JP6498437B2 - 表皮基底膜保護剤 - Google Patents
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Description
日光に暴露した皮膚では、基底膜分解酵素の増加とともに、基底膜に構造変化が起こり、特に基底膜の多重化が頻繁に観察されることが報告されている(非特許文献4、5)。
MMP−2やMMP−9は、基底膜を構成する細胞外マトリクス成分であるラミニン及びIV型コラーゲン、VII型コラーゲンを基質として分解する。その結果、基底膜のラミニンやIV型コラーゲン繊維の断裂、多重化、分解、変性、消失等が起こり、基底膜の機能に異常が生じる。
このような紫外線照射による皮膚の老化等に対し、非特許文献3では、MMP−2及びMMP−9の発現の阻害活性を示す化合物を塗布することで、紫外線暴露したマウスの皮膚におけるしわの形成が抑制される効果が報告されている。
しかしながら、基底膜成分の分解という点では、上述のように、化粧料のような皮膚に塗布する形態で適用できる成分が見出されてはいた。しかし、基底膜構成成分の分解に対して、飲食できる成分で、十分な抑制作用を有する安全性の確認されたものは少ないという課題があった。
例えば、分子量3000〜80000の乳由来塩基性蛋白質を皮膚に適用して、コラーゲンの産生を促進させる美肌剤が開発されている(特許文献3)。この技術によれば、皮膚のコラーゲン量を増加させることができるとしている。
また、乳塩基性蛋白質画分及び/又は乳塩基性蛋白質画分分解物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進用飲食品及び化粧料が開発されている(特許文献4)。それらを飲食又は皮膚に適用することにより、ヒアルロン酸の生合成を促進させ、しわやたるみを防止できるとしている。
更に、ホエイ蛋白質加水分解物を有効成分とする美肌剤が開発されている(特許文献5)。この技術によれば、肌の保湿やしわ防止等に有効な美肌用化粧品、飲食品等を提供できるとしている。
本技術に係る表皮基底膜保護剤は、基底膜分解酵素及び/又はケモカインの産生を抑制することができる。
本技術に係る表皮基底膜保護剤が作用する基底膜分解酵素としては、MMP−2及び/又はMMP−9を挙げることができる。
また、本技術に係る表皮基底膜保護剤が作用するケモカインとしては、MCP−1及び/又はMIP−2を挙げることができる。
また、前記加水分解物は、ラクトフェリンをペプシンにより加水分解して得られた加水分解物であってよく、且つ、前記加水分解物の数平均分子量が5000ダルトン以下であってよい。
また、本技術によれば、前記表皮基底膜保護剤を含有する表皮基底膜保護用医薬組成物、表皮基底膜保護用化粧料及び表皮基底膜保護用飲食品を提供できる。
(1)ラクトフェリン加水分解物
原料であるラクトフェリンは、乳、涙、唾液、血液等に存在する鉄結合性の糖蛋白質である。ラクトフェリンは、特に哺乳動物、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒトの乳に含まれる。含有量、入手容易の点から、例えば、ウシ、ヒト等の乳が好ましい。乳は、初乳、移行乳、常乳、末期乳のいずれでもよい。
本技術においては、ラクトフェリンは哺乳動物の乳由来のものに限定されず、他に、前記乳の処理物である脱脂乳、ホエイ等から常法(例えば、イオンクロマトグラフィー等)によって分離されたラクトフェリン、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等から産生された組換えラクトフェリン、化学合成ラクトフェリン、又はそれらの混合物でもよい。また、ラクトフェリンは、非グリコシル化又はグリコシル化されたものでもよい。
本技術におけるラクトフェリン加水分解物の平均分子量は、以下の数平均分子量の概念により求めるものである。
数平均分子量(Number Average of Molecular Weight)は、例えば文献(社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第116〜119頁、株式会社東京化学同人、1978年)に記載されているとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
すなわち、タンパク質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、タンパク質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量(以下、Mnと略記することがある。)は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖iの分子量がMiであり、その分子数をNiとすると、次の式により定義される。
ラクトフェリン加水分解物の製造方法は特に限定されないが、蛋白質分解酵素等の酵素を用いて製造する方法等が挙げられる。以下、蛋白質分解酵素を用いて、ラクトフェリン加水分解物を製造する方法について、具体的に説明する。
該溶解液の濃度は特に限定されないが、通常、蛋白質換算で3〜15質量%前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から好ましい。
蛋白質分解酵素としては、細菌由来、動物由来の蛋白質分解酵素等があり、いずれのものも使用することができる。
動物由来の蛋白質分解酵素は特に限定されないが、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒト等の胃液由来ペプシンが挙げられる。
また、上述した蛋白質分解酵素は、単独又は2種類以上を組み合わせて使用することもできる。
反応継続時間は、反応温度、初発pH等の反応条件によって進行状態が異なり、例えば、酵素反応の反応継続時間を一定とすると、製造バッチ毎に異なる理化学的性質を有する分解物が生じる可能性等の問題があるため、一該に決定することができない。したがって、酵素反応をモニターすることにより、ラクトフェリン加水分解物の理化学的性質が所望の値となるように反応継続時間を決定する。
蛋白質の分解率の算出方法は、ケルダール法(日本食品工業学会編、「食品分析法」、第102頁、株式会社光琳、昭和59年)により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法(満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第547ページ、養賢堂、1970年)により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出する。
分解率(%)=(ホルモール態窒素量/全窒素量)×100
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素を失活させることにより行われる。失活処理は、常法、例えば、加熱失活処理等により実施することができる。
加熱失活処理の条件(加熱温度、加熱時間等)は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができ、例えば、80〜130℃の温度範囲で30分間〜2秒間の保持時間で行うことができる。
濾過を行うことにより、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び/又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
この場合、膜分離処理後の膜透過画分としてラクトフェリン加水分解物を含有する溶液が得られる。
膜分離処理を行うことにより、(a)の濾過と同様、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び/又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
樹脂吸着分離は、これらの樹脂をカラムに充填して前記加水分解失活液を連続的に流入させ、流出させることによる連続方式で行うこともでき、また、前記加水分解失活液中に樹脂を投入し、一定時間接触させた後、加水分解失活液と樹脂とを分離するバッチ方式で行うこともできる。
加水分解失活液中には、保存期間中に混濁、沈殿、凝集及び褐変等を惹起する因子(例えば、疎水性アミノ酸を多く含むペプチド等)が残存している可能性があり、樹脂吸着分離を行うことにより、これらの因子を除去できる。
殺菌方法は、常法による加熱処理方法等を用いることができる。
加熱処理時の加熱温度と保持時間は、充分に殺菌できる条件を適宜設定すればよく、例えば、70〜140℃で30分間〜2秒間加熱処理することにより殺菌できる。
加熱殺菌の方式は、バッチ方式、連続方式のいずれの方式も可能であり、連続方式においてもプレート熱交換方式、インフュージョン加熱方式、インジェクション加熱方式等の方式を用いることができる。
以上のようにして得られた、本技術で用いるラクトフェリン加水分解物は、表皮基底膜の構成成分を特異的に分解するゼラチナーゼ(IV型コラゲナーゼともいう)に対して作用する。ここで、表皮基底膜の構成成分として、例えば、IV型コラーゲン、ラミニン、VII型コラーゲンが挙げられる。また、ゼラチナーゼとして、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼファミリーのMMP−2、MMP−9が挙げられる。前記ラクトフェリン加水分解物は、MMP−2、MMP−9の産生を抑制し、表皮基底膜のコラーゲン、ラミニン等の分解を防ぐ。
また、本発明で用いるラクトフェリン加水分解物は、紫外線照射等により放出される表皮の炎症性ケモカインの産生を抑制する作用を有する。ここで、炎症性ケモカインは、例えば、MIP−2、MCP−1が挙げられる。
本技術に係る表皮基底膜保護剤の有効成分であるラクトフェリン加水分解物は、抗原性が低く水溶性に優れ、かつ、後述するように表皮基底膜保護効果を有する。そのため、紫外線等による皮膚への刺激に起因した皮膚のダメージや、日光黒子、炎症後色素沈着等の色素沈着症の予防又は治療のための化粧品又は医薬品として用いることができる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
上述した通り、本技術に係る表皮基底膜保護剤の有効成分であるラクトフェリン加水分解物は、腸管からの吸収性に優れ、かつ、後述するように表皮基底膜保護効果を有する。そのため、皮膚への刺激等に起因した皮膚のダメージや色素沈着症の予防又は治療のための飲食品等の有効成分としてこれらに配合して使用することができる。
即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル(穀物加工品)等が挙げられる。
水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
乳・乳製品としては、例えば、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
ウシラクトフェリン(森永乳業社製)を精製水にて5質量%となるように溶解し、塩酸溶液にてpH3に調製した。調製したラクトフェリンを45℃に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して3%のペプシンを添加して攪拌しながら6時間反応させて加水分解行った。
加水分解反応が終了後、反応液を80℃に加温し、10分間保温して酵素を失活させた。反応液を冷却後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応液のpHを6に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン加水分解物を製造した。
なお、製造したラクトフェリン加水分解物の平均分子量は、1600Daであることを確認した。
本試験は、本発明で用いたラクトフェリン加水分解物の抗原性について検討するために行った。
前記製造例1において製造したラクトフェリン加水分解物について、抗原性試験(ELISA法)により抗原性の試験を行った。抗体は抗ウシラクトフェリン抗体(Bethyl社製)を用いた。
その結果、製造例1で製造したラクトフェリン加水分解物中に含まれるラクトフェリンの測定値は236.6μg/gであり、ラクトフェリン加水分解物の抗原性は、同量のラクトフェリンに比べて0.0236%(1/1000以下)であることが確認された。
本試験では、ラクトフェリン及び前記製造例1で得られたラクトフェリン加水分解物の経口摂取による表皮基底膜保護作用について、ゼラチナーゼ及び炎症性ケモカインの抑制効果を調べた。
ラクトフェリン加水分解物及び比較品として未分解のラクトフェリン(森永乳業社製)を使用し、皮膚の基底膜分解酵素の産生に及ぼす効果について検討した。
動物実験には、ヘアレスマウス(Hos:HR−1、日本エスエルシー社)を使用した。餌及び水は自由摂取させ、温度22±2℃、湿度50±5%、12時間明暗周期、紫外線の影響のない環境下で飼育を行った。マウスを1週間馴化させた後、被検物質を生理食塩水に溶解し、マウス体重1kgあたり200mgを1日1回、6日間投与した。その後、マウスを個別ケージに入れ、UVBランプ(三共電気製)を用いて、2日間連続で紫外線を照射し皮膚に急性の炎症を誘導した(紫外線照射量360mJ/cm2)。UVB照射強度は、デルマレイUV強度計(テルモクリニカルサプライ社)を用いて測定した。なお、非照射対照群(1群)については紫外線照射を行わなかった。群の構成は以下のとおりである。
1群:紫外線を照射せずに生理食塩水を投与する対照群
2群:紫外線照射前に生理食塩水を投与する溶媒対照群
3群:紫外線照射前に未分解のラクトフェリンをマウス体重1kgあたり200mg投与する群
4群:紫外線照射前にラクトフェリン加水分解物をマウス体重1kgあたり200mg投与する群
本試験結果を表1、表2、表3に示す。皮膚中のMMP−9、MCP−1、MIP−2は皮膚タンパク質1mgあたりの量として表記した。値は各濃度の平均値±標準誤差を表し、統計解析(Tukey検定)において2群との間に統計的有意差(P<0.05)が認められたものに*を付記した。なお、表中のLFはラクトフェリンを示す。
本試験では、ラクトフェリン及び試験例1で得られたラクトフェリン加水分解物を用いて、表皮基底膜保護作用によるしわの改善効果について調べた。
ラクトフェリン加水分解物及び比較品として未分解のラクトフェリン(森永乳業社製)を、また陽性対照として加水分解されたヒアルロン酸を使用して、皮膚のしわ改善効果について検討した。
動物は、ヘアレスマウス(SKH1、日本チャールスリバー社)を使用した。餌及び水は自由摂取させ、温度22±2℃、湿度50±5%、12時間明暗周期、紫外線の影響のない環境下で飼育を行った。試験物質投与前に、マウスを個別ケージに入れ、UVBランプ(三共電気製)を用いて週3回、12週間にわたって紫外線を照射し、背部に慢性的な光老化ダメージを与え深いしわを形成させた。UVB照射強度(1.0mW/cm2)は、デルマレイUV強度計(テルモクリニカルサプライ社)を用いて測定した。なお、非照射対照群(1群)については紫外線照射を行わなかった。群の構成は以下のとおりである。
1群:紫外線を照射せずに生理食塩水を投与する対照群
2群:紫外線照射後に生理食塩水を投与する照射対照群
3群:紫外線照射後に加水分解ヒアルロン酸をマウス体重1kgあたり200mg投与する群
4群:紫外線照射後に未分解のラクトフェリンをマウス体重1kgあたり200mg投与する群
5群:紫外線照射後にラクトフェリン加水分解物をマウス体重1kgあたり200mg投与する群
試験開始時(12週間の紫外線照射後)と試験終了時(投与終了時)に、マウスの背部皮膚の写真を撮影し、それぞれの個体の試験群をブラインド化した上で、6名によるしわのスコア化を行った。しわ目視評価は、前記非特許文献3(Inomata et al., 2003)の評価基準(表4)に準拠し、しわスコア0,2,4,6,8の5段階にて評価した。
結果を表5に示す。値はしわスコアの平均値±標準偏差を表し、統計解析(Dunnett検定)において2群との間に統計的有意差(P<0.05)が認められたものに*を付記した。なお、表中のLFはラクトフェリンを示し、HAは加水分解ヒアルロン酸を示す。
一方、LF加水分解物群のしわスコアは3.52±0.34であり、溶媒対照群と比較して31.5%低下し、顕著なしわの改善が認められた。なお、未分解のラクトフェリン(4群)投与群のしわスコアは5.05±0.34であり、1.8%の低下であった。
これらの結果から、ラクトフェリンの加水分解物では、未分解のラクトフェリンあるいは加水分解ヒアルロン酸と比べて、顕著なしわ改善効果が得られることが確認された。
以上の結果から、本技術に係る表皮基底膜保護剤を投与することにより、マウスの紫外線照射による皮膚のダメージが改善することが明らかとなった。この効果は、しわや色素沈着症の改善に非常に有効であると考えられる。
Claims (8)
- ラクトフェリンの加水分解物を有効成分として含有する、表皮基底膜保護剤。
- 基底膜分解酵素及び/又はケモカインの産生を抑制する、請求項1に記載の表皮基底膜保護剤。
- 基底膜分解酵素はMMP−2及び/又はMMP−9である、請求項2に記載の表皮基底膜保護剤。
- ケモカインはMCP−1及び/又はMIP−2である、請求項2に記載の表皮基底膜保護剤。
- 前記加水分解物が、ラクトフェリンをペプシンにより加水分解して得られた加水分解物であり、且つ、前記加水分解物の数平均分子量が5000ダルトン以下である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の表皮基底膜保護剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の表皮基底膜保護剤を含有する、表皮基底膜保護用医薬組成物。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の表皮基底膜保護剤を含有する、表皮基底膜保護用化粧料。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の表皮基底膜保護剤を含有する、表皮基底膜保護用飲食品。
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