图)，空白组腺肌胃正常，肌胃角质层棕褐色、完整、有光泽(C图)；
图3为实施例1的模型组和空白组的病理切片的图片；其中，模型1、2组腺胃纤毛脱落(A图、C图)，十二指肠黏膜纤毛脱落(B图、D图)，空白组腺胃、十二指肠黏膜正常(E图、F图)；
图4为实施例2的实验组(A图)和空白对照组(B图)的粪便图片；其中A图的实验组粪便变稀，内有未消化的饲料，呈土黄色；B图的空白对照组粪便正常；
图5为实施例2的实验组和空白组的腺肌胃肠剖检的图片；其中A-C图分别为实验组的腺胃、肠、肌胃的图片，D图为空白组的肌胃的图片；其中实验组鸡腺胃肿大如球，腺胃壁增厚，黏膜水肿，乳头肿大、模糊(A图)；肠道臌气，内有饲料残渣样稀薄内容物(B图)；肌胃角质层不完整，出现大小不一、弥散分布的淡黄色溃烂灶，甚者角质层下出现大小不一的溃疡灶(C图)；
图6为实施例3的模型组(A、C、D、E)和空白组(B、F)的粪便和腺肌胃图片。其中模型组粪便变稀(A图)、腺胃肿大(C图)；模型1组(D图)、模型2组(E图)腺胃黏膜卡他性炎症、出血，肌胃角质层淡黄色、粗糙、无光泽，空白组腺肌胃正常(F图)，肌胃角质层棕褐色、完整、有光泽。
图7为实施例3的模型组和空白组的病理切片的图片，其中，模型1、2组腺胃纤毛脱落(A、B图)，十二指肠黏膜纤毛脱落(C-D图)，空白组正常(E-F图)。
具体实施方式
实施例1：SPF鸡腺肌胃炎模型的快速构建(大黄—醋酸)
1.实验材料与方法
1.1材料：大黄，购自济南建联中药店，制成生药比1:1的水煎液，备用；冰乙酸，天津市富宇精细化工有限公司；Duck IL-2ELISA KiT、Duck IL-4ELISA KiT、Duck TNF-αELISA KiT，武汉基因美生物科技有限公司产品，α-淀粉酶，南京建成生物工程研究所产品。蛋鸡育成前期配合饲料AC820R，济南安池饲料有限公司2020年07月09日生产，粗蛋白≥15％；50日龄SPF公鸡，山东昊泰实验动物中心提供；SPF鸡不锈钢隔离器：苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产。玻璃体温计，深圳市君十医疗器械有限公司生产。
1.2方法
1.2.1实验分组：实验分模型1组、模型2组和空白组(实验分组方法如表1所示)，每组30只，分别称重编号，体重均匀度在90％以上，随机分组，饲养在SPF鸡隔离器中，控制统一的温度和通风量。
1.2.2模型构建方法：饮水量依据实验前3天采食量的2倍计算。
表1实验分组方法
Figure BDA0002906709200000041
1.2.3数据采集：每天观察粪便、精神状态等。
1.2.3.1增重率、腺肌胃指数、腺胃病变率、肌胃病变率：实验结束逐只空腹称重，宰杀，分别取腺肌胃，称重，观察病理变化，分别计算增重率、腺肌胃指数、腺胃病变率、肌胃病变率。
腺胃病变判别标准：凡出现外观腺胃肿大甚或有出血斑，腺胃壁增厚甚或出血；腺胃黏膜卡他性炎症(内黏膜表面有大量黏液覆盖)；乳头肿大、出血，扁平或模糊不清。
肌胃病变判别标准：肌胃角质层颜色变淡，由棕黄色减退为淡黄色，表面粗糙无光泽，布满大小不一、不规则的溃疡灶；甚者角质层糜烂，角质层下有溃疡灶。
Figure BDA0002906709200000042
Figure BDA0002906709200000043
Figure BDA0002906709200000044
1.2.3.2体温：实验结束逐只测量腋窝体温，分析体温变化，统计差异性。
1.2.3.3血清检测：实验结束每组随机选5只鸡采血分离血清，分别进行IL-2、IL-4、TNF-α、α-淀粉酶检测；
1.2.3.4病理检查：实验结束逐只宰杀、剖检；
腺肌胃：观察腺胃、肌胃病理变化，统计病变率；称取腺肌胃重量，计算腺肌胃指数；取腺胃组织，固定，染色，封蜡，切片，镜检，观察病理变化。
1.2.4.模型判断标准：模型鸡出现精神萎靡、排土黄色混有未消化饲料残渣的稀便。剖检腺胃肿大，腺胃壁增厚，腺胃黏膜水肿，腺胃乳头肿大、突出，甚者模糊不清或溃疡出血；肌胃角质层颜色减退为淡黄色、表面粗糙、无光泽，弥散分布大小不一、形状不规则的溃疡灶，甚者角质层下出现大小不一的溃疡灶，其他器官无明显病理变化。表明模型构建成功。
2.结果
2.1临床症状：模型组饮水2天后采食量严重下降，饮水量下降，精神状态差；用药3天粪便变稀，内有未消化的饲料，呈土黄色(见图1中的A图)；5天精神萎靡。空白对照组精神状态、饮水量、采食量、粪便正常(见图1中的D图)。
2.2病理变化：模型组腺胃肿大(见图1中的B图)，肠道鼓胀充满气体、内有未消化的饲料残渣(见图1中的C图)，空白组腺胃正常(见图1中的E图)。模型组黏膜卡他性炎症、出血，肌胃角质层淡黄色、粗糙、无光泽(分别见图2中的A、B图)，空白组腺肌胃正常，肌胃角质层棕褐色、完整、有光泽(见图2的C图)。模型1、2组腺胃(见图3中的A图、C图)、十二指肠黏膜纤毛脱落(见图3中的B图、D图)，空白组腺胃、十二指肠黏膜正常(见图3的E图、F图)。
2.3增重率、腺肌胃指数、腺肌胃病变、体温变化
表2添加药物对模型鸡增重率、腺肌胃指数、腺肌胃病变、体温变化的影响
模型一 模型二 空白组
增重率(％) 41.5 32.3 42.1
腺肌胃指数 33.5 33.9 33.5
腺肌胃病变率(％) 100 100 0
腺胃病变率(％) 66.7 100 0
肌胃病变率(％) 66.7 100 0
较空白组体温变化 -0.31 -0.41 0
从表2可见，空白组增重率分别比模型一组、模型二组高0.7和9.9个百分点；空白组体温分别比模型一组、模型二组高0.31℃和0.41℃；各组腺肌胃指数差别不大；模型组腺肌胃病变率均达100％，空白组无明显病变。
2.4对血清IL-2、IL-4、TNF-α、α-淀粉酶的影响
表3加药物对模型鸡血清IL-2、IL-4、TNF-α、α-淀粉酶的影响
模型一 模型二 空白组
IL-2 173.37±12.43 165.98±15.98 158.32±12.65
IL-4 153.74±7.17 141.35±8.68 260.60±106.40
TNF-α 94.29±12.15 85.90±3.37 84.15±4.76
α-淀粉酶 705.69±72.20 885.87±148.56 1281.25±440.09
从表3可见，各组IL-2、TNF-α差异不大，空白组IL-4、α-淀粉酶明显高于实验组，说明模型组对饲料的消化能力减弱。
3结论：在50日龄SPF鸡上午饮水中添加13.5g/kg.w-6.75g/kg.w大黄水煎液(生药比1:1)和1.0％-0.5％的醋酸，下午更换自来水，连续15天，可成功构建粪便变稀、生长缓慢；腺胃肿大，腺胃壁增厚，腺胃卡他性炎症、出血，肌胃角质层颜色减退为淡黄色、粗糙、无光泽、溃疡；腺胃黏膜层、粘膜下层、基底层充血、出血，黏膜纤毛脱落的腺肌胃炎模型。但以模型2组(6.75g/kg.w大黄水煎液(生药比1:1)和0.5％醋酸，下午更换自来水，连续15天)构建的模型最理想。
实施例2：杂交肉鸡腺肌胃模型的构建(大黄—醋酸)
1.实验材料与方法
1.1材料：大黄，购自济南建联中药店，制成生药比1:1的水煎液，备用；冰乙酸，天津市富宇精细化工有限公司；蛋鸡育成前期配合饲料AC820R，济南安池饲料有限公司2020年07月09日生产，执行标准GB/T5916-2008，粗蛋白≥15％；20日龄杂交肉鸡，聊城奥祥禽业有限公司；玻璃体温计，深圳市君十医疗器械有限公司生产。
1.2方法
1.2.1分组：实验分实验一组、实验二组和空白对照组，每组15只鸡。分别称重编号。
1.2.2、用药方法：上午实验组饮水中分别添加2.5g/kg.w大黄水煎液和1.0％的醋酸，下午换自来水，饮水量依据前3天的平均量计算；空白组饮用自来水。连续饮用10天。
1.2.3、数据采集
1.2.3.1观察：鸡群精神状态、饮水量、粪便颜色和形态等指标；
1.2.3.2体温、体温测定：实验结束每只鸡均采用腋窝测定体温，每次3min；用电子秤称量实验前后体重。
1.2.3.4病理变化：实验结束，所有鸡均称重、宰杀，分别取腺肌胃、胸腺、法氏囊、脾脏重量，计算器官指数；观察腺肌胃病变，统计腺肌胃病变率。
2.结果
2.1.临床症状：模型组饮水2天后采食量严重下降，饮水量下降，精神状态差；用药3天粪便变稀，内有未消化的饲料，呈土黄色(见图4中的A图)；5天精神萎靡。空白对照组精神状态、饮水量、采食量正常，粪便正常(如图4中的B图)。
2.2.剖检：模型组鸡腺胃肿大如球，腺胃壁增厚，黏膜水肿，乳头肿大、模糊(见图5中的A图)；肠道臌气，内有饲料残渣样稀薄内容物(见图5中的B图)；肌胃角质层不完整，出现大小不一、弥散分布的淡黄色溃烂灶，甚者角质层下出现大小不一的溃疡灶(见图5中的C图)；空白对照组腺肌胃无明显病理变化(见图5中的D图)。
2.3添加药物对模型鸡增重率、体温、腺肌胃指数、腺肌胃病变率的影响
表4：添加药物对模型鸡增重率、体温、腺肌胃指数、腺肌胃病变率的影响
Figure BDA0002906709200000071
Figure BDA0002906709200000081
从表4可见，模型组增重率较空白组低11.5个百分点，体温较空白组下降0.21℃，腺肌胃病变率达100％。
3结论：20日龄杂交肉鸡上午饮水中分别添加2.5g/kg.w大黄水煎液和1.0％醋酸，下午换自来水，连续饮用10天，可成功构建粪便变稀、消化不良，粪便中含有未消化的饲料残渣，生长缓慢，体温降低，肠道臌气，内有饲料残渣样稀薄内容物；腺胃肿大，腺胃壁肿胀，腺胃黏膜卡他性炎症、出血、溃疡，肌胃角质层淡黄色、粗糙、无光泽、溃疡的腺肌胃炎模型。
实施例3：SPF鸡腺肌胃炎模型的快速构建(大黄-聚乙二醇)
1.实验材料与方法
1.1材料：大黄，购自济南建联中药店，制成生药比1:1的水煎液，备用；聚乙二醇-400，天津石英钟厂霸州化工分厂生产，批号，20010306；Duck IL-2 ELISA KiT、Duck IL-4ELISA KiT、Duck TNF-αELISA KiT，武汉基因美生物科技有限公司产品，α-淀粉酶，南京建成生物工程研究所产品；蛋鸡育成前期配合饲料AC820R，济南安池饲料有限公司2020年07月09日生产，粗蛋白≥15％；50日龄SPF公鸡，山东昊泰实验动物中心提供；SPF鸡不锈钢隔离器：苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产；玻璃体温计，深圳市君十医疗器械有限公司生产。
1.2方法：
1.2.1实验分组：实验分模型1组、模型2组和空白组(实验分组方法如表5所示)，每组30只，分别称重编号，体重均匀度在90％以上，随机分组，饲养在SPF鸡隔离器中，控制同一的温度和通风量。
1.2.2模型构建方法：饮水量依据实验前3天采食量的2倍计算。
表5实验分组方法
Figure BDA0002906709200000082
Figure BDA0002906709200000091
1.2.3数据采集：每天观察粪便、精神状态等。
1.2.3.1增重率、腺肌胃指数、腺胃病变率、肌胃病变率：实验结束逐只空腹称重，宰杀，分别取腺肌胃，称重，观察病理变化，计算增重率、腺肌胃指数、腺胃病变率、肌胃病变率。
1.2.3.2体温：实验结束逐只测量腋窝体温，分析体温变化，统计差异性。
1.2.3.3血清检测：实验结束每组随机选5只鸡采血分离血清，分别进行IL-2、IL-4、TNF-α、α-淀粉酶检测；
1.2.3.4病理检查：实验结束逐只宰杀、剖检观察腺胃、肌胃病理变化，统计病变率；称取腺肌胃重量，计算腺肌胃指数；取腺胃组织，固定，染色，封蜡，切片，镜检，观察病理变化。
1.2.4.模型判断标准：模型鸡出现精神萎靡、排土黄色混有未消化饲料残渣的稀便。剖检腺胃肿大，腺胃壁增厚，腺胃黏膜水肿，腺胃乳头肿大、突出，甚者模糊不清或溃疡出血；肌胃角质层颜色减退为淡黄色、表面粗糙、无光泽，弥散分布大小不一、形状不规则的溃疡灶，甚者角质层下出现大小不一的溃疡灶，其他器官无明显病理变化。表明模型构建成功。
2.结果
2.1临床症状：模型组用药3天后粪便变稀，陆续出现土黄色、混有饲料残渣的料便(见图6中的A图)；空白组粪便正常(见图6中的B图)。
2.2病理变化：模型组脾胃肿大(见图6中的C图)，腺胃黏膜、出血，肌胃角质层淡黄色、粗糙、无光泽(见图6中的D、E图)，空白组腺肌胃正常，肌胃角质层棕褐色、完整、有光泽(见图6中的F图)。模型组腺胃黏膜出血、纤毛脱落(图7中的A-B图)，十二指肠黏膜下层、肌层出血，黏膜纤毛脱落(图7中的C-D图)，空白组均正常(图7中的E-F图)。
2.3增重率、体温及腺肌胃病变率的影响
表6添加药物对模型鸡增重率、体温及腺肌胃病变率的影响(％、℃)
Figure BDA0002906709200000101
从表6可见，模型1组、2组增重率较空白组分别低6.7、2.9个百分点，体温分别低0.41℃、0.20℃，模型1组腺肌胃指数低2.8；模型1组、2组腺肌胃病变率均达100％。
2.4添加药物对模型鸡血清IL-2、IL-4、TNF-α、α-淀粉酶的影响
表7添加药物对模型鸡血清IL-2、IL-4、TNF-α、α-淀粉酶的影响(ug/mL、u/dL)
组别 IL-2(ug/mL) IL-4(ug/mL) TNF-α(ug/mL) α-淀粉酶(u/dL)
模型1 187.647±19.94 140.906±7.49 72.379±4.69 881.361±201.98
模型2 149.976±18.06 142.381±19.29 78.388±6.45 974.451±207.80
空白 158.315±12.65 260.599±106.40 84.147±4.76 1281.251±440.09
从表7可见，模型1组、模型2组IL-4、TNF-α低于空白组，说明模型组机体免疫力和抵抗力均下降；模型1组、模型2组α-淀粉酶均低于空白组，说明模型组对饲料的消化能力减弱。
3结论
在50日龄SPF鸡上午饮水中添加6.5g/kg.w-9.0g/kg.w大黄水煎液(生药比1:1)和0.5％-1.0％的聚乙二醇-400，下午更换自来水，连续15天，可成功构建粪便变稀、生长缓慢，体温降低；腺胃肿大，腺胃壁增厚，卡他性炎症、出血，肌胃角质层颜色减退为淡黄色、粗糙、无光泽、溃疡；腺胃黏膜层、粘膜下层、基底层充血、出血，黏膜纤毛脱落的腺肌胃炎模型。但以模型1组(6.5g/kg.w大黄水煎液(生药比1:1)和1.0％聚乙二醇-400，下午更换自来水，连续15天)构建的模型最理想。

Claims (6)

1.一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，其特征是，采用以下三种方法中的任一种：
方法一：50日龄SPF公鸡的饮水中添加13.5～6.75g/kg.w大黄和1.0～0.5％醋酸，自由饮水，连续添加10～15日；
方法二：50日龄SPF公鸡的饮水中添加6.5～9.0g/kg.w大黄和1.0～0.5％聚乙二醇-400，自由饮水，连续添加10～15日；
方法三：在20日龄杂交肉鸡的饮水中添加2.5g/kg.w大黄和1.0％聚乙二醇-400，自由饮水，连续添加10～15日；
其中大黄以生药计，使用时制成生药比1:1的水煎液。
2.如权利要求1所述的一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，其特征是，方法一：在50日龄SPF公鸡的饮水中添加6.75g/kg.w大黄和0.5％醋酸，连续添加15日，上午饮用，下午换自来水。
3.如权利要求1所述的一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，其特征是，方法二：在50日龄SPF公鸡的饮水中添加6.5g/kg.w大黄和1.0％聚乙二醇-400，连续添加15日，上午饮用，下午换自来水。
4.如权利要求1所述的一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，其特征是，方法三：在20日龄杂交肉鸡的饮水中添加2.5g/kg.w大黄和1.0％聚乙二醇-400，连续添加10日，上午饮用，下午换自来水。
5.如权利要求1-4中任一项所述的一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，其特征是，所属大黄使用时制成生药比1:1的水煎液。
6.如权利要求1-4中任一项所述的一种快速构建鸡腺肌胃炎模型的方法，其特征是，模型构建成功的判断标准：模型鸡出现精神萎靡、排土黄色混有未消化饲料残渣的稀便，剖检腺胃肿大，腺胃壁增厚，腺胃黏膜水肿，腺胃乳头肿大、突出；肌胃角质层颜色减退为淡黄色、表面粗糙、无光泽，弥散分布大小不一、形状不规则的溃疡灶。
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