CN116850204A - 一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用 - Google Patents

一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用。其优点在于，本发明的抗猪德尔塔冠状病毒的药物通过降低细胞中MDA含量，提高T‑AOC水平和抗氧化酶活性，从而缓解氧化应激对细胞造成的损伤；还下调GLUT1含量和mRNA表达，同时下调HK2、LDHA、PDK、G6PD、TALDO、TKT的活性和mRNA表达，改善细胞内糖代谢紊乱现象；还下调凋亡基因caspase‑3、Bax mRNA的表达，上调抗凋亡基因Bcl‑2mRNA的表达，缓解由PDCoV导致的细胞凋亡。即本发明的药物能通过恢复细胞内氧化抗氧化平衡、改善糖代谢紊乱以及抑制促凋亡基因的表达来保护细胞。

Description

一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，PDCoV)是一种猪肠道冠状病毒，主要引起猪的呕吐、水样腹泻、脱水甚至死亡，且PDCoV大多与猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)等肠道冠状病毒存在混合感染情况，给临床诊断和防控带来许多困难。到目前为止，PDCoV已经在美国、加拿大及亚洲多个国家被检出，给当地养猪业造成严重影响。并且，PDCoV还能在宿主间跨越发展成为人畜共患病，从而威胁到公共卫生安全。
许多研究表明，病毒感染能够导致细胞自由基产生过量，抗氧化酶的活性受到抑制，氧化还原平衡遭到破坏，同时，病毒感染会打破机体的糖代谢稳态，还会引起细胞凋亡，并且氧化应激、糖代谢及细胞凋亡与病毒复制也存在相互影响。但目前PDCoV在上述方面研究还较少，只了解到PDCoV在体内外都能诱导细胞发生凋亡，有关PDCoV引发细胞氧化应激的研究还不多，也不清楚PDCoV是否能引起宿主细胞糖代谢变化。
硒是人和动物不可或缺的一类微量元素，具有重要且不可替代的生理功能。硒对免疫系统起调节作用，合理摄入可以提升宿主对病毒的抵抗力，减轻多种病毒感染造成的机体氧化应激损伤，并且硒能够参与调控机体糖代谢及细胞凋亡过程。Nano-Se(纳米硒)是主要以无机硒源为原料，采用化学、物理和生物方法制备得到的具有纳米尺度的单质硒。它在胃肠道环境拥有更高地稳定性，且能够在特定位置释放或作为潜在的药物载体。Nano-Se作为一种很有前途的新型硒制剂，已经在抗病毒、抗氧化防御、代谢紊乱疾病和免疫调节等多个领域发挥作用。
目前，预防PDCoV感染的疫苗接种是首选，但针对PDCoV的商品化疫苗和有效药物缺失。因此，目前急需寻找出抗PDCoV感染的药物。本发明针对硒具有抗病毒、抗氧化、调节糖代谢和细胞凋亡等多种作用，将Nano-Se作用于感染PDCoV的猪肾细胞，探究Nano-Se的抗病毒效果以及Nano-Se对细胞氧化应激、糖代谢和凋亡的作用，解决临床上PDCoV感染无治疗药物及治疗后效果不理想的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用，以解决相关技术中存在的治疗效果不理想等问题。
具体如下，本发明公开了一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用，活性成分包括纳米硒。
根据本发明应用技术方案中的一种技术方案，至少具备如下有益效果：
本发明的抗猪德尔塔冠状病毒的药物通过降低细胞中MDA含量，提高T-AOC水平和抗氧化酶活性，从而缓解氧化应激对细胞造成的损伤；还下调GLUT1含量和mRNA表达，同时下调HK2、LDHA、PDK、G6PD、TALDO、TKT的活性和mRNA表达，改善细胞内糖代谢紊乱现象；还下调凋亡基因caspase-3、Bax mRNA的表达，上调抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表达，缓解由PDCoV导致的细胞凋亡。即本发明的药物能通过恢复细胞内氧化抗氧化平衡、改善糖代谢紊乱以及抑制促凋亡基因的表达来保护细胞；即纳米硒具有拮抗PDCoV所致的损伤，进而防控PDCoV感染的功能。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为0.1μg/mL～1000μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为0.1μg/mL～500μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为0.1μg/mL～100μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为0.1μg/mL～50μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为0.1μg/mL～25μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为1μg/mL～25μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为5μg/mL～25μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为10μg/mL～25μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为10μg/mL～15μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒为细胞抗氧化剂。
根据本发明的一些实施方式，所述抗氧化剂具有降低细胞中MDA含量、提高T-AOC水平和抗氧化酶活性的功能。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒具有下调GLUT1含量和mRNA表达的功能。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒为糖代谢酶上调剂。
根据本发明的一些实施方式，所述糖代谢酶包括HK2、LDHA、PDK、G6PD、TALDO和TKT中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒为促凋亡基因的表达抑制剂。
根据本发明的一些实施方式，所述促凋亡基因包括caspase-3和Bax mRNA中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述纳米硒为抗凋亡基因的表达上调剂。
根据本发明的一些实施方式，所述抗凋亡基因包括Bcl-2mRNA。
根据本发明的一些实施方式，所述抗猪德尔塔冠状病毒的药物的制备原料还包括药用载体。
根据本发明的一些实施方式，所述药用载体为药学领域常规的药物载体。
根据本发明的一些实施方式，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述赋形剂包括水、乳糖、玉米淀粉、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素和二氧化硅中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述填充剂包括淀粉和蔗糖中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述黏合剂包括聚乙烯醇、纤维素衍生物、藻酸盐、阿拉伯胶、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述纤维素衍生物包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟基丙基纤维素和羟基丙基甲基纤维素中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述湿润剂包括甘油。
根据本发明的一些实施方式，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述吸收促进剂包括季铵化合物。
根据本发明的一些实施方式，所述表面活性剂包括十六烷醇。
根据本发明的一些实施方式，所述吸附载体包括高岭土和皂黏土中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，本发明所述药理学上容许的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属离子、碱土金属离子和碱性氨基酸形成的盐。
根据本发明的一些实施方式，所述无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸和单宁酸中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱金属离子包括锂离子、钠离子和钾离子中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱土金属离子包括钙离子和镁离子中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为本领域常规的各种剂型。
根据本发明的一些实施方式，所述抗猪德尔塔冠状病毒的药物可经由领域其他化学药和生物药形式实现功能。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为固体、半固体或液体的形式。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为水溶液、非水溶液或混悬液。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、干混悬剂、滴丸剂、干浸膏剂、注射剂或输注剂。
根据本发明的一些实施方式，所述片剂或所述颗粒剂上包覆糖衣、明胶衣、以及其它的必要外衣。
根据本发明的一些实施方式，制备注射剂时，根据需要向主药中添加包括pH调节剂、缓冲剂、悬助剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述注射剂按照常规方法制成静脉、皮下或肌肉内注射剂。
根据本发明的一些实施方式，所述注射剂按照常规方法制成冷冻干燥物。
根据本发明的一些实施方式，所述悬助剂包括甲基纤维素、吐温80、羟基乙基纤维素、阿拉伯胶、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸盐中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述增溶剂包括聚氧化乙烯氢化蓖麻油、吐温80、烟酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸盐、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述稳定剂包括亚硫酸钠和偏亚硫酸钠中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚和氯甲酚中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述药物制剂的制备方法均可采用本领域技术人员制备该种剂型常规使用制备方法制得。
根据本发明的一些实施方式，所述药物制剂中每一制剂单位中含有植物精油组合物的含量为0.001mg～50mg。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的给药方式可以为本领域常规的给药方式，包括但不限于注射给药或口服给药。
根据本发明的一些实施方式，所述药物可采用预防给药、共同给药或治疗给药中的至少一种。
根据本发明的一些实施反射，所述预防给药为作为病毒预防剂。
根据本发明的一些实施方式，所述抗猪德尔塔冠状病毒的药物包括各种可接受的剂型。
根据本发明的一些实施方式，所述注射给药可以为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
根据本发明的一些实施方式，所述抗猪德尔塔冠状病毒的药物的给药量标准为纳米硒0.1mg/天～1000mg/天。
本文所述的术语“给药剂量”为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。可以随被治疗的具体疾病以及其它因素而定，其它因素包括年龄、体重、健康状况、症状的严重程度、给药途径、治疗的频率和在治疗期间是否伴随其它的药物。
本文所述的术语“抗猪德尔塔冠状病毒的药物”是指减轻猪德尔塔冠状病毒及其导致并发症的程度，或者治愈猪德尔塔冠状病毒及导致并发症使之正常化，或者减缓猪德尔塔冠状病毒复制及其并发症的进程。
附图说明
图1是Nano-Se对LLC-PK1细胞活性的影响
图2是不同浓度Nano-Se在LLC-PK1内对PDCoV复制量的影响。
图3是Nano-Se在体外抗PDCoV时间点。
图4是Nano-Se体外抗PDCoV作用方式(A：Nano-Se预先处理后加病毒B：Nano-Se与病毒同时作用C：病毒预先处理后加Nano-Se)。
图5是Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞MDA含量的影响。
图6是Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞T-AOC水平的影响。
图7是Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞SOD活性的影响。
图8是Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞GST活性的影响。
图9是Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞GPx活性的影响。
图10Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞TrxR活性的影响。
图11Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞葡萄糖消耗(a)和乳酸分泌(b)的影响。
图12Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞GLUT1含量(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图13Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞HK2活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图14Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞LDHA活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图15Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞PKM活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图16Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞PFK活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图17Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞PDH活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图18Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞PDK活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图19Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞G6PD活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图20Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞TALDO活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图21Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞TKT活性(a)和mRNA表达水平(b)的影响。
图22Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞凋亡相关基因caspase-3(A)、Bax(B)和Bcl-2(C)表达水平的影响。
附图标记：
*表示各组与control组进行比较的结果；
#表示virus组与NanoSe+virus组比较的结果(n＝3)；
“*”和“#”表示P＜0.05；
“**”和“##”表示P＜0.01(n＝3)。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行描述和说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。基于本申请提供的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本申请应用于其他类似情景。此外，还可以理解的是，虽然这种开发过程中所作出的努力可能是复杂并且冗长的，然而对于与本申请公开的内容相关的本领域的普通技术人员而言，在本申请揭露的技术内容的基础上进行的一些设计，制造或者生产等变更只是常规的技术手段，不应当理解为本申请公开的内容不充分。
在本申请中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域普通技术人员显式地和隐式地理解的是，本申请所描述的实施例在不冲突的情况下，可以与其它实施例相结合。
除非另作定义，本申请所涉及的技术术语或者科学术语应当为本申请所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本申请所涉及的“一”、“一个”、“一种”、“该”等类似词语并不表示数量限制，可表示单数或复数。本申请所涉及的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含；例如包含了一系列步骤或单元(单元)的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可以还包括没有列出的步骤或单元，或可以还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。本申请所涉及的“多个”/“若干”是指两个或两个以上。“和/或”描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“A和/或B”可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。本申请所涉及的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序。
本发明实施方式中以猪肾细胞(LLC-PK1)为模型，探究Nano-Se对PDCoV感染的LLC-PK1细胞的保护效果。
实施例1
本实施例确定Nano-Se最适浓度：
本实施例中使用粒径为20nm～50nm，含量为2.8mg/mL的Nano-Se溶液(Nano-Se购自烟台佳隆纳米产业有限公司，批号为202107027)，精密量取适量Nano-Se置于无血清培养基中配制成设置浓度为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL和30μg/mL的Nano-Se(纳米硒)溶液进行实验。
(1)CCK8法测定纳米硒对LLC-PK1细胞活性的影响
在96孔细胞培养板中每孔分别加入100μL细胞悬液(细胞密度为1×104个/孔)过夜培养至细胞贴壁。同时设置空白孔(只含无血清培养基)、对照孔(含细胞和无血清培养基)和试验孔(分别含细胞和由无血清培养基配制的终浓度为5、10、15、20、25和30μg/mL的Nano-Se)，每个分组设3个重复，37℃，5％ CO2恒温培养箱中培养36h后，弃去旧培养液并清洗2次，每孔加入10μL CCK8试剂避光孵育2h，用酶标仪检测各孔在450nm处的吸光度(OD值)，计算细胞的相对存活率。从图1中得知，Nano-Se对LLC-PK1细胞的最大无毒浓度为25μg/mL。
(2)不同浓度纳米硒在体外对PDCoV的复制量测定
根据Nano-Se对LLC-PK1细胞的最大无毒浓度(TC0)，分别设置浓度为5、10、15、20、25μg/mL的Nano-Se进行试验。首先将LLC-PK1细胞接种到96孔板中，生长24h至100％融合。使用10倍稀释的PDCoV感染细胞，37℃孵育2h后，PBS洗涤3次，再继续孵育72h，根据得到的结果计算出PDCoV在LLC-PK1细胞中的半数组织感染量(TCID50)为(10-4.15/0.1mL)。随后LLC-PK1细胞按5×105个/孔的密度加入6孔板后，过夜培养至细胞贴壁。弃去旧培养液，用D-Hanks清洗2遍，将100TCID50的用量(10-2.15/0.1mL)加入LLCPK1细胞中，37℃，5％CO2恒温培养箱孵育1.5h，弃去病毒液，用D-Hanks清洗2遍，然后加入不同浓度Nano-Se处理，36h后收样，提取细胞总RNA，qPCR检测细胞内的PDCoV复制量。
从图2、表1中得知，15μg/mL的Nano-Se对PDCoV的复制抑制效果最好，因此确定15μg/mL的Nano-Se为最适抗病毒浓度。
表1不同浓度Nano-Se在LLC-PK1内对PDCoV复制量的影响
实施例2
本实施例确定Nano-Se最佳作用时间：
根据实施例1的结果选择15μg/mL的Nano-Se作用于感染PDCoV的LLCPK1细胞，同时设置病毒对照组，分别于12h、24h和36h收样，提取细胞总RNA，qPCR检测细胞内PDCoV复制量，观察Nano-Se在不同时间点的抗病毒效果。
本实施例的测试结果见图3、表2，Nano-Se作用36h后Nano-Se+virus组细胞内病毒复制量显著下降，且抗PDCoV复制效果最好，因此36h为最佳作用时间。
表2三种Nano-Se在体外抗PDCoV时间点对对PDCoV复制量的影响
实施例3
本实施例确定Nano-Se最佳给药方式：
本实施例设置预防给药组(Nano-Se预先处理后加病毒)、共同给药组(Nano-Se与病毒同时作用)、治疗给药组(病毒预先处理后加Nano-Se)，同时设置病毒组和Nano-Se组，每组设置三个重复。
(1)Nano-Se预先处理后加病毒(预防给药)：LLC-PK1细胞按5×105个/孔的密度加入6孔板后，在37℃，5％ CO2恒温培养箱中过夜培养至细胞贴壁。弃去旧培养液，D-Hanks清洗2遍，将最佳浓度的Nano-Se加入到细胞中，37℃，5％CO2恒温培养箱孵育1.5h后，弃去液体，并清洗2遍。再将100TCID50 PDCoV加入细胞中,37℃，5％CO2恒温培养箱孵育1.5h，弃去病毒液，清洗2遍。最后加入无血清培养基在37℃，5％ CO2恒温培养36h后进行检测。
(2)Nano-Se与病毒同时作用(共同给药)：LLC-PK1细胞按5×105个/孔密度加入6孔板后，过夜培养至细胞贴壁。弃去旧培养液，D-Hanks清洗2遍。用Nano-Se溶液将PDCoV病毒液稀释至100TCID50，同时使Nano-Se的终浓度为最佳抗病毒浓度。Nano-Se和PDCoV混合液置于37℃，5％CO2恒温培养箱作用1.5h后，将混合液一起加入到细胞中，37℃，5％ CO2恒温培养箱孵育1.5h，弃去混合液，用D-Hanks清洗2遍。最后加入无血清培养基在37℃，5％ CO2恒温培养36h后进行检测。
(3)病毒预先处理后加Nano-Se(治疗给药)：LLC-PK1细胞按5×105个/孔密度加入6孔板后，过夜培养至细胞贴壁。弃去旧培养液，D-Hanks清洗2遍。将100TCID50 PDCoV加入细胞中，37℃，5％CO2恒温培养箱孵育1.5h，弃去病毒液，用D-Hanks清洗2遍，加入由无血清培养基配制的最佳抗病毒浓度Nano-Se，在37℃，5％CO2恒温培养36h后进行检测。
本实施例中测试结果如图4、表3所示，从图中可以看出，预防给药组显著抑制PDCoV的体外复制且效果最好，因此预防给药为最佳给药方式。
表3三种Nano-Se体外抗PDCoV作用方式对PDCoV复制量的影响
实施例4
本实施例为Nano-Se对PDCoV体外抑制测试。
本实施例中设置只加无血清培养基的对照组(control)、只加含Nano-Se无血清培养基的纳米硒组(Nano-Se，浓度为15μg/mL)、PDCoV感染后加无血清培养基的病毒组(virus，10-4.15/0.1mL)、PDCoV感染后加入含Nano-Se无血清培养基的纳米硒+病毒组(Nano-Se(15μg/mL)+virus(10-4.15/0.1mL))，分组各设置三个重复。
(1)MDA、T-AOC、SOD、GST、GPx、TrxR水平检测
将细胞悬液接种于6孔板中(5×105个/孔，2mL/孔)，体积分数5％CO2，37℃的恒温培养箱中培养36h后，按1000r/min离心4min，弃上清收集细胞沉淀，按照试剂盒要求检测MDA、T-AOC、SOD、GST、GPx、TrxR水平。
结果见图5-图10、表5，PDCoV可显著增加LLC-PK1细胞MDA含量，显著降低T-AOC水平，SOD、GST、GPx和TrxR活性。
表4Nano-Se对PDCoV感染的LLC-PK1细胞氧化应激(MAD、T-AOC、SOD、GST、GPx、TrxR)的影响
(2)葡萄糖、乳酸含量检测
将细胞悬液接种于6孔板中(5×105个/孔，2mL/孔)，体积分数为5％CO2、37℃的恒温培养箱中培养36h后收样，按照试剂盒要求检测葡萄糖、乳酸含量。
结果见图11、表5，PDCoV感染使LLC-PK1细胞培养上清中葡萄糖的消耗和乳酸分泌增加。
表5Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞葡萄糖消耗和乳酸分泌的影响
(3)GLUT1、HK2、LHDA、PKM、PFK、PDH、PDK、G6PD、TALDO、TKT检测
将细胞悬液接种于6孔板中(5×105个/孔，2mL/孔)，体积分数为5％CO2、37℃的恒温培养箱中培养36h后收样，按照试剂盒要求检测细胞内的GLUT1、HK2、LHDA、PKM、PFK、PDH、PDK、G6PD、TALDO、TKT活性。同时，提取细胞总RNA，qPCR检测细胞内的GLUT1、HK2、LHDA、PKM、PFK、PDH、PDK、G6PD、TALDO、TKT基因表达水平。
结果见图12-图21、表6-表7，细胞内GLUT1及糖代谢关键酶HK2、LDHA、PDK、G6PD、TALDO、TKT的活性和mRNA表达增加，PDH活性和mRNA表达减少，PKM、PFK活性和mRNA表达量无明显差异。
表6Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞糖代谢(GLUT1、HK2、LHDA、PKM、PFK、PDK、PDH、G6PD、TALDO、TKT)的影响
表7Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞糖代谢相关指标基因表达水平(GLUT1、HK2、LHDA、PKM、PFK、PDK、PDH、G6PD、TALDO、TKT)的影响
(4)caspase-3、Bax、Bcl-2mRNA水平检测
将细胞悬液接种于6孔板中(5×105个/孔，2mL/孔)，5％CO2、37℃的恒温培养箱中培养36h后收样，提取细胞总RNA，qPCR检测caspase-3、Bax、Bcl-2mRNA基因表达水平。
结果见图22、表8，PDCoV感染使LLC-PK1细胞中的凋亡相关基因caspase-3、BaxmRNA水平上调并使Bcl-2mRNA表达下调。
表8Nano-Se对感染PDCoV的LLC-PK1细胞凋亡相关基因caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平的影响
实施例5
本实施例按100TCID50的用量(10-2.15/0.1mL)感染LLC-PK1细胞，加入15μg/mL的Nano-Se处理，36h后收样，弃上清收集细胞沉淀检测细胞抗氧化功能。
结果显示，15μg/mL的Nano-Se作用于PDCoV感染的LLC-PK1细胞后能够通过降低细胞中MDA含量，提高T-AOC水平和抗氧化酶活性，从而缓解氧化应激对细胞造成的损伤。
实施例6
本实施例按100TCID50的用量(10-2.15/0.1mL)感染LLC-PK1细胞，加入15μg/mL的Nano-Se处理，36h后收样，收集上清检测细胞内GLUT1及糖代谢关键酶含量，提取细胞总RNA检测细胞内葡萄糖转运蛋白GLUT1及糖代谢关键酶表达水平。
结果显示，15μg/mL的Nano-Se作用于感染PDCoV的细胞后可以下调GLUT1含量和mRNA表达，同时下调HK2、LDHA、PDK、G6PD、TALDO、TKT的活性和mRNA表达，改善细胞内糖代谢紊乱现象。
实施例7
本实施例按100TCID50的用量(10-2.15/0.1mL)感染LLC-PK1细胞，加入15μg/mL的Nano-Se处理，36h后收样，提取细胞总RNA检测细胞凋亡基因表达水平。结果显示，15μg/mL的Nano-Se作用于感染PDCoV的细胞后可下调凋亡基因caspase-3、Bax mRNA的表达，上调抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表达，缓解由PDCoV导致的细胞凋亡。
Nano-Se(15μg/mL)作用于PDCoV感染的LLC-PK1细胞后，能通过恢复细胞内氧化抗氧化平衡、改善糖代谢紊乱以及抑制促凋亡基因的表达来保护细胞。
本发明的优点在于，本发明的抗猪德尔塔冠状病毒的药物通过降低细胞中MDA含量，提高T-AOC水平和抗氧化酶活性，从而缓解氧化应激对细胞造成的损伤；还下调GLUT1含量和mRNA表达，同时下调HK2、LDHA、PDK、G6PD、TALDO、TKT的活性和mRNA表达，改善细胞内糖代谢紊乱现象；还下调凋亡基因caspase-3、Bax mRNA的表达，上调抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表达，缓解由PDCoV导致的细胞凋亡。即本发明的药物能通过恢复细胞内氧化抗氧化平衡、改善糖代谢紊乱以及抑制促凋亡基因的表达来保护细胞。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种纳米硒在制备抗猪德尔塔冠状病毒的药物中的应用，其特征在于，活性成分包括纳米硒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米硒在抗猪德尔塔冠状病毒的药物的浓度为0.1μg/mL～1000μg/mL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米硒为细胞抗氧化剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗氧化剂具有降低细胞中MDA含量、提高T-AOC水平和抗氧化酶活性的功能。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纳米硒具有下调GLUT1含量和mRNA表达的功能。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米硒为糖代谢酶上调剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述糖代谢酶包括HK2、LDHA、PDK、G6PD、TALDO和TKT中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米硒为促凋亡基因的表达抑制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促凋亡基因包括caspase-3和BaxmRNA中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米硒为抗凋亡基因的表达上调剂；优选地，所述抗凋亡基因包括Bcl-2mRNA。
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