CN113559181B - 一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药及其制备方法，该包括草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、甘松、大黄，上述7味药的质量比为2∶1∶1∶1∶1∶2∶2，本发明通过改善动物肠道菌群结构等，调节腹泻模型动物及靶动物的抗炎、免疫及肠道屏障作用，提高动物的抗菌、抗炎及肠道屏障功能，使大肠杆菌性腹泻发病率降低，进而提高幼畜存活率，提高经济效益。

Description

一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药及其制备方法

技术领域

本发明属于蒙兽药制备技术领域，尤其涉及一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药及其制备方法。

背景技术

大肠杆菌病传染性强，死亡率高，腹泻是其病常见临床症状，是与传染病相关的三大致死病因之一，主要影响幼龄动物。美国国家动物健康监测系统显示，病犊牛中约57.0％死于腹泻，在中国，10日龄犊牛发病率达30.27％，死亡率4.73％，1月龄内犊牛在12月至4月份发病率较高，达18.87％～21.26％。内蒙古在内的西北地区，大肠杆菌诱发性腹泻阳性检出率35.90％，新疆犊牛大肠杆菌性腹泻检出率51.30％，抗生素是其首选药物，具有迅速缓解症状，成本低、效果稳定等特点。养殖户为寻求经济和生产效益在饲料中添加抗生素提高饲料转化率，加速畜禽生长。我国每年有9.7万吨抗生素用于畜牧养殖，约占年产量的46％。但过度使用抗生素带来耐药菌、变异超细菌、过敏、菌群紊乱等一系列隐患。中国北方部分规模化奶牛场34株犊牛腹泻大肠杆菌强力霉素的耐药率均达100％，对氨卞西林、链霉素、阿奇霉素、复方新诺明的耐药率80％以上，且确定10重耐药以上耐药菌24株，占比70.59％。2019年农业农村部第194号公告推行了“禁止除中药外所有促生长类药物在商品饲料中的使用的规定”。故，开发绿色且可以替代抗生素的新型药物变得尤为重要。

蒙医药是祖国医学的重要组成部分，历经两千多年同疾病作斗争的经验总结和智慧结晶，并吸纳了部分藏医、印度医学及中医学基本理论，形成了独具一格的理论体系和诊疗经验的特色民族医学体系。蒙医学认为，机体由“三根”“七素”组成，三根是指赫依、希拉、巴达干三种机体所需能量，七素是指精华、血、肉、脂、骨、髓、精液七种基本物质。“三根”“七素”之间的平衡调控着动物机体健康。然而，在各种致病因素作用下，机体的三根出现偏盛或偏衰，破坏机体稳态而产生疾病。蒙医观的疾病痊愈实际就是调整三根的盛、衰，使其恢复平衡的过程。这正符合生理学的稳态理论。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药，包括草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、甘松、大黄，上述7味药的质量比为2∶1∶1∶1∶1∶2∶2。

在上述技术方案中，所述草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、甘松、大黄的质量优选为草乌叶5g，诃子2.5g，多叶棘豆2.5g，茜草2.5g，黑云香2.5g，甘松5g，大黄5g。

一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药的制备方法，如下所述：

将草乌叶5g，诃子2.5g，多叶棘豆2.5g，茜草2.5g，黑云香2.5g，甘松5g，大黄5g，这7味药按比例混合后进行粉碎制得，调和于水或乳中服用。

在上述技术方案中，所述蒙兽药的服用方法为以10.0g/kg.b.w、5.0g/kg.b.w、2.5g/kg.b.w剂量，连续7d，2次/d灌胃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

通过改善动物肠道菌群结构等，调节腹泻模型动物及靶动物的肠道屏障作用，提高动物的抗菌、抗炎及肠道屏障功能，使大肠杆菌性腹泻发病率降低，进而提高幼畜存活率和生长速度，提高经济效益。

附图说明

图1物种多样性曲线及物种累积箱形图。

图2各组小鼠基于Bray-Curtis盲肠微生物的PcoA与UPGAMA分析。

图3各组小鼠肠道微生物门水平的差异。

图4各组小鼠肠道微生物目水平的差异。

图5各组小鼠肠道微生物属水平的差异。

图6各组小鼠十二指肠杯状细胞的变化(×400)。

图7各组小鼠空肠杯状细胞的变化(×400)。

图8各组小鼠回肠杯状细胞的变化(×400)。

图9各组小鼠杯状细胞数的变化。

图10各组小鼠十二指肠中MUC-2的表达(×400)。

图11各组小鼠十二指肠溶菌酶与肠三叶因子含量的变化。

图12各组小鼠十二指肠二糖酶含量的变化。

图13各组小鼠十二指肠组织形态变化(HE染色，×400)。

图14各组小鼠空肠组织形态变化(HE染色，×400)。

图15各组小鼠回肠组织形态变化(HE染色，×400)

图16各组小鼠小肠Chiu’s评分。

图17各组小鼠肠组织V/C比值的影响。

图18各组小鼠十二指肠超微结构的变化(×8000)。

图19各组小鼠空肠超微结构的变化(×8000)。

图20各组小鼠回肠超微结构的变化(×8000)。

图21各组小鼠十二指肠中TJ相关蛋白Occludin蛋白的表达。

图22各组小鼠十二指肠中TJ相关蛋白Claudin-1蛋白的表达。

图23各组小鼠十二指肠中TJ相关蛋白Zo-1蛋白的表达。

图24各组小鼠十二指肠中TJ相关蛋白JAMA蛋白的表达。

图25各组小鼠十二指肠中TJ相关蛋白MLCK蛋白的表达。

图26各组小鼠血清中DAO、D-LA和ET水平的变化。

图27各组小鼠外周血淋巴细胞中CD3⁺和CD19⁺细胞的二维点阵。

图28各组小鼠外周血中CD3⁺T and CD19⁺B百分比的变化。

图29各组小鼠外周血淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺细胞的二维点阵。

图30各组小鼠外周血中CD4⁺、CD8⁺百分比和CD4⁺/CD8⁺的变化。

图31各组小鼠外周血中TH₁和TH₂CD4⁺T淋巴细胞的二维点阵。

图32各组小鼠外周血中TH₁和TH₂CD4⁺T淋巴细胞百分比的变化。

图33各组小鼠十二指肠中细胞因子含量的变化。

图34各组小鼠血清中免疫球蛋白含量的变化。

图35各组小鼠十二指肠、空肠、回肠中sIgA含量的变化。

具体实施方式

下面结合附图与具体的实施方式对本发明作进一步详细描述：

实施例1：蒙兽药BBS传统复方优化筛选实验

1.1实验耗材与器材

1.1.1主要试剂

普通营养琼脂、伊红美蓝营养琼脂、营养肉汤，环丙沙星(批号：11220023)，购自广州白云山制药股份有限公司；诃子，茜草，草乌叶、多叶棘豆、黑云香、大黄、甘松、瞿麦等均购自内蒙古天力药业有限公司。

1.1.2菌种

致病性大肠杆菌(E.coli O₁)由内蒙古农业大学动物科学学院牛生产实验室敖日格乐教授赠送，该菌株由敖日格乐教授实验团队中的杨斯琴博士分离、鉴定、保存。

1.1.3实验动物

SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体重23±2g，购自内蒙古大学实验动物中心，许可证号：SCXK(蒙2016-0001)。小鼠置于单独干燥的通风笼中，每笼10只，适应饲养3d后，开始实验。实验小鼠符合内蒙古农业大学动物保护使用委员会批准的规程。

1.1.4主要仪器

双人面垂直送风超净化工作台、生化培养箱(HPS-250.SW-CJ-2D)，苏州博莱尔设备净化有限公司；ST-360酶标仪，济南好来宝医疗器材有限公司。

1.2实验方法

1.2.1实验用菌培养

使用前将冻存的菌株分别在麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养琼脂培养基上划线，于37℃恒温培养箱培养18h得到大肠杆菌纯培物，放置4℃冰箱保存备用，试验前用麦氏比浊法将菌液调至1.0×10⁸cfu/ml。

1.2.2药物提取

采用水提法，将不同草药用粉碎机粉碎，过40目筛，分别取不同药物50g放入8层纱布缝制的滤药袋，加10倍的蒸馏水室温浸泡过夜，文火煎煮1h，药液经八层纱布滤过，滤渣中再次加250mL蒸馏水，煎煮30min，过滤，合并两次虑液，文火浓缩至50mL(即药液中所含生药量为1g/mL)。121℃高压灭菌，4℃冰箱保存备用。1.2.3抑菌直径测定

于超净工作台内，取100uL菌液(1.0×10⁸cfu/mL)均匀涂布于无菌琼脂表面，将3个无菌牛津杯成三角形状放置于带有菌层的平皿内，牛津杯内加入200uL的药液，于37℃恒温培养箱中培养18h。游标卡尺测量抑菌圈的直径，结果取3个平行平均值。判定标准为“-”代表未产生抑菌圈或不敏感；抑菌圈直径R≥15mm为极敏；10mm≤R≤15mm为高敏，8mm≤R≤10mm为低敏，R≤8mm为不敏感。

1.2.4 MIC、MBC浓度的测定

测定采用微量稀释法和平板法。取无菌96孔板，在1～8孔(试验孔)加入用肉汤2倍倍比稀释的药液，每孔200uL，设9孔为阳性对照孔(不加药物)，10孔为阴性对照孔(不加病原菌)。在1～9孔中加入100uL稀释好的1.0×10⁶cfu/mL菌液。震荡混匀后置于37℃恒温箱培养24h，观察培养结果。若1～8孔内浑浊，说明有细菌生长即与阳性对照相同；若1～8孔内澄清，说明无细菌生长，即与阴性对照组相同。肉眼观察无细菌生长且药物浓度最低孔即为该味蒙兽药对该菌株的最低抑菌浓度(MIC)。从未长菌的各孔取100uL均匀涂布于营养琼脂上。37℃培养过夜，菌落数小于5～10个的最低药液浓度为最小杀菌浓度(MBC)。MIC＜7.80mg/mL，为高度敏感；7.80mg/mL≤MIC≤250mg/mL，为中度敏感；MIC＞250mg/mL，为不敏感。

1.2.5 FIC指数的测定

将对致病性E.coli O₁敏感蒙兽药用无菌肉汤2倍稀释成1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.95mg/mL 10个梯度。将制备好的蒙兽药按棋盘法设计，测定MIC。观察结果并计算协同指数(Fractional Inhibitory Concentration，FIC)，FIC指数＝MIC(甲药联合)/MIC(甲单药)+MIC(乙药联合)/MIC(乙单药)。FIC指数≤0.5，协同作用；0.5＜FIC指数≤1，累加；1≤FIC指数≤2，无关；FIC指数＞2，拮抗作用。

1.2.6最低致死量(Minimum Lethal Dosage，MLD)的测定

将E.coli O₁传至第3代，当其活力达到最佳时，用灭菌生理盐水对菌液进行10倍稀释，将其稀释成1.0×10¹³CFU/mL、1.0×10¹²CFU/mL、1.0×10¹¹CFU/mL、1.0×10¹⁰CFU/mL和1.0×10⁹CFU/mL浓度梯度，将5个梯度的菌悬液分别给10只小鼠腹腔注射，同时设置灭菌生理盐水阴性对照组。从而确定致病性E.coli O₁对小鼠的100％MLD浓度。观察小鼠3d内的死亡状况并记录结果。分组及注射方案见表1。

表1致病性E.coli O₁100％MLD小鼠腹腔注射方案

Table.1 Injection regimen of pathogenic E.coli O₁to mice for 100％MLD

1.2.7 80％MLD测定

由表1结果可知，腹腔注射0.3mL 1.0×10¹¹CFU/mL E.coli O₁的小鼠全部死亡，而低于此浓度的小鼠未出现全部死亡。故将1.0×10¹¹CFU/mL的E.coli O₁进行2倍稀释，稀释五个梯度后给度过适应期的储备小鼠腹腔注射。观察3d内小鼠死亡状况，确定致病性E.coli O₁对小鼠的80％MLD浓度。分组及注射方案见表2。

表2致病性E.coli O₁80％MLD小鼠腹腔注射方案

Table.2 Injection regimen of pathogenic E.coli O₁to mice for 80％MLD

1.2.8蒙兽药BBS复方的各单味蒙兽药体内抑制致病性E.coli O₁剂量的优化

健康小鼠随机分组，10只/组，雌雄各半，按L₁₈(3⁷)正交设计(见表3)分为18组，同时设置阴性对照组(蒸馏水)，阳性对照组(环丙沙星)。药物因素及其剂量水平设置见表3，试验组给药方案见表4，连续给药7d，2次/d。末次给药2h后小鼠腹腔注射80％MLD致病性E.coli O₁每只小鼠注射0.3mL，观察2d内小鼠的死亡数，计算抗菌保护率。结果采用极差分析法进行统计。保护率＝(1-试验组死亡数/阴性对照组死亡数)×100％。

表3 L₁₈(3⁷)正交表

Table 3 L₁₈(3⁷)orthogonal table

表4 BBS复方各方案因素剂量水平设计(g)

Table 4 Design of main factors dosage level of orthogonal compoundMongolian medicine BBS

1.2.9蒙兽药BBS复方对感染E.coli O₁实验小鼠的体内抗菌保护率测定

健康小鼠随机分为5组，10只/组，雌雄各半，分别为阴性对照组(蒸馏水)，阳性对照组(环丙沙星)，BBS复方组。实验分组及给药方案见表5，连续给药7d，2次/d。末次给药2h后小鼠腹腔注射80％MLD致病性E.coli O₁，每只小鼠注射0.3mL，观察2d内小鼠的死亡数，计算抗菌保护率。抗菌保护率＝(1-试验组死亡数/阴性对照组死亡数)×100％。

表5小鼠体内抗菌保护率的实验分组及给药方案

Table.5 The experimental grouping and the administration regimen ofantibacterial protection rate in mice

1.3实验结果及分析

1.3.1复方中各单味草药对致病性E.coli O₁体外抑菌效果的测定

由表6可知，蒙兽药体外抑菌圈实验中，草乌叶、诃子、黑云香、大黄对致病性E.coli O₁的抑菌直径在10.19～13.26mm之间，符合10≤R＜15mm，故致病性E.coli O₁对草乌叶、诃子、黑云香、大黄等4味蒙兽药呈现高敏。多叶棘豆、茜草、甘松对致病性E.coli O₁的抑菌直径在9.20～9.87mm之间，符合8≤R＜10mm，故致病性E.coli O₁对多叶棘豆、茜草、甘松3味蒙兽药呈现低敏。在蒙兽药体外MIC、MBC抑菌实验中，诃子对致病性E.coli O₁抑菌效果表现为高度敏感，其MIC为0.063g/mL，MBC为0.125g/mL；草乌叶、黑云香、大黄、多叶棘豆、茜草、甘松对致病性E.coli O₁抑菌效果表现为中度敏感，其MIC为0.125～0.25g/mL，MBC为0.125～0.5g/mL。

表6复方中各单味蒙兽药对致病性E.coli O₁的体外抑菌直径、MIC和MBC的测定

Table 6 Diameter of inhibition zone，MIC and MBC of each singleMongolian medicine of compound against pathogenic E.coli O₁in vitro

注；抑菌圈直径R≥15mm为极敏；10≤R＜15mm为高敏；8≤R＜10mm为低敏；R＜8mm为不敏感。MIC＜0.0780g/mL，为高度敏感；0.0780g/mL≤MIC≤0.25g/mL，为中度敏感；MIC＞0.25g/mL，为不敏感。

Note：Inhibition zone，R≥15mm is significantly sensitive，10≤R＜15mmis highly sensitive，8≤R＜10mm is low sensitive，R＜8mm is no sensitive.MIC＜0.0780g/mL，is significantly sensitive，0.0780g/mL≤MIC≤0.25g/mL，is highlysensitive，MIC＞0.25g/mL，is no sensitive.

1.3.2致病性E.coli O₁100％MLD的测定

由表7可知，腹腔注射0.3mL 1.0×10¹³～1.0×10¹¹CFU/mL的致病性E.coli O₁，死亡率为100％；腹腔注射0.3mL 1.0×10¹⁰CFU/mL的致病性E.coli O₁，死亡率为50％；腹腔注射0.3mL 1.0×10⁹CFU/mL的致病性E.coli O₁，死亡率为30％。采用致死率为100％最低菌浓，即1.0×10¹¹CFU/mL作为筛选80％MLD的原始菌浓开展下一步实验。

表7致病性E.coli O₁100％MLD的测定结果

Table.7 The results of pathogenicE.coli O₁of 100％MLD

1.3.3致病性E.coli O₁80％MLD的测定

由表8可知，小鼠腹腔注射0.3mL 1.0×10¹¹～0.5×10¹⁰CFU/tnL的致病性E.coliO₁，死亡率为100％；小鼠腹腔注射0.3mL 2.5×10¹⁰CFU/mL的致病性E.coli O₁，死亡率为90％；小鼠腹腔注射0.3mL 1.25×10¹⁰CFU/mL的致病性E.coli O₁，死亡率为80％。小鼠腹腔注射0.3mL 6.25×10⁹CFU/mL的致病性E.coli O₁，死亡率为60％。故，致病性E.coli O₁80％MLD为1.25×10¹⁰CFU/mL。

表8致病性E.coli O₁80％MLD的测定结果

Table.8 The results of pathogenic E.coli O₁of 80％MLD

1.3.4蒙兽药BBS复方中各单味草药体内抑制致病性E.coli O₁的剂量优化

由表9可知，按照L₁₈(3⁷)正交表设计实验，在小鼠体内验证不同剂量配比蒙兽药对致病性E.coli O₁的抗菌保护率。采用极差分析方法可得蒙兽药BBS复方各单味蒙兽药最优配比为A∶B∶C∶D∶E∶F∶G＝3∶2∶2∶2∶2∶3∶3。

表9蒙兽药BBS复方对小鼠抗菌保护率的测定结果

Table.9 The determination results of BBS Mongolian compound toantibacterial protection in mice

1.3.5蒙兽药BBS复方对感染E.coli O₁实验小鼠的体内抗菌保护率测定

由表10可知，抗生素环丙沙星对感染致病性E.coli O₁小鼠的保护率为75％；蒙兽药BBS复方对感染E.coli O₁小鼠的保护率为62.5％。

表10蒙兽药BBS复方对感染E.coli O₁小鼠的体内抗菌保护率

Table 10 Protection rate of compound BBS Mongolian medicines to miceinfected with E.coli O₁

1.4结论：

1、蒙兽药巴布-7复方为：草乌叶5g，诃子2.5g，多叶棘豆2.5g，茜草2.5g，黑云香2.5g，甘松5g，大黄5g

2、蒙兽药巴布-7复方对小鼠的抗菌保护率为62.5％。

实施例2：蒙兽药BBS对大肠杆菌性腹泻犊牛临床治愈实验

2.1实验材料

2.1.1试验动物

选择48头体重相近(40±2kg)荷斯坦犊牛。随机分为6组，每组8头。

2.1.2试验药物

7味蒙药用粉碎机粉碎，过200目筛，按照研制剂量配伍，均购自内蒙古天力药业有限公司。环丙沙星组(生产批号：20180316)，购自成都新亨药业有限公司。

2.2试验方法

2.2.1试验设计

试验在内蒙古鄂尔多斯达拉特旗骑士牧场进行，并获得该公司所有者的许可。所有实验方案均已获得内蒙古农业大学牲畜护理委员会的批准，并按照内蒙古农业大学兽医学院动物伦理委员会的指导方针进行。犊牛按照1周龄每日4L牛奶，分别将试验药品混于牛奶中，并于6∶30和18∶30进行人工饲喂。

选择48头体重相近(40±2kg)的健康荷斯坦犊牛，随机分成6组，每组8头牛，分别为正常对照组(VG)、模型组(MG+E.coli O₁)、环丙沙星组(0.5mg/kg.b.w CG+E.coli O₁)、蒙兽药巴布-7复方低剂量组(2.50g/kg.b.w BBS-L+E.coli O₁)、巴布-7中剂量组(5.0g/kg.b.w BBS-M+E.coli O₁)、巴布-7高剂量组(10.0g/kg.b.w BBS-H+E.coli O₁)见表11。先经口服接种致病性E.coli O₁(2.50×10¹¹CFU/mL，100mL/头)建立腹泻模型，腹泻模型成功后，用药连续治疗7d，2次/d(将各试验药物混于牛奶中给药)，于第8d早上采样和统计结果。

表11犊牛试验分组及给药方案

Table 11 Schematic overview of concerning and dosage regimens

2.2.2犊牛试验期临床症状，腹泻情况记录

试验期间观察犊牛精神状态、毛发光泽程度、活动力、食欲、进食量等；犊牛粪便评分数据采集，粪便评分见表12，2分以上评定为腹泻。记录犊牛试验前、后体重。

表12粪便评分表

根据准则记录每日每头犊牛粪便情况，按公式计算：

腹泻率(Diarrhea Rate，DR)-腹泻头数/总头数×100％

2.2.3数据统计与分析

以平均值±标准差表示，使用SPSS 17.0统计软件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)进行分析。单因素方差分析(ANOVA)组间差异，并用单因素方差分析(One-way ANOVA)确定组间差异的显著性(p＜0.05和p＜0.01)。

2.3结果与分析

2.3.1蒙药巴布-7复方对犊牛体重的影响

由表13可知，试验前，选择出生犊牛体重各组之间差异不显著(P＞0.05)。给药7d后，与VG相比，MG组体重显著降低(P＜0.05)。与MG相比，BBS治疗组体重略增加，但无显著性差异，且与CG持平(P＞0.05)。与VG相比，BBS治疗组体重差异不显著，说明蒙兽药BBS可以调控犊牛体重趋于正常水平(P＞0.05)。

表13蒙药巴布-7对腹泻犊牛体重增加的影响

Table 13 The effect of Mongolian medicine Babu-7 on weight gain ofdiarrhea calves

2.3.2蒙兽药巴布-7对犊牛腹泻率的影响

蒙兽药巴布-7对腹泻模型犊牛腹泻率和死亡率的影响见表14。给药7d后，MG腹泻率达到87.5％。BBS-M、BBS-H、CG腹泻率为25％，治愈率75％。与VG相比，BBS-M、BBS-H、CG组犊牛腹泻率有所增加。此外，在试验期间，各组均未出现犊牛死亡。

表14蒙兽药巴布-7对腹泻犊牛腹泻率的影响

Table 14 Effect of Mongolian medicine Babu-7 on diarrhea rate indiarrhea calves

2.4结论：

蒙兽药巴布-7可降低犊牛腹泻率，增加体重，其中10.0g/kg.b.w效果最佳。

实施例3蒙兽药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜生物屏障的影响

3.1实验材料

3.1.1实验用菌

致病性大肠杆菌(E.coli O₁)由内蒙古农业大学动物科学学院牛生产实验室敖日格乐教授赠送，由杨斯琴博士分离、鉴定并保存。

3.1.2实验动物

SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体重23±2g，购自内蒙古大学实验动物中心，许可证号：SCXK(蒙2016-0001)。于单独干燥通风笼中，每笼10只，恒温(21±2℃)、恒湿(53±5％)、自由采食饮水，光照/黑暗周期为12h。适应饲养3d，开展实验。实验符合内蒙古农业大学动物保护使用委员会批准的规程。

3.2实验方法

3.2.1药物制备

将各单味草药按巴布-7复方配方后，用粉碎机粉碎，过40目筛，将药物放入8层纱布缝制的滤药袋，加10倍的蒸馏水室温浸泡过夜，文火煎煮1h，药液再经八层纱布滤过，滤渣中再次加250mL蒸馏水，煎煮30min，过滤，合并两次虑液，文火浓缩至50mL(即药液中所含生药量为1g/mL)。121℃高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

3.2.2受试菌培养

将斜面保存的将致病性E.coli O1接种于肉汤中，37℃培养至对数期18～24h，调整混合指示菌为1×10⁹cfu/mL后，置于4℃冰箱备用。

3.2.3腹泻模型建立

连续3d灌服2％碳酸氢钠溶液和1.0×10⁹CFU/mL的致病性E.coli O1建立小鼠腹泻模型。根据临床症状、剖检症状、DAI评分、肠道组织Chiu’s评分、肠道炎性因子(TNF-α、MPO、IL-6、IL-1β)含量、腹泻率，综合评定腹泻模型成功与否。当小鼠出现精神萎靡、蜷缩成团、消瘦、眼周分泌物增加、肛周被稀便污染，背毛树立，剖检时肠道外观泛红，肠道质地稀薄，易断，肠道鼓气、DAI评分＞6以上、肠道炎性因子含量升高、肠绒毛断裂、崩解，炎性细胞浸润，腹泻率达75％且腹泻症状能持续72h以上即为造模成功。

3.2.4实验分组及给药方案

成功建立小鼠大肠杆菌性腹泻模型后，用蒙兽药BBS复方进行治疗。85只昆明小鼠，每组10只，随机分为6组，试验分组及给药方案见表15。造模成功后，连续治疗7d，在第8d早上处死存活小鼠(各组约10只)，采集样品进行后续实验分析。

表15实验分组情况及给药方案

Table.15 The trial grouping and dosage regiment

3.2.4 DNA提取

根据QIAamp Fast DNA Stool Mini-Kit试剂盒说明书，从收集的盲肠内容物样本中提取微生物DNA。对每个样本，使用波长为260和280nm的紫外分光光度计和1.0％琼脂糖凝胶电泳，对总DNA浓度和完整性进行定量，将提取的合格核酸立即保存在-80℃待进一步分析。

3.2.5 16S rRNA基因扩增

用PCR扩增细菌16S核糖体RNA(rRNA)的V3-V4区。引物：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)，805R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。反应条件：预变性(95℃，3min)，变性(95℃，30s，25个循环)，退火(55℃，30s)，延伸(72℃，45s)，终端延伸(72℃，10min)，终止(10℃)。PCR反应体系参考50μL，含有5μLTaq聚合酶，10ng/μL(5μL)模板DNA，10μmol/L的上下游引物各1μL。PCR产物使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒说明书回收纯化。

3.2.6文库构建和测序

将2μg纯化后的PCR产物用Ion Plus Fragment Library Kit 48rxns建库试剂盒进行文库构建，经过Qubit定量和文库检测合格后，使用Ion S5TMXL进行上机测序。

3.2.7测序数据处理

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机序列中得到每个样品序列，截去Barcode和引物序列后使用Cutadapt(V1.9.1，http：//cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)对每个样品的reads进行拼接，得到拼接序列，即Raw reads。Raw reads序列通过(https：//github.com/torognes/vsearch/)严格过滤比对，去除嵌合体序列后，得到最终的有效数据(Clean Reads)。

3.2.8 OTU聚类和物种注释

先用Uparse软件(version 7.0.1001 http：//www.drive5.com/uparse/)以97％相似性截断聚类操作单元(OTUs)，选取高频出现序列做OUT的代表序列。后用Mothur方法与SILVA132(http：//www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库对OTU序列进行物种注释分析(设阈值为0.8～1)。再用MUSCLE(Version 3.8.31 http：//www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs序列的系统发生关系。

3.2.9样本复杂度分析(Alpha Diversity)

用Qiime软件(Version 1.9.1)对相似度达到97％的OTUs进行分析，计算细菌群落丰富度和α多样性指数，包括Observed-otus、Ace、Chao1、ace、Shannon、Simpson、Goods-coverage、PD whole tree指数。用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线，Rank abundance曲线，物种累积曲线。

3.2.10多样本比较分析(Beta Diversity)

用Qiime软件(Version 1.7.0)对相似度达到97％的OTUs进行分析，计算Uniftac距离，构建UPGMA样品聚类树。使用R软件(Version 2.15.3)绘制PCA，PCoA和NMDS图。使用LEfSe软件进行LEfSe分析，将LDA Score筛选值默认设置为4。

3.3数据统计同1.3。

3.4实验结果

3.4.1物种多样性曲线及物种累积箱形图结果

稀释曲线是从样本中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种数目即(OTUs数目)，以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建曲线。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种。如图1-a所示，各样本稀释曲线趋于平缓，说明测序数量达标，测序深度能够覆盖各样本中的所有物种。等级聚类曲线是OTUs的排序编号为横坐标及该等级OTU中序列数的相对百分含量为纵坐标绘制而来，可直观反映样本中物种的丰富度和均匀度。曲线在横坐标上的跨度与物种的丰富度呈正相关，在纵坐标上的平滑度与物种均匀度呈正相关。如图1-b所示，各样本曲线平滑说明其物种分布均匀。物种累积箱形图(species accumulation boxplot)是描述随着样本量的增加物种多样性增加的分析。在一定范围内，随着样本量加大，若箱形图位置表现为急剧上升则表示群落中有大量物种被发现；当箱形图位置趋于平缓，则表示此环境中的物种并不会随样本量的增加而显著增多。物种累积箱形图可以作为对样本量是否充分的判断，箱形图位置急剧上升表明样本量不足，需要增加抽样量；箱形图位置趋于平缓，则表明抽样充分，可以进行数据分析。如图1-c所示，箱形图位置趋于平缓，说明本研究样本量充分，实验数据可以进行后续分析。

3.4.2 Alpha Diversity指数分析结果

Alpha Diversity用于分析样本内(Within-community)的微生物群落的丰富度与多样性[189]。Shannon指数与Simpon指数是反映菌群多样性的两个指数，Shannon指数越高，菌群多样性越高；反之，则低。由表16可知，与VG相比，MG和CG Shannon指数显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，说明MG和CG菌群多样性降低。与MG相比，蒙兽药巴布-7治疗组Shannon指数显著升高，说明，蒙兽药巴布-7治疗组菌群多样性升高。Simpon指数与Shannon指数相反，Simpon指数越高，菌群多样性越低；反之，则越高。由表16可知，MG和CG Simpon指数显著或极显著低于VG、BBS治疗组(P＜0.05或P＜0.01)。Chao1指数与ACE指数是反映菌群丰富度的两个指数，其算法不同，表示的内容相同。Chao1指数与ACE指数高，菌群丰富度升高，反之，降低。由表16可知，VG和蒙兽药BBS治疗组Chao1指数与ACE指数显著高于MG和CG。说明，蒙兽药BBS治疗组菌群丰富度高于MG和CG(P＜0.05或P＜0.01)，与VG相当。Observedspieces指数和Goods coverage指数是测序深度指数，测序深度达到98％～99％，测序深度已经完全覆盖了样品中可能出现的物种。

表16菌群多样性指数

Tab.16 Bacterial diversity index

3.4.3多样本比较分析结果(Beta Diversity)

Beta Diversity是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析。常用的分析方法有多变量统计学方法主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，无度量多维标定法(NMDS，Non-MetricMulti-Dimensional Scaling)，非加权组平均聚类分析(UPGMA，Unweighted Pair-groupMethod with Arithmetic Means)。使用R软件，基于Bray-Curtis算法距离，进行主成分分析(PCoA)和UPGMA分析，探究各组样本之间菌群结构的差异性和相似性。UPGMA分析结果如图2-a所示，主要成分分析结果如图2-b所示，MG、抗生素与正常组、药物治疗组小鼠盲肠微生物菌群呈现区分和独立分布，说明小鼠造模和抗生素治疗可明显改变肠道菌群结构。而VG、BBS治疗组没有明显独立分布，且部分区域重叠，说明BBS的治疗可以恢复建模造成的菌群紊乱，且与VG小鼠肠道菌群相似。

3.4.4门水平分析结果

为探究各组小鼠盲肠微生物优势菌群的差异，选取各组小鼠盲肠微生物门水平上排名前10的物种进行分析，差异物种相对丰度见图3。由图3可知，与VG相比，MG的拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度显著降低(P＜0.05)，与MG相比，其他各组小鼠盲肠微生物中的拟杆菌门和疣微菌门均显著升高。与VG相比，MG的变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度显著升高(P＜0.05)。与MG相比，CG、BBS-H、BBS-M组小鼠盲肠微生物中的变形菌门和厚壁菌门相对丰度显著降低(P＜0.05)。

3.4.5目水平分析结果

为探究各组小鼠盲肠微生物优势菌群的差异，选取各组小鼠盲肠微生物目水平上排名前10的物种进行分析，差异物种相对丰度见图4。由图4可知，与VG相比，MG的梭菌目(Clostridiales)和肠杆菌目(Enterobacteriales)显著升高(P＜0.05)，与MG相比，CG、BBS-H、BBS-M组梭菌目和肠杆菌目显著降低(P＜0.05)。与VG相比，MG的拟杆菌目(Bacteroidales)、乳酸菌目(Lactobacillales)和疣微菌目(Verrucomicrobiales)相对丰度显著降低(P＜0.05)，与MG相比，CG、BBS-H组小鼠盲肠微生物中的拟杆菌目、乳酸菌目和疣微菌目均显著升高(P＜0.05)。

3.4.6属水平分析结果

为探究各组小鼠盲肠微生物优势菌群的差异，选取各组小鼠盲肠微生物属水平上排名前10的物种进行分析，差异物种相对丰度见图5。由图5可知，与VG相比，MG的肠球菌属(Enterococcus)，梭菌属显著升高(P＜0.05)。与MG相比，BBS治疗组显著降低肠球菌属(Enterococcus)和梭菌属的相对丰度(P＜0.05)。与VG相比，MG的拟杆菌属和乳酸菌属显著降低(P＜0.05)，与MG相比，BBS治疗组拟杆菌属和乳酸菌属的相对丰度显著升高(P＜0.05)。

3.5结论：蒙兽药BBS复方能通过提高有益菌数量，降低有害菌数量来改善致病性大肠杆菌造成的菌群丰富度和多样性降低。

实施例4蒙兽药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜化学屏障的影响

4.1.1试验与耗材

荧光(CY3)标记羊抗兔IgG(生产批号：BA1032)、封闭用的浓缩型正常山羊血清(生产批号：BA1032)，购自武汉博士德生物工程有限公司；Muc-2(生产批号：A14659)，Abclone；DAPI(生产批号：C1002)，购自碧云天公司；抗荧光淬灭封片剂(生产批号：0100-01)，southernbiotech、ITF、溶菌酶，ELISA试剂盒均购自于武汉酶免生物科技有限公司；乳糖酶检测试剂盒、蔗糖酶检测试剂盒、麦芽糖酶检测试剂盒均购自于南京建成试剂有限公司。

4.1.2菌种同3.1.2。

4.1.3实验动物同3.1.3。

4.1.4主要仪器同3.1.4。

4.2.1蒙兽药BBS传统复方的制备同3.2.1。

4.2.2受试菌培养同3.2.2。

4.2.3实验分组及给药方案同3.2.3。

4.2.4 PAS染色

常规方法包埋组织，切片，组织切片常规脱蜡、脱水后用1％过碘酸水溶液浸泡切片10min，蒸馏水洗2min；滴加Schiff氏试剂于切片组织上，室温避光孵育20min，流水冲洗切片5min 2次；Mayer苏木素复染2min，自来水冲洗至细胞核变蓝；无水乙醇脱水、二甲苯透明，通风柜中风干后中性树胶封片，镜检；400倍光镜拍照，每张切片随机选取5个视野，每100个纳入到视野细胞中杯状细胞数，计数，取平均值。

4.2.5免疫荧光常规方法进行免疫荧光实验。MUC-2稀释比例为1∶100。

4.2.6 ELISA

取100mg新鲜回肠组织放入电动组织匀浆器，加入0.9mL灭菌生理盐水，制备组织匀浆，3000r/min，离心10min后取上清。按试剂盒说明检测肠三叶因子(溶菌酶、ITF-3、二糖酶活力)。

4.3数据处理同1.3。

4.4结果与分析

4.4.1肠组织杯状细胞检测结果

由图6-8PAS染色可知，VG小鼠肠黏膜杯状细胞呈圆形或椭圆形，多分布于肠绒毛中部和基部。MG小鼠肠黏膜杯状细胞体型变小、着色较浅，数量明显减少，散在分布于肠绒毛中上部，肠腺、绒毛基部分布较少。与MG小鼠相比，CG、BBS-H组杯状细胞数量明显增多，体型稍大，着色清晰。空、回肠杯状细胞形态分布有类似趋势。

由图9可知，十二指肠杯状细胞，与VG相比，MG显著降低(P＜0.01)；与MG相比，CG、BBS-H、BBS-M组均显著或极显著升高(P＜0.01或P＜0.05)。空、回肠杯状细胞有类似趋势且数量从十二指肠到回肠由少变多。

4.4.2 MUC-2的检测结果

由图10可知，MG小鼠十二指肠中MUC-2的荧光强度显著弱于VG(p＜0.05)，BBS-L组外，各组显著强于MG(p＜0.05)。

4.4.3溶菌酶及ITF的检测结果

由图11可知，溶菌酶活力，MG小鼠十二指肠中溶菌酶活力极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组小鼠的均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优。肠三叶因子，MG小鼠十二指肠中的显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.001)。

4.4.4二糖酶活力的检测结果

由图12可知，MG小鼠十二指肠中麦芽糖酶活力极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优。MG小鼠十二指肠中乳糖酶活力显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H素效果最优(P＜0.001)。由图14-c可知，MG小鼠十二指肠中蔗糖酶活力显著低于VG(P＜0.001)；除BBS-L，各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.001)。

4.5结论

蒙兽药BBS复方可以提高杯状细胞数量及其分泌的黏蛋白MUC-2，提高溶菌酶活力、二糖酶活力及TFF3含量加强对致病菌黏附，阻碍致病性E.coli O₁的入侵，从而缓解腹泻症状。

实施例5蒙兽药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜机械屏障的影响

5.1.1试剂与耗材

药材同上；Occludin(批号：Ab216327)、Claudin-1(批号：ab15098)、Zo-1(批号：21773-1-ap)、MLCK(批号：ab76092)、JAM-A(批号：ab180821)，购自Abeam公司；DAO、D-LA、ETELISA试剂盒购自武汉酶免生物科技有限公司。

5.1.2实验菌株同3.1.2。

5.1.3实验动物同3.1.3。

5.2.1药物制备同3.2.1。

5.2.2受试菌培养同3.2.1

5.2.3实验分组及给药方案同3.2.3。

5.2.4实验流程及样品采集

按50mg/kg bw给小鼠腹腔注1％戊巴比妥钠麻醉，心脏采血1mL，室温静置60min，3000r/min离心15min，收集血清，用于后续检测炎性因子、肠黏膜通透性等实验。无菌操作，在离幽门括约肌0.5cm处取十二指肠1cm、在离梅克尔憩室0.5cm处取空肠1cm、距回盲孔0.5cm处取回肠1cm，用冰生理盐水冲洗。肠组织标本分三份，组织大小1.5×1.5×1mm³。两份分别固定于2.5％戊二醛(pH 7.4，4℃)，用于HE、免疫组化和肠上皮细胞微结构观察；一份快速置于DEPC处理低温试管，液氮中过夜，转-80℃冰箱中保存，为探究Occludin、Claudin-1和ZO-1、JAMA、MLCK的基因、蛋白相对表达水平做准备。

5.2.5 HE染色

HE常规染色方法。每张切片中选取5根最长最直的肠绒毛，用测微尺测量肠绒毛长度(villus length，V)，隐窝深度(crypt depth，C)，记录数据并计算绒腺比值(V/C值)。按照chiu’s评分标准进行评分，评分标准见表17。

表17 qPCR反应程序

Table.17 The procedure of fluorescence quantitative PCR reaction

5.2.6透射电镜检测常规操作。电镜观察并采集图像。

5.2.7免疫组织化学检测

病理组织切片详细步骤同2.2.3，按照常规步骤进行免疫组化。

5.2.8 RT-PCR

方法同1.2.3，引物列表见表18。

表18紧密连接相关蛋白的引物序列

Table.18 Table of primers for tightly junction linked proteins

5.2.9 Western bolt：

按照常规步骤进行Western bolt检测

5.2.10 ELISA法：

按试剂盒使用说明检测小鼠血清中DAO、D-LA、ET含量。

5.3实验结果

5.3.1对大肠杆菌性腹泻小鼠肠道病理损伤的影响

由图13-15可知，VG小鼠十二指肠组织结构正常。MG小鼠十二指肠黏膜出现明显损伤，肠绒毛崩解、断裂、大量炎性细胞浸润、溃疡。BBS-H和CG小鼠十二指肠症状减轻，未见明显肠坏死和出血，肠绒毛排列有序，但CG有轻微损伤。BBS-M组小鼠十二指肠肠绒毛出现崩解、断裂、炎性细胞浸润，但依然可见完整的肠绒毛形态。BBS-L组小鼠十二指肠出现严重出血、充血、肠绒毛断裂，崩解及大量炎性细胞浸润。此外，图16所示，在组织学评分方面，MG小鼠十二指肠病理评分显著高于VG(P＜0.05)，而BBS-H组和CG显著低于MG(P＜0.05)。结果显示，BBS-H剂量能够缓解致病性E.coli O₁对腹泻小鼠十二指肠造成的病理损伤，略优于环丙沙星。空肠，回肠与十二指肠有类似的趋势。

5.3.2对大肠杆菌性腹泻小鼠绒毛长度、隐窝深度及其比值的影响

由图17可知，MG十二指肠绒毛长度、隐窝深度及V/C极显著低于VG(P＜0.001)，BBS-H和CG极显著升高于MG(P＜0.001)，BBS-H治疗效果最好，显著高于BBS-M、BBS-L(P＜0.05或P＜0.01)，与环丙沙星相当。空肠，回肠绒毛长度、隐窝深度及V/C变化与十二指肠有类似的趋势。

5.3.3对大肠杆菌性腹泻小鼠肠道超微结构的影响

由图18-20可知，VG小鼠十二指肠上皮细胞微绒毛排列整齐、紧密，上皮细胞膜和核膜完整，核仁清晰可见；在细胞质中，内质网和线粒体均清晰可见，细胞间紧密连接无明显增宽。MG肠上皮细胞表面微绒毛断裂，崩解，排列稀疏，长短不一，细胞间紧密连接明显增宽。而BBS-H和CG小鼠十二指肠上皮细胞膜完整，细胞形态较正常，微绒毛分布规律。BBS-M小鼠十二指肠微绒毛略有脱落，肠上皮紧密连接稍增宽。BBS-L组十二指肠微绒毛断裂、崩解、排列稀疏。即BBS治疗维护十二指肠上皮的超微结构略优于环丙沙星。空肠，回肠肠道超微结构的变化与十二指肠有类似的趋势。

5.3.4 Occludin检测结果

由图21可知，VG中Occludin蛋白表达均匀分布在肠上皮细胞的边缘。MG中Occludin染色分布不均，Occludin蛋白表达明显降低。RT-PCR结果，MG十二指肠黏膜Occludin蛋白表达显著低于VG(P＜0.001)。BBS-H最好，均显著高于BBS-M、BBS-L(P＜0.05或P＜0.01)，与环丙沙星相当。

5.3.5 Claudin-1检测结果

由图22可知，VG中Claudin-1蛋白表达均匀分布在肠上皮细胞的边缘。MG中Claudin-1染色分布不均，Claudin-1蛋白表达明显降低。药物治疗组Claudin-1蛋白表达均有不同程度提高，其中蒙兽药BBS效果最好。RT-PCR结果，MG十二指肠中Claudin-1mRNA表达极显著下降(P＜0.001)。各组Claudin-1 mRNA表达量均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H优于环丙沙星。

5.3.6 Zo-1检测结果

WB结果如图23显示，MG十二指肠中ZO-1蛋白表达水平显著低于VG(p＜0.05)。BBS-H ZO-1蛋白表达水平显著高于MG(p＜0.05)。RT-PCR结果显示，MG十二指肠ZO-1mRNA表达水平极显著低于VG(p＜0.001)。BBS-H、BBS-M、CG组ZO-1mRNA表达水平显著或极显著高于MG(p＜0.01或p＜0.05)，其中蒙兽药BBS-H、BBS-M效果最优。

5.3.7 JAMA检测结果

WB结果如图24显示，MG十二指肠中JAMA蛋白表达水平显著低于VG(p＜0.001)。BBS-H组小鼠十二指肠中JAMA蛋白表达水平显著高于MG(p＜0.05)。RT-PCR结果，MG十二指肠组织中JAMA mRNA表达水平极显著低于VG(p＜0.001)，各治疗组JAMA mRNA表达水平显著或极显著高于MG(p＜0.01或p＜0.05)，其中蒙兽药BBS-H效果最优。

5.3.8 MLCK检测结果

WB结果如图25所示，MG十二指肠中MLCK蛋白表达水平显著低于VG(p＜0.001)。BBS-H组十二指肠中MLCK蛋白表达水平显著高于MG。RT-PCR结果所示，MG十二指肠组织中MLCK mRNA表达水平显著低于VG(p＜0.05)。各治疗组十二指肠组织中MLCK mRNA表达水平显著或极显著高于MG(p＜0.01或p＜0.05)，其中蒙兽药BBS-H效果最优。

5.3.9 DAO、D-LA、ET检测结果

由图26可知，MG血清中DAO、D-LA、ET的含量极显著高于VG(p＜0.001)。各治疗组血清中DAO含量均显著或极显著低于MG(p＜0.01或p＜0.05)，其中蒙兽药BBS-H效果最优。

5.4结论

蒙药BBS复方有效修复致病性E.coli O₁所造成的小肠病理损伤，提高肠绒毛宽度、隐窝深度及VCR来维持小肠的吸收和消化功能，并提高紧密连接相关蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1、JAMA-A、MLCK的表达来降低致病性E.coli O₁造成的小鼠肠黏膜通透性升高，从而修复受损的肠黏膜屏障。

6蒙兽药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜免疫屏障的影响

6.1实验材料

6.1.1试剂与耗材

Pharmingen^TMLeukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug^TM刺激剂，Pharmingen^TM Transcription Factor Buffer Set Buffer，IntraSure^TM Kit破膜剂，FACS溶血素，均购自BD公司；FITC-anti-CD8，PE-anti-CD3，FITC-anti-CD19，APC-anti-CD4，APC-anti-IFN-γ，PE-anti-IL-4，PE-anti-IL-17均购自Biolegend公司；IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α、IgA、IgG、IgM，C3、C4、sIgA ELISA试剂盒均购自于武汉酶免生物科技有限公司。

6.1.2实验菌种、实验动物同实施例3。

6.2实验方法

6.2.1蒙兽药BBS复方制备、受试菌培养、实验分组及给药方案同实施例3。

6.2.2实验流程及样品采集

小鼠麻醉，用肝素钠抗凝真空采血管眼球采血1mL用于流式细胞计数。之后，心脏采血1mL于促凝采血管中，室温静置60min，3000r/min离心15min，收集血清、分装用于后续检测免疫球蛋白及补体等实验。取十二指肠制备组织匀浆检测炎性因子。

6.2.3流式细胞术

(1)取200μL抗凝血，按1∶10的比例加入1×的溶血素，混匀后室温静置直至血变的清凉透明，1500g离心7min；弃去上清液，如管底有红色沉淀则重复上述步骤，直到沉淀无红色为止；

(2)加3mLPBS洗一次，悬浮振荡，1500g离心7min；弃上清，重复上述步骤2次；

(3)加150μLPBS稀释，调细胞浓度为1×10⁶个/μL；

(4)将溶液分成两份，50μL/份加入上样管，分别加10μL小鼠淋巴细胞荧光标记抗体APC-anti-CD4/FITC-anti-CD8，PE-anti-CD3/FITC-anti-CD19，室温避光标记30min；

(5)重复步骤(2)；

(6)沉淀中加200μLPBS，悬浮振荡，流式细胞仪圈门淋巴细胞，分别检测CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T和CD19⁺B细胞所占百分数。

6.2.4流式细胞术(TH1、TH2)

(1)取血：肝素钠真空抗凝采血管取小鼠外周血全血1～2mL(血液室温放置，8h内进行检测，否则弃用)；

(2)以一个样本为例：取2支流式管，并按顺序编号(A管：刺激未染色，用于定电压，B管：刺激剂+IFN-γ+IL-4抗体)，然后每支试管加入200μL抗凝全血(裂解红细胞后，白细胞浓度达到2×10⁶细胞/ml)，每管样本加入4μL刺激剂，涡旋混匀，37℃，5％CO2培养箱或37℃水浴孵育4～6h；

注意：同时取另外2支流式管，顺序编号(UA管：未刺激未染色；UB管：未刺激+IFN-γ+IL-4抗体)，每支流式管中加入相同血液样本200μL，不加刺激剂；

(3)细胞表面标记染色：向每个样本管(A、B、UA、UB)加入CD4抗体20μL，涡旋混匀，室温避光孵育15min(20-25℃)；

(4)每支试管4只：(A、B和UA、UB)加入100μL的A液(BD IntraSure Kit)，涡旋混匀，室温避光孵育5min(20-25℃)；

(5)溶血：每支试管(4只：A、B和UA、UB)加入配好的1X BD FACS溶血素2ml，涡旋混匀，室温避光10min(20-25℃)，6800g离心5min，弃去上清；

(6)每支试管(4只：A、B和UA、UB)加入50μLB液(BD IntraSure Kit)，分别加入胞内抗体：A管：IL-4 PE 20μL，IFN-γAPC 5μL。涡旋混匀，室温避光孵育30min；

(7)每管(4只：A、B和UA、UB)加入2mL PBS，低速涡旋，800g，离心5min，弃掉上清。

(8)每管(4只：A、B和UA、UB)加入500μL PBS，上机检测。

(9)使用流式细胞仪检测，调整好条件(Cytometer-＞Instrument Setting调用Calibur 4色LNW)，获取CD4+的细胞10000个，分析结果。

6.2.5 ELISA

制备小鼠血清，分装后按ELISA试剂盒说明检测IgA、IgG、IgM含量。制备十二指肠组织匀浆检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α及sIgA含量。

6.3数据处理同上。

6.4实验结果

6.4.1 CD3⁺T、CD19⁺B细胞百分比检测结果

由图27-28可知，CD3⁺T细胞，MG小鼠外周血CD3⁺T细胞百分比极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组外周血CD3+T细胞百分均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.001)。CD19⁺B细胞，MG小鼠外周血中CD19⁺B细胞百分比极显著低于VG(P＜0.001)；CG、BBS-H、BBS-M鼠外周血CD19⁺B细胞百分均显著或极显著于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H组效果最优(P＜0.001)。

6.4.2 CD4⁺T、CD8⁺T细胞百分比检测结果

由图29-30可知，CD4⁺T细胞，MG小鼠外周血CD4⁺T细胞百分比极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组小鼠外周血CD4⁺T细胞百分均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中BBS-H效果最优。CD8⁺T细胞，MG小鼠外周血CD8⁺T细胞百分比极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组小鼠外周血CD8⁺T细胞百分均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中BBS-H组效果最优。CD4⁺/CD8⁺，MG小鼠外周血中CD4⁺/CD8⁺的比值极显著低于VG(P＜0.05)；其余各治疗组CD4⁺/CD8⁺比值均显著高于MG(P＜0.05)，且各组差异不显著(P＞0.05)。

6.4.3 Th₁、Th₂细胞检测结果

由图31-32可知，Th₁细胞，MG小鼠外周血中Th₁细胞的百分比极显著高于VG(P＜0.001)；各治疗组外周血Th₁细胞百分均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.001)。Th₂细胞，MG小鼠外周血中Th₂细胞百分比极显著低于VG(P＜0.001)；CG、BBS-H、BBS-M小鼠外周血Th₂细胞百分均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中BS-H组效果最优(P＜0.001)。

6.4.4细胞因子检测结果

由图33可知，IL-1β含量，MG小鼠IL-1β含量极显著高于VG(P＜0.001)；除BBS-L外，其余各治疗组小鼠IL-1β含量均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中蒙兽药巴布-7治疗组效果最好。IL-6含量，MG小鼠极显著高于VG(P＜0.001)；各治疗组小鼠均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.05)。TNF-α含量，MG小鼠TNF-α含量极显著高于VG(P＜0.01)；各治疗组均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中BBS-H效果最优(P＜0.01)。IL-10含量，MG小鼠IL-10含量极显著高于VG(P＜0.001)；各治疗组均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.05)。IL-4含量，MG小鼠IL-4含量极显著低于VG(P＜0.01)；与MG相比，除BBS-H组以外，各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.001)。IFN-γ含量，MG小鼠IFN-γ含量极显著低于VG(P＜0.01)；除BBS-L外，其余各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优。TGF-β含量，MG小鼠TGF-B含量极显著低于VG(P＜0.01)；除BBS-H，其余各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.01)。IL-23含量，与VG相比，MG小鼠IL-23含量显著升高，其中BBS-H效果最优(P＜0.001)。各治疗组均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优(P＜0.001)。IL-17含量，MG小鼠IL-17含量显著高于VG(P＜0.01)；各治疗组小鼠IL-17含量均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优。IL-8含量，MG小鼠IL-8含量显著高于VG(P＜0.01)；各治疗组小鼠IL-8含量均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H、BBS-M效果最优。IL-2含量，MG小鼠IL-2含量极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组小鼠IL-2含量均显著或极显著高于VG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H与环丙沙星相当(P＜0.001)。NO含量，MG小鼠外周血中NO含量极显著高于VG(P＜0.001)；各治疗组均显著或极显著低于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中BBS-H效果最优(P＜0.001)。

6.4.5免疫球蛋白检测结果

由图34可知，IgA含量，MG小鼠外周血IgA含量显著低于VG(P＜0.01)；除BBS-L外，各治疗组小鼠均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优。IgG含量，MG小鼠外周血IgG含量显著低于VG、蒙兽药BBS治疗组显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)。BBS-H效果最优(P＜0.001)。IgM含量，MG小鼠外周血IgM含量显著低于VG、各治疗组显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)。BBS-H、BBS-M效果最优(P＜0.001)。

6.4.6 sIgA检测结果

由图35可知，十二指肠sIgA含量，MG组极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组显著或极显著升高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中BBS-H效果最优。空肠中sIgA含量，MG小鼠极显著低于VG(P＜0.001)；除环丙沙星，各治疗组小鼠均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，BBS-H效果最优。回肠中sIgA含量，MG小鼠极显著低于VG(P＜0.001)；各治疗组均显著或极显著高于MG(P＜0.01或P＜0.05)，其中BBS-H效果最优。

6.5结论

蒙兽药BBS通过提高CD4⁺/CD8⁺的比值及CD19⁺B淋巴细胞百分比，提高小鼠免疫球蛋白、sIgA含量及纠正致病性E.coli O₁入侵造成的Th1、Th2细胞及其细胞因子的失衡，来提高动物机体免疫力，从而抵抗致病性E.coli O₁导致的肠道免疫屏障损伤。

以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (3)

1.一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药，其特征在于：由草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、甘松和大黄组成，上述7味药的质量比为2∶1∶1∶1∶1∶2∶2。

2.根据权利要求1所述的一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药，其特征在于：所述草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、甘松、大黄的质量为草乌叶5g，诃子2.5g，多叶棘豆2.5g，茜草2.5g，黑云香2.5g，甘松5g，大黄5g。

3.一种抗大肠杆菌性腹泻病蒙兽药的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：将草乌叶5g，诃子2.5g，多叶棘豆2.5g，茜草2.5g，黑云香2.5g，甘松5g，大黄5g，这7味药按比例混合后进行粉碎制得，调和于水或乳中。

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