CN116333907A - 一种芽孢杆菌及其制备玻色因的方法 - Google Patents

一种芽孢杆菌及其制备玻色因的方法 Download PDF

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王颖思
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Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌及其制备玻色因的方法。本发明首先从湖南山毛榉落叶中分离到一株具有玻色因分泌特性的菌株，然后经鉴定为芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37，该菌株的保藏编号为GDMCC No:62485。上述菌株QYN37在37℃下有氧发酵培养，产生玻色因，发酵产量为43.97mg/L。利用该菌株制备玻色因，工艺简单，原料廉价，绿色环保，具有潜在的工业化应用前景。

Description

一种芽孢杆菌及其制备玻色因的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌及其制备玻色因的方法。
背景技术
玻色因，化学名称为(2S,3R,4S,5R)-2-(2-羟丙基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇，简称羟丙基四氢吡喃三醇，CAS号为439685-79-7，分子式为C8H16O6，分子量为192.1，是一种木糖衍生物。玻色因可诱导人细胞中糖胺聚糖(GAG)的合成，增加细胞分泌硫酸皮肤素(DS)，增强成纤维细胞生长因子(FGF-10)的作用，从而促进上皮修复和再生。因此，玻色因广泛应用于抗皱类、紧致类、修护类、抗衰老类护肤品。
目前，玻色因是通过化学合成的方法来获得，其合成路线是：以木糖(D-Xylose)为主要原料，与乙酰丙酮在碱性水溶液中发生Knoevenagel缩合反应，生成1-((2S,3R,4S,5R)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-2-酮，之后，再与硼氢化钠发生还原反应，还原生成物之中的酮羰基，最终得到(2S,3R,4S,5R)-2-(2-羟丙基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇，即玻色因(Pro-Xylane)。
生物合成方法通常比化学合成方法更绿色环保，然而，迄今为止还没有通过生物合成方法来制备玻色因的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37。该菌株于2022年5月19保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62485。该菌株在有氧发酵下可产生玻色因，其制备工艺简单，原料廉价。
本发明从湖南山毛榉落叶中分离到一株生长速度快、具有玻色因分泌特性的菌株Bacillus siamensis QYN37。该菌株的菌落特征如图1所示，菌落湿润、圆形、半透明，菌苔隆起、边缘整齐，表面光滑，经24小时培养，菌落直径达10～15mm，菌苔粘稠可拉丝。16SrRNA序列如SEQ ID NO.1所示。芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37的显微镜照片如图2所示，革兰氏染色为阳性，短杆状，孢子位于细胞中央，有氧生长。
本发明的第二个目的是提供所述的芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37在制备玻色因中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种制备玻色因的方法，该制备方法采用所述的芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37进行发酵，包括以下步骤：
(1)种子液培养：将所述的芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37菌株接种于种子培养基中摇床培养16～24h，得到种子液；
(2)有氧发酵：将种子液接种于发酵培养基中培养24～48h，得到含玻色因的发酵液。
优选的，所述的种子培养基或发酵培养基的组分及含量为：牛肉浸出粉2g/L、可溶性淀粉1.5g/L、酪蛋白酸水解物17.5g/L，溶剂为水。
优选的，所述接种的接种量为体积比1～5％。
优选的，所述培养的培养温度为37℃。
本发明的第四个目的是提供所述的制备方法在生产玻色因中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种玻色因检测方法，其包括以下步骤：发酵完成后，取一定体积的发酵液向其中加入三倍体积的乙醇，静置2小时，过0.45微米滤膜，减压旋蒸除去溶剂后，再加入与所取发酵液等体积的水溶解，稀释到合适的浓度后，使用液质联用仪进行检测。
其中，色谱条件为：C18柱2.1×100mm,3.5μm，流动相为水：甲醇体积比＝90:10，流速0.3mL/min，柱温为40℃；质谱条件为：离子源为ESI负离子模式，离子化电压为-4500V，去簇电压(DP)为80V。定性离子对为191.2→110.9(碰撞能量(CE)为20V)，191.2→83.1(碰撞能量(CE)为26V)。定量离子对为191.2→110.9。
本发明具有如下有益效果：
本发明的芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37可通过发酵的方法制备玻色因，是一种新的玻色因制备方法，绿色环保。芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37在有氧条件下生长快速，所需发酵培养基简单易得，培养简单，有利于工业化开发，在生物技术领域和化妆品领域具有重要的意义与价值。
芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37，其于2022年5月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62485。
附图说明
图1是芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37的菌落形态特征的照片。
图2是芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37的显微镜照片。
图3是芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37发酵液中玻色因定量测定的结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：产玻色因菌株的筛选
将采集于湖南的山毛榉落叶样品用无菌水清洗表面，收集清洗液涂布于营养琼脂的培养基(配方为：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，溶剂为水；配制步骤为：将各成分溶于水，灭菌，冷却，即得)平板上，37℃培养，待菌落长出后挑选单菌落，继续分离纯化，直至获得纯菌，利用液相质谱联用法测定玻色因的有无及产量的多少，筛选得到产玻色因最高的菌株命名为QYN37菌株。
实施例2：菌株QYN37的形态学观察
菌株QYN37在营养琼脂培养基上生长较快，37℃下有氧培养24小时，菌落直径达10-15mm，菌落湿润、圆形、半透明，菌苔隆起、边缘整齐，表面光滑，菌苔粘稠可拉丝，其菌落形态特征参见图1。该菌株革兰氏染色为阳性，短杆状，孢子位于细胞中央，参见图2。
实施例3：菌株QYN37的分子生物学特征
菌株QYN37的16S rRNA的扩增、测序及序列比对：
收集新鲜菌体，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA模板，利用通用引物27F/1492R进行16S rRNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，直接进行序列测定，测定由广州擎科生物技术有限公司进行。
引物序列如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'；
50μL PCR反应体系如下：模板1μL；上游引物、下游引物各1μL；Dream Taq GreenPCR Master Mix 25μL；ddH2O 22μL。
PCR条件：95℃5min，94℃30s，52℃2min，72℃1min；循环30次。
测得全序列结果如下：菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，并将所得到的全序列上传到NCBI网站上进行序列比对，发现菌株QYN37与芽孢杆菌Bacillus siamensis相似度为99.93％，结合菌落特征及生理生化特征，将该菌株鉴定为芽孢杆菌Bacillussiamensis QYN37。该菌株已经于2022年5月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62485。
实施例4：利用芽孢杆菌QYN37制备玻色因
一种利用芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37进行发酵制备玻色因的方法，包括以下步骤：
(1)种子液培养：将芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37菌株接种于种子培养基中，在37℃条件下摇床培养24h，得到种子液；所述的种子培养基配方为：牛肉浸出粉2g/L、可溶性淀粉1.5g/L、酪蛋白酸水解物17.5g/L，溶剂为水。配制为：将各成分溶于水，搅拌溶解，灭菌，即得。
(2)有氧发酵：将种子液以体积比5％的接种量接种于发酵培养基中，在37℃条件下培养48h，得到含玻色因的发酵液。所述的发酵培养基配方为：牛肉浸出粉2g/L、可溶性淀粉1.5g/L、酪蛋白酸水解物17.5g/L，溶剂为水。配制为：将各成分溶于水，搅拌溶解，灭菌，即得。
实施例5：玻色因的检测
以实施例4中的芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37发酵液为试验样品，将试验样品用水稀释10倍后采用液相质谱联用法进行玻色因含量测定。液相条件：色谱柱为C18柱，内径与长度为2.1×100mm，填料粒径为3.5μm；柱温为40℃；进样量为1μL；流动相为水：甲醇体积比＝90:10；流速0.3mL/min。质谱条件：离子源为ESI负离子模式，离子化电压为-4500V，去簇电压(DP)为80V。定性离子对为191.2→110.9(碰撞能量(CE)为20V)，191.2→83.1(碰撞能量(CE)为26V)。定量离子对为191.2→110.9。结果如图3所示。
芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37发酵液中玻色因的产量为43.97mg/L。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37，其保藏编号为：GDMCC No:62485。
2.权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37在制备玻色因中的应用。
3.一种制备玻色因的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的芽孢杆菌BacillussiamensisQYN37进行发酵。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子液培养：将权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus siamensis QYN37菌株接种于种子培养基中摇床培养16～24h，得到种子液；
(2)有氧发酵：将种子液接种于发酵培养基中培养24～48h，得到含玻色因的发酵液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的种子培养基或发酵培养基的组分及含量为：牛肉浸出粉2g/L、可溶性淀粉1.5g/L、酪蛋白酸水解物17.5g/L，溶剂为水。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述接种的接种量为体积比1～5％。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养的培养温度为37℃。
8.权利要求3-7任一项所述的制备方法在生产玻色因中的应用。
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