CN106029685A - 具有成骨细胞增殖促进活性的肽及其利用 - Google Patents

具有成骨细胞增殖促进活性的肽及其利用 Download PDF

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Abstract

为了提供兼具骨形成促进作用和软骨细胞增殖促进作用的新型肽，本发明提供包含下述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列、氨基酸残基数为100以下、具有成骨细胞增殖促进活性的肽或其衍生物或其盐。(a)Val‑Asn‑Pro‑Glu‑Ser‑Glu‑Glu‑Glu‑Asp‑Glu‑Ser‑Ser‑Pro‑Tyr‑Glu(序列号1)(b)在(a)的氨基酸序列中具有1～3个氨基酸的保守性置换或缺失的氨基酸序列(c)由(a)或(b)的氨基酸序列中至少4个连续的氨基酸构成的氨基酸序列。

Description

具有成骨细胞增殖促进活性的肽及其利用
技术领域
本发明涉及具有成骨细胞增殖促进活性的肽、含有该肽的骨形成促进剂、骨吸收抑制剂、软骨细胞增殖促进剂、透明质酸产生促进剂、软骨祖细胞分化诱导剂、间充质干细胞增殖促进剂、间充质干细胞分化诱导剂、以及它们的利用。
背景技术
骨质疏松症是因骨量或骨矿含量的减少而导致骨的微细结构破坏、骨强度降低、骨折的风险提高的全身性疾病。在日本，骨质疏松症的患者据说有约1100万人，其中8成是女性。此外，骨质疏松症是中年之后多见的疾病，因此，伴随着近年来的老龄化，推测今后患者数会增加。另外，近年来，中小学生的骨折率增加，从预防骨质疏松症的观点出发，在幼年期切实地提高骨矿含量、获得更高的最大骨量也是非常重要的。由此可见，无论性别、年龄如何，确保骨的健康是目前全社会关注的事宜。
以往，作为预防或治疗骨疾病的方法，进行了通过药膳疗法补钙、轻度运动、日光浴、药物治疗等。作为通过药膳疗法进行的补钙，使用了碳酸钙、磷酸钙等钙盐、牛骨粉、蛋壳、鱼骨粉等天然钙剂，但从溶解性、吸收性、呈味性的观点出发，未必是适合口服摄取的材料。适度的运动可增加骨量、使骨强化，因此，散步、慢走被认为有益于骨的健康，但在体质弱的情况下，轻度运动也是有麻烦的。何况卧床的老人几乎无法运动。日光浴在补给活化维生素D3的方面被认为是有益的，但仅此是不充分的。
另一方面，在各种软骨疾病的预防和治疗的过程中，软骨细胞的增殖、分化功能的表现很重要。即，认为软骨细胞的增殖、成熟化带来骨的正常成长或骨折的情况下的修复。作为诱导软骨细胞增殖的因子，报告了TGF-β1(Transforming Growth Factor：转化生长因子)、IGF-1(Insulin-like Growth Factor：胰岛素样生长因子)、bFGF(basic FibroblastGrowth Factor：碱性成纤维细胞生长因子)、PTHrP(PTH-related peptide：甲状旁腺激素相关肽)、HGF(Hepatocyte Growth Factor：肝细胞生长因子)、BMP(bone morphogeneticprotein：骨形态发生蛋白)等。但是，尚未确立安全性、稳定性、有效性优良的软骨细胞增殖促进药的临床应用。
软骨疾病中，患者数最多的疾病是变形性关节病。认为原因之一是老龄化，预测在今后的老龄化社会中该病例会增加。在关节疾病等以软骨的变性为主要病变的软骨障碍(軟骨障害)的预防和治疗中，以往主要使用雌激素、降钙素等骨吸收抑制物质、阿司匹林或非甾体消炎剂(NSAID)，但不仅未得到充分的效果，而且消化道障碍等有害作用是众所共知的。因此，迫切要求在软骨损伤、软骨障碍的治疗中安全使用的预防或改善剂。
本发明人们发现，至少包含以Ala-Glu-Ser表示的氨基酸序列的卵黄来源的肽具有成骨细胞增殖促进活性(参考专利文献1)、卵黄蛋白水解物具有软骨细胞增殖促进活性(参考专利文献2)，并进行了专利申请。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-211979号公报
专利文献2：国际公开第2014/007318号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供兼具骨形成促进作用和软骨细胞增殖促进作用的新型肽，并且提供利用该肽的优良用途。
用于解决问题的方法
为了解决上述问题，本发明包含下述各发明。
[1]一种肽或其衍生物或其盐，所述肽包含下述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列，氨基酸残基数为100以下，且具有成骨细胞增殖促进活性。
(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号1)
(b)在(a)的氨基酸序列中具有1～3个氨基酸的保守性置换或缺失的氨基酸序列
(c)由(a)或(b)的氨基酸序列中至少4个连续的氨基酸构成的氨基酸序列
[2]如上述[1]所述的肽或其衍生物或其盐，其中，具有至少一个磷酸化丝氨酸。
[3]如上述[1]或[2]所述的肽或其衍生物或其盐，所述肽为卵黄脂磷蛋白1的片段。
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，其还具有软骨细胞增殖促进活性和/或透明质酸产生促进活性。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，所述肽由选自下述(i)～(vi)中的氨基酸序列构成。
(i)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号1)
(ii)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号2)
(iii)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu(序列号3)
(iv)Pro-Glu-Ser-Glu-Glu(序列号4)
(v)Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号5)
(vi)Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号6)
[6]一种多核苷酸，其编码上述[1]～[5]中任一项所述的肽。
[7]一种表达载体，其含有上述[6]所述的多核苷酸。
[8]一种转化体，其利用上述[7]所述的重组载体进行了转化。
[9]一种骨形成促进剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[10]如上述[9]所述的骨形成促进剂，其具有成骨细胞增殖促进作用。
[11]一种骨吸收抑制剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[12]一种软骨细胞增殖促进剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[13]一种透明质酸产生促进剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[14]一种软骨祖细胞分化诱导剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[15]一种间充质干细胞增殖促进剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[16]一种间充质干细胞分化诱导剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[17]如上述[9]～[16]中任一项所述的剂，其用于口服给药。
[18]一种药物，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[19]如上述[18]所述的药物，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
[20]一种饮食品，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[21]如上述[20]所述的饮食品，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
[22]一种营养补充剂，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[23]如上述[22]所述的营养补充剂，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
[24]一种食品添加物，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[25]如上述[24]所述的食品添加物，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
[26]一种化妆品，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[27]如上述[26]所述的化妆品，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
[28]一种骨形成促进方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[29]一种软骨障碍或关节疾病的预防或改善方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[30]在骨形成促进、或者软骨障碍或关节疾病的预防或改善中使用的上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
[31]上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐在促进骨形成、或者预防或改善软骨障碍或关节疾病中的应用。
[32]上述[1]～[5]中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐在制造用于促进骨形成、或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病的药物中的应用。
发明效果
根据本发明，能够提供兼具骨形成促进作用和软骨细胞增殖促进作用的新型肽。该肽通过口服摄取能够促进骨形成，因此，作为用于促进骨形成或者用于预防、改善软骨障碍或关节痛的药物、饮食品、营养补充剂、食品添加物、化妆品等有用。
附图说明
图1是示出利用分级分子量为1kDa的UF膜将卵黄蛋白水解物分级、并对各个级分的成骨细胞增殖活性进行测定而得到的结果的图。
图2是示出将卵黄蛋白水解物的分子量1kDa以上的级分供于阴离子交换柱、并对非吸附级分(直接通过)、以各氯化钠浓度(750mM、1M)洗脱得到的级分的成骨细胞增殖活性进行测定而得到的结果的图。
图3是示出对确认到强成骨细胞增殖活性的750mM NaCl洗脱级分进行反相HPLC而分取的级分的图。
图4是示出对图3中所示的G1～G9各自的成骨细胞增殖活性进行测定而得到的结果的图。
图5是示出对G3和G4中的级分11～20的成骨细胞增殖活性进行测定而得到的结果的图。
图6是示出进一步在不同的条件下对级分12进行HPLC而检测到的峰的图。
图7是示出分取分别含有图6中所示的2个峰的级分、并对成骨细胞增殖活性进行测定而得到的结果的图。
图8是示出分析结果所明确的肽的结构的图。
图9是示出对合成肽(No.1)进行成骨细胞增殖活性的测定而得到的结果的图。
图10是示出对合成肽(No.2和No.3)进行成骨细胞增殖活性的测定而得到的结果的图。
图11是示出对合成肽(No.4和No.5)进行成骨细胞增殖活性的测定而得到的结果的图。
图12是示出对合成肽(No.6)进行成骨细胞增殖活性的测定而得到的结果的图。
图13是示出对口服给药了合成肽(No.1)的大鼠的胫骨生长板的伸长幅度进行测定而得到的结果的图。
图14是示出对合成肽(No.1和No.6)进行软骨细胞增殖活性的测定而得到的结果的图。
图15是示出对合成肽(No.1和No.6)进行透明质酸产生促进活性的测定而得到的结果的图。
图16是示出实施例14的实验操作程序的图。
图17是示出对合成肽给药组测量每一天的生长软骨伸长速度(纵向)而得到的结果的图。
图18是示出对合成肽给药组利用荧光显微镜确认初级松质骨的形成而得到的结果的图。
图19是示出对合成肽给药组确认血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度增加而得到的结果的图。
图20是示出实施例15的实验操作程序的图。
图21是示出对合成肽给药组计算每一天的大鼠胫骨生长幅度而得到的结果的图。
图22是示出对合成肽给药组测定大鼠单位骨组织的次级松质骨的骨量而得到的结果的图。
图23是示出对合成肽给药组测定成骨细胞所局限的骨表面积相对于总骨表面积的比例而得到的结果的图。
图24是示出对合成肽给药组测定破骨细胞所局限的骨表面积相对于总骨表面积的比例而得到的结果的图。
图25是示出实施例16的实验操作程序的图。
图26是示出对合成肽给药组计算每一天的大鼠次级松质骨钙化速度而得到的结果的图。
图27是示出对合成肽给药组测定成骨细胞所局限的骨表面积相对于总骨表面积的比例而得到的结果的图。
图28是示出对合成肽给药组测定大鼠单位骨组织的成骨细胞数而得到的结果的图。
图29是示出对合成肽给药组计算骨形成速度而得到的结果的图。
具体实施方式
[肽]
本发明提供具有成骨细胞增殖促进活性的肽。
本发明人们尝试了从将卵黄蛋白水解而得到的肽混合物中鉴定具有强成骨细胞增殖促进活性的肽，分离出由下述(i)～(vi)的各氨基酸序列构成的肽。(ii)～(vi)的各氨基酸序列为(i)的氨基酸序列中所包含的部分序列。
(i)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号1)
(ii)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号2)
(iii)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu(序列号3)
(iv)Pro-Glu-Ser-Glu-Glu(序列号4)
(v)Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号5)
(vi)Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号6)
本发明的肽为包含下述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列、且具有成骨细胞增殖促进活性的肽。
(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号1)
(b)在(a)的氨基酸序列中具有1～3个氨基酸的保守性置换或缺失的氨基酸序列
(c)由(a)或(b)的氨基酸序列中至少4个连续的氨基酸构成的氨基酸序列
本发明的肽可以是仅由上述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列构成的肽，也可以是由上述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列和除此以外的氨基酸序列构成的肽。在包含(a)、(b)或(c)以外的氨基酸序列的情况下，只要肽具有成骨细胞增殖促进活性，则(a)、(b)或(c)以外的氨基酸序列不受特别限定。例如，作为(a)、(b)或(c)以外的氨基酸序列，可以包含标签序列(例如，多聚组氨酸标签、Myc标签、FLAG标签等)。
本发明的肽的氨基酸残基数没有特别限定，优选为1000以下，更优选为500以下，进一步优选为200以下，进一步优选为100以下，进一步优选为80以下，进一步优选为70以下，进一步优选为60以下，进一步优选为50以下，进一步优选为40以下，进一步优选为30以下，进一步优选为20以下，特别优选为15以下。只要具有成骨细胞增殖促进活性，则下限没有特别限定，优选为3以上，更优选为4以上，进一步优选为5以上。
同源性检索的结果表明，序列号1的氨基酸序列是卵黄中含有的前体蛋白质的一种即卵黄蛋白原(vitellogenin)2的氨基酸序列(序列号7)的第1060位-第1074位。因此，本发明的肽优选为包含卵黄蛋白原2的第1060位-第1074位中的至少4个连续的氨基酸、且具有成骨细胞增殖促进活性的卵黄蛋白原2的片段。
在此，已知卵黄蛋白原2是卵黄中含有的前体蛋白质，其被切断成卵黄脂磷蛋白1(Lipovitellin-1)、卵黄高磷蛋白(Phosvitin)、卵黄脂磷蛋白2(Lipovitellin-2)和YGP40(yolk glycoprotein of 40kDa，40kDa的卵黄糖蛋白)这4种卵黄蛋白(参考DATABASEUniProt：P02845(VIT2_CHICK))。卵黄蛋白原2的第1060位-第1074位相当于卵黄脂磷蛋白1的氨基酸序列(序列号8)的第1045位-第1059位。因此，本发明的肽优选为包含卵黄脂磷蛋白1的第1045位-第1059位中的至少4个连续的氨基酸、且具有成骨细胞增殖促进活性的卵黄脂磷蛋白2的片段。
作为本发明的肽，优选由上述(i)～(vi)的氨基酸序列构成的肽。
本说明书中，“氨基酸的保守性置换”是指下述表1的各组内的氨基酸间的置换。其中，作为优选的氨基酸的保守性置换，可以列举天冬氨酸与谷氨酸之间的置换、精氨酸与赖氨酸与组氨酸之间的置换、色氨酸与苯丙氨酸之间的置换、苯丙氨酸与缬氨酸之间的置换、亮氨酸与异亮氨酸与丙氨酸之间的置换、甘氨酸与丙氨酸之间的置换等。
表1
对于本发明的肽的衍生物而言，以特定的氨基酸序列表示的肽的C末端可以为羧基(-COOH)、羧酸根(カルボキシレート)(-COO-)、酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)中的任意一种。作为酯中的R，可以列举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基等C1-6烷基；例如环戊基、环己基等C3-8环烷基；例如苯基、α-萘基等C6-12芳基；例如苄基、苯乙基等苯基-C1-2烷基或α-萘甲基等α-萘基-C1-2烷基等C7-14芳烷基，除此以外，还可以列举作为口服用酯被广泛使用的新戊酰氧基甲基等。作为酰胺体，可以列举酰胺、被1个或2个C1-6烷基取代的酰胺、被1个或2个被苯基取代的C1-6烷基取代的酰胺、形成包含酰胺基的氮原子的5～7元环的氮杂环烷烃的酰胺等。
本发明的肽在C末端以外具有羧基或羧酸根的情况下，这些基团酰胺化或酯化而成的物质也包含在本发明的肽的衍生物中。
本发明的肽的衍生物也包括N末端的氨基被保护基(例如甲酰基、乙酰基等C2-6烷酰基等C1-6酰基等)保护的衍生物、N末端侧在生物体内被切断而生成的谷氨酰基经焦谷氨酸化后的衍生物、分子内的氨基酸的侧链上的取代基(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被适当的保护基(例如甲酰基、乙酰基等C2-6烷酰基等C1-6酰基等)保护的衍生物。
构成本发明的肽的衍生物的氨基酸的侧链可以被任意的取代基修饰。取代基没有特别限定，可以列举例如氟原子、氯原子、氰基、羟基、硝基、烷基、环烷基、烷氧基、氨基、磷酸基等。另外，侧链的取代基可以被保护基保护。此外，结合有糖链的糖肽也包含在本发明的肽的衍生物中。
本发明的肽或其衍生物可以形成盐，作为其盐，优选生理学上可接受的盐。作为生理学上可接受的盐，可以列举例如与盐酸、硫酸、磷酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、油酸、棕榈酸等酸的盐；与钠、钾、钙等碱金属或碱土金属或者铝的氢氧化物或碳酸盐的盐；与三乙胺、苄胺、二乙醇胺、叔丁胺、二环己胺、精氨酸等的盐等。
只要可保持原来的肽的特性，本发明的肽或其衍生物可以含有D-氨基酸，也可以含有非天然氨基酸。另外，只要可保持原来的肽的特性，本发明的肽或其衍生物可以在肽上连接其他物质。作为能够与肽连接的其他物质，可以列举例如其他肽、脂质、糖或糖链、乙酰基、天然或合成的聚合物等。另外，只要保持原来的肽的特性，本发明的肽也可以对肽进行糖基化、侧链氧化、磷酸化等修饰。
本发明的肽其衍生物或其盐优选具有至少一个磷酸化丝氨酸。磷酸化丝氨酸的位置没有特别限定，优选序列号1所示的氨基酸序列的第5位、第11位和第12位的丝氨酸残基中的至少一个被磷酸化，更优选第5位和第11位中的至少一个被磷酸化，进一步优选第5位和第11位这两者都被磷酸化。通过对丝氨酸进行磷酸化，确认到骨化细胞的增殖促进作用增强。
作为本发明的肽衍生物，优选由序列号9～14所示的氨基酸序列构成的具有磷酸化丝氨酸的肽(参考图10)。
本发明的肽其衍生物或其盐(以下将它们简记为“本发明的肽”)可以按照公知的一般的肽合成的操作程序利用固相合成法(Fmoc法、Boc法)或液相合成法进行制造。另外，可以使用导入了含有编码本发明的肽的DNA的表达载体的转化体进行制造。另外，可以将含有编码在一部分中含有本发明的肽的肽的DNA的表达载体导入转化体，使用该转化体获取肽，将其利用适当的蛋白酶、肽酶切断，由此进行制造。另外，可以通过使用体外转录-翻译系统的方法进行制造。
另外，本发明的肽可以由鸡的卵黄蛋白的水解物纯化而获取。卵黄蛋白的水解物的制备方法、肽的纯化方法没有特别限定，可以适当选择公知的方法来使用。具体而言，可以列举例如制备脱脂卵黄粉末、使用蛋白酶等酶制备水解物、使用超滤、HPLC等各种色谱纯化目标肽的方法等。
所得到的肽具有成骨细胞增殖促进活性如下确认即可：在从测定细胞增殖的公知的方法中适当选择的试验体系中使用成骨细胞，将添加了肽的情况与未添加肽的情况相比较，添加了肽的情况下成骨细胞的增殖水平更高。可以列举例如在使用成骨细胞来源的细胞株的细胞培养体系中使用MTT检测、细胞计数法的方法。
所得到的肽具有软骨细胞增殖促进活性如下确认即可：在从测定细胞增殖的公知的方法中适当选择的试验体系中使用软骨细胞或软骨祖细胞，将添加了肽的情况与未添加肽的情况相比较，添加了肽的情况下成骨细胞的增殖水平更高。可以列举例如在使用成骨细胞来源的细胞株的细胞培养体系中使用MTT检测、细胞计数法的方法。
所得到的肽具有透明质酸产生促进活性如下确认即可：使用具有透明质酸产生能力的培养细胞，利用公知的方法测定在培养基中添加了肽的情况下和未添加肽的情况下的培养上清中的透明质酸量并进行比较，添加了肽的情况下培养上清中的透明质酸量更高。作为透明质酸量的测定方法，可以列举例如ELISA法等。
[多核苷酸]
本发明的多核苷酸只要是编码上述本发明的肽的多核苷酸即可。多核苷酸可以以RNA(例如mRNA)的形态或DNA的形态(例如cDNA或基因组DNA)存在。多核苷酸可以为双链也可以为单链。双链的情况下，可以为双链DNA、双链RNA、或DNA与RNA的杂合链中的任意一种。单链的情况下，可以为编码链(有义链)或非编码链(反义链)中的任意一种。另外，本发明的多核苷酸可以在其5’侧或3’侧与编码标签标识(标签序列或标记序列)多核苷酸融合。此外，可以包含非翻译区域(UTR)的序列、载体序列(包含表达载体序列)等序列。
编码本发明的肽的多核苷酸的碱基序列可以通过基于本发明的肽的氨基酸序列适当选择并组合各氨基酸的密码子来任意地进行设计。另外，如上所述，序列号1的氨基酸序列是作为卵黄中含有的前体蛋白质的一种的卵黄蛋白原2的氨基酸序列(序列号7)的一部分，因此，可以基于编码卵黄蛋白原2的基因的碱基序列进行设计。
本发明的多核苷酸可以通过公知的DNA合成法、PCR法等来获取。具体而言，例如，基于本发明的肽的氨基酸序列，适当选择各氨基酸的密码子来设计碱基序列，使用市售的DNA合成仪进行化学合成即可。另外，可以设计出用于扩增编码卵黄蛋白原2的基因的碱基序列(登录号：X13607)中编码本发明的肽的区域的引物，使用这些引物以鸡基因组DNA或cDNA等为模板进行PCR等，由此可以大量获取包含本发明的多核苷酸的DNA片段。
[表达载体]
本发明提供用于制造上述本发明的肽而使用的表达载体。本发明的表达载体只要包含编码本发明的肽的多核苷酸，则没有特别限定，优选具有RNA聚合酶的识别序列的质粒载体(pSP64、pBluescript等)。作为表达载体的制作方法，可以列举使用质粒、噬菌体或粘粒等的方法，没有特别限定。载体的具体种类没有限定，可以适当选择能够在宿主细胞中进行表达的载体。即，根据宿主细胞的种类，选择用于可靠地表达本发明的多核苷酸的适当启动子序列，将其与本发明的多核苷酸组入各种质粒等中，使用所得到的载体作为表达载体即可。对使用本发明的表达载体转化后的宿主进行培养、栽培或饲养后，可以按照惯用的方法(例如过滤、离心分离、细胞的破碎、凝胶过滤层析、离子交换层析等)从培养物等中回收、纯化本发明的肽。
表达载体优选包含至少一个选择标记。作为这样的标记，对于真核生物细胞培养，可以列举二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因，对于大肠杆菌(Escherichia coli)和其他细菌中的培养，可以列举四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因。使用上述选择标记时，可以确认本发明的多核苷酸是否导入了宿主细胞、以及是否在宿主细胞中可靠地表达。或者，也可以以融合肽的形式表达本发明的肽，例如，可以使用维多利亚多管发光水母来源的绿色荧光蛋白质GFP(Green Fluorescent Protein)作为标记，以GFP融合肽的形式表达本发明的肽。
宿主没有特别限定，可以适当使用现有公知的各种细胞。具体而言，可以列举例如大肠杆菌等细菌、酵母(芽殖酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、线虫(秀丽隐杆线虫，Caenorhabditiselegans)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞、动物细胞(例如CHO细胞、COS细胞和Bowes黑色素瘤细胞)等。将上述表达载体导入到宿主细胞中的方法、即转化法也没有特别限定，可以适当使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等现有公知的方法。
[转化体]
本发明提供导入有上述本发明的表达载体的转化体。本发明的转化体不仅包括细胞、组织或器官，还包括生物个体。另外，作为转化对象的生物也没有特别限定，可以列举作为上述宿主细胞所例示的各种微生物、植物或动物。本发明的转化体的特征在于表达了本发明的肽。本发明的转化体优选稳定地表达本发明的肽，但也可以瞬时地表达本发明的肽。
[骨形成促进剂、骨吸收抑制剂、软骨细胞增殖促进剂、透明质酸产生促进剂、软骨祖细胞分化诱导剂、间充质干细胞增殖促进剂、间充质干细胞分化诱导剂]
本发明提供含有本发明的肽的骨形成促进剂。本发明的肽具有骨形成促进活性，因此能够适合用作骨形成促进剂的有效成分。本发明的肽具有骨形成促进活性可以如下确认：例如，以一定的期间(例如7、14、21天等)对受试动物给药(例如口服给药等)本发明的肽，然后，以胫骨生长板的伸长幅度的增加、生长软骨的伸长速度的增大、初级松质骨的形成促进、血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的增加、单位骨组织的次级松质骨的骨量的增大、成骨细胞的增加、破骨细胞的减少、次级松质骨钙化速度的增大等作为指标进行确认。在此，生长软骨是指例如位于骨端的骨的伸长部位。初级松质骨是指例如紧挨生长软骨之下的未成熟的松质骨。次级松质骨是指例如成熟的松质骨。即，本发明中，“骨形成促进”可以换言之为“胫骨生长板的伸长幅度的增加”、“生长软骨的伸长速度的增大”、“初级松质骨的形成促进”、“血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度的增加”、“单位骨组织的次级松质骨的骨量的增大”、“成骨细胞的增加”、“破骨细胞的减少”、“次级松质骨钙化速度的增大”等。另外，本发明提供含有本发明的肽的成骨细胞增殖促进剂。本发明的肽具有成骨细胞增殖促进活性，因此能够适合用作成骨细胞增殖促进剂的有效成分。另外，本发明提供含有本发明的肽的骨吸收抑制剂。本发明的肽具有骨吸收抑制活性，因此能够适合用作骨吸收抑制剂的有效成分。另外，本发明提供含有本发明的肽的软骨细胞增殖促进剂。本发明的肽具有软骨细胞增殖促进活性，因此能够适合用作软骨细胞增殖促进剂的有效成分。另外，本发明提供含有本发明的肽的透明质酸产生促进剂。本发明的肽具有透明质酸产生促进活性，因此能够适合用作透明质酸产生促进剂的有效成分。另外，本发明提供含有本发明的肽的软骨祖细胞分化诱导剂。本发明的肽具有软骨祖细胞分化诱导活性，因此能够适合用作软骨祖细胞分化诱导剂的有效成分。另外，本发明提供含有本发明的肽的间充质干细胞增殖促进剂。本发明的肽具有间充质干细胞增殖促进活性，因此能够适合用作间充质干细胞增殖促进剂的有效成分。另外，本发明提供含有本发明的肽的间充质干细胞分化诱导剂。本发明的肽具有间充质干细胞分化诱导活性，因此能够适合用作间充质干细胞分化诱导剂的有效成分。
作为上述各剂的有效成分，除了本发明的肽以外，还可以适当使用卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。本说明书中，卵黄脂磷蛋白1是指，由与序列号8所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列构成、且具有与卵黄脂磷蛋白1实质上相同的活性的蛋白质。作为与序列号8所表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以列举例如在序列号8所表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个～几个氨基酸而得到的氨基酸序列。“缺失、置换或添加了1个～几个氨基酸”是指，缺失、置换或添加利用定点诱变法等公知的突变肽制作法所能够缺失、置换或添加的程度的数量(优选为10个以下、更优选为7个以下、进一步优选为5个以下)的氨基酸。这样的突变蛋白质并不限定于具有利用公知的突变多肽制作法人为地导入的突变的蛋白质，也可以是分离纯化天然存在的蛋白质而得到的蛋白质。另外，实质上相同的氨基酸序列可以列举与序列号1所表示的氨基酸序列至少80％相同、更优选至少85％相同、90％相同、92％相同、95％相同、96％相同、97％相同、98％相同或99％相同的氨基酸序列。
作为卵黄脂磷蛋白1的衍生物，优选在上述本发明的肽的衍生物的说明中例示的各种衍生物。另外，作为卵黄脂磷蛋白1或其衍生物的盐，优选在上述本发明的肽或其衍生物的盐的说明中例示的各种盐。
卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐可以使用公知的基因重组技术以重组蛋白质的形式制造。另外，可以通过使用体外转录-翻译系统的方法进行制造。另外，可以从鸡的卵黄蛋白进行纯化。
以下，将卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐也包含在内，记作“本发明的肽等”。
已确认本发明的肽等通过口服给药于哺乳动物可发挥目标效果，因此，这些剂可以以用于口服给药的剂的形式适当实施。另外，本发明的肽等是作为卵黄蛋白的卵黄脂磷蛋白1或其片段，因此，安全性高，作用温和，能够长期摄取或使用。
[药物]
本发明提供含有本发明的肽等的药物。本发明的肽等具有成骨细胞增殖促进活性，因此能够用作骨形成促进用的药物。本发明的骨形成促进用药物适合用作例如骨质疏松症、骨形成障碍、高钙血症、甲状旁腺功能亢进症、软骨病、骨软化、骨溶解性骨疾病、骨坏死、派杰氏病、类风湿性关节、变形性关节病所致的骨减少、炎症性关节炎、骨髄炎、糖皮质激素治疗、转移性骨疾病、牙周的骨丧失、癌症所致的骨丧失、老年化所致的骨丧失、骨折、腰痛等的预防或治疗用药物。
另外，本发明的肽等具有软骨细胞增殖促进活性和/或透明质酸产生促进活性，因此能够用作软骨障碍或关节疾病的预防或改善用药物。作为软骨障碍，可以列举例如变形性关节病、软骨的缺损、软骨损伤、半月板损伤等。作为关节疾病，可以列举关节痛、慢性类风湿关节炎、变形性关节炎、化脓性关节炎、痛风性关节炎、外伤性关节炎、骨关节炎等。
本发明的药物以本发明的肽等作为有效成分，可以按照作为药物制剂的制造法而公知的方法(例如日本药典中记载的方法等)，适当配合药学上可接受的载体或添加剂进行制剂化。具体而言，可以列举例如片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片、舌下片、口腔内崩解片、含片等)、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊剂、微胶囊剂)、口腔用含片剂、糖浆剂、液剂、乳剂、混悬剂、控释制剂(例如速释性制剂、缓释性制剂、缓释性微胶囊剂)、气溶胶剂、膜剂(例如口腔内崩解膜、口腔粘膜贴膜)、注射剂(例如皮下注射剂、静脉内注射剂、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂)、滴注剂、经皮吸收型制剂、软膏剂、洗剂、贴剂、栓剂(例如肛门栓剂、阴道栓剂)、颗粒、经鼻剂、经肺剂(吸入剂)、滴眼剂等口服剂或非口服剂。关于载体或添加剂的配合比例，基于药物领域中通常采用的范围适当设定即可。可配合的载体或添加剂没有特别限制，可以列举例如水、生理盐水、其他水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体；赋形剂、粘结剂、pH调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。
作为可以混合到片剂、胶囊剂等中的添加剂，可以使用例如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、阿拉伯胶之类的粘结剂、微晶纤维素之类的赋形剂、玉米淀粉、明胶、海藻酸等之类的膨化剂、硬脂酸镁之类的润滑剂、蔗糖、乳糖或糖精之类的甜味剂、胡椒薄荷、红珠树油(アカモノ油)或樱桃之类的香味剂等。在制剂单元形态为胶囊的情况下，可以在上述类型的材料中进一步含有油脂之类的液态载体。用于注射的无菌组合物可以按照通常的制剂操作(例如使有效成分溶解或悬浮于注射用水、天然植物油等溶剂中等)进行制备。作为注射用的水性液，可以使用例如含有生理盐水、葡萄糖或其他助剂的等渗液(例如D-山梨醇、D-甘露醇、氯化钠等)等，可以与适当的助溶剂、例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂(例如聚山梨酯80TM、HCO-50)等组合使用。作为油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，可以与作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。另外，可以与缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、舒缓剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苄醇、苯酚等)、抗氧化剂等进行配合。
如此得到的制剂安全且低毒性，因此，可以对例如人或其他哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔、山羊、猪、牛、猫、狗、猴等)给药。
对于本发明的药物而言，尽管根据剂型、给药方法、载体等而有所不同，但可以通过相对于制剂总量以通常为0.01～100％(w/w)、优选为0.1～95％(w/w)的比例添加本发明的肽等并按照常规方法进行制造。
给药量根据给药对象、症状、给药途径等而有所差异，在口服给药的情况下，例如对于体重约60kg的人而言，通常每1天为约0.01mg～约1000mg，优选为约0.1mg～约100mg，更优选为约0.5mg～约500mg。每1天的总给药量可以单次给药，也可以分次给药。
本发明的药物通过与其他骨疾病治疗用药物、其他软骨或关节疾病治疗用药物组合使用，可以期待相加或协同性的效果的提高。作为其他骨形成促进用药物，可以列举例如活性型维生素D3制剂、维生素K2制剂、甲状旁腺激素制剂(特立帕肽)、女性激素制剂(雌激素)、双磷酸盐制剂、SERM(盐酸雷洛昔芬)、降钙素制剂等。作为其他软骨或关节疾病治疗用药物，可以列举例如葡糖胺、软骨素、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、N-乙酰葡糖胺等。
[饮食品]
本发明提供含有本发明的肽等的饮食品。本发明的饮食品适合作为骨形成促进用饮食品、以及软骨障碍或关节疾病的预防、改善用饮食品。
饮食品中包括健康食品、功能性食品、特定保健用食品、患者用食品。饮食品的形态没有特别限定。可以列举例如茶饮料、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、果实饮料、乳酸饮料等饮料；荞麦面、乌冬面、中华面、即食面等面类；饴糖、糖果、口香糖、巧克力、休闲零食、饼干、果冻、果酱、奶油、烘焙食品、面包等点心和面包类；鱼糕、火腿、香肠等水产/畜产加工食品；加工乳、发酵乳等乳制品；色拉油、天妇罗油、人造奶油、蛋黄酱、起酥油、打发奶油、调味料等油脂和油脂加工食品；调味汁、酱汁等调味料；咖喱、炖菜、盖饭、粥、泡饭等蒸煮袋食品；冰淇淋、沙冰、刨冰等冷饮等。
本发明提供含有本发明的肽等的营养补充剂。本发明的营养补充剂适合作为骨形成促进用营养补充剂、以及软骨障碍或关节疾病的预防/改善用营养补充剂。营养补充剂例如可以以片剂、颗粒剂、散剂、饮剂等形态提供。
本发明提供含有本发明的肽等的食品添加物。本发明的食品添加物适合作为骨形成促进用食品添加物、以及软骨障碍或关节疾病的预防/改善用食品添加物。本发明的食品添加物的形态没有特别限定，可以列举例如液状、糊状、粉末状、薄片状、颗粒状等。本发明的食品添加物可以基于一般的食品添加物的制造方法进行制造。
此外，也可以以含有本发明的肽等的饲料或饲料添加物的形式实施。
本发明提供含有本发明的肽等的化妆品。本发明的化妆品适合作为骨形成促进用化妆品、以及软骨障碍或关节疾病的预防、改善用化妆品。化妆品中包括所谓的药用化妆品(准药品(医薬部外品))。作为化妆品，可以列举例如清洗剂、洗发水、护发素、养发液、护发乳液、须后水、润肤乳、化妆乳液、洁面霜、按摩霜、润肤霜、气溶胶制品、除臭剂、芳香剂、脱臭剂或沐浴剂等。本发明的化妆品中，除了本发明的肽以外，可以根据目的适当配合作为化妆品常规使用的成分、例如表面活性剂、保湿剂、动植物来源油脂、有机硅类、高级醇、低级醇、动植物来源提取物、紫外线吸收剂、消炎剂、金属封链剂、维生素类、抗氧化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂、pH调节剂、着色剂、各种香料等。
本发明进一步包含下述发明。
(a)上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐在制造用于促进骨形成、或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病的药物中的应用。
(b)用于促进骨形成、或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病的上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
(c)一种骨形成促进方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
(d)一种软骨障碍或关节疾病的预防或改善方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
(e)一种非治疗性的骨形成促进方法，其特征在于，使哺乳动物口服摄取上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
(f)一种非治疗性的软骨障碍或关节疾病的预防或改善方法，其特征在于，使哺乳动物口服摄取上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
(g)在骨形成促进、或者软骨障碍或关节疾病的预防或改善中使用的上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
(h)上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐在促进骨形成、或者预防或改善软骨障碍或关节疾病中的应用。
(i)上述本发明的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐在制造用于促进骨形成、或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病的药物中的应用。
实施例
以下，利用实施例详细地对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1：卵黄蛋白水解物中的成骨细胞增殖促进活性成分的鉴定]
(1)卵黄蛋白水解物的制备
在脱脂卵黄粉末(丘比株式会社制造)100质量份中添加水500质量份，均匀搅拌后，添加商品名“アルカラーゼ”(地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源的蛋白酶、诺维信日本株式会社制造)5质量份，在pH7下在55～60℃反应3小时。反应结束后，通过90℃下10分钟的热处理使酶失活后，进行过滤，回收滤液。将滤液喷雾干燥，得到卵黄蛋白水解物。
需要说明的是，脱脂卵黄粉末可以从市售的卵黄粉末(例如丘比株式会社制造)进行制备。具体而言，在市售的卵黄粉末1质量份中添加乙醇(或正己烷)5～10质量份，用混合器搅拌约30分钟后，过滤回收固体成分。将该操作重复3次左右，从卵黄中脱脂。将脱脂后的卵黄风干，由此能够制备脱脂干燥粉末。
(2)成骨细胞增殖活性的测定方法
将小鼠成骨细胞样细胞株MC3T3-E1亚克隆-4(ATCC No.CRL-2593)使用含有10％FBS的α-MEM培养液在37℃、5％CO2-95％空气的条件下培养至汇合后，通过胰蛋白酶处理收集细胞。将收集的细胞悬浮到上述α-MEM培养液中，制备细胞悬浮液(1×104个/mL)。将该细胞悬浮液以每孔1m接种到24孔板中，在37℃、5％CO2-95％空气的条件下进行预培养。次日，更换为在添加有CaCl2而使Ca浓度为500μg/mL的α-MEM培养液950μL中添加样品或PBS(-)50μL并充分混合而得到的培养液，进一步培养72小时。成骨细胞的增殖活性通过细胞计数法进行测定。样品的成骨细胞增殖促进活性以将PBS(-)的生长值设为100时的相对值来表示。
(3)利用UF膜的分级
将卵黄蛋白水解物60g溶解于水600mL，使用UF膜(分级分子量：1kDa、日本密理博株式会社制造)进行分级，对于分子量1kDa以下的级分和分子量1kDa以上的级分测定成骨细胞增殖活性。作为阳性对照，使用未分级的卵黄蛋白水解物(1mg/mL)。对于分子量1kDa以下的级分和分子量1kDa以上的级分，添加与未分级的卵黄蛋白水解物中的各个级分的含量相当的量(与卵黄蛋白水解物0.2mg相当的量)。
将结果示于图1。由图1表明，在分子量1kDa以上的级分中确认到成骨细胞增殖活性。
(4)利用阴离子交换柱的分级
将上述(3)中确认到成骨细胞增殖活性的分子量1kDa以上的级分供于阴离子交换柱(树脂：Dowex、柱尺寸：φ10mm×63mm)，对于直接通过的级分和以各NaCl浓度(750mM或1M)的水溶液洗脱、分级而得到的各级分测定成骨细胞增殖活性。作为阳性对照，使用未分级的卵黄蛋白水解物(1mg/mL)。对于各级分，添加与未分级的卵黄蛋白水解物中的各个级分的含量相当的量(与卵黄蛋白水解物10mg相当的量)。
将结果示于图2。由图2表明，在750mM NaCl洗脱级分中确认到最强的成骨细胞增殖活性。
(5)利用HPLC的分级(第1次)
将上述(4)中确认到最强的成骨细胞增殖活性的750mM NaCl洗脱级分利用C18-反相柱(柱尺寸：φ50mm×250mm)进行分级，以1分钟的间隔分取洗脱时间0～45分钟的级分。HPLC的条件如下所述。
柱：“C18-反相柱、尺寸：φ50mm×250mm)”(株式会社ハイペップ研究所制造)
流动相：(A)10％乙腈/0.1％TFA
(B)60％乙腈/0.1％TFA
B 5％→95％(40分钟)梯度
检测：UV215nm
样品量：601mg
将所得到的45个级分以每5个级分进行混合，作为G1～G9(参考图3)、对其测定成骨细胞增殖活性。对于各级分，添加与未分级的卵黄蛋白水解物中的各个级分的含量相当的量(与卵黄蛋白水解物66mg相当的量)。作为阳性对照，使用未分级的卵黄蛋白水解物(1mg/mL)。
将结果示于图4。由图4表明，在G3中确认到强的成骨细胞增殖活性。
接着，对于G3的5个级分(级分11～15)和G4的5个级分(级分16～20)测定成骨细胞增殖活性。对于各级分，添加与未分级的卵黄蛋白水解物中的各个级分的含量相当的量(与卵黄蛋白水解物66mg相当的量)。作为阳性对照，使用未分级的卵黄蛋白水解物(1mg/mL)。
将结果示于图5。由图5表明，在级分11～20的任意一个级分中均确认到强于对照的成骨细胞增殖活性。
(6)利用HPLC的分级(第2次)
对于级分11～20，进一步以下述条件进行HPLC。
柱：商品名“ODS-A(10×4.6mmI.D.)”(YMC公司制造)
流动相：4％乙腈/0.1％TFA(等度)
温度：40℃
检测：UV215nm
样品量：50μg
级分11～20中，在级分12中检测出2个明确的峰(参考图6)，因此，对该级分12进行分析。即，将级分12供于上述条件的HPLC，分取包含峰1和峰2的级分(参考图6)。对于包含峰1的级分(峰1)、包含峰2的级分(峰2)以及峰1和峰2以外的级分(其他)，测定成骨细胞增殖活性。对于各级分，添加与未分级的卵黄蛋白水解物中的各个级分的含量相当的量(与卵黄蛋白水解物133mg相当的量)。需要说明的是，作为阳性对照，使用未分级的卵黄蛋白水解物(1mg/mL)。
将结果示于图7。由图7表明，在包含峰2的级分中确认到最强的成骨细胞增殖活性。
(7)肽的鉴定
使用MALDI-TOF-MS(质谱分析仪)对包含峰2的级分中含有的肽的氨基酸序列进行分析。由它们的分析结果表明，在包含峰2的级分中，至少存在图8所示的6种肽。这些肽为卵黄中含有的卵黄脂磷蛋白1的片段，在卵黄脂磷蛋白1的氨基酸序列(序列号8)中，No.1对应于第1045位-第1052位、No.2对应于第1045位-第1051位、No.3对应于第1047位-第1051位、No.4对应于第1053位-第1059位、No.5对应于第1052位-第1059位、No.6对应于第1045位-第1059位。
[实施例2：使用合成肽的成骨细胞增殖促进活性的研究]
对实施例1中鉴定的具有成骨细胞增殖促进活性的6种肽进行化学合成，测定成骨细胞增殖促进活性。肽的合成使用肽自动合成装置Syro II(Biotage日本株式会社制造)。
利用与实施例1相同的方法测定各合成肽的成骨细胞增殖活性。在各孔中添加各合成肽，使浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL。在对照中添加PBS(-)。成骨细胞的增殖促进活性以将PBS(-)的生长值设为100时的相对值来表示。
将No.1的结果示于图9，将No.2和No.3的结果示于图10，将No.4和No.5的结果示于图11，将No.6的结果示于图12。由图9～12表明，任意一种合成肽均浓度依赖性地促进成骨细胞的增殖。
[实施例3：利用合成肽的生长期大鼠的骨伸长促进作用的研究]
使用胃管以1天1次对3周龄的Sprague-Dawley系雄性大鼠分别强制口服给药4天合成肽(No.1)或生理食盐液(对照)。合成肽的用量为1mg/kg/天、10mg/kg/天或100mg/kg/天。另外，作为阳性对照，以20μg/kg/天、1天1次皮下给药4天人生长激素(hGH；humangrowth hormone、诺德欣(Norditropin)、日本标准商品分类编号872412)。在第4天给药后，皮下给予钙黄绿素，再饲养1天。将大鼠在麻醉下放血使其安乐死，采集胫骨，制作胫骨生长板的组织标本，使用荧光显微镜测定胫骨生长板中形成的钙黄绿素的沉积面(荧光区域)，由此观察骨的伸长幅度。
将结果示于图13。由图13表明，确认到胫骨生长板的伸长幅度依赖于合成肽的给药量而增加。最大给药量时的作用与皮下给药人生长激素时观察到的伸长幅度的增加量基本同等。由该结果表明，本发明的肽通过口服给药能够促进骨形成。
[实施例4：使用合成肽的软骨细胞增殖促进活性的研究]
使用具有向软骨细胞分化的分化能力的小鼠来源细胞株ATDC5(理研细胞库(RIKEN BANK)、RBC0565)。将处于对数生长期的ATDC5悬浮于含有5％FCS(胎牛血清)的Eagle MEM培养基中，制备细胞悬浮液(3×104个/mL)，以每孔100μL接种到96孔板中，在5％CO2-95％空气、37℃的条件下进行预培养。次日，除去全部培养基，添加含有10nmol/mL合成肽(No.1或No.6)的培养基，培养72小时。在对照中添加不含合成肽的培养基。在各孔中添加细胞计数试剂盒8(同仁化学研究所)的反应溶液(10μg/孔)，孵育3小时后，用酶标仪测定450nm的吸光度。合成肽的软骨细胞增殖促进活性以将对照的吸光度(增殖值)设为100％时的相对值来表示。
将结果示于图14。由图14表明，在合成肽No.6和作为其片段的合成肽No.1这两者中均确认到软骨细胞的增殖促进作用。
[实施例5：使用合成肽的透明质酸产生促进活性的研究]
使用与实施例4相同的小鼠来源细胞株ATDC5细胞。将处于对数生长期的ATDC5以2×104个/mL/孔接种到24孔板中，使用含有5％FCS(胎牛血清)、10μg/ml转铁蛋白、3×10-8M亚硒酸钠的DMEM/F-12(1:1)培养基，在5％CO2-95％空气、37℃的条件下进行预培养。次日，除去全部培养基，添加含有10nmol/mL合成肽(No.1或No.6)的培养基，培养72小时。在对照中添加不含合成肽的培养基。回收培养48小时后的培养上清，使用QnE透明质酸ELISA检测剂(Biotech Trading Partners)测定透明质酸浓度。将减去与背景相当的吸光度后的值应用于利用标准物质预先制作的标准曲线，算出合成肽添加组中的培养上清中的透明质酸浓度。
将结果示于图15。由图15表明，在合成肽No.6和作为其片段的合成肽No.1这两者中均确认到透明质酸产生促进作用。
[实施例6：利用合成肽的骨密度恢复试验]
对3周龄的Sprague-Dawley系雄性大鼠给予低钙饮食(以碳酸钙计为0.05％)，进行1周预饲养后，转换为普通饮食(以碳酸钙计为1.2％)，使用胃管以1天1次分别强制口服给药7天合成肽(No.1)或生理食盐液(对照)。合成肽的用量为1mg/kg/天、10mg/kg/天或100mg/kg/天。在第7天的口服给药后，将大鼠在麻醉下放血使其安乐死，摘除股骨和胫骨，利用双能X射线吸收测定(DXA)法和周围骨定量的计算机断层摄影(pQCT)法进行胫骨和股骨的骨量和骨形态测量。结果，与对照组相比，在合成肽给药组中确认到胫骨的长度、重量和骨密度增加的倾向，显示出促进了因钙缺乏而降低的骨密度的恢复。
[实施例7：使用卵巢摘除大鼠的闭经后骨质疏松症模型中的研究]
对实施了卵巢摘除手术(OVX)的雌性大鼠(8月龄、各10例/组)从手术次日开始使用胃管以1天1次强制口服给药6个月的合成肽No.1。合成肽的用量为1mg/kg/天、10mg/kg/天或100mg/kg/天。结果，在OVX-合成肽给药组中，随着合成肽给药量的增加，股骨骨干端远端部的骨密度增加，与OVX对照组(合成肽非给药组)相比确认到显著的增加。另外，在中等用量给药组(10mg/kg/天)和高用量给药组(100mg/kg/天)中，与未摘除卵巢的假手术组为同等程度以上。另外，关于骨形态测量参数，在OVX-合成肽给药组中，随着给药量的增加，胫骨骨干端近端部的松质骨骨量增加，与OVX对照组相比确认到显著的增加，在中用量给药组和高用量给药组中，与未摘除卵巢的假手术组为同等程度以上。另外，由OVX导致的骨小梁数和骨小梁宽度的减少以及骨小梁间隔的增大在OVX-合成肽给药组中观察到被抑制的倾向。
[实施例8：成熟大鼠和老年大鼠中的骨形成促进作用]
对成熟雌性大鼠(8月龄、各10例/组)使用胃管以1天1次强制口服给药20周合成肽No.1。合成肽的用量为1mg/kg/天、10mg/kg/天或100mg/kg/天。另外，作为阳性对照，以1天1次连续皮下给药20周阿仑膦酸钠水合物(以下称为“阿仑膦酸”)(300μg/kg)。结果，在给药结束时，股骨的骨密度和胫骨骨干端近端部的松质骨骨量在合成肽给药组和阿仑膦酸给药组中与对照组相比显著地增加，合成肽给药组和阿仑膦酸给药组中的增加程度为同等程度。
对老年雌性大鼠(13～14月龄、各10例/组)使用胃管以1天1次强制口服给药20周合成肽No.1。合成肽的用量为1mg/kg/天、10mg/kg/天或100mg/kg/天。另外，作为阳性对照，以1天1次连续皮下给药20周阿仑膦酸(300μg/kg)。结果，股骨的骨密度和胫骨骨干端近端部的松质骨骨量在合成肽给药组中以用量依赖性的方式增加。
[实施例9：破骨细胞培养系中的骨吸收抑制作用]
将由兔的长管骨和肩胛骨制备的破骨细胞粗级分在象牙切片上在合成肽(0.0001～1000μmol/L)存在下培养48小时，结果，确认到浓度依赖性的吸收陷窝的总面积的减少。另外，将对破骨细胞粗级分进行胶原蛋白处理而制备的分离破骨细胞利用合成肽(0.0001～1000μmol/L)进行15分钟预处理后，在象牙切片上培养24小时，结果，确认到浓度依赖性的吸收陷窝的总面积的减少。
[实施例10：使用合成肽的间充质干细胞增殖促进活性的研究]
将小鼠间充质干细胞10T1/2(JCRB细胞编号：JCRB9080)或ST2(理研BRC ID：RCB0224)以每孔5000个接种到装有添加了10％胎牛血清的DMEM培养基的96孔板中，分别以0.1～100nmol/ml添加合成肽，培养72小时。每100μL培养液添加10μL的细胞计数试剂盒8(同仁化学研究所)，在37℃下孵育1～4小时。然后，使用酶标仪对450nm下的吸光度进行测定。结果，通过添加合成肽，10T1/2和ST2的增殖活性显著升高。
[实施例11：使用合成肽的间充质干细胞分化诱导作用的研究]
将小鼠间充质干细胞10T1/2或ST2以每孔5000个接种到装有添加了10％胎牛血清的DMEM培养基的96孔板中，分别以0.1～100nmol/ml添加合成肽，培养4天后，更换为添加有β甘油磷酸I(10mM)和抗坏血酸(50μg/ml)的DMEM培养基。此时，对含有上述合成肽的培养基和不含上述合成肽的培养基分别进行研究。在该培养基中进一步进行3天培养(总计为7天)后，将细胞固定。固定后，使用碱性磷酸酶底物试剂盒I<VECTOR Red>(Vector实验室)进行碱性磷酸酶的活性染色。结果，在添加有合成肽的细胞中，确认到强碱性磷酸酶活性。另一方面，在非添加的细胞中，未确认到这样的活性。即，通过添加合成肽，在4天这样较短的时间内，能够有效地诱导从未分化的间充质干细胞向成骨细胞样细胞(骨祖细胞)的分化。
[实施例12：使用合成肽的软骨祖细胞的分化诱导作用的研究]
将具有向软骨细胞分化的分化能力的小鼠EC(胚胎癌)来源的克隆化细胞株ATDC5(理研BRC ID：RCB0565)在含有5％FBS的DMEM/F-12培养基中进行培养。将ATDC细胞以2×104个/孔接种到48孔板中。24小时后除去培养上清，添加含有10ng/mL胰岛素的DMEM/F-12培养基。同时以0.1～100nmol/ml的浓度添加合成肽。作为阳性对照，添加1ng/mL和5ng/mL的BMP-2或BMP-4(R&D)。每3～4天更换培养基。
进一步，为了确认合成肽与BMP-2或BMP-4的协同效果，同时添加0.1～100nmol/ml的合成肽与1ng/mL的BMP-2或BMP-4。一边反复更换培养基，一边进行14天培养后，利用10％福尔马林中性缓冲液进行细胞的固定。固定后，利用阿利新蓝液进行4小时染色，清洗色素后使板干燥，拍摄照片。
在小鼠软骨祖细胞ATDC5细胞中，通过添加合成肽，确认到阿利新蓝阳性结节的形成，且其数量依赖于浓度而增加。这显示合成肽使ATDC5细胞分化为软骨细胞。此外，显示出与BMP-2或BMP-4的协同效果。
[实施例13：使用成骨样细胞的骨形成因子的分析]
使用以合成肽浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的方式分别添加有合成肽的含有10％FBS的α-MEM培养液，在37℃、5％CO2-95％空气的条件下将小鼠成骨细胞样细胞株MC3T3-E1亚克隆-4(ATCC No.CRL-2593)培养72小时。培养结束后，利用对硝基苯基磷酸底物法测定成骨样细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。进一步，使用骨钙蛋白测定用试剂盒(宝生物)，利用ELISA测定培养上清中的骨钙蛋白(OCN)量。结果，ALP活性和OCN量依赖于合成肽的添加浓度而显示出增加倾向。ALP、OCN被认为是反映骨形成功能的因子，暗示出各合成肽通过这样的相关因子促进成骨样细胞的骨形成功能。
[实施例14：利用合成肽的生长软骨和初级松质骨的骨形成促进作用的研究]
使用胃管以1天1次对4周龄的Crlj:W1雄性大鼠分别强制口服给药7天合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝3)。合成肽(No.1)的用量为100mg/kg/天。另外，作为阳性对照，以500μg/kg/天、1天1次皮下给药7天人生长激素(hGH；诺德欣、日本标准商品分类编号872412)。作为骨形成部位的荧光标记，在给药第4天后皮下给予四环素(20mg/kg)、在给药第6天后皮下给予钙黄绿素(10mg/kg)。在第7天给药样本后，在断食条件下饲养大鼠。24小时后采血，然后将大鼠在麻醉下放血使其安乐死，采集胫骨(参考图16)。然后，对于胫骨近端部制作非脱钙标本，利用荧光显微镜(奥林巴斯公司制造的BX-53)获取图像，使用形态测量系统(Histometry RT digitizer，System Supply Co.,Ltd.)和分析软件(CSS-840松质骨形态测量版，System Supply Co.,Ltd.)进行骨形态测量。在生长软骨的纵向的生长率(Lo.G.R；Longitudinal Growth Rate)的测量中，关于生长率，测量四环素和钙黄绿素的标记宽度，由这些荧光标记的给予间隔(2天)算出每一天的生长宽度。
结果，hGH给药组和No.1给药组相对于对照组显示出显著的骨生长促进作用，No.1给药组相对于hGH给药组也显示出显著的骨生长促进作用(图17)。此外，相对于对照组和hGH给药组，No.1给药组高频率地检测出摄取到初级松质骨中的荧光标记，暗示出在生长期中早期诱导了松质骨的形成(图18；白色部位)。
另外，对血清中的胰岛素样生长因子(IGF-1)浓度进行ELISA(R&D公司制造的小鼠/大鼠IGF-I Quantikine ELISA试剂盒；MG100)测定，结果，相对于对照组，hGH给药组和No.1给药组的IGF-1浓度为高值(图19)。暗示出在生长期中参与骨、肌肉发育的IGF-1的增加可能是带来上述骨生长促进作用的因素之一。
由这些结果表明，本发明的肽通过口服给药可促进纵向的骨生长和作为内部结构的松质骨的形成。
[实施例15：利用合成肽的生长软骨和次级松质骨的骨形成促进作用的研究]
使用胃管以1天1次对4周龄的Crlj:W1雄性大鼠分别强制口服给药21天合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝3)。合成肽的用量为100mg/kg/天。另外，作为阳性对照，以500μg/kg/天、1天1次皮下给药21天人生长激素(hGH；诺德欣、日本标准商品分类编号872412)。作为骨形成部位的荧光标记，在给药第18天后皮下给予四环素(20mg/kg)、在给药第20天后皮下给予钙黄绿素(10mg/kg)。在第21天给药样本后，在断食条件下饲养大鼠。24小时后，将大鼠在麻醉下放血使其安乐死，采集胫骨(参考图20)。然后，对于胫骨近端部制作非脱钙标本，利用荧光显微镜(奥林巴斯公司制造的BX-53)获取图像，使用形态测量系统(Histometry RT digitizer，System Supply Co.,Ltd.)和分析软件(CSS-840松质骨形态测量版，System Supply Co.,Ltd.)进行骨形态测量。在骨端软骨的纵向的生长率(Lo.G.R；Longitudinal Growth Rate)的测量中，关于生长率，测量四环素和钙黄绿素的标记宽度，由这些荧光标记的给予间隔(2天)算出每一天的生长宽度。
结果，hGH给药组和No.1给药组相对于对照组显著地显示出骨生长促进作用，No.1给药组相对于hGH给药组也显示出显著的骨生长促进作用(图21)。由此显示出，本发明的肽在更长期的口服给药条件下也可促进纵向的骨生长。
进一步，利用上述分析系统对次级松质骨的骨量(BV；Bone volume/TV；Tissuevolume)进行分析，结果，相对于对照组和hGH给药组，No.1给药组的次级松质骨的骨量为高值(图22)。另外，No.1给药组中，成骨细胞所局限的骨表面积相对于总骨表面积的比例(Ob.S；Osteoblast surface/BS；Bone surface)为高值(图23)，破骨细胞所局限的骨表面积相对于总骨表面积的比例(Oc.S；Osteoclast surface/BS；Bone surface)为低值(图24)。
由这些结果显示出，通过口服给药本发明的肽，能够诱导成骨细胞的增加、向破骨细胞的分化抑制所介导的形成占优势的骨代谢。
[实施例16：利用合成肽的次级松质骨的骨钙化速度的增加作用的研究]
使用胃管以1天1次对4周龄的Crlj:W1雄性大鼠分别强制口服给药7天合成肽(No.1)或注射水(对照)(各组：n＝10)。合成肽的用量为1mg/kg/天、10mg/kg/天和100mg/kg/天。另外，作为阳性对照，以500μg/kg/天、1天1次皮下给药7天人生长激素(hGH；诺德欣、日本标准商品分类编号872412)。作为骨形成部位的荧光标记，在给药第4天后皮下给予四环素(20mg/kg)、在给药第6天后皮下给予钙黄绿素(10mg/kg)。在第7天给药样本后，在断食条件下饲养大鼠。24小时后，将大鼠在麻醉下放血使其安乐死，采集胫骨。然后，对于胫骨近端部制作非脱钙标本，利用荧光显微镜(奥林巴斯公司制造的BX-53)获取图像，使用形态测量系统(Histometry RT digitizer,System Supply Co.,Ltd.)和分析软件(CSS-840松质骨形态测量版，System Supply Co.,Ltd.)进行骨形态测量。关于次级松质骨的骨钙化速度(MAR：Mineral Apposition Rate)，测量次级松质骨中的四环素和钙黄绿素的标记宽度，由这些荧光标记的给予间隔(2天)算出每一天的骨钙化速度。结果，与对照组相比，hGH给药组和No.1给药组的骨钙化速度显著增加。此外，No.1给药组中，在10mg/kg/天以上时，相对于hGH给药组也显示出显著的骨钙化速度的增加(图26)。No.1给药组中，成骨细胞所局限的骨表面积相对于总骨表面积的比例(Ob.S；Osteoblast surface/BS；Bone surface)为高值(图27)，单位骨组织的成骨细胞数(N.Ob；Number of osteoblast/TV：Tissue volume)也为高值(图28)。认为No.1给药组中观察到的次级松质骨的骨钙化速度的增加可能起因于这样的成骨细胞的增加。另外，算出以骨表面积为基准在1年间所形成的骨量作为骨形成速度(BFR；Bone formation rate/BS；Bone surface)，结果，No.1给药组中为高值(图29)。No.1给药组中，在10mg/kg/天以上时，相对于对照组显示出显著的骨形成速度的增加。
由这些结果显示出，通过口服给药本发明的肽，次级松质骨的骨钙化得到促进，骨形成速度增加。
需要说明的是，本发明并不限定于上述各实施方式和实施例，可以在权利要求书所示的范围内进行各种变更，将不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围中。另外，本说明书中记载的学术文献和专利文献全部以参考的形式援引于本说明书中。

Claims (32)

1.一种肽或其衍生物或其盐，所述肽包含下述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列，氨基酸残基数为100以下，且具有成骨细胞增殖促进活性，
(a)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号1)；
(b)在(a)的氨基酸序列中具有1～3个氨基酸的保守性置换或缺失的氨基酸序列；
(c)由(a)或(b)的氨基酸序列中至少4个连续的氨基酸构成的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的肽或其衍生物或其盐，其中，具有至少一个磷酸化丝氨酸。
3.如权利要求1或2所述的肽或其衍生物或其盐，所述肽为卵黄脂磷蛋白1的片段。
4.如权利要求1～3中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，其还具有软骨细胞增殖促进活性和/或透明质酸产生促进活性。
5.如权利要求1～4中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，所述肽由选自下述(i)～(vi)中的氨基酸序列构成，
(i)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号1)；
(ii)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列号2)；
(iii)Val-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu(序列号3)；
(iv)Pro-Glu-Ser-Glu-Glu(序列号4)；
(v)Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号5)；
(vi)Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu(序列号6)。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1～5中任一项所述的肽。
7.一种表达载体，其含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种转化体，其利用权利要求7所述的重组载体进行了转化。
9.一种骨形成促进剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
10.如权利要求9所述的骨形成促进剂，其具有成骨细胞增殖促进作用。
11.一种骨吸收抑制剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
12.一种软骨细胞增殖促进剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
13.一种透明质酸产生促进剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
14.一种软骨祖细胞分化诱导剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
15.一种间充质干细胞增殖促进剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
16.一种间充质干细胞分化诱导剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
17.如权利要求9～16中任一项所述的剂，其用于口服给药。
18.一种药物，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
19.如权利要求18所述的药物，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
20.一种饮食品，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
21.如权利要求20所述的饮食品，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
22.一种营养补充剂，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
23.如权利要求22所述的营养补充剂，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
24.一种食品添加物，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
25.如权利要求24所述的食品添加物，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
26.一种化妆品，其特征在于，含有权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐，或者含有卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
27.如权利要求26所述的化妆品，其用于促进骨形成，或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病。
28.一种骨形成促进方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
29.一种软骨障碍或关节疾病的预防或改善方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
30.在骨形成促进、或者软骨障碍或关节疾病的预防或改善中使用的权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐。
31.权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐在促进骨形成、或者预防或改善软骨障碍或关节疾病中的应用。
32.权利要求1～5中任一项所述的肽或其衍生物或其盐、或者卵黄脂磷蛋白1或其衍生物或其盐在制造用于促进骨形成、或者用于预防或改善软骨障碍或关节疾病的药物中的应用。
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