CN106148257A - 改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用。该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。通过将克雷伯氏肺炎杆菌中葡萄糖酸脱氢酶的编码基因进行失活来获得所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。利用所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸，具有较高的底物转化率，较高的生产强度和较高的产物终浓度。

Description

改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用

技术领域

本发明属于菌株的基因工程改造技术领域，具体涉及改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用。

背景技术

葡萄糖酸是一种重要的大宗有机酸，葡萄糖酸金属盐广泛应用于保健食品领域作为补充钙、铁、锌等元素的补充剂。葡萄糖酸盐还是重要的药品，应用于多种病症治疗。葡萄糖酸及其盐具有很好的螯合作用，应用于冷却用水等的缓蚀阻垢。葡萄糖酸及其盐作为除垢剂用于钢铁和玻璃等表面清洗。葡萄糖酸及其盐应用到混凝土是一种很好的缓凝剂，增加混凝土的可塑性和强度。葡萄糖酸还是土壤中解磷微生物解磷的主要代谢产物，葡萄糖酸与土壤中的钙离子结合，而释放出磷酸根，供给植物磷源。

葡萄糖酸生产多数以葡萄糖为原料通过化学或生物方法生产。化学法生产葡萄糖酸可以通过化学氧化剂，如双氧水等在贵催化剂的催化下进行氧化。葡萄糖为原料通过电化学氧化也可以生产葡萄糖酸。也有报道在超声波作用下利用碘氧化葡萄糖生产葡萄糖酸。葡萄糖酸可以通过生物法进行生产，多种微生物可以代谢葡萄糖生成葡萄糖酸，其中葡萄糖酸生产能力比较高的主要是黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)和氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)等。目前在我国工业上主要是利用黑曲霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸。

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，可用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产。一般生物体中细胞外的葡萄糖通过细胞膜上磷酸烯醇式丙酮酸依赖的转运系统进入胞内，同时磷酸化形成磷酸葡萄糖，在胞内代谢生产各种代谢终产物，并产生能量。克雷伯氏肺炎杆菌在好氧条件下利用葡萄糖为原料主要合成2,3-丁二醇和乙酸、琥珀酸、乳酸等有机酸。但是在酸性条件下培养，克雷伯氏肺炎杆菌可以积累高水平的2-酮基葡萄糖酸。具体内容参见申请号为201310012784的中国发明专利。

发明内容

本发明的目的是，提供一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为位于周质空间内膜上的葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

所述葡萄糖脱氢酶是指位于细胞周质空间的葡萄糖酸脱氢酶，催化周质空间的葡萄糖酸氧化生成2-酮基葡萄糖酸。该酶蛋白由两个亚基组成，两个亚基的编码基因相邻，其在克雷伯氏肺炎杆菌342中小亚基的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，Genebank编号为(gene ID 6937950)；大亚基的基因阅读框如SEQ ID NO.2所示，Genebank编号为(gene ID6934738)。

所述葡萄糖酸脱氢酶的失活通过葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因和/或小亚基基因失活来实现。利用基因重组方法对葡萄糖酸脱氢酶基因大亚基基因和小亚基基因中的一个基因进行失活或两个基因同时进行失活，从而构建获得所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。

本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产葡萄糖酸中的应用。

本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到以葡萄糖为碳源的培养基中，进行好氧发酵培养。

优选地，所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖5-300g/L，氮源0.5-50g/L，无机盐0-10g/L。所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

优选地，所述好氧发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，保持发酵过程中溶解氧浓度大于饱和溶氧的1％，保持发酵过程中发酵液的pH值在3.5-6.0之间。

进一步优选地，所述好氧发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶氧的20％，保持发酵过程中发酵液的pH值在4-5.5之间。

优选地，所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法还包括：发酵过程中待葡萄糖消耗至1-20g/L时流加高浓度葡萄糖进行补料发酵。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过葡萄糖酸脱氢酶失活对克雷伯氏肺炎杆菌进行改造，改造后的克雷伯氏肺炎杆菌利用葡萄糖为碳源进行发酵培养时，葡萄糖在周质空间氧化形成葡萄糖酸以后，在发酵液中积累。本发明提供的方法，葡萄糖转化成葡萄糖酸的转化率高，产物终浓度高，生产强度大，可用于工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌葡萄糖酸脱氢酶基因小亚基进行失活，来实现葡萄糖脱氢酶活性失活。

本实施例中的克雷伯氏肺炎杆菌采用保藏号为CGMCC 1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01)，其保藏地址为：为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏。该保藏号为CGMCC 1.6366的菌株已经在授权发明专利ZL201310346916.8中公开，另外在公开文献(Wei Dong,Wang Min,ShiJiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiellapneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:12191226)中也已经公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms ableto produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal ofMicrobiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。

1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌葡萄糖酸脱氢酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

克雷伯氏肺炎杆菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎杆菌，其全基因组已经测序，并且提交到了genebank。根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计乙偶姻脱氢酶系及调控基因PCR引物，上游引物gad-s：GGGCCAGACGCTAAGCGGTTTGAAAGCGCA(SEQID NO.3所示)，下游引物gad-a：AACCATTGCATTTTCATCATCTGCCTTCCT(SEQ ID NO.4所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得葡萄糖酸脱氢酶小亚基基因大亚基基因以及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-gad质粒，该重组质粒上连接的来自克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的葡萄糖酸脱氢酶小亚基、大亚基基因及相邻片段的序列测定结果如SEQ ID NO.5所示，其中1-831的序列为gad小亚基阅读框，897-2618的序列为gad大亚基阅读框。

2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-gad质粒进行同源重组，获得pMD18T-gad质粒上重组失活的gad小亚基基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与gad小亚基基因同源的序列，中间连接抗性盒。

本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见(Wei et.al.Redrecombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：

a.pMD18T-gad质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-gad。

b.设计引物gads-s和gads-a，序列分别为：

GTGCCCAAACAGATCTATAACCTCGGGATCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.6所示)和AAGCCTTCGCGGGTGTTCTGCAGCAGATAGTGTAG GCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.7所示)。

利用引物gads-s和gads-a，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与gad小亚基序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-gad感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-gad上的gad小亚基同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-Δgads质粒。

d.利用引物gad-s(SEQ ID NO.3所示)和gads-a2CCGCAGTTCGATGGGATCGACGCGGAAATG(SEQ ID NO.8所示)，以pMD18T-Δgads质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kb的DNA片段B。

DNA片段B两端分别具有gad小亚基基因序列和下游部分大亚基基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上gad小亚基基因重组的线性DNA片段。

3)利用转化将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的葡萄糖酸脱氢酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体葡萄糖酸脱氢酶小亚基重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，将转化有pDK6-red质粒的CGMCC 1.6366命名为CGMCC 1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-gads^-，该菌株的葡萄糖酸脱氢酶小亚基基因通过同源重组而失活。

实施例2

利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌葡萄糖酸脱氢酶基因大亚基进行失活，来实现葡萄糖脱氢酶活性失活。

步骤如下：本实施例中的克雷伯氏肺炎杆菌为CGMCC 1.6366菌株。

1)制备两侧连有gad大亚基基因同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

具体步骤如下：

a.设计引物gadl-s和gadl-a，序列分别为：

GAGGTGGGCTACCATCCCTACAACCTGCCGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.9所示)和CCATTTGCTGCCCCACGCCGGGGTGCCCGGTGTA GGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.10所示)。

利用引物gadl-s和gadl-a，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A1。该片段的两端分别具有与葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

b.利用DNA片段A1转化实施例1中制备的感受态DH5α-pMD18T-gad感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A1两侧的同源序列与质粒pMD18T-gad上的gad大亚基同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔgadL质粒。

c.利用引物gadl–s2ATGCGCGACACCTGGCCGGACGGCGCCTAT(SEQID NO.11所示)和gad-a(SEQ ID NO.7所示)，以pMD18T-ΔgadL质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kbp的DNA片段B1。

DNA片段B1两端分别具有葡萄糖脱氢酶大亚基基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B1中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B1用于进行乙酰乳酸脱羧酶活性失活的CGMCC 1.6366菌株染色体上葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因重组的线性DNA片段。

2)将制备的DNA片段B1转入到CGMCC 1.6366菌株中，DNA片段B1与染色体上的葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366菌株中，线性DNA片段B1电击转化含有pDK6-red质粒的CGMCC 1.6366菌株的感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-gadl^-，该菌株的葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因通过同源重组而失活。

实施例3

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株进行摇瓶批次发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株Kp-gads^-和Kp-gadl^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml葡萄糖酸发酵培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行好氧发酵培养。

培养基组分为：葡萄糖5g/L，玉米浆0.5g/L，碳酸钙1g每瓶。

培养12小时，测定发酵液中组分。测定采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱60℃。葡萄糖酸和葡萄糖酸盐在本发明中不做区分，都以葡萄糖酸计。各菌株发酵结果如表1所示。

表1，药瓶发酵实验中各菌株的发酵数据结果

从表1的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366利用葡萄糖好氧发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成葡萄糖酸。葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株(Kp-gads^-和Kp-gadl^-)利用葡萄糖好氧培养合成葡萄糖酸，产生少量2,3-丁二醇。

实施例4

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株Kp-gads^-和Kp-gadl^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml葡萄糖酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：葡萄糖5g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。

发酵培养基组成为：葡萄糖300g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。

培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度1％，发酵温度45℃，发酵液pH降低后，利用氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在6.0，发酵48小时结束，采用实施例3方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表2所示。

表2，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

从表2的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366利用高浓度葡萄糖速率较慢，主要合成2,3-丁二醇和2-酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸脱氢酶突变株利用高水平葡萄糖速率快，主要合成葡萄糖酸和2,3-丁二醇。

实施例5

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株Kp-gads^-和Kp-gadl^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml葡萄糖酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：葡萄糖5g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁1g/L。

培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度20％，发酵温度25℃，发酵液pH降低后，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在3.5，发酵72小时结束，采用实施例3方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表3所示。

表3，实施例5中各菌株的发酵数据结果

从表3的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366在上述培养条件下利用葡萄糖主要合成2-酮基葡萄糖酸和2,3-丁二醇。葡萄糖酸脱氢酶突变株主要合成葡萄糖酸。

实施例6

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株Kp-gads^-和Kp-gadl^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml葡萄糖酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：葡萄糖5g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆20g/L，硫酸镁1g/L。

培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度20％，发酵温度30℃，发酵液pH降低后，利用氨水稳定发酵液pH 4，发酵24小时结束，采用实施例3方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表4所示。

表4，实施例6中各菌株的发酵数据结果

从表4的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366在上述培养条件下利用葡萄糖主要合成2-酮基葡萄糖酸和2,3-丁二醇。葡萄糖酸脱氢酶突变株主要合成葡萄糖酸。

实施例7

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株Kp-gads^-和Kp-gadl^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml葡萄糖酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：葡萄糖5g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁1g/L。

培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度20％，发酵温度40℃，发酵液pH降低后，利用氢氧化钠溶液稳定发酵液pH 5.5，发酵10小时结束，采用实施例3方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表5所示。

表5，实施例7中各菌株的发酵数据结果

葡萄糖酸脱氢酶活性失活的菌株生产葡萄糖酸，生产强度达到10.5g/L/h。

实施例8

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将实施例1-2中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的菌株Kp-gads^-和Kp-gadl^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml葡萄糖酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：葡萄糖5g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。

发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L，玉米浆15g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁1g/L。

培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度20％，发酵温度37℃，发酵液pH降低后，利用氨水稳定发酵液pH 5.5，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1-20g/L时，补加50％(g/g)的葡萄糖溶液，发酵64小时结束，采用实施例3方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表6所示。

表6，实施例8中各菌株的发酵数据结果

从表6的数据可以看出：利用流加发酵，葡萄糖酸脱氢酶活性失活的菌株Kp-gadl^-可以合成420g/L的葡萄糖酸。该数据结果表明：本发明改造后的克雷伯氏肺炎杆菌具有很强的葡萄糖酸生产能力，适合于工业化生产。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产葡萄糖酸的应用

<130> 2015

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342

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atgatgtcga gcgagaaaac caacaattcc aggcgtgatt tcctggtgaa atcgatggcg 60

ctgatcccga cggtggtgat cggcggcgcg ggagcagggg ccattggcgt ggccaccagc 120

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gactggaagc cgcagttctt caacgatcgt gagtgggcgt ttatcaacgc cgccgtcgcg 240

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<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggccagacg ctaagcggtt tgaaagcgca 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaccattgca ttttcatcat ctgccttcct 30

<210> 5

<211> 2618

<212> DNA

<213> （克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366）

<400> 5

atggtatcgg ttccagcacg acattcactg gttttgtcag cgacaaaaac agtaattttc 60

aatgacagga atgtgatgat gtcgagcgag aaaactaaca attccaggcg tgatttcctg 120

gtgaaatcga tggcgctgat cccgacggtg gtgatcggcg gcgcgggagc aggggccatt 180

ggcgtggcca ccagcgcgac cgcgcaggcg gcccccgctt cagagccagc ctccgggaac 240

acggcggcgg ccagcgactg gaagccgcag ttcttcaacg atcgtgagtg ggcgtttatc 300

aacgccgctg tcgctcgctt aatcccggcg gatgaacttg ggcccggcgc taaagaggcc 360

ggcgtgccgg agtttatcga ccgccagctc aatacccctt acgccaccgg ctccatctgg 420

tatatgcagg ggcccttcaa ccccgacgtg ccgaaagaga tgggctatca actgccgctg 480

gtgcccaaac agatctataa cctcgggatc gccgatgccg aggcctggtg tcaggacaag 540

tatcacaaga cctttgctga actgagcagc gagcagcagg acgaggcgct cggcctgtgg 600

gaatcgggca aagccgagtt caaacagcta ccggcttcgc tgttcttcac ctatctgctg 660

cagaacaccc gcgaaggctt cttcagcgac ccgatccatg gcggtaacaa aggcatggtt 720

ggctggacgc tgattaattt tcccggcgcg cgcgccgact ttatggattg ggttgaacgg 780

ggcgaacgct accccttccc gccggtatca attaatgggg agagggcgta atcatggcca 840

ccgtattgaa aaaaaccgat gtcgcgatcg tcggcttcgg ctgggttggg gcgatcatgg 900

ccaaagagct gaccgaagcc gggctcaacg tcgtggcgct ggagcgcggc ccgatgcgcg 960

acacctggcc ggacggcgcc tatccgcagg tgattgatga gctgacctac aacatccgcc 1020

gcaagctgtt ccaggatctg tcgaaaagca ccgtcaccat ccggcataac accagccagc 1080

aggcggtgcc gtatcgccag ctcgcggctt tcctgccggg taccggcgtg ggcggcgccg 1140

ggctgcactg gtccggcgtc catttccgcg tcgatcccat cgaactgcgg atgcgcagcc 1200

actatgaaga gcgctacggc aaaaacttca ttccccagga tatgatcatc caggatttcg 1260

gcgtcaccta cgacgagctg gaaccgttct tcgataaagc ggagaaagtg ttcggcacct 1320

ccgggaccgc ctggtcgatc aaaggcaagg tcgtcggcaa aggccgcggc ggcaacgcct 1380

tcgccccgga ccgttcagat gacttcccgc tgccggcgca gaaaaacacc tggtcggcgc 1440

agctgtttga aaaagcggcg ctcgaggtgg gctaccatcc ctacaacctg ccgtcggcca 1500

acacttccga ctcctatacc aacccgtacg gcgcgcagat gggcccgtgc aacttctgcg 1560

gtttctgcag cggctacgcc tgctacatgt actccaaagc ctcgccgaac gtgaacattc 1620

tgccggcgct gcgccaggaa aaacgctttg agctgcggac caacgccaac gtgctgaagg 1680

tcaacctgac cgacgacaaa tcccgtgcca ccggcgtgac ctacgtcgac ggccaggggc 1740

gcgaaatgga gcagccggcg gacctggtga tcatcggcgc cttccagttc cataacgtgc 1800

acctgatgct gctctccggg atcggcaaac cctacaatcc ggagaccggc gaaggggtgg 1860

tggggcgtaa cttcgcctac cagaacatga ccaccattaa ggccattttc gacaaagaca 1920

cctacaccaa cccgtttatc ggcgcgggcg gcaacggcgt cggcgtcgac gacttcaacg 1980

ccgacaactt cgaccacggc gcggcgggct ttgtcggcgg ttcgccgttc tgggtcaacc 2040

aggccgggac caagcccatc tccggtttcc cggtaccgcc gggcaccccg gcgtggggca 2100

gcaaatggaa agcggcggtg gccgatacct acacccatca cctgtcgatg gatgctcacg 2160

gcgcgcacca gtcctatcgg cagaactacc tcgatcttga tccgaactac aaaaacgtct 2220

ttggccagcc gctgctgcgc atgacctttg actggcagga aaacgacatc aagatggcgc 2280

agtttatgtt cgataagatg gcgccgatcg ccaaagcgat gaagccgaaa tatatcctcg 2340

gcagcccgaa aaacgccaac agccactttg ataccaccac ctaccagacc acccatatga 2400

acggcggggc ggtgatgggg gaggatccga aaaccagcgc cgttaaccgt tatctgcaaa 2460

gctgggacgt gcataacgtc ttcgtcatcg gcgcctccgc tttcccgcag gggctgggct 2520

ataacccaac cggcacggtg gccgcgctgg cgtactggtc agcgaaggcg atccgcgagc 2580

agtatctgaa aaatccgggt cccctggtgc aggcataa 2618

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgcccaaac agatctataa cctcgggatc attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagccttcgc gggtgttctg cagcagatag tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgcagttcg atgggatcga cgcggaaatg 30

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaggtgggct accatcccta caacctgccg attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccatttgctg ccccacgccg gggtgcccgg tgtaggctgg agctgcttc 49

Claims (10)

1.一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为位于周质空间内膜上的葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

2.如权利要求1所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述葡萄糖酸脱氢酶的失活通过葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因和/或小亚基基因失活来实现。

3.如权利要求2所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖酸脱氢酶小亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1-3任一项所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产葡萄糖酸中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，该方法为：将所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到以葡萄糖为碳源的培养基中，进行好氧发酵培养生产葡萄糖酸。

6.如权利要求5所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖5-300g/L，氮源0.5-50g/L，无机盐0-10g/L。

7.如权利要求6所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐，所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

8.如权利要求5所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述好氧发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，保持发酵过程中溶解氧浓度大于饱和溶氧的1％，保持发酵过程中发酵液的pH值在3.5-6.0之间。

9.如权利要求5所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述好氧发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶氧的20％，保持发酵过程中发酵液的pH值在4-5.5之间。

10.如权利要求5所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产葡萄糖酸的方法，其特征在于还包括如下步骤：发酵过程中待葡萄糖消耗至1-20g/L时流加高浓度葡萄糖进行补料发酵。