CN106038713B - 睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及睡莲花提取物技术领域，是一种睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用；本发明睡莲花总黄酮提取物所含黄酮含量的重量百分比在50%至80%，isostrictiniin含量的重量百分比在1.2%至3.0%，烟花苷含量的重量百分比在9.0%至16.0%，紫云英苷含量的重量百分比在4.5%至8.0%。本发明提供了对睡莲花总黄酮提取物进行分离纯化的方法，采用大孔树脂和聚酰胺树脂联用的方法从睡莲花中提取黄酮类成分，本发明具有成本低、无污染、易于工业化生产的优点，同时本发明睡莲花总黄酮提取物具有较好的抗肝炎作用，且高效、低毒，可应用于肝损伤的防治。

Description

睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及睡莲花提取物技术领域，是一种睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用。
背景技术
由病毒、酒精、药物等多种因素引起的肝损伤是临床上的常见疾病，严重或持续的肝损伤可导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌等疾病，防治肝损伤是临床肝病治疗的重要任务，近几十年来从中药民族药以及天然药物中寻找具有防治肝损伤的活性部位活性成分已成为肝病治疗药物研发的热点领域。睡莲花为睡莲属植物雪白睡莲Nymphaea candidaPresl的干燥花蕾，具有清热解毒、镇静安神之功效，用于感冒发热、头痛咳嗽、心悸不安、咽痛等疾病的治疗，收载于《中华人民共和国药品标准维吾尔药分册》，是维吾尔医治疗炎症性和病毒性疾病的首选药物之一。睡莲花提取物具有抗菌、抗炎、抗氧化和神经保护等多种药理作用。黄酮类化合物是睡莲花所含的主要特征性成分，也是睡莲花发挥药效的主要物质基础。金晓红等报道了睡莲花总黄酮的超声提取工艺，但对其分离纯化工艺却至今未见有文献报道。
发明内容
本发明提供了一种睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和在制备防治肝损伤药物中的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决睡莲花分离纯化工艺空白的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种睡莲花总黄酮提取物，所含黄酮含量的重量百分比在50％至80％，isostrictiniin含量的重量百分比在1.2％至3.0％，烟花苷含量的重量百分比在9.0％至16.0％，紫云英苷含量的重量百分比在4.5％至8.0％。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述睡莲花总黄酮提取物按下述方法得到：第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分比为30％的乙醇和体积百分比为50％至70％的乙醇洗脱，收集体积百分比为50％至70％乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。
上述第一步中，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为0.5h至3h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为30％至80％的乙醇水溶液。
上述睡莲花为雪白睡莲Nymphaea candida Presl的干燥花蕾。
上述第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2后，得到一次浸膏。
上述第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液；或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
上述第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
上述大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种睡莲花总黄酮提取物的制备方法，按下述步骤进行：第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分比为30％的乙醇和体积百分比为50％至70％的乙醇洗脱，收集体积百分比为50％至70％乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为0.5h至3h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为30％至80％的乙醇水溶液。
上述睡莲花为雪白睡莲Nymphaea candida Presl的干燥花蕾。
上述第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2后，得到一次浸膏。
上述第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液；或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
上述第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
上述大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种睡莲花总黄酮提取物在制备防治肝损伤药物中的应用。
本发明提供了对睡莲花总黄酮提取物进行分离纯化的方法，采用大孔树脂和聚酰胺树脂联用的方法从睡莲花中提取黄酮类成分，本发明具有成本低、无污染、易于工业化生产的优点，同时本发明睡莲花总黄酮提取物具有较好的抗肝炎作用，且高效、低毒，可应用于肝损伤的防治。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1，该睡莲花总黄酮提取物，所含黄酮含量的重量百分比在50％至80％，isostrictiniin含量的重量百分比在1.2％至3.0％，烟花苷含量的重量百分比在9.0％至16.0％，紫云英苷含量的重量百分比在4.5％至8.0％。
实施例2，该睡莲花总黄酮提取物，所含黄酮含量的重量百分比在50％或80％，isostrictiniin含量的重量百分比在1.2％或3.0％，烟花苷含量的重量百分比在9.0％或16.0％，紫云英苷含量的重量百分比在4.5％或8.0％。
实施例3，该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分比为30％的乙醇和体积百分比为50％至70％的乙醇洗脱，收集体积百分比为50％至70％乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。
实施例4，作为上述实施例的优化，第一步中，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为0.5h至3h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为30％至80％的乙醇水溶液。
实施例5，作为上述实施例的优化，睡莲花为雪白睡莲Nymphaea candida Presl的干燥花蕾。
实施例6，作为上述实施例的优化，第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2后，得到一次浸膏。
实施例7，作为上述实施例的优化，第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液；或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的上样量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
实施例8，作为上述实施例的优化，第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
实施例9，大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
实施例10，该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，称取睡莲花10.0kg，置于提取罐中，在睡莲花中加入乙醇水溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的8倍，每次提取时间为1h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为70％的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10后，得到一次浸膏；第二步，一次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到第一稀释液，第一稀释液对D101型大孔树脂柱进行吸附，吸附后用去离子进行洗脱，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍，去离子水洗脱后用体积百分比为30％的乙醇水溶液进行洗脱，再用体积百分比为70％的乙醇水溶液进行洗脱，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，体积百分比为70％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍并收集体积百分比为70％乙醇洗脱液，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到第二稀释液，第二稀释液对30目至60目聚酰胺树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为70％的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10，然后在温度为40℃下干燥12h，干燥后得到睡莲花总黄酮提取物。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物为棕黄色粉末，得率为2.52％；以烟花苷为对照品，在波长为349nm下，紫外分光光度法测定黄酮含量为74.61％。高效液相色谱法测定标识性成分isostrictiniin、烟花苷和紫云英苷的含量，分别为2.39％、15.47％和含量为5.06％。高效液相色谱条件为：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈和0.1％磷酸梯度洗脱,0-50min，乙腈：13％-19％；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：266nm。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物中黄酮含量为74.61％，isostrictiniin含量为2.39％，烟花苷含量为15.47％，紫云英苷含量为5.06％。
实施例11，该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，称取睡莲花0.5kg，置于提取罐中，在睡莲花中加入乙醇水溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的10倍，每次提取时间为1h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为50％的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.15后，得到一次浸膏；第二步，一次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到第一稀释液，第一稀释液对AB-8大孔树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为30％的乙醇水溶液进行洗脱，再用体积百分比为50％的乙醇水溶液进行洗脱，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍，体积百分比为50％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍并收集体积百分比为50％乙醇洗脱液，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.15后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到第二稀释液，第二稀释液对14目至30目聚酰胺树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为70％的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.15，然后在温度为45℃下干燥14h，干燥后得到睡莲花总黄酮提取物。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物为棕黄色粉末，得率为2.59％；以烟花苷为对照品，在波长为349nm下，紫外分光光度法测定黄酮含量为63.62％。高效液相色谱法测定标识性成分isostrictiniin、烟花苷和紫云英苷的含量，分别为1.53％、11.02％和7.35％。高效液相色谱条件为：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈和0.1％磷酸梯度洗脱,0-50min，乙腈：13％-19％；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：266nm。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物中黄酮含量为63.62％，isostrictiniin含量为1.53％，烟花苷含量为11.02％，紫云英苷含量为7.35％。
实施例12，该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，称取睡莲花0.5kg，置于提取罐中，在睡莲花中加入乙醇水溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍，每次提取时间为1h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为70％的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.18后，得到一次浸膏；第二步，一次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到第一稀释液，第一稀释液对PDH-100大孔树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为30％的乙醇水溶液进行洗脱，再用体积百分比为50％的乙醇水溶液进行洗脱，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的8倍，体积百分比为50％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的8倍并收集体积百分比为50％乙醇洗脱液，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.18后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到第二稀释液，第二稀释液对30目至60目聚酰胺树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为70％的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.18，然后在温度为50℃下干燥16h，干燥后得到睡莲花总黄酮提取物。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物为棕黄色粉末，得率为2.36％；以烟花苷为对照品，在波长为349nm下，紫外分光光度法测定黄酮含量为57.25％。高效液相色谱法测定标识性成分isostrictiniin、烟花苷和紫云英苷的含量，分别为1.29％、12.11％和5.42％。高效液相色谱条件为：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈和0.1％磷酸梯度洗脱,0-50min，乙腈：13％-19％；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：266nm。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物中黄酮含量为57.25％，isostrictiniin含量为1.29％，烟花苷含量为12.11％，紫云英苷含量为5.42％。
实施例13，该睡莲花总黄酮提取物在制备防治肝损伤药物中的应用。
上述实施例得到的本发明睡莲花总黄酮提取物在制备治疗肝损伤药物中的应用体内药效学试验如下：
1试验材料与动物
联苯双酯滴丸：北京协和药厂生产，批号：0505010r7，每滴丸含联苯双酯7.5mg；总蛋白定量(BCA法)、MDA、SOD、GSH、NO试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为20151219、20151207、20150610、20151112、20150605；IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司；迈瑞全自动生化分析仪；UV1200紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；全波长酶标仪，BIO-RAD，BenchMarkPLUS。
昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，SPF级，购自新疆医科大学实验动物研究中心，合格证号为SYXK(新)2011-0004，使用许可证号为SYXK(新)2011-0001。
2睡莲花总黄酮对D-半乳糖胺致化学性肝损伤的防治作用
2.1方法
2.1.1动物分组与给药
昆明种小鼠60只，18～22g，随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、阳性对照联苯双酯(150mg·kg-1)、睡莲花总黄酮高、中、低(200、100、50mg·kg-1)剂量组。联苯双酯组和总黄酮高、中、低剂量组按10ml·kg-1体重每日灌胃给药1次，正常组和模型组每日灌胃等体积的蒸馏水1次，连续灌胃7d。末次给药后，正常组小鼠腹腔注射生理盐水0.2ml/10g体重，其他各组腹腔注射D-半乳糖胺(800mg/kg,0.2ml/10g体重)造模，禁食8h后，摘眼球取血离心，留取血清待检。
2.1.2指标测定
采用全自动生化仪检测血清ALT和AST活性。采用ELISA法测定血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平。按试剂盒说明书测定肝匀浆中MDA、SOD、GSH和NO含量。
2.1.3统计学分析
应用SPSS13.0软件进行统计分析，各组数据结果以x±s表示，计量资料采用方差分析，等级资料采用Ridit分析，检验水准α＝0.05。
2.2结果
2.2.1睡莲花总黄酮对肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响如表1所示
实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清ALT、AST活性显著增加(P<0.05)。与模型组比较，中、高剂量的睡莲花总黄酮(100、200mg/kg)均能显著降低小鼠血清ALT、AST水平(P<0.01)，其活性接近于阳性对照联苯双酯，结果说明本发明睡莲花总黄酮具有显著的保肝降酶作用。
2.2.2睡莲花总黄酮对肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、SOD、GSH和NO的影响如表2所示
实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠肝匀浆MDA、NO水平显著增加(P<0.01)，SOD和GSH水平显著减少(P<0.01)。与模型组比较，中、高剂量的睡莲花总黄酮(100、200mg/kg)均能显著降低小鼠血清MDA水平(P<0.05，P<0.01)，其活性优于阳性对照联苯双酯。不同剂量的睡莲花总黄酮均能显著降低NO水平(P<0.01)。此外，不同剂量的睡莲花总黄酮能显著提高GSH水平(P<0.05，P<0.01)，中、高剂量的睡莲花总黄酮(100、200mg/kg)均能显著提高小鼠血清SOD水平(P<0.05，P<0.01)。结果显示睡莲花总黄酮在降低MDA和NO水平、改善SOD和GSH水平上优于联苯双酯。说明本发明睡莲花总黄酮具有较好的抗氧化能力，可通过抗氧化作用发挥肝保护的作用。
2.2.3睡莲花总黄酮对肝损伤小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的影响如表3所示
实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平显著提高(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组的睡莲花总黄酮均能显著降低IL-1β水平(P<0.05)，且呈剂量依赖关系，其降低效果接近于阳性对照联苯双酯组。高剂量组的睡莲花总黄酮还能显著降低TNF-α、IL-6和IFN-γ水平(P<0.05)。
3睡莲花总黄酮对刀豆蛋白A致小鼠免疫性肝损伤的保护作用
3.1方法
3.1.1小鼠急性免疫性肝损伤模型的建立及给药方法
昆明种小鼠60只，按体重随机分为正常组、模型组、联苯双酯(150mg·kg-1)组、睡莲花总黄酮高、中、低剂量组(200、100、50mg·kg-1)，每组10只。每日灌胃给药1次，正常组和模型组每日灌胃等体积的蒸馏水1次，连续灌胃10d。末次给药后，正常组小鼠尾静脉注射PBS溶液0.3ml，其他各组按刀豆蛋白A20mg/kg以PBS溶液稀释为0.3ml尾静脉注射造模。禁食8h后，摘眼球取血，离心15min(3000r·min-1)，分离血清，留取血清待检。
3.1.2指标测定
采用全自动生化仪检测血清ALT和AST活性。采用ELISA法测定血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平。按试剂盒说明书测定肝匀浆中MDA、SOD、GSH和NO含量。
3.1.3统计学分析
应用SPSS13.0软件进行统计分析，各组数据结果以x±s表示，计量资料采用方差分析，等级资料采用Ridit分析，检验水准α＝0.05。
3.2结果
3.2.1对免疫性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响如表4所示
实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清ALT、AST活性显著增加(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量的睡莲花总黄酮(50、100、200mg/kg)均能显著降低小鼠血清ALT、AST水平(P<0.05)，并呈剂量依赖关系，其活性优于阳性对照联苯双酯。
3.3.2对免疫性肝损伤小鼠肝组织中MDA、SOD、GSH和NO的影响如表5所示
实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠肝匀浆MDA、NO水平显著增加(P<0.01)，SOD和GSH水平显著减少(P<0.01)。与模型组比较，不同剂量的睡莲花总黄酮(50、100、200mg/kg)均能显著降低小鼠血清MDA水平(P<0.05，P<0.01)，其活性接近于阳性对照联苯双酯；中、高剂量的睡莲花总黄酮均能显著降低NO水平(P<0.01)。此外，与模型组相比，不同剂量的睡莲花总黄酮能显著提高SOD水平(P<0.05，P<0.01)，且呈剂量依赖关系；中、高剂量的睡莲花总黄酮(50、100mg/kg)均能显著提高小鼠血清GSH水平(P<0.05，P<0.01)。
3.3.3对免疫性肝损伤小鼠血清IL-1β、IL-6、TN F-α和IFN-γ的影响如表6所示
实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清中的IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，中、高剂量组的NCTF均能显著降低IL-1β和TNF-α水平(P<0.05)。高剂量组的睡莲花总黄酮也能明显降低IL-6和IFN-γ水平(P<0.05)。
结论：药效学研究表明，本发明睡莲花总黄酮提取物对D-半乳糖胺诱导的小鼠化学性肝损伤和刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤均有较好的防治作用，其作用机制与清除自由基、抑制脂质过氧化、下调TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ水平密切相关，本发明睡莲花总黄酮提取物可用于肝损伤相关疾病的治疗。
综上所述，本发明提供了对睡莲花总黄酮提取物进行分离纯化的方法，采用大孔树脂和聚酰胺树脂联用的方法从睡莲花中提取黄酮类成分，本发明具有成本低、无污染、易于工业化生产的优点，同时本发明睡莲花总黄酮提取物具有较好的抗肝炎作用，且高效、低毒，可应用于肝损伤的防治。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

Claims (35)

1.一种睡莲花总黄酮提取物，其特征在于所含黄酮含量的重量百分比在50％至80％，1-O-没食子酰-2,3-O-六羟基联苯二甲酰-β-D-葡萄糖含量的重量百分比在1.2％至3.0％，烟花苷含量的重量百分比在9.0％至16.0％，紫云英苷含量的重量百分比在4.5％至8.0％；其中：该睡莲花总黄酮提取物按下述方法得到：第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为50％至70％乙醇水溶液洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第一步中，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为0.5h至3h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为30％至80％的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于睡莲花为雪白睡莲的干燥花蕾。
4.根据权利要求1或2所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2后，得到一次浸膏。
5.根据权利要求3所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2后，得到一次浸膏。
6.根据权利要求1或2所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液；或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
7.根据权利要求3所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液；或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
8.根据权利要求4所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液；或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
9.根据权利要求5所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液；或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
10.根据权利要求1或2所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
11.根据权利要求3所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
12.根据权利要求4所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
13.根据权利要求5所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
14.根据权利要求6所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
15.根据权利要求7所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
16.根据权利要求8所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
17.根据权利要求9所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液；或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40℃至50℃。
18.根据权利要求1或2所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
19.根据权利要求3所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
20.根据权利要求4所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
21.根据权利要求5所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
22.根据权利要求6所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
23.根据权利要求7所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
24.根据权利要求8所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
25.根据权利要求9所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
26.根据权利要求10所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
27.根据权利要求11所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
28.根据权利要求12所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
29.根据权利要求13所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
30.根据权利要求14所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
31.根据权利要求15所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
32.根据权利要求16所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
33.根据权利要求17所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
34.一种根据权利要求1至33中任意一项所述睡莲花总黄酮提取物的制备方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分比为30％的乙醇水溶液和体积百分比为50％至70％的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为50％至70％乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。
35.一种根据权利要求1至33中任意一项所述的睡莲花总黄酮提取物在制备防治肝损伤药物中的应用。
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