CN106093218A - 王老吉凉茶指纹图谱的构建方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种王老吉凉茶指纹图谱的构建方法及检测方法，属于凉茶植物饮料质量控制技术领域。该构建方法，包括以下步骤：(1)分别精密称取丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15‑去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷对照品，以甲醇溶解并定容，配制对照品溶液；(2)精密量取王老吉凉茶，浓缩后离心，取上层液过滤膜，制备供试品溶液；(3)分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到具有共有特征峰的王老吉凉茶指纹图谱。该构建方法及检测方法能够全面的表征王老吉凉茶中加入的各成分，并且具有稳定性好的特点，既能有效表征王老吉凉茶的质量，又有利于监控产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及凉茶植物饮料质量控制技术领域，特别是涉及一种王老吉凉茶指纹图谱的构建方法及检测方法。
背景技术
岭南凉茶文化拥有悠久的历史积蕴和民俗内涵。古时岭南为百越之地，多瘴气，染者无有不死。岭南人民在与恶劣自然环境的不断抗争中，积累了调理保健、防病治病的宝贵经验。他们根据本地的气候、水土特性，以一些具有清热解毒、生津止渴、祛火除湿等功效的岭南特色中草药为基础，在中医养生理论指导下经过长期实践，创造出各种各样的"凉茶"，用于防病治病，形成了一条岭南文化的独特风景线。
王老吉凉茶是历史最早的广东凉茶，始创于1828年(清道光八年)，至今已有180多年历史，被公认为凉茶始祖，有"药茶王"之称。最近几十年，随着现代化生产设备和先进管理理念的引入，凉茶业发生了大变革，过去守着凉茶铺喝凉茶的局面被打破，凉茶被加工成饮用更方便的颗粒剂、袋泡茶、利乐包、罐装等多种规格。
王老吉凉茶以水、白砂糖、仙草、蛋花、菊花、夏枯草、甘草、金银花、布渣叶为原料，经提取、浓缩、配制、灭菌、包装等主要加工工艺制成，其口感清凉爽口，冷热饮用皆宜，受到消费者的喜爱。为全面的反映及监测该品种的内在质量，促进该品种的发展，应开展该品种的指纹图谱研究。
发明内容
本发明提供一种王老吉凉茶指纹图谱的构建方法及检测方法，用以对王老吉凉茶的质量进行监测，能够实现全面保证王老吉凉茶质量的目的。
一种王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的配制：
分别精密称取丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷对照品，以甲醇溶解并定容，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密量取王老吉凉茶，浓缩后离心，取上层液过滤膜，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到具有共有特征峰的王老吉凉茶指纹图谱。
上述王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，经过本发明人长久积累的经验以及大量实验后，选取了丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷作为指纹图谱中的参照物。其中，丹参素、咖啡酸和迷迭香酸均是凉粉草和夏枯草中的共有成分，原儿茶酸是夏枯草和布渣叶中的共有成分，15-去甲基鸡蛋花苷和海芒果酸B是鸡蛋花中的特有成分，甘草苷和甘草酸单铵盐是甘草中的特有成分，迷迭香酸苷是凉粉草中的特有成分。以上述参照物能够较好的表征王老吉凉茶中加入的各成分，并且具有稳定性好的特点。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的测定条件如下：
色谱柱：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式。
以反向色谱柱作为固定相，再通过梯度洗脱的方式，能够将王老吉凉茶中的各成分在液相色谱图中表征，建立能够较好表征王老吉凉茶质量的指纹图谱。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的测定条件还包括：
流速：1.0mL/min；
柱温：18-25℃；
检测波长：235nm。
选用上述检测条件，王老吉凉茶中的各成分能在指纹图谱上具有较好的分 离效果。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：
0min-7min，流动相B的体积百分数为5％；
7min-20min，流动相B的体积百分数由5％变化至10％；
20min-30min，流动相B的体积百分数由10％变化至11％；
30min-35min，流动相B的体积百分数由11％变化至19％；
35min-40min，流动相B的体积百分数由19％变化至20％；
40min-55min，流动相B的体积百分数由20％变化至30％；
55min-65min，流动相B的体积百分数由30％变化至46％；
65min-70min，流动相B的体积百分数由46％变化至52％。
选用上述梯度洗脱条件，能够使王老吉凉茶中的各成分在液相色谱中分离，并具有较好峰型、分离度及分离效果，从而更好得以指纹图谱表征王老吉凉茶中含有的中药化学成分群中各种成分。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述共有特征峰为丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷的色谱峰。
选用上述成分的色谱峰作为共有特征峰，既具有代表性，又具有重现性好的优点。
在其中一个实施例中，所述共有特征峰中，以海芒果酸B的色谱峰为参照峰，设定该海芒果酸B的色谱峰的相对保留时间为1.0、相对峰面积为1.0，构建得到由上述共有特征峰构成的王老吉凉茶指纹图谱。
在充分考察了各共有特征峰的特点后，由于海芒果酸B色谱峰的保留时间，峰面积和分离度均较适合，选择海芒果酸B的色谱峰作为参照峰，在对指纹图谱相似度评价时具有较好的评价效果。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，按照200ml王老吉凉茶浓缩至25ml的比例进行浓缩。
本发明还公开了一种王老吉凉茶指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的配制：
分别精密称取丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷对照品，以甲醇溶解并定容，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密量取王老吉凉茶，浓缩后离心，取上层液过滤膜，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测。
上述王老吉凉茶指纹图谱的检测方法，以丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷作为指纹图谱中的参照物，能够很好的表征王老吉凉茶中加入的各成分，并且具有稳定性好的特点。
在其中一个实施例中，将步骤(3)检测得到的供试品溶液色谱图与上述构建方法得到的指纹图谱比较，计算相似度，对王老吉凉茶的质量进行评价。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的测定条件如下：
色谱柱：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：
0min-7min，流动相B的体积百分数为5％；
7min-20min，流动相B的体积百分数由5％变化至10％；
20min-30min，流动相B的体积百分数由10％变化至11％；
30min-35min，流动相B的体积百分数由11％变化至19％；
35min-40min，流动相B的体积百分数由19％变化至20％；
40min-55min，流动相B的体积百分数由20％变化至30％；
55min-65min，流动相B的体积百分数由30％变化至46％；
65min-70min，流动相B的体积百分数由46％变化至52％；
流速：1.0mL/min；
柱温：18-25℃；
检测波长：235nm。
采用上述检测条件，能够使王老吉凉茶中的各成分在液相色谱中分离，并具有较好峰型、分离度及分离效果，从而更好得以指纹图谱表征王老吉凉茶中含有的中药化学成分群中各种成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，在本发明人长久积累的经验以及大量实验后，选取了丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷作为指纹图谱中的参照物，能够全面的表征王老吉凉茶中加入的各成分，并且具有稳定性好的特点，既能有效表征王老吉凉茶的质量，又有利于监控产品的质量。
并且，该构建方法还确定了供试品溶液的制备以及整个构建过程中的最优参数，能有效表征王老吉凉茶的质量，有利于监控产品的质量。
本发明的一种王老吉凉茶指纹图谱的检测方法，能够全面的表征王老吉凉茶中加入的各成分，并且具有稳定性好的特点，既能有效表征王老吉凉茶的质量，又有利于监控产品的质量。该检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
附图说明
图1为实施例1中10批样品的液相色谱图；
图2为实施例1中对照品液相色谱图；
图3为实施例1中10批样品匹配后的指纹图谱；
图4为实施例1中生成的对照图谱；
图5为实施例2中10批样品匹配后的指纹图谱；
图6为实施例3中阴性样本图谱与对照图谱示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例为王老吉凉茶指纹图谱的构建方法。
一、仪器与设备
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。
二、材料与试剂
王老吉凉茶样品(由广州王老吉药业股份有限公司提供)；
对照品：丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷；
甲醇(色谱纯，美国Honeywell公司)；
甲酸(分析纯，广州化学试剂厂)；
乙腈(色谱纯，美国Honeywell公司)。
三、方法
1、对照品溶液的配制。
分别取丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷各5mg，精密称定，分别用少量甲醇溶解于5ml量瓶中，并定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液(包括丹参素对照品溶液、甘草酸单铵盐对照品溶液、甘草苷对照品溶液、原儿茶酸对照品溶液、15-去甲基鸡蛋花苷对照品溶液、海芒果酸B对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、迷迭香酸对照品溶液、迷迭香酸苷对照品溶液)。
2、供试品溶液的制备。
取王老吉凉茶200ml，水浴浓缩至25ml，离心，取上层液过0.45μm微孔滤膜，即得王老吉凉茶供试品溶液。
3、指纹图谱建立。
(1)、测定。
色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪。
色谱柱：Phenomenex Luna C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，即以碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱。
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液(A)—乙腈(B)梯度洗脱，具体梯度洗脱条件如下表所示。
表1.流动相的梯度洗脱条件
| 时间min | 0 | 7 | 20 | 30 | 35 | 40 | 55 | 65 | 70 |
| B％ | 5 | 5 | 10 | 11 | 19 | 20 | 30 | 46 | 52 |
| A％ | 95 | 95 | 90 | 89 | 81 | 80 | 70 | 54 | 48 |
流速：1.0ml/min；
柱温：20℃；
检测波长：235nm；
测定法：分别取对照品溶液、供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定各色谱图。分别得到如图1所示的10个不同批次样品的液相色谱图，以及如图2所示的对照品液相色谱图，图中横坐标为时间(min)，纵坐标为检测器响应值。
(2)、分析。
A、10批样品共有峰的标定。
按照上述方法，选用10个不同批次的王老吉凉茶(由广州王老吉药业股份有限公司提供)，进行测定，得到如图1所示的10个不同批次样品的液相色谱图，经过与图2所示的对照品液相色谱图匹配后，得到具有共有特征峰的王老吉凉茶指纹图谱，如图3所示。
并以ChempatternTM谱蕴化学指纹图谱系统解决方案软件(北京科迈恩科技有限公司)对10批样品的原始HPLC图谱(指纹图谱)进行分析，其中，指纹图谱中的共有特征峰为9个，5号峰(海芒果酸B)出峰时间合适，峰面积和分离度高，以5号峰为参照峰，以其相对保留时间、相对峰面积为1.0，计算10批样品(S1-S10)中指纹图谱共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果如下表所示。
表2.共有特征峰的相对保留时间
| 样品号 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5(S) | P6 | P7 | P8 | P9 |
| S1 | 0.42 | 0.50 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.25 | 1.42 | 1.80 |
| S2 | 0.42 | 0.49 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.26 | 1.42 | 1.81 |
| S3 | 0.42 | 0.50 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.25 | 1.42 | 1.80 |
| S4 | 0.42 | 0.50 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.25 | 1.42 | 1.80 |
| S5 | 0.42 | 0.50 | 0.61 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.25 | 1.42 | 1.80 |
| S6 | 0.42 | 0.49 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.26 | 1.42 | 1.81 |
| S7 | 0.42 | 0.50 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.25 | 1.42 | 1.80 |
| S8 | 0.42 | 0.50 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.25 | 1.42 | 1.80 |
| S9 | 0.42 | 0.49 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.26 | 1.42 | 1.81 |
| S10 | 0.42 | 0.49 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.26 | 1.42 | 1.81 |
| 分离度 | 3.86 | 7.74 | 2.18 | 5.96 | 2.33 | 1.65 | 1.75 | 4.18 | 5.46 |
| 平均值 | 0.42 | 0.50 | 0.60 | 0.96 | 1.00 | 1.20 | 1.25 | 1.42 | 1.80 |
| RSD(％) | 0 | 1.04 | 0.53 | 0 | 0 | 0 | 0.41 | 0 | 0.29 |
表3.共有特征峰的相对峰面积
B、样品指纹图谱分析。
通过对9种对照品图谱(丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷)和供试品溶液图谱分析，可辨认出指纹图谱中共有9个共有特征峰，占总峰面积的53％，其中1号峰为丹参素，2号峰为原儿茶酸，3号峰为15-去甲基鸡蛋花苷，4号峰为咖啡酸，5号峰为海芒果酸B，6号峰为甘草苷，7号峰为迷迭香酸苷，8号峰为迷迭香酸，9号峰为甘草酸单铵盐。
C、10批样品指纹图谱相似度评价。
采用ChempatternTM谱蕴化学指纹图谱系统解决方案软件(北京科迈恩科技有限公司)对10批样品HPLC图谱进行评价，以相对面积平均数为对照，进行相似度计算，并得出10批样品HPLC图谱生成如图4所示的对照图谱，相似度计算结果见下表。
表4.相似度计算结果
对照图谱指上述10批样品HPLC图谱生成的对照图谱，即考察各批次样品与该对照图谱的相似度。从上述结果可以看出，各批样品与对照图谱的相似度均大于0.90，说明各批样品与对照图谱的相似度较高。
实施例2
王老吉凉茶指纹图谱的检测方法。
本实施例利用王老吉凉茶指纹图谱对王老吉凉茶进行检测，具体如下：
一、仪器与设备
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。
二、材料与试剂
另取10批王老吉凉茶样品(由广州王老吉药业股份有限公司提供)，其它材料与试剂同实施例1。
三、方法
1、对照品溶液的配制：同实施例1。
2、供试品溶液的制备：同实施例1。
3、检测。
(1)、色谱条件：同实施例1。
测定：分别进样对照品溶液、供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定各色谱图。
(2)、评价分析。
利用上述检测方法分别对10批王老吉凉茶样品进行检测，记录色谱图(如图5所示)并导入中药色谱相似度评价系统软件(2004A版处理)，与实施例1得到的对照图谱比较，计算相似度，相似度计算结果见下表。
表5.相似度计算结果
从上述结果可以看出，各批样品相似度均大于0.90。表明王老吉凉茶指纹图谱的相似度较高，可以作为王老吉凉茶质量控制和评价指标。
实施例3
本实施例利用王老吉凉茶指纹图谱对王老吉凉茶进行检测，与实施例2基本相同，不同之处在于：
本实施例中的王老吉凉茶样品的制备中，分别不投料布渣叶、甘草、鸡蛋花、金银花、菊花、夏枯草、或仙草，分别制得阴性布渣叶、阴性甘草、阴性鸡蛋花、阴性金银花、阴性菊花、阴性夏枯草、阴性仙草的王老吉凉茶不合格品，再以上述指纹图谱对该王老吉凉茶不合格品进行检测，记录色谱图(如图6所示)并导入中药色谱相似度评价系统软件(2004A版处理)，与实施例1得到的对照图谱比较，计算相似度，结果如下表所示。
表6 各阴性样品与共有模式的相似度
从上述结果可以看出，不合格品的相似度均小于0.9。表明王老吉凉茶指纹图谱可以作为王老吉凉茶质量控制和评价指标。并且，本发明能有效表征王老吉凉茶的质量，有利于监控产品的质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)对照品溶液的配制：
分别精密称取丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷对照品，以甲醇溶解并定容，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密量取王老吉凉茶，浓缩后离心，取上层液过滤膜，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到具有共有特征峰的王老吉凉茶指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱仪的测定条件如下：
色谱柱：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式。
3.根据权利要求2所述的王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱仪的测定条件还包括：
流速：1.0mL/min；
柱温：18-25℃；
检测波长：235nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱方式为：
0min-7min，流动相B的体积百分数为5％；
7min-20min，流动相B的体积百分数由5％变化至10％；
20min-30min，流动相B的体积百分数由10％变化至11％；
30min-35min，流动相B的体积百分数由11％变化至19％；
35min-40min，流动相B的体积百分数由19％变化至20％；
40min-55min，流动相B的体积百分数由20％变化至30％；
55min-65min，流动相B的体积百分数由30％变化至46％；
65min-70min，流动相B的体积百分数由46％变化至52％。
5.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述共有特征峰为丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷的色谱峰。
6.根据权利要求5所述的王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述共有特征峰中，以海芒果酸B的色谱峰为参照峰，设定该海芒果酸B的色谱峰的相对保留时间为1.0、相对峰面积为1.0，构建得到由上述共有特征峰构成的王老吉凉茶指纹图谱。
7.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，按照200ml王老吉凉茶浓缩至25ml的比例进行浓缩。
8.一种王老吉凉茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的配制：
分别精密称取丹参素、甘草酸单铵盐、甘草苷、原儿茶酸、15-去甲基鸡蛋花苷、海芒果酸B、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸苷对照品，以甲醇溶解并定容，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密量取王老吉凉茶，浓缩后离心，取上层液过滤膜，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测。
9.根据权利要求8所述的王老吉凉茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，将步骤(3)检测得到的供试品溶液色谱图与权利要求1-7任一项的构建方法得到的指纹图谱比较，计算相似度，对王老吉凉茶的质量进行评价。
10.根据权利要求8所述的王老吉凉茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱仪的测定条件如下：
色谱柱：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
流动相：体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：
0min-7min，流动相B的体积百分数为5％；
7min-20min，流动相B的体积百分数由5％变化至10％；
20min-30min，流动相B的体积百分数由10％变化至11％；
30min-35min，流动相B的体积百分数由11％变化至19％；
35min-40min，流动相B的体积百分数由19％变化至20％；
40min-55min，流动相B的体积百分数由20％变化至30％；
55min-65min，流动相B的体积百分数由30％变化至46％；
65min-70min，流动相B的体积百分数由46％变化至52％；
流速：1.0mL/min；
柱温：18-25℃；
检测波长：235nm。
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