JP6301831B2

JP6301831B2 - 軟骨細胞増殖促進剤

Info

Publication number: JP6301831B2
Application number: JP2014523779A
Authority: JP
Inventors: 金　武祚; 武祚金; 和哉渡部; 芝英安; 正義青笹; 典子堀江; 和二行益田; 克仁浅井
Original assignee: Everlife Co Ltd; Pharma Foods International Co Ltd
Current assignee: Everlife Co Ltd; Pharma Foods International Co Ltd
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2018-03-28
Anticipated expiration: 2033-07-04
Also published as: US10034911B2; US20150164973A1; CN104736164A; WO2014007318A1; JPWO2014007318A1

Description

本発明は、軟骨細胞増殖促進剤、軟骨障害の予防または改善剤、および関節痛等の軟骨に関わる疾病の予防または改善剤に関するものであり、詳細には卵黄タンパク質加水分解物を有効成分とする軟骨細胞増殖促進剤、軟骨障害の予防または改善剤、および関節痛等の軟骨に関わる疾病の予防または改善剤に関するものである。

各種軟骨疾患の予防および治療の過程においては、軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要である。すなわち、軟骨細胞の増殖、成熟化が骨の正常な成長や骨折した場合の修復をもたらすものと考えられている。軟骨細胞の増殖を誘導する因子としては、ＴＧＦ−β１（Transforming Growth Factor：形質転換増殖因子）、ＩＧＦ−１（Insulin-like Growth Factor：インスリン様成長因子）、ｂＦＧＦ（basic Fibroblast Growth Factor：塩基性繊維芽細胞成長因子）、ＰＴＨｒＰ（PTH-related peptide：副甲状腺ホルモン関連タンパク）、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor：肝細胞増殖因子）、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）等が報告されている。しかし、安全性、安定性、有効性に優れた軟骨細胞増殖促進薬の臨床的応用は確立されていない。

軟骨疾患の中でも、最も患者数の多い疾患は変形性関節症である。原因の一つとして加齢が考えられ、これからの高齢化社会においては本症例の増加が予想される。関節疾患など軟骨の変性を主病変とする軟骨障害の予防と治療には、従来、エストロゲン、カルシトニンなどの骨吸収抑制物質、アスピリンや非ステロイド性消炎剤（ＮＳＡＩＤ）が主に使用されてきたが、十分な効果が得られていないばかりか、消化管障害などの有害作用はよく知られている。それゆえ、軟骨損傷や軟骨障害の治療において安全に用いられる予防または改善剤が強く求められている。

一方、本願発明者らは、以前から卵黄タンパク質加水分解物の機能について研究しており、抗酸化作用（特許文献１）、骨強化作用（特許文献２）などを見出している。しかし、軟骨に対する作用は報告されていない。

特開２００１−３２８９１９号公報国際公開第ＷＯ２００６／０７５５５８号

本発明は、軟骨損傷や軟骨障害等の軟骨に関わる疾病の予防、改善または治療において、安全に用いることができる新規な有効成分を提供することを課題とする。

本発明は上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］卵黄タンパク質加水分解物を有効成分として含有することを特徴とする軟骨細胞増殖促進剤。
［２］卵黄タンパク質加水分解物を有効成分として含有することを特徴とする軟骨障害および／または関節痛の予防または改善剤。
［３］軟骨障害および／または関節痛の予防または治療のための医薬であって、前記［１］に記載の軟骨細胞増殖促進剤を含む医薬。
［４］軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のためのサプリメントであって、前記［１］に記載の軟骨細胞増殖促進剤を含むサプリメント。
［５］軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のための食品添加剤であって、前記［１］に記載の軟骨細胞増殖促進剤を含む食品添加剤。
［６］軟骨細胞増殖促進剤を製造するための卵黄タンパク質加水分解物の使用。
［７］軟骨障害および／または関節痛の予防または改善剤を製造するための卵黄タンパク質加水分解物の使用。
［８］卵黄タンパク質加水分解物を軟骨細胞の増殖促進が必要なヒトに経口的に摂取させることを特徴とする非治療的な軟骨障害または関節痛の予防または改善方法。
［９］卵黄を脱脂処理する工程、得られた脱脂卵黄をタンパク質加水分解酵素を用いて加水分解して卵黄タンパク質加水分解物を得る工程、得られた、卵黄タンパク質加水分解物を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする軟骨細胞増殖促進剤の製造方法。

本発明により、軟骨細胞増殖促進剤、軟骨障害の予防または改善剤、および関節痛の予防または改善剤を提供することができる。有効成分である卵黄タンパク質加水分解物は、天然物由来の安全なものであるので、日常的に摂取可能な飲食品、医薬、飼料等として、広く使用が可能である。

実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物のゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量分析の結果を示した図である。ウサギ軟骨欠損モデルの膝関節欠損処置部のパラフィン切片をアルシアンブルー染色し、アルシアンブルー染色面積を対照群と比較した結果を示す図である。ウサギ軟骨欠損モデルの膝関節欠損処置部のパラフィン切片をサフラニンＯ染色し、サフラニンＯ染色面積を対照群と比較した結果を示す図である。卵黄タンパク質加水分解物の服用による膝関節痛患者の痛み改善効果を検討した結果を示す図である。実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物のゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量分析の結果を示した図である。実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物を分画し、得られた分画物のゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量分析の結果を示した図である。

本発明は、卵黄タンパク質加水分解物を有効成分として含有する軟骨細胞増殖促進剤、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善剤を提供する。
卵黄タンパク質加水分解物は、特に限定されないが、卵黄タンパク質を加水分解して得られるものが好ましい。卵黄タンパク質加水分解物の原料として用いる卵黄は、鶏、アヒル、うずら等の卵黄が挙げられるが、生産性の点から鶏の卵黄が好ましく用いられる。卵黄は、卵黄液、卵黄粉末、脱脂卵黄粉末等を用いることができ、中でも卵黄粉末、脱脂卵黄粉末が好ましく用いられる。また、資源の有効利用やコストの点から、卵黄から卵黄油や卵黄レシチンを製造する際に副産物として生じる脱脂卵黄を用いることが好ましい。卵黄の脱脂処理は、卵黄に食品加工に使用可能な有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、ヘキサンなどの少なくとも一種）を作用させて実施するのが好ましい。簡便性と安全性の点からエタノールが好ましく用いられる。

卵黄タンパク質を加水分解するために用いるタンパク質加水分解酵素は、特に限定されないが、プロテアーゼ活性またはカルボキシペプチダーゼ活性を有し食品製造に使用可能な酵素が好ましい。例えば、ペプシン（EC.3.4.23.1）、トリプシン（EC.3.4.21.4）、レニン（EC.3.4.23.15）、レニンを含むチーズ用途のレンネット、カルボキシペプチダーゼＡ（EC.3.4.17.1）、バチルス属細菌由来のプロテアーゼ（商品名「アルカラーゼ」ノボザイム社製、商品名「オリエンターゼ２２ＢＦ」エイチビィアイ株式会社製、商品名「ヌクレイシン」エイチビィアイ株式会社製、商品名「プロテアーゼＳ『アマノ』Ｇ」天野エンザイム株式会社製、商品名「サモアーゼＰＣ１０」大和化成株式会社製等）、アスペルギルス属麹菌由来プロテアーゼ（商品名「オリエンターゼＯＮＳ」エイチビィアイ株式会社製、商品名「オリエンターゼ２０Ａ」エイチビィアイ株式会社製、商品名「プロテアーゼＰ『アマノ』３Ｇ」天野エンザイム株式会社製、商品名「フレーバーザイム」ノボザイム社製等）などが挙げられる。タンパク質加水分解酵素は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。好ましくは、バチルス属細菌由来のプロテアーゼ、ペプシンまたはこれらの組み合わせである。

タンパク質加水分解酵素の濃度は、使用する原料卵黄および酵素に応じて適宜変動するが、原料に脱脂卵黄を用いる場合、酵素と脱脂卵黄の質量比が約１：２０から約１：１０００の範囲が好ましい。また、酵素反応温度や反応時間も使用する原料卵黄および酵素により異なるが、約２５〜約７５℃で約１〜約２４時間加水分解を行うことが好ましい。
得られた卵黄タンパク質加水分解物は、適宜脱塩してそのまま用いることができる。また、限外ろ過膜、ゲルろ過や各種カラムクロマトグラフィー、メンブレンフィルター、等電点を利用した方法などで精製や分画して用いてもよい。精製、分画後の卵黄タンパク質加水分解物が軟骨細胞増殖促進作用を有することは、例えば実施例２に記載の方法で確認することができる。

得られた卵黄タンパク質加水分解物は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量約１００以上約２０，０００以下の部分の面積比が約６５％以上を占めることが好ましく、前記面積比が約７５％以上を占めることがより好ましく、前記面積比が約８５％以上を占めることがさらに好ましく、前記面積比が約９０％以上を占めることがさらに好ましい。
また、より好ましい卵黄タンパク質加水分解物としては、分子量１，０００の限外濾過膜を用いた分画により得られた卵黄タンパク質加水分解物であって、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量約５００以上約２０，０００以下の部分の面積比が約８５％以上、好ましくは約９０％以上を占める卵黄タンパク質加水分解物が挙げられる。

このようにして得られた卵黄タンパク質加水分解物は、軟骨細胞増殖促進作用、軟骨障害の予防、治療または改善作用、関節痛の予防、治療または改善作用等を有しているので、軟骨細胞増殖促進剤、軟骨障害の予防、治療または改善剤、および関節痛の予防、治療または改善剤等の有効成分として好適に用いることができる。軟骨障害としては、例えば変形性関節症、軟骨の欠損、軟骨損傷、半月板損傷などが挙げられる。

本発明の軟骨細胞増殖促進剤、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善剤において、卵黄タンパク質加水分解物の含有量は特に限定されるものではないが、卵黄タンパク質加水分解物を約０．０５〜約５０質量％含むことが好ましく、約０．１〜約２５質量％含むことがより好ましい。また、卵黄タンパク質加水分解物の１日当たりの投与量は投与対象により異なるが、例えば対象が成人ヒトの場合、通常約０．０５〜約２０００ｍｇ／日であり、好ましくは約０．１〜約１０００ｍｇ／日である。

本発明は、軟骨障害および／または関節痛の予防または治療のための医薬を提供する。本発明の医薬は、上記本発明の軟骨細胞増殖促進剤を含むものであればよい。本発明の医薬は、経口または非経口のいずれかの経路で哺乳動物に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）などが挙げられる。これらの製剤は、当該分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等を担体として使用できる。

経口用の固形剤（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等）は、有効成分を賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸等）等と混合し、常法に従って製剤化することができる。必要に応じて、コーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。

経口用の液剤（水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等）は、有効成分を一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノールまたはそれらの混液等）に溶解、懸濁または乳化して製剤化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。

注射剤は、溶液、懸濁液、乳濁液、および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、有効成分を溶剤に溶解、懸濁または乳化して製剤化される。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。

本発明は、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のためのサプリメントを提供する。本発明のサプリメントは、上記本発明の軟骨細胞増殖促進剤を含むものであればよい。本発明のサプリメントは、経口用の固形剤（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等）または経口用の液剤等の形態で実施することができる。これらの製剤は、上述の医薬と同様の手法により製剤化することができる。

本発明は、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のための飲食品を提供する。本発明の飲食品は、上記本発明の軟骨細胞増殖促進剤を含むものであればよい。飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品が含まれる。飲食品の形態は特に限定されない。例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などを挙げることができる。

本発明は、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のための食品添加剤を提供する。本発明の食品添加剤は、上記本発明の軟骨細胞増殖促進剤を含むものであればよい。本発明の食品添加剤の形態は特に限定されないが、例えば、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、顆粒状等が挙げられる。本発明の食品添加剤には、飲料用の添加剤も含まれる。本発明の食品添加剤は、一般的な食品添加剤の製造方法に準じて製造することができる。

本発明は、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のための飼料を提供する。本発明の飼料は、上記本発明の軟骨細胞増殖促進剤を含むものであればよい。飼料としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ等の家禽用飼料、イヌ、ネコ等のペット用飼料などが挙げられる。本発明の飼料は、飼料中に本発明の軟骨細胞増殖促進剤等を添加する以外、一般的な飼料の製造方法を用いて加工製造することができる。

本発明の軟骨細胞増殖促進剤、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善剤の有効成分である卵黄タンパク質加水分解物は、食経験の長い卵黄に存在する成分であるため安全性が高く、作用がマイルドであり長期間の摂取または使用が可能である。また、有効成分の卵黄タンパク質加水分解物は、複数の作用を兼ね備えた多機能成分であり、軟骨疾患治療のために使用される他の有効成分と組み合わせて使用することにより、相加的または相乗的な効果の向上が期待できる。軟骨疾患治療のために使用される他の有効成分としては、例えば、グルコサミン、コンドロイチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、Ｎ−アセチルグルコサミン等が挙げられる。

本発明には、卵黄タンパク質加水分解物の有効量を軟骨細胞の増殖促進が必要なヒトに投与する軟骨障害または関節痛の予防、治療または改善方法が含まれる。また、卵黄タンパク質加水分解物を軟骨細胞の増殖促進が必要なヒトに経口的に摂取させる非治療的な軟骨障害または関節痛の予防または改善方法も含まれる。なお、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体または動物の体への処置行為を含まない概念である。

本発明には、軟骨細胞増殖促進剤の製造方法が含まれる。本発明の製造方法は、卵黄を脱脂処理する工程、得られた脱脂卵黄をタンパク質加水分解酵素を用いて加水分解し、卵黄タンパク質加水分解物を得る工程、得られた、卵黄タンパク質加水分解物を有効成分として含有させる工程を有するものであればよい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例１：卵黄タンパク質加水分解物の製造〕
（１）脱脂卵黄の調製
卵黄粉末１ｋｇにエタノール５Ｌを加え、ブレンダーで３０分間攪拌したのち固形物を回収した。この操作を３回繰り返して卵黄から脱脂を行い、風乾し、５６８ｇの脱脂卵黄粉末を得た。
（２）卵黄タンパク質加水分解物の調製
（１）で得られた脱脂卵黄粉末５００ｇに水２．５ｋｇおよびノボザイムズ社製のアルカラーゼ（商品名、Bacillus licheniformis 由来のプロテアーゼ）２５ｇを加え、ｐＨを７にあわせて、５５℃で３時間酵素反応させ、その後、８０℃で１５分間の熱処理で酵素を失活させ、３０００×ｇで２０分間遠心分離し、不溶物を除去し、ろ過後、ろ液をスプレー乾燥して、約１４０ｇの卵黄タンパク質加水分解物を得た。

得られた卵黄タンパク質加水分解物について、以下の条件のゲル濾過クロマトグラフィーで分子量の分析を行った。
カラム：Ｄｉｏｌ６０（６．０×３００ｍｍ）（商品名、ワイエムシイ社製）
溶出液：０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．２ＭＮａＣｌ（ｐＨ６．９）／アセトニトリル（７０：３０）
流速：０．７ｍｌ／分
検出波長：２８０ｎｍ
分子量分析の結果を図１に示した。図１から、実施例１の卵黄タンパク質加水分解物はタンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計を示す全面積に対して、分子量１００以上２０，０００以下の部分の面積比が約９０％を占めることが明らかとなった。

〔実施例２：卵黄タンパク質加水分解物の軟骨細胞増殖に対する効果の検討〕
卵黄タンパク質加水分解物として上記実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物を用いた。
細胞には、マウス胚細胞由来の軟骨細胞様に分化するＡＴＤＣ５（ＲＩＫＥＮＢＡＮＫ、ＲＢＣ０５６５）培養細胞株を用いた。ＡＴＤＣ５を９６ウェルプレートに２×１０^４個／ｃｍ^２の密度で播種し、５％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有イーグルＭＥＭ培地を用いて５％ＣＯ_２下、３７℃で培養した。１日間培養後、血清を含まないイーグルＭＥＭ培地で１回洗浄し、９５μｌのイーグルＭＥＭ培地を各ウェルに添加した後、５μｌの試験液を入れ３日間３７℃で培養した。試験液には、卵黄タンパク質加水分解物を、イーグルＭＥＭ培地に溶解した後０．４５μｍのフイルターでろ過滅菌したものを用いた。試験液の卵黄タンパク質加水分解物濃度は１ウェルに５μｌを添加した時に、終濃度が１ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。３日間培養後、細胞数をＭＴＴ法で測定した。

結果を表１に示した。卵黄タンパク質加水分解物無添加群の細胞数を１００％とした場合の添加群の細胞数を％値（増殖値）として算出した。表１に示したように、卵黄タンパク質加水分解物は、ＡＴＤＣ５細胞を用量依存的に増加させ、即ち軟骨細胞に対する増殖促進作用を有することが示された。

〔実施例３：ウサギ軟骨欠損モデルに対する卵黄タンパク質加水分解物の効果〕
３−１試験方法
（１）投与検体
卵黄タンパク質加水分解物として上記実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物を用いた。当該卵黄タンパク質加水分解物を精製水で５０ｍｇ／１５ｍＬ（５０ｍｇ／ｄａｙ群）、２００ｍｇ／１５ｍＬ（２００ｍｇ／ｄａｙ群）となるように用時調製し、懸濁液を投与検体とした。
（２）試験動物および試験条件
２２週齢のウサギ（Ｓｌｃ：ＪＷ、ＳＰＦ、雄、日本エスエルシー株式会社）を購入した。入手した動物は、５日間の検疫期間を設け、その後１日または７日間の馴化期間を設けた。動物は、設定温度２３℃、設定湿度５５％に維持された飼育室で飼育した。動物入手後、アルミニウム製ケージを用いて個別飼育した。飼料は、固型飼料（ＬＲＣ４、オリエンタル酵母工業株式会社）１２０ｇ／日を給餌した。飲料水は、水道水を自由に摂取させた。

（３）ウサギ軟骨欠損モデルの作製
ケタミン塩酸塩およびキシラジン塩酸塩の混合液を大腿筋に筋肉内投与して麻酔を行った。大腿部周辺を毛刈し、動物を仰臥位に固定し、５％ヒビテン液（登録商標、大日本住友製薬株式会社）の約１０倍希釈液、消毒用アルコールおよびイソジン液１０％で消毒後、リドカイン塩酸塩を左右大腿部皮下に２〜３ｍＬ投与した。左右大腿部について、外側の皮膚および筋膜をメスで切開して膝関節を露出させた。内側の膝蓋靱帯に沿って関節包を切開し、膝蓋骨を脱臼させた。各大腿骨関節溝に対し、２箇所（Φ２ｍｍ、Φ４ｍｍ）についてドリルを用いて骨面に対し垂直方向に骨孔を作製した。なお、損傷する際は、エンロフロキサシン添加（０．０５％）生理食塩液（株式会社大塚製薬工場）で術野および骨孔を洗浄した。切開した左右大腿部の筋膜、皮膚を縫合糸（ナイロン縫合糸、４−０、３−０、アルフレッサファーマー株式会社）を用いて縫合した。縫合後、イソジンゲル（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ株式会社）を塗布した。エンロフロキサシンを術後２日間、頸背部に皮下投与した。切開部感染防止のため、エリザベスカラーを術後１週間装着した。

（４）群構成および試験スケジュール
対照群（精製水投与）、５０ｍｇ／ｄａｙ群および２００ｍｇ／ｄａｙ群の３群を設けた。１群当たり３匹のウサギを用いた。損傷翌日から剖検前日までの３週間、１日１回強制経口投与（１５ｍＬ／匹）した。投与期間中は、１日１回一般状態および死亡の有無を観察した。
全例の剖検日に４％ペントバルビタールナトリウム耳介静脈内投与による麻酔下で腹大動脈から放血致死後、剖検し、損傷部位およびその周囲を肉眼的に観察した。
（５）病理組織学的評価および統計学的方法
大腿骨（損傷部位を含む）を摘出し、４％パラホルムアルデヒド／りん酸緩衝液で固定し、脱脂後、Ｋ−ＣＸで脱灰した。定法に従ってパラフィン包埋して、欠損処置部の中心部を標本とし、ＨＥ染色、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色標本を作製した。アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色標本において、染色部位の面積を市販ソフト（Microsoft Office Excel 2003）を用いて計測した。
各群のアルシアンブルー染色面積およびサフラニンＯ染色面積について平均および標準偏差を求め、対照群と５０ｍｇ／ｄａｙ群および対照群と２００ｍｇ／ｄａｙ群の有意差検定（ｔ検定）を実施した。有意水準は５％とし、５％未満（Ｐ＜０．０５）と１％未満（Ｐ＜０．０１）とに分けて表示した。

３−２結果
いずれの個体にも死亡例および瀕死例はみられず、投与期間を通じて一般状態に異常は認められなかった。剖検時の損傷部位肉眼所見では、５０ｍｇ／ｄａｙ群および２００ｍｇ／ｄａｙ群とも、骨孔の修復が進んでいることが観察された。特にΦ２ｍｍの骨孔の修復が顕著に進んでいた。
アルシアンブルー染色面積の結果を図２に示した。図２から明らかなように、５０ｍｇ／ｄａｙ群および２００ｍｇ／ｄａｙ群ともΦ２ｍｍの骨孔において、対照群と比較して有意な増加が認められた。この結果から、卵黄タンパク質加水分解物の経口投与により、軟骨基質成分である酸性ムコ多糖類が増加していることが明らかになった。
サフラニンＯ染色面積の結果を図３に示した。図３から明らかなように、２００ｍｇ／ｄａｙ群のΦ２ｍｍおよびΦ４ｍｍの骨孔において、対照群と比較して有意な増加が認められた。この結果から、卵黄タンパク質加水分解物の経口投与により、軟骨基質成分であるプロテオグリカン類が増加していることが明らかになった。

〔実施例４：膝関節痛患者に対する卵黄タンパク質加水分解物の効果〕
４−１試験方法
（１）検体
卵黄タンパク質加水分解物として上記実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物を用いた。当該卵黄タンパク質加水分解物を５０ｍｇ含有するハードカプセルを検体とした。プラセボには、卵黄タンパク質加水分解物を含有しないハードカプセル（賦形剤のみ含有）を用いた。

（２）試験群および被験者の選定基準
以下の選定基準１〜５により選定した膝関節痛患者（平均年齢５６．９歳）について、卵黄タンパク質加水分解物投与群（５０ｍｇ／日）およびプラセボ群の２群に分け試験を開始した。
〔選定基準〕
１．膝関節の痛みを自覚し医師が認めるもの
２．４０歳代〜７０歳代
３．試験実施日に来院することが可能な人
４．膝関節に対する投薬治療を受けていない人
５．治療を要する精神的な疾患がなく健康な者
６．試験に関する説明を受け同意を得たもの

（３）服用期間
いずれの群も、ハードカプセル１粒を毎日朝食後１回適当量の水で服用し、８週間継続摂取した。
（４）評価
ＷＯＭＡＣ（Western Orntario and McMaster Universities Osteoarthritis Index）アンケートにより評価した。ＷＯＭＡＣは、変形性膝関節症の主観的痛みや主観的身体機能に対する世界的に用いられている指標であり、医師が問診し状態を判断し記入した。服用開始前、服用開始４週間目および８週間目に実施した。服用開始前の評価に偏りがないように群分けを行った。

４−２結果
結果を図４に示した。最終的な被験者数は、卵黄タンパク質加水分解物投与群が１６名、プラセボ群が１７名であった。図４から明らかなように、服用開始４週間目および８週間目で卵黄タンパク質加水分解物投与群に有意な膝関節痛の改善が認められた。

〔実施例５：卵黄タンパク質加水分解物の分子量分析〕
実施例１で調製した卵黄タンパク質加水分解物について、実施例１と異なる以下の条件のゲル濾過クロマトグラフィーで分子量の分析を行った。
カラム：Ｄｉｏｌ６０（８．０×５００ｍｍ）（商品名、ワイエムシイ社製）
溶出液：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．２ＭＮａＣｌ（ｐＨ６．９）／アセトニトリル（７０：３０）
流速：０．７ｍｌ／分
検出波長：２１５ｎｍ
分子量分析の結果を図５に示した。全面積に対する分子量１００以上２０，０００以下の部分の面積比は、約９０％を占めた。

〔実施例６：卵黄タンパク質加水分解物の分画〕
実施例１と同じ方法で調製した卵黄タンパク質加水分解物を、分子量１，０００の限外濾過膜を用いて分画した。得られた分画物について、上記実施例５と同じ条件のゲル濾過クロマトグラフィーで分子量の分析を行った。
分子量分析の結果を図６に示した。図６から、分画物はタンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計を示す全面積に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が約９０％を占めることが明らかとなった。

〔実施例７：分画物の軟骨細胞増殖に対する効果の検討〕
上記実施例６で調製した分画物を用い、実施例２と同じ方法で軟骨細胞増殖に対する効果を検討した。すなわち、ＡＴＤＣ５細胞を９６ウェルプレートに２×１０^４個／ｃｍ^２の密度で播種し、５％ＦＣＳ含有イーグルＭＥＭ培地を用いて５％ＣＯ_２下、３７℃で培養した。１日間培養後、血清を含まないイーグルＭＥＭ培地で１回洗浄し、９５μｌのイーグルＭＥＭ培地を各ウェルに添加した後、５μｌの試験液を入れ３日間３７℃で培養した。試験液には、上記分画物をイーグルＭＥＭ培地に溶解した後０．４５μｍのフイルターでろ過滅菌したものを用いた。試験液の分画物濃度は１ウェルに５μｌを添加した時に、終濃度が１ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。３日間培養後、細胞数をＭＴＴ法で測定した。

結果を表２に示した。無添加群の細胞数を１００％とした場合の添加群の細胞数を％値（増殖値）として算出した。表２に示したように、分画物は、ＡＴＤＣ５細胞を用量依存的に増加させ、即ち軟骨細胞に対する増殖促進効果を有することが示された。

〔実施例８：清涼飲料水〕
実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物を含有する清涼飲料水を調製した。すなわち、組成が混合異性化糖１５．０％、果汁１０％、卵黄タンパク質加水分解物２．０％、香料０．１％、カルシウム０．１％、水７２．８％である原料を混合し、プレート殺菌機を用いて９０℃、１５秒間殺菌し、清涼飲料水を製造した。

〔実施例９：ヨーグルト〕
実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物を含有するヨーグルトを調製した。すなわち、組成が卵黄タンパク質加水分解物３．０％、蔗糖７％、香料０．１％、ヨーグルト８９．９％である原料を混合し容器に充填して、ヨーグルトを製造した。

〔実施例１０：チーズ〕
実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物を含有するプロセスチーズを調製した。すなわち、ゴーダチーズ３５％、チェダーチーズ３５％、パルメザンチーズ２０％、卵黄タンパク質加水分解物２．０％、リン酸カルシウム１．０％、水７．０％を含むように各原料を混合後、乳化温度８５℃で乳化して、プロセスチーズを製造した。

〔実施例１１：カプセル剤〕
実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物６０％、コーンスターチ３０％、乳糖１０％を含むように各原料を配合して、ゼラチンカプセルに充填（カプセル１個当たり２００ｍｇ）し、カプセル剤を製造した。

〔実施例１２：錠剤〕
実施例１で製造した卵黄タンパク質加水分解物６０％、還元麦芽糖１８％、結晶セルロース１８％、ショ糖エステル４％を含むように各原料を配合後打錠（１錠当たり３００ｍｇ）して、錠剤を製造した。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

Claims

ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量約１００以上約２０，０００以下の部分の面積比が約６５％以上を占め、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善作用を有する卵黄タンパク質加水分解物を有効成分として含有することを特徴とする軟骨障害および／または関節痛の予防または改善剤。
軟骨障害および／または関節痛の予防または治療のための医薬であって、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量約１００以上約２０，０００以下の部分の面積比が約６５％以上を占め、軟骨障害および／または関節痛の予防または治療作用を有する卵黄タンパク質加水分解物を含む医薬。
軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のためのサプリメントであって、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量約１００以上約２０，０００以下の部分の面積比が約６５％以上を占め、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善作用を有する卵黄タンパク質加水分解物を含むサプリメント。
軟骨障害および／または関節痛の予防または改善のための食品添加剤であって、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量約１００以上約２０，０００以下の部分の面積比が約６５％以上を占め、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善作用を有する卵黄タンパク質加水分解物を含む食品添加剤。
軟骨障害および／または関節痛の予防または改善剤を製造するための、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量約１００以上約２０，０００以下の部分の面積比が約６５％以上を占め、軟骨障害および／または関節痛の予防または改善作用を有する卵黄タンパク質加水分解物の使用。