CN106008738B - 一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法 - Google Patents

一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，包括如下步骤：(1)将丙酮丁醇梭菌种子液接种到发酵罐中，加入固定化材料，培养至固定化材料表面被丙酮丁醇梭菌生物膜完全覆盖；(2)用碱性溶液溶解丙酮丁醇梭菌的生物膜，离心去除菌体沉淀，向上清液中加入有机溶剂，使有机溶剂的体积分数为30％～90％，所述的有机溶剂为乙醇、丙酮或丁醇，离心，收集沉淀；再加酸调节pH为3.5～10.0，收集沉淀，两次收集的沉淀即为胞外多糖。本发明提供的胞外多糖分离提取方法，具有成本低廉，操作简单的特点。

Description

一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体设计一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法。
背景技术
研究发现，丙酮丁醇梭菌接触固定化介质时，细胞聚集并分泌自聚物将自身包裹，在介质表面形成一个特殊的细胞群体结构——生物膜(biofilm)。生物膜中的微生物生活在自身产生的基质中，该基质是胞外多聚物(EPS)，EPS主要成分是多糖和蛋白质。
多糖是指由20个以上的单糖组成的糖类化合物，是生物体内重要的生物大分子之一，因其多变的结构而成为一种最具魅力的信息载体，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗炎、抗病毒等生理功能，并逐渐成为现代生物医药、食品、化工行业的研究开发重点，具有很大的发展潜力。
目前对于多糖提取分离的方法及应用的报道很多，程翼宇等人在专利(专利申请号CN200810162493.3)“一种金钗石斛多糖提取物的制备和应用”中经脱脂、提取、醇沉、除蛋白、除单糖和寡糖、凝胶柱纯化等步骤实现金钗石斛多糖的提取，多糖提取物中多糖含量在93％以上；张梅等人在专利(专利申请号CN201510201883.7)“一种波棱瓜子多糖提取方法，该提取方法得到的波棱瓜子多糖提取物及用途”中通过脱脂、水浴加热回流提取、Sevag法除蛋白、沉淀等步骤进行波棱瓜子多糖的提取，多糖的提取效果较好，纯度较高。
丙酮丁醇梭菌在固定化发酵生产丁醇过程中会分泌大量的胞外多糖，然而现阶段的对丙酮丁醇梭菌生物膜的研究很少，对于丙酮丁醇梭菌生物膜的结构以及组成研究还处于起步阶段，对于丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法还未见报道，因此研究并掌握丙酮丁醇梭菌生物膜中胞外多糖的分离提取方法具有重要的意义和利用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种高效的丙酮丁醇梭菌生物膜中胞外多糖的分离提取方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，包括如下步骤：
(1)将丙酮丁醇梭菌种子液接种到发酵罐中，加入固定化试剂，培养至固定化材料表面被丙酮丁醇梭菌生物膜完全覆盖；
(2)向发酵液中加入碱性溶液，溶解丙酮丁醇梭菌的生物膜，离心去除沉淀，向上清液中加入有机溶剂，使有机溶剂的体积分数为30％～90％，优选有机溶剂的体积分数为60％～75％；所述的有机溶剂为乙醇、丙酮或丁醇，优选乙醇；离心，收集沉淀；再加酸调节pH为3.5～10.0，优选pH为4～6.5，所述的酸为盐酸或乙酸，优选盐酸，收集沉淀，两次收集的沉淀即为胞外多糖。
步骤(1)中，所述的固定化材料为棉纤维。
步骤(1)中，所述的丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌ATCC 824。
步骤(1)中，培养条件为培养条件为37℃，培养10-15批次，每批次10-14h。
步骤(2)中，所述的碱性溶液为0.075mol/L～0.125mol/L的NaOH、Na2CO3、NaHCO3或氨水的水溶液，所述的碱性溶液优选0.1mol/L～0.125mol/L NaOH水溶液。
步骤(2)中，所述的胞外多糖A，其相对分子质量为9107kD，所述的胞外多糖B，其相对分子质量为2.77kD；
所述胞外多糖A中包括如下单糖：N-乙酰葡糖胺、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，单糖的摩尔比为N-乙酰葡糖胺：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝5.4：5.5：11.4：1；
所述胞外多糖B中包括如下单糖：N-乙酰葡糖胺、半乳糖，单糖的摩尔比为N-乙酰葡糖胺：半乳糖＝1：3.2。
上述丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法得到的胞外多糖在本发明的保护范围之内。
上述胞外多糖在食品、医药领域的应用在本发明的保护范围之内。
有益效果：
本发明提供了一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，通过该方法提取到丙酮丁醇梭菌ATCC 824产生的两种胞外多糖，该提取方法具有成本低廉，操作简单的特点。
附图说明
图1丙酮丁醇梭菌生物膜的电镜图。
图2胞外多糖红外图谱。
图3胞外多糖A单糖组成分析图谱。
图4胞外多糖B单糖组成分析图谱。
图5胞外多糖A分子量分析图谱。
图6胞外多糖B分子量分析图谱。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
将培养好的200ml丙酮丁醇梭菌(丙酮丁醇梭菌ATCC 824)种子液接种到装有1.8LP2发酵液的厌氧发酵罐中，在体积为2L的发酵罐中固定放置约60克固定化材料，37℃恒温培养，反复培养12批次，每批次培养12h，在固定化材料的表面会生长出一层厚厚的丙酮丁醇梭菌生物膜。
将培养好的生物膜用超纯水冲洗两次，以除去生物膜表面的游离菌体和残余的发酵液。收集培养好的生物膜，高速离心(10000rpm，10min，4℃)，约得到体积为50ml的生物膜。
实施例2：
取12支5ml的离心管，标号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，分别加入1ml的生物膜，再分别加入0.075mol/L、0.1mol/L、0.125mol/L三种浓度的NaOH溶液、Na2CO3溶液和EDTA溶液各1ml，震荡1h，观察溶解情况(溶解率＝10000rpm离心后沉淀的体积/初始生物膜的体积)，如下表：
表1不同溶液不同浓度下生物膜的溶解情况
NaOH溶液 Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液 NaHCO<sub>3</sub>溶液 氨水
0.075mol/L 70％ 40％ 20％ 50％
0.1mol/L 100％ 45％ 30％ 60％
0.125mol/L 100％ 45％ 35％ 65％
如表1所示，用0.1mol/L的NaOH溶解生物膜的效果最好，溶解率达到100％，因此最终选择用0.1mol/L的NaOH溶解生物膜。
取20ul生物膜的NaOH溶液，用纯水稀释50倍，用苯酚-硫酸法测得生物膜中多糖的含量约为15.88％～21.07％，用考马斯亮蓝法测得生物膜中蛋白质的含量约为47.71％～53.8％。
实施例3：
取1支50ml的离心管，加入10ml的生物膜，再加入20ml 0.1mol/L的NaOH溶液，震荡，使生物膜完全溶解，高速离心除去下层菌体沉淀，收集上层清液1约28ml。
取9支10ml的离心管，吸取上述上清液1约2ml，分别缓慢加入1.6ml、3ml、6ml的无水乙醇、丙酮和丁醇，摇晃均匀，溶液变浑浊有沉淀析出，高速离心(10000rpm，10min，4℃)得到沉淀，即为胞外多糖A，冷冻干燥称干重，如下表。
表2不同溶剂不同浓度下沉淀出的多糖的干重
乙醇 丙酮 丁醇
45％ 14.3mg 8.5mg 7.2mg
60％ 21.6mg 9.6mg 8.3mg
75％ 21.5mg 10.3mg 9.8mg
如表2所示，乙醇沉淀多糖的效果明显好于丙酮与丁醇的沉淀效果，因此，醇析沉淀胞外多糖A时选用的有机溶剂为乙醇，且其终浓度(乙醇的体积/溶液总体积)为60％。
称取1mg胞外多糖A，溶于1ml 0.1M/L的NaOH溶液中，使其终浓度为1mg/ml，用BCA试剂盒测得蛋白杂质的含量约为6.58％～11.32％。
实施例4：
取1支50ml的离心管，加入5ml的生物膜，再加入10ml 0.1mol/L的NaOH溶液，震荡，使生物膜完全溶解，高速离心除去下层菌体沉淀，收集上层清液1约14ml，缓慢加入无水乙醇21ml，使乙醇的最终浓度(乙醇的体积/溶液总体积)为60％，摇晃均匀，高速离心(10000rpm，10min，4℃)，收集上清液2以及胞外多糖A(沉淀)。
取6支5ml离心管，分别加入上述上清液2约2ml，缓慢滴加1mol/L的HCl溶液和乙酸溶液，摇晃均匀，使得溶液的pH值分别为4、6.5、9，溶液变浑浊有沉淀析出，高速离心(10000rpm，10min，4℃)，得到沉淀，即为胞外多糖B，冷冻干燥称干重，如下表。
表3不同溶液不同pH条件下沉淀出的多糖干重
HCl溶液 乙酸溶液
PH＝9 13.3mg 9.6mg
pH＝6.5 32.6mg 23.1mg
pH＝4 32.7mg 23.1mg
如表3所示，用HCl溶液比用乙酸溶液调节pH沉淀多糖的效果好，因此，调节pH沉淀胞外多糖B时选择HCl溶液，且溶液的最终pH调节为6.5左右。
称取1mg胞外多糖B，溶于1ml 0.1M/L的NaOH溶液中，使其终浓度为1mg/ml，用BCA试剂盒测得蛋白杂质的含量约为50.31％～55.04％。
实施例5：红外分析。
收集上述实验中的胞外多糖A和胞外多糖B，冷冻干燥得到两种胞外多糖的晶体粉末。
将冷冻干燥后得到的两种胞外多糖晶体在500～4000cm-1的区域内进行红外光谱扫描，红外光谱图谱如图2所示，详细数据见表4～5。
表4胞外多糖A红外分析结果
吸收峰波数cm<sup>-1</sup> 官能团 振动方式 特征吸收峰
3280 O-H O-H伸缩振动 多糖特征吸收峰
2923 C-H C-H伸缩振动 多糖特征吸收峰
1558 仲酰胺
1380 C-H C-H变角振动 多糖特征吸收峰
1033 C-O-C(环) C-O伸缩振动 糖环的特征吸收峰
表5胞外多糖B红外分析结果
实施例6：胞外多糖的单糖组成分析。
称取2mg胞外多糖A和胞外多糖B于安瓿瓶中，加入400μL三氟乙酸(TFA，2mol/L)，混匀后封管；于115℃降解3h；降解结束后，取出降解液，除去残留的TFA；干燥后样品加入100μL水溶解，加入100μL 0.3mol/L的NaOH溶液，120μL PMP-甲醇溶液，混匀后70℃水浴反应1h；反应结束后，加入100μL 0.3mol/L的HCl溶液中和；加入1mL氯仿萃取三次，并用0.22μm的滤膜过滤，即可用于高效液相色谱分析。标准品无需进行降解，配制成25mmol/L的水溶液，取100μL直接进行衍生即可，衍生方法与样品相同。
色谱条件：ThermoC18色谱柱(250mm×4.6mm)，流动相：磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)/CH3CN(V/V)＝83/17；流速：0.8mL/min；柱温30℃，进样体积：20μL；检测器：DAD(254nm)。
胞外多糖A和胞外多糖B的单糖组成及其摩尔比值，如下表：
表6两种胞外多糖的单糖组成及其摩尔比值
注：部分成分响应值太低，未计算入内
实施例7：胞外多糖分子量检测。
采用凝胶排阻法对胞外多糖A和胞外多糖B进行分子量测定，样品溶于流动相中(5mg/mL)，过0.22μm滤膜后备用。色谱条件如下：色谱柱：TSK-Gel GMPWx色谱柱(7.5×300mm)；流动相：0.1mol/L Na2SO4；柱温：35℃；流速：0.5mL/min；检测器：示差检测器；上样量：20μL。
标准曲线的绘制：各葡聚糖系列标准品(2500，4600，7100，10000，21400，41100，84400，133800，2000000Da)依次进行色谱分析，记录保留时间(TR)，以标准葡聚糖分子量的对数(logMw)对色谱保留时间(TR)作图，得到标准曲线用于计算样品相对分子量。
胞外多糖A和胞外多糖B的色谱图分别如图5和图6所示，将保留时间代入标准曲线得到胞外多糖分子量的分布情况，其中，胞外多糖A的相对分子量较高，为9107kD，胞外多糖B中主要组分的相对分子质量较低，为2.77kD。

Claims (10)

1.一种丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 将丙酮丁醇梭菌种子液接种到发酵罐中，加入固定化材料，发酵培养，收集丙酮丁醇梭菌生物膜，洗净；
(2) 将丙酮丁醇梭菌生物膜加入碱性溶液，溶解丙酮丁醇梭菌的生物膜，离心，去除沉淀，向混合物中加入有机溶剂，使有机溶剂的体积分数为30%~90%，所述的有机溶剂为乙醇、丙酮或丁醇，分别收集沉淀和上清液，得到的沉淀为胞外多糖A；再加酸调节上清液的pH为3.5~10.0，所述的酸为盐酸或乙酸，得到的沉淀为胞外多糖B。
2.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的固定化材料为棉纤维。
3.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌 ATCC 824。
4.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养的条件为37℃，培养10~15批次，每批次10~14h。
5.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的碱性溶液为0.075mol/L~0.125 mol/L的NaOH、Na2CO3、NaHCO3或氨水溶液。
6.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的胞外多糖A，其相对分子质量为9107 kD，所述的胞外多糖B，其相对分子质量为2.77 kD。
7.根据权利要求6所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，所述胞外多糖A中包括如下单糖： N-乙酰葡糖胺、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，单糖的摩尔比为N-乙酰葡糖胺：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=5.4：5.5：11.4：1。
8.根据权利要求6所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法，其特征在于，所述胞外多糖B中包括如下单糖：N-乙酰葡糖胺、半乳糖，单糖的摩尔比为N-乙酰葡糖胺：半乳糖=1：3.2。
9.权利要求1~8任一所述的丙酮丁醇梭菌胞外多糖的提取分离方法得到的胞外多糖。
10.权利要求9所述的胞外多糖在食品、医药领域的应用。
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