CN106074627B - 冬虫夏草在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冬虫夏草的药物用途，提供了一种冬虫夏草在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的用途，所述药物包括作为活性成分的冬虫夏草和一种或多种可药用辅料，所述冬虫夏草选自天然冬虫夏草、冬虫夏草发酵菌丝体、以及天然冬虫夏草和冬虫夏草发酵菌丝体的提取物，所述提取物选自水提取物、醇提取物、酯提取物、醚提取物、氯仿提取物中的一种或几种的组合。本发明通过对黄热病毒的抑制实验证实了冬虫夏草所具有的良好抑制作用，从而证实冬虫夏草能够用于预防和/或治疗黄热病毒感染，并具有效果显著、副作用小、见效快等优点。因此冬虫夏草可被用于研制抗黄热病毒引起的疾病的药物，具有巨大的社会效益和研究价值。

Description

冬虫夏草在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的 用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及冬虫夏草的药物用途，尤其涉及其在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的用途。

背景技术

热病病毒(yellow fever virus，YFV)属于黄热病科黄热病毒属的病毒，为RNA病毒，具有嗜内脏性及嗜神经性。黄热病毒能够引起黄热病，该病为急性传染病。黄热病主要经蚊媒传播，临床特征主要为高热、黄疸、蛋白尿和出血，病程大约两周，病死率高达约20-50％。国际上已将黄热病定为检疫传染病，中国也将其定为甲类传染病。该病主要在中南美洲和非洲的热带地区流行，亚洲的热带国家也有分布。黄热病全年均可发生，3-4月份病例较多。上世纪80年代以来，世界卫生组织(WHO)报告非洲、南美洲发生黄热病的地区和病例逐年上升。在1998年和1999年共有11个国家向WHO报告了黄热病病例。在非洲，33个国家的居民受到黄热病的威胁。在美洲10个国家和1个加勒比岛域，黄热病呈地方性流行。2000年，黄热病再次在非洲暴发。该年12月，流行于几内亚的黄热病造成近200人死亡。进入21世纪后，黄热病疫情似乎又有再次盛行的迹象。2005至2007年，马里、几内亚、布基纳法索和科特迪、塞内加尔、苏丹、多哥等地相继报告黄热病病例，引起世界卫生组织高度重视。2007年5月，世界卫生组织近日决定向非洲12个国家提供5800万美元，用于这些国家的黄热病疫苗接种工作，以防止该疾病在非洲大规模传播。

迄今为止，中国尚无病例的报道，但是这并不能使我们放松对该病毒的警惕，因为中国的气候、地理环境复杂，蚊虫种类繁多，具备传播条件，同时随着国际交流的日益频繁，YFV传入中国境内的可能性非常大。因此，我们应该高度重视对黄热病毒的研究，加强对其的科研力度，做好相关知识和药物的储备。

冬虫夏草是一种天然存在的稀有中药材，富含了虫草多糖、虫草素、虫草酸、虫草多肽、麦角甾醇等多种单体活性成分。天然冬虫夏草生长条件苛刻，自然寄生率低，加上人们的滥采，导致天然资源紧缺，价格昂贵。

现代研究证明冬虫夏草以其调节阴阳、肺肾双补之特性，补而不峻、温而不火之优势，广泛应用于免疫、心血管、呼吸、泌尿生殖、消化、神经系统疾病，备受关注。但尚未有文献报导过其具有预防和治疗黄热病毒感染的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冬虫夏草在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的用途。该用途具有效果显著、副作用小、见效快等优点。

进一步地，所述药物包括作为活性成分的冬虫夏草和一种或多种可药用辅料。

进一步地，所述冬虫夏草选自天然冬虫夏草、冬虫夏草发酵菌丝体、以及天然冬虫夏草和冬虫夏草发酵菌丝体的提取物。所述提取物选自水提取物、醇提取物、酯提取物、醚提取物、氯仿提取物中的一种或几种的组合，优选天然冬虫夏草和冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物。

进一步地，所述冬虫草夏发酵菌丝体为冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(Berkeley)Sacc)中蝙蝠蛾拟青霉、中华被毛孢(Hirsutela sinensis)、中华头孢菌、蝙蝠蛾被孢霉和/或中华束丝孢菌采用工业化发酵生产的冬虫夏草菌丝体。

进一步地，所述发酵的培养基选自大米、小米、玉米、小麦、大麦、荞麦、土豆汁、糊精、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、麸皮、蚕蛹粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或几种。

进一步地，所述可药用辅料包括但不限于：填充剂如淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、山梨醇等；粘合剂如纤维素衍生物(甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠)、海藻酸钠、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如水、乙醇、甘油等；崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠、羟丙甲纤维素、交联聚维酮、泡腾崩解剂、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等；注射溶剂如注射用水、植物油、油酸乙酯、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘油、苯甲醇等；缓冲剂如醋酸-醋酸钠、枸橼酸-枸橼酸钠、酒石酸-酒石酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、碳酸氢钠-碳酸钠等；抑菌剂如苯甲醇、羟丙丁酯/甲酯、苯酚、三氯叔丁醇等；局麻剂利多卡因、苯甲醇、三氯叔丁醇等；等渗调节剂如氯化钠、葡萄糖、甘油等；抗氧剂如亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等；助悬剂如明胶、甲基纤维素、果胶等；保护剂乳糖、蔗糖、麦芽糖等；乳化剂如吐温、司盘、泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠、脂肪酸甘油酯；基质如PEG6000、PEG4000、硬脂酸钠、氢化植物油、虫蜡等。另外还包括色素、香味剂、甜味剂、助溶剂、吸收促进剂等。

进一步地，所述药物中冬虫夏草的含量为0.1-99.9％重量百分比，优选为1-95％重量百分比、10-85％重量百分比、15-70％重量百分比、20-60％重量百分比或25-50％重量百分比。

进一步地，所述药物通过肠道或者非肠道途径给药。给药制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、滴丸、混悬剂等。给药途径包括皮下、皮内、动脉内、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、病灶内、颅内注射或输注，或者，口服、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、皮内、粘膜、气管、尿道给药，或者通过吸入气雾或植入蓄积或者针刺方式给药。

进一步地，所述给药制剂可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使冬虫夏草与一种或多种辅料混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明通过对黄热病毒的抑制实验证实了冬虫夏草所具有的良好抑制作用，从而证实冬虫夏草能够用于预防和/或治疗黄热病毒感染，并具有效果显著、副作用小、见效快等优点。因此冬虫夏草可被用于研制抗黄热病毒引起的疾病的药物，具有巨大的社会效益和研究价值。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实施例1冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物的制备

冬虫夏草菌(Cordyceps sinesis)中华被毛孢(Hirsutela sinensis)菌株经液体发酵培养所得菌丝体，用热水浸提、离心过滤、再经减压浓缩、冷冻干燥得到冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物。

实施例2冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物对Vero细胞的毒性实验

Vero细胞是热病病毒的易感细胞，需首先检测冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物对Vero细胞的细胞毒性，为后续对热病病毒的抑制实验提供数据参考。

实验步骤如下：

1：接种Vero细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔5000-8000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积200μL；

2：培养Vero细胞：在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下，培养48小时；

3：加入冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入200μL用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0、6.25、12.5、25、50、100mg·L^-1)的冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物；

4：呈色：培养48小时后，每孔加MTT溶液10μL，在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下继续孵育4小时；吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；

5：测量：在490nm测定吸收值(见表1)。

表1不同浓度的冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物对Vero细胞的毒性

由此可见，即使冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物在100mg·L^-1的高剂量浓度条件下，Vero细胞的存活率仍能达到92.22％，表明其细胞毒性很小。

实施例3冬虫夏草的高浓度水溶液对Vero细胞的毒性实验

按照实施例2的实验方法，检测冬虫夏草的高浓度水溶液对Vero细胞的细胞毒性。

其中，步骤2向各个孔中加入200μL用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成100mg·L^-1的冬虫夏草的高浓度水溶液(冬虫夏草经超微粉碎后制得冬虫夏草极细粉后使用)；对照孔中加200μL不含冬虫夏草的10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(见表2)。

表2冬虫夏草的高浓度水溶液对Vero细胞的毒性

由此可见，即使冬虫夏草水溶液在100mg·L^-1的高剂量浓度条件下，Vero细胞的存活率仍能达到91.49％，表明其细胞毒性很小。

实施例4冬虫夏草对黄热病毒的抑制实验

以不同浓度的冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物和不同浓度的冬虫夏草水溶液分别作用于已经感染了黄热病毒的Vero细胞，来获得冬虫夏草对病毒的抑制效率。所使用的浓度均在使Vero细胞具有90％以上存活率的范围内，从而排除冬虫夏草浓度过高而对实验数据的影响。

实验步骤如下：

选择Vero细胞为培养黄热病毒的细胞，MOI为0.1。

在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，20小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为90％)。吸出培养基，接入病毒样品200μL，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0、6.25、12.5、25、50、100mg·L^-1)的冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物或冬虫夏草水溶液，于37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养48小时，收集各个孔中的上清用于病毒噬斑实验。

病毒噬斑实验：在24孔板中接入Vero细胞，20小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为90％)，吸弃各孔中的培养基，接入用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基10×系列稀释的病毒样品200μL，37℃吸附2小时。吸附完成后弃去各孔的上清液，用10％(v/v)FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的37℃预热的半固定培养基(A成分：3％(v/v)FBS，2×MEM培养基，青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL、0.1mg/mL；B成分：1％(w/v)的琼脂糖。A成分与B成分体积比为1:1)，于37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养48小时。待噬斑形成后用结晶紫染色(2％(w/v)结晶紫溶于10％(v/v)甲醛)，2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml，PFU：噬斑形成单位)。PFU＝病毒稀释度×P/V，(P：空蚀斑数目；V：接种量)。结果见表3。

表3不同浓度的冬虫夏草对黄热病毒滴度降低及抑制作用

由此可见，在100mg·L^-1的浓度下，冬虫夏草发酵菌丝体的水提取物对黄热病毒的抑制率为86.34％，冬虫夏草水溶液对黄热病毒的抑制率为83.57％。表明冬虫夏草能够有效地抑制黄热病毒的增殖，可进一步开发为预防和/或治疗黄热病毒感染引起的疾病的药物，具有广泛的应用前景。

实施例5冬虫夏草片剂

称取冬虫夏草粉5g、淀粉60g、羟丙甲纤维素10g、泊洛沙姆8g，分别过100目筛，混匀，加入0.5％PVP乙醇溶液制成软材，用14目筛制粒后，置于60℃烘箱中干燥，用12目筛整粒，加入硬脂酸镁2g混匀后，压片。

实施例6冬虫夏草软胶囊

将冬虫夏草发酵菌丝体干燥粉碎后，称取5g与食用玉米油50g混合，充分搅匀制得软胶囊内容物；称取明胶、甘油和水各适量(质量比为明胶∶甘油∶水＝1∶0.5∶1)制备囊材胶液；采用旋转模压法，将内容物和囊材胶液装入自动旋转制囊机中，压制得软胶囊，适量液状石蜡作为润滑剂。

实施例7冬虫夏草混悬液

取冬虫夏草干燥细粉5g，用0.5％羧甲基纤维素钠溶液作为溶剂配制成浓度为20％混悬液。

实施例8冬虫夏草滴丸

称取冬虫夏草发酵菌丝体干燥粉末40g，加入PEG4000 1Kg作为基质，适量液体石蜡为冷却剂；药液温度50℃，滴速为每分钟10滴，滴距4.0cm，冷却柱长25cm，滴口内径2.0cm，冷却剂温度0℃(冰水浴)。

最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.冬虫夏草在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的用途，其特征在于：所述药物包括作为活性成分的冬虫夏草和一种或多种可药用辅料；

所述冬虫夏草选自天然冬虫夏草、冬虫夏草发酵菌丝体，以及天然冬虫夏草和冬虫夏草发酵菌丝体的提取物；

所述提取物选自水提取物、醇提取物、酯提取物、醚提取物、氯仿提取物中的一种或几种的组合；

所述冬虫夏草发酵菌丝体为冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(Berkeley)Sacc)中蝙蝠蛾拟青霉、中华被毛孢(Hirsutela sinensis)、中华头孢菌、蝙蝠蛾被孢霉和/或中华束丝孢菌发酵生产的冬虫夏草菌丝体；

所述发酵的培养基选自大米、小米、玉米、小麦、大麦、荞麦、土豆汁、糊精、葡糖糖、蛋白胨、酵母膏、麸皮、蚕蛹粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或多种。

2.根据权利1所述的用途，其特征在于：所述药物的剂型选自由片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、滴丸、混悬剂组成的组。