CN105999244B - 治疗由骨胶原介导的疾病的组合物及治疗方法 - Google Patents
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Abstract
一种治疗由骨胶原介导的疾病的组合物及治疗方法。本发明公开了包括来自于溶组织梭状芽孢杆菌的高纯度胶原酶I以及胶原酶II的组合的药物产品。所述的药物产品中包含的胶原酶I与胶原酶II的比例大约为1：1，其纯度高于至少95％。本发明进一步公开了用于制备所述的药物的改进了的发酵和纯化方法。
Description
本申请是2007年1月30日递交的申请号为200780008746.5，发明名称为“治疗由骨胶原介导的疾病的组合物及治疗方法”的分案申请。
相关申请
本申请要求享有申请日为2006年1月30日、申请号为No.60/763470的美国临时申请的权益，以及申请日为2006年3月20日、申请号为No.60/784135的美国临时申请的权益。上述申请的全部内容在此引入作为参考。
背景技术
骨胶原是哺乳动物有机体中主要的结构组分，其构成了皮肤以及动物机体其他部位中的全部蛋白质含量的很大一部分。对于人类而言，骨胶原在伤口愈合的过程中以及自然老化的过程中是格外重要的。各种皮肤创伤例如烧伤、外科手术、感染以及意外通常都表现为富含骨胶原的纤维组织的不稳定聚集并且具有升高的蛋白多糖含量。在愈合的过程中，除了对已经损伤或者破坏了的正常组织进行替换之外，有时新的组织会产生过分沉积以及创伤性沉积。这种过分的骨胶原沉积归因于骨胶原合成与骨胶原分解之间的平衡紊乱。
许多疾病以及症状与过分的骨胶原沉积以及富含骨胶原的纤维组织的不稳定聚集相关。这类疾病以及症状在这里被统称为“由骨胶原介导的疾病”。胶原酶已经被用来治疗各种由骨胶原介导的疾病。胶原酶是一种具有消化骨胶原的特异性能力的酶。
用于治疗用途的胶原酶可以从许多种来源中获得，这些来源包括哺乳动物(例如，人类)，甲壳类(例如，螃蟹，小虾)，真菌，以及细菌(例如，来自于梭状芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌、或者弧菌的发酵)。胶原酶也可以被遗传工程化。粗胶原酶的一种普遍的来源是来自于细菌的发酵过程，特别是溶组织梭状芽孢杆菌(C.his)的发酵。可以使用各种色谱技术中的任何一种对通过溶组织梭状芽孢杆菌所获得的粗胶原酶进行纯化。
溶组织梭状芽孢杆菌的发酵过程中存在的一个缺点在于：它所产生的不同种类的胶原酶的比例不确定，其中所述的不同种类的胶原酶是例如胶原酶I以及胶原酶II，通常用于治疗由骨胶原介导的症状的治疗性组合物中。并且，这种培养历来(historically)需要使用到肉类产品。这种肉类培养物最初来自于1956年哥伦比亚大学(ColumbiaUniversity)的Dr.I.Mandl’s实验室中的溶组织梭状芽孢杆菌H4菌株，并且保藏于ATCC(美国菌种保藏中心)。用熟肉培养物制造出了冻干小瓶(lyophilized vials)，并将其命名为ABC溶组织梭状芽孢杆菌主细胞库(master cell bank)。
在治疗性的胶原酶制备物中，不同比例的胶原酶I与胶原酶II具有不同的生物学作用。因此，需要提供一种治疗性的胶原酶制备物，在该制备物中胶原酶I与胶原酶II的比例能够被容易并且有效的测定和控制，从而达到优秀的并且始终如一的酶活性和治疗作用。
发明内容
本发明提供了一种胶原酶组合物，包括高纯度的胶原酶I以及胶原酶II的组合。优选的，所述的胶原酶I以及胶原酶II存在的质量比约为1：1。当将其作为药物组合物用于治疗由骨胶原介导的疾病时，本发明所述的组合物能够提供增强的并且始终如一的治疗作用，并且减少副作用的潜在性。
本发明进一步提供了制备本发明所述的胶原酶组合物的方法，制备包含本发明所述组合物的药物制剂的方法，以及使用本发明所述的胶原酶组合物治疗患有由骨胶原介导的疾病的患者的方法。
附图说明
前述的以及其他的关于本发明的目标、特征以及优点将在随后对本发明优选实施方式的更加详细的描述中显现出来，正如附图中所描述的，在这些附图中相似的参考特征指的是不同附图中的相同部分。所述的附图没有必要按比例绘制并强调，相反，所述附图意在对本发明的原理进行描述。
附图1描述的是在5L DCFT24a、DCFT24b发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的生长曲线(OD vs时间)。
附图2描述的是在5L DCFT24a，DCFT24b发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的网状成长曲线(net growth curves)(网状OD vs时间)。
附图3是来自于第二次发酵过程中的8％的Tris-甘氨酸SDS PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶：
带1：高分子量标记物
带2：胶原酶I–0.27微克
带3：胶原酶II–0.29微克
带4：20小时(6.12微升样本)-收集点
带5：19小时(6.12微升样本)
带6：17小时(6.12微升样本)
带7：16小时(6.12微升样本)
带8：15小时(6.12微升样本)
带9：14小时(6.12微升样本)
带10：13小时(6.12微升样本)
带11：11.6小时-19小时(6.12微升样本)
带12：10.5小时(6.12微升样本)；
附图4是来自于第一次发酵过程中的8％的Tris-甘氨酸SDS PAGE凝胶：
带1：高分子量标记物
带2：胶原酶I–0.27微克
带3：胶原酶II–0.29微克
带4：20小时(6.12微升样本)-收集点
带5：19小时(6.12微升样本)
带6：17小时(6.12微升样本)
带7：16小时(6.12微升样本)
带8：15小时(6.12微升样本)
带9：14小时(6.12微升样本)
带10：13小时(6.12微升样本)
带11：11.4小时(6.12微升样本)
带12：10.4小时(6.12微升样本)；
附图5是第二次发酵过程中的半定量SDS PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，收集点样本：
带1：高分子量标记物
带2：0.87微升样本(发酵样本的1/7稀释液)
带3：1.22微升样本(发酵样本的1/5稀释液)
带4：1.53微升样本(发酵样本的1/4稀释液)
带5：2.04微升样本(发酵样本的1/3稀释液)
带6：0.27微克胶原酶I
带7：0.18微克胶原酶I
带8：0.135微克胶原酶I
带9：0.29微克胶原酶II
带10：0.193微克胶原酶II
带11：0.145微克胶原酶II；
附图6表示的是用于DCFT26a以及DCFT26b的发酵策略；
附图7描述了在5L DCFT26a、DCFT26b发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的生长曲线(OD vs时间)；
附图8描述的是在5L DCFT26a，DCFT26b发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的网状成长曲线(net growth curves)(网状ODvs时间)；
附图9是DCFT26a的SDS PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶：
带1：高分子量标记物
带2：胶原酶I–0.67微克
带3：胶原酶II–0.72微克
带4：20小时(6.12微升样本)-收集点
带5：19小时(6.12微升样本)
带6：18小时(6.12微升样本)
带7：17小时(6.12微升样本)
带8：16小时(6.12微升样本)
带9：14小时(6.12微升样本)
带10：13小时(6.12微升样本)
带11：11小时(6.12微升样本)；
附图10是DCFT26b的SDS PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶：
带1：高分子量标记物
带2：20小时(6.12微升样本)-收集点
带3：19小时(6.12微升样本)
带4：18小时(6.12微升样本)
带5：17小时(6.12微升样本)
带6：16小时(6.12微升样本)
带7：15小时(6.12微升样本)
带8：14小时(6.12微升样本)
带9：13小时(6.12微升样本)
带10：11小时(6.12微升样本)
带11：胶原酶I–0.67微克
带12：胶原酶II–0.72微克；
附图11是DCFT26a的半定量SDS PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，收集点样本：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I
带3：0.18微克胶原酶I
带4：0.135微克胶原酶I
带5：0.29微克胶原酶II
带6：0.193微克胶原酶II
带7：0.145微克胶原酶II
带8：0.87微升样本(发酵样本的1/7稀释液)
带9：1.22微升样本(发酵样本的1/5稀释液)
带10：1.53微升样本(发酵样本的1/4稀释液)
带11：2.04微升样本(发酵样本的1/3稀释液)；
附图12是DCFT26b的半定量SDS PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，收集点样本：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I
带3：0.18微克胶原酶I
带4：0.135微克胶原酶I
带5：0.29微克胶原酶II
带6：0.193微克胶原酶II
带7：0.145微克胶原酶II
带8：2.04微升样本(发酵样本的1/3稀释液)
带9：1.53微升样本(发酵样本的1/4稀释液)
带10：1.22微升样本(发酵样本的1/5稀释液)
带11：0.87微升样本(发酵样本的1/7稀释液)；
附图13是透析后的硫酸铵沉淀(100克/升以及150克/升)样本的DCFT26a的SDSPAGE凝胶，收集点样本：
带1：高分子量标记物
带2：0.67微克胶原酶I以及0.72微克胶原酶II
带3：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带4：来自于SC11的6.12微升上清液样本
带5：透析后样本–100克/升硫酸铵(纯的)
带6：透析后样本–100克/升硫酸铵(1/5)
带7：透析后样本–100克/升硫酸铵(1/10)
带8：透析后样本–150克/升硫酸铵(纯的)
带9：透析后样本–150克/升硫酸铵(1/5)
带10：透析后样本–150克/升硫酸铵(1/10)；
附图14是透析后的硫酸铵沉淀(200克/升以及250克/升)样本的DCFT26a的SDSPAGE凝胶，收集点：
带1：高分子量标记物
带2：0.67微克胶原酶I以及0.72微克胶原酶II
带3：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带4：来自于SC11的6.12微升上清液样本
带5：透析后样本–200克/升硫酸铵(纯的)
带6：透析后样本–200克/升硫酸铵(1/5)
带7：透析后样本–200克/升硫酸铵(1/10)
带8：透析后样本–250克/升硫酸铵(纯的)
带9：透析后样本–250克/升硫酸铵(1/5)
带10：透析后样本–250克/升硫酸铵(1/10)；
附图15是透析后的硫酸铵沉淀(300克/升以及400克/升)样本的DCFT26a的SDSPAGE凝胶，收集点：
带1：高分子量标记物
带2：0.67微克胶原酶I以及0.72微克胶原酶II
带3：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带4：来自于SC11的6.12微升上清液样本
带5：透析后样本–300克/升硫酸铵(纯样本)
带6：透析后样本–300克/升硫酸铵(1/5稀释液)
带7：透析后样本–300克/升硫酸铵(1/10稀释液)
带8：透析后样本–400克/升硫酸铵(纯的)
带9：透析后样本–400克/升硫酸铵(1/5稀释液)
带10：透析后样本–400克/升硫酸铵(1/10稀释液)；
附图16描述的是在PBFT57发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的生长曲线(OD vs时间以及网状OD vs时间)；
附图17是半定量SDS PAGE凝胶，收集点样本：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I
带3：0.18微克胶原酶I
带4：0.135微克胶原酶I
带5：0.29微克胶原酶II
带6：0.193微克胶原酶II
带7：0.145微克胶原酶II
带8：2.04微升样本(发酵收集样本的1/3稀释液)
带9：1.53微升样本(发酵收集样本的1/4稀释液)
带10：1.22微升样本(发酵收集样本的1/5稀释液)
带11：0.87微升样本(发酵收集样本的1/7稀释液)；
附图18a是来自于PBFT57发酵过程中透析后的500毫升样本的定量SDS PAGE凝胶，收集点样本。加入了400克/升的硫酸铵：
带1：高分子量标记物
带2：0.272微克胶原酶I以及0.286微克胶原酶II
带3：0.181微克胶原酶I以及0.190微克胶原酶II
带4：0.136微克胶原酶I以及0.142微克胶原酶II
带5：0.109微克胶原酶I以及0.114微克胶原酶II
带6：透析后样本–400克/升硫酸铵(1/15稀释液)
带7：透析后样本–400克/升硫酸铵(1/20稀释液)
带8：透析后样本–400克/升硫酸铵(1/25稀释液)
带9：透析后样本–400克/升硫酸铵(1/30稀释液)
带10：透析后样本–400克/升硫酸铵(1/35稀释液)
带11：高分子量标记物；
附图18b是对硫酸铵沉淀样本离心之后的上清液的SDS PAGE凝胶：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带3：硫酸铵沉淀样本之后的上清液(纯的)(400克/升缓慢加入)
带4：硫酸铵沉淀样本之后的上清液(纯的)(400克/升快速加入)
带5：硫酸铵沉淀样本之后的上清液(纯的)(440克/升缓慢加入)
带6：硫酸铵沉淀样本之后的上清液(纯的)(480克/升缓慢加入)
带7：硫酸铵沉淀样本之后的上清液(纯的)(520克/升缓慢加入)
带8：硫酸铵沉淀样本之后的上清液(纯的)(400克/升，pH6)
带9：硫酸铵沉淀样本之后的上清液(纯的)(400克/升，氧化的)；
附图19的半定量SDS PAGE凝胶表示的是来自于收集点上清液的稀释样本以及透析后的硫酸铵沉淀样本(400克/升，快速加入)的凝胶：
带1：高分子量标记物
带2：发酵样本-收集(纯的)
带3：发酵样本-收集(1/1稀释液)
带4：发酵样本-收集(1/2稀释液)
带5：发酵样本-收集(1/3稀释液)
带6：发酵样本-收集(1/4稀释液)
带7：对应于带1的透析后样本–收集(1/17.54稀释液)
带8：对应于带2的透析后样本–收集(1/35.08稀释液)
带9：对应于带3的透析后样本–收集(1/52.62稀释液)
带10：对应于带4的透析后样本–收集(1/70.16稀释液)
带11：对应于带5的透析后样本–收集(1/87.70稀释液)；
附图20描述的是PBFT57的半定量SDS PAGE凝胶，表示的是来自于收集点上清液的稀释样本以及透析后的硫酸铵沉淀样本(520克/升)的凝胶：
带1：高分子量标记物
带2：发酵样本-收集(纯的)
带3：发酵样本-收集(1/1稀释液)
带4：发酵样本-收集(1/2稀释液)
带5：发酵样本-收集(1/3稀释液)
带6：发酵样本-收集(1/4稀释液)
带7：对应于带1的透析后样本–收集(1/15.63稀释液)
带8：对应于带2的透析后样本–收集(1/31.26稀释液)
带9：对应于带3的透析后样本–收集(1/46.89稀释液)
带10：对应于带4的透析后样本–收集(1/62.52稀释液)
带11：对应于带5的透析后样本–收集(1/78.15稀释液)；
附图21描述的是在PBFT58c、PBFT58d发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌菌株004以及013的生长曲线(网状OD vs时间)；
附图22是在PBFT58c中的SDS PAGE凝胶(菌株004)：
带1：高分子量标记物
带2：胶原酶I–1.00微克
带3：胶原酶I–0.67微克
带4：胶原酶II–1.08微克
带5：胶原酶II–0.72微克
带6：16.25小时(6.12微升样本)
带7：17小时(6.12微升样本)
带8：18小时(6.12微升样本)
带9：19小时(6.12微升样本)
带10：20.5小时(6.12微升样本)；
附图23是在PBFT58d中的SDS PAGE凝胶(菌株013)：
带1：高分子量标记物
带2：胶原酶I–1.00微克
带3：胶原酶I–0.67微克
带4：胶原酶II–1.08微克
带5：胶原酶II–0.72微克
带6：16.25小时(6.12微升样本)
带7：17小时(6.12微升样本)
带8：18小时(6.12微升样本)
带9：19小时(6.12微升样本)
带10：20.5小时(6.12微升样本)；
附图24是PBFT58c中的半定量SDS PAGE凝胶(菌株004)，收集点样本：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带3：0.18微克胶原酶I以及0.19微克胶原酶II
带4：0.135微克胶原酶I以及0.145微克胶原酶II
带5：0.108微克胶原酶I以及0.116微克胶原酶II
带6：6.12微升样本
带7：3.06微升样本
带8：2.04微升样本
带9：1.53微升样本
带10：1.22微升样本；
附图25是PBFT58d中的半定量SDS PAGE凝胶(菌株013)，收集点样本：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带3：0.18微克胶原酶I以及0.19微克胶原酶II
带4：0.135微克胶原酶I以及0.145微克胶原酶II
带5：0.108微克胶原酶I以及0.116微克胶原酶II
带6：6.12微升样本
带7：3.06微升样本
带8：2.04微升样本
带9：1.53微升样本
带10：1.22微升样本；
附图26是在PBFT58c发酵过程中透析后收集点样本(520克/升硫酸铵)的SDS PAGE凝胶(菌株004)：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带3：0.18微克胶原酶I以及0.19微克胶原酶II
带4：0.135微克胶原酶I以及0.145微克胶原酶II
带5：0.108微克胶原酶I以及0.116微克胶原酶II
带6：透析后收集点样本–纯的
带7：透析后收集点样本-(1/5稀释液)
带8：透析后收集点样本-(1/10稀释液)
带9：透析后收集点样本-(1/15稀释液)
带10：透析后收集点样本-(1/20稀释液)；
附图27是在PBFT58d发酵过程中透析后收集点样本(400克/升硫酸铵)的SDS PAGE凝胶(菌株013)：
带1：高分子量标记物
带2：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II
带3：0.18微克胶原酶I以及0.19微克胶原酶II
带4：0.135微克胶原酶I以及0.145微克胶原酶II
带5：0.108微克胶原酶I以及0.116微克胶原酶II
带6：透析后收集点样本–纯的
带7：透析后收集点样本-(1/5稀释液)
带8：透析后收集点样本-(1/10稀释液)
带9：透析后收集点样本-(1/15稀释液)
带10：透析后收集点样本-(1/20稀释液)；
附图28的图解描述的是用来筛选可供选择的蔬菜蛋白胨的试验步骤的流程图；
附图29描述的是DCFT27a、DCFT27b发酵过程的分批补料策略；
附图30描述了在5L DCFT27a以及DCFT27b补料分批发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的生长曲线(网状OD vs时间)；
附图31描述了在5L PBFT59a、PBFT59b、PBFT59c分批发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的生长曲线(网状ODvs时间)；
附图32描述了在5L DCFT27d补料分批发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的生长曲线(网状ODvs时间)；
附图33a是在DCFT27d中的SDS PAGE凝胶(植物蛋白胨与氨基酸一同补充)：
带1：高分子量标记物
带2：18小时(6.12微升样本)
带3：17小时(6.12微升样本)
带4：15小时(6.12微升样本)
带5：14小时(6.12微升样本)
带6：13小时(6.12微升样本)
带7：11.3小时(6.12微升样本)
带8：0.27微克胶原酶I以及0.29微克胶原酶II；
附图33b表示的是接种步骤的示意图；
附图33c表示的是大约200升的补料分批接种过程的流程图；
附图34表示的是使用羟磷灰石色谱法后得到的色谱图；
附图35表示的是进行fractogel TMAE阴离子交换之后得到的色谱图；
附图36表示的是来自于5L规模的过程中的羟磷灰石前物质(Pre HA)、羟磷灰石后物质(Post HA)以及TMAE后物质(Post TMAE)的8％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析：
附图37表示的是进行fractogel TMAE阴离子交换之后得到的色谱图；
附图38表示的是在亮抑蛋白酶肽存在的状态下，对TMAE后物质的季胺琼脂糖阴离子交换(IEX)色谱进行的8％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE分析：
附图39表示的是在亮抑蛋白酶肽存在的状态下，对TMAE后物质的季胺琼脂糖阴离子交换色谱进行的8％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE分析。凝胶2-峰值2(ABC I)：
附图40表示的是进行改进的梯度的季胺琼脂糖高效液相色谱阴离子交换之后得到的色谱图；
附图41表示的是在对ABC II进行了Superdex 75凝胶渗透色谱法之后得到的色谱图；
附图42表示的是在精氨酸的存在下，对浓缩型ABC II的Superdex 75凝胶渗透色谱(GPC)进行的12％的Bis-Tris SDS-PAGE分析：
附图43表示的是在对ABC I进行了Superdex 75凝胶渗透色谱法之后得到的色谱图；
附图44表示的是在精氨酸的存在下，对浓缩型ABC I的Superdex 75凝胶渗透色谱(GPC)进行的4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE分析：
附图45表示的是一种被提议的制备方法的流程图；
附图46表示的是方法3的发酵步骤的流程图；
附图47表示的是方法3的纯化步骤的流程图；
附图48是中间产物AUX I以及AUX II的SDS-PAGE(还原的)考马斯(Coomasie)染色：
带
1.高分子量标记物
2.0.132毫克/毫升ABC I参考
3.0.0265毫克/毫升ABC I参考
4.0.132毫克/毫升AUX I中间产物
5.0.0265毫克/毫升AUX I中间产物
6.0.132毫克/毫升ABC II参考
7.0.0265毫克/毫升ABC II参考
8.0.132毫克/毫升AUX II中间产物
9.0.0265毫克/毫升AUX II中间产物；
附图49是药用物质的SDS-PAGE(还原的)考马斯染色：
带
1.高分子量标记物
2.0.132毫克/毫升混合的BTC参考
3.0.0265毫克/毫升混合的BTC参考
4.0.132毫克/毫升药用物质
5.0.0265毫克/毫升药用物质；
附图50是药用物质的SDS-PAGE(还原的)银染色：
带
1.高分子量标记物
2.混合的BTC参考1.3微克
3.空白
4.药用物质1.3微克
5.药用物质0.27微克
6.药用物质0.13微克；
附图51描述的是在一个分批发酵过程中生长于朊间质蛋白胨#3上的溶组织梭状芽孢杆菌与在补料分批培养过程中使用植物蛋白胨的现有发酵过程中生长的溶组织梭状芽孢杆菌的比较；
附图52表示的是在5L的朊间质蛋白胨#3分批发酵过程(GCFT03b)的收集点(20小时)处的胶原酶产物的SDS-PAGE分析(8％的Tris-甘氨酸)：
估计值
AUX I～176毫克/升
AUX II～190毫克/升
附图53表示的是在5L的植物蛋白胨补料分批发酵过程(GCFT03d)的收集点(20小时)处的胶原酶产物的SDS-PAGE分析(8％的Tris-甘氨酸)：
估计值
AUX I～88毫克/升
AUX II～142毫克/升
附图54描述的是生长于50克/升PP3(朊间质蛋白胨3)的溶组织梭状芽孢杆菌的三个发酵过程，证明了一种可再现生长曲线：
附图55是一个SDS-PAGE分析，表明了GCFT05d的时间过程(使用朊间质蛋白胨#3的分批发酵)，(8％的Tris甘氨酸凝胶，胶体染色)：
附图56是一个SDS-PAGE分析，表明了GCFT05d的时间过程(使用朊间质蛋白胨#3的分批发酵)，(8％的Tris甘氨酸凝胶，银染色)：
附图57是一个SDS-PAGE分析，表明了DCFT24b的时间过程(使用植物蛋白胨的补料分批发酵)，(8％的Tris甘氨酸凝胶，胶体染色)：
附图58描述的是使用不同量的PP3(朊间质蛋白胨#3)的发酵过程中溶组织梭状芽孢杆菌的生长曲线的比较：
附图59描述的是对三种不同量的PP3(朊间质蛋白胨#3)进行的小规模比较以及对100克/升PP3(朊间质蛋白胨#3)的评价：
附图60描述的是利用100克/升的PP3(朊间质蛋白胨#3)的两个5L的发酵过程的生长曲线：
附图61是对PBFT70c、100克/升的PP3(朊间质蛋白胨#3)(lot#5354796)发酵过程的时间过程的SDS-PAGE分析(85dTris-甘氨酸)：
附图62是对PBFT70d、100克/升的PP3(朊间质蛋白胨#3)(lot#5325635)发酵过程的时间过程的SDS-PAGE分析(85dTris-甘氨酸)：
附图63表示的是来自于5L的PBFT70c发酵过程的SDS-PAGE的密度计量学分析，用来将细胞生长与产物形成进行比较：
附图64描述的是在5L以及200L的规模中100克/升PP3(朊间质蛋白胨#3)的比较：
附图65是对200L发酵过程的时间过程进行的SDS-PAGE分析(8％的Tris-甘氨酸)：
附图66表示的是来自于200L的发酵过程的SDS-PAGE的密度计量学分析，用来将细胞生长与产物形成进行比较：
附图67是对200L发酵过程的时间过程进行的SDS-PAGE分析(4-12％的Tris-甘氨酸)：
附图68表示的是用于对胶原酶浓度进行密度定量评价的标准曲线。
附图69表示的是对溶组织梭状芽孢杆菌的发酵以及收集的示意性描述。
附图70(a)以及70(b)是使用苯基琼脂糖FF(低取代)的疏水作用色谱得到的色谱图：(a)是满量程色谱而(b)是表示出馏分收集的放大的色谱。
附图71表示的是对Mustang Q步骤至TFF1(正切流动过滤步骤1)步骤的处理过程中的样本进行的4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE分析。其中的凝胶使用胶体蓝进行染色并且过量装载(2.5微克蛋白质总量/带)以表示出污染带(contaminant bands)：
附图72是疏水作用色谱(HIC)后的物质的离子交换色谱(季胺琼脂糖高效液相色谱)，其中所述的物质之前经过了浓缩和渗滤，所述的渗滤是在10毫摩Tris、200微摩亮抑蛋白酶肽、pH8的条件下进行的。
附图73表示的是对来自于峰值1(AUX II)并且在离子交换柱中进行洗脱了的馏分(附图5)进行的4-12％的Bis Tris SDS-PAGE分析。凝胶1：所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色：
附图74表示的是对来自于峰值1(AUX II)并且在离子交换柱中进行洗脱了的馏分(附图5)进行的4-12％的Bis Tris SDS-PAGE分析。凝胶2：所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色：
附图75表示的是对来自于峰值2(AUX I)并且在离子交换柱中进行洗脱了的馏分(附图5)进行的4-12％的Bis Tris SDS-PAGE分析。凝胶3：所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色：
附图76表示的是对来自于峰值2(AUX I)并且在离子交换柱中进行洗脱了的馏分(附图5)进行的4-12％的Bis Tris SDS-PAGE分析。凝胶4：所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色：
附图77表示的是对从阴离子交换步骤至最终产品的处理过程中的样本进行的4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE分析。其中的凝胶使用胶体蓝进行了染色。凝胶1：1微克/带装载量：
附图78表示的是对从阴离子交换步骤至最终产品的处理过程中的样本进行的4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE分析。其中的凝胶使用胶体蓝进行了染色。凝胶2：2.5微克/带装载量：
附图79是使用8％的Tris甘氨酸的SDS-PAGE(NB Ref AS/1640/020)：
1.高分子量标记物
2.空白带
3. 1微克发酵滤液第4天
4. 1微克发酵滤液第5天
5. 1微克Mustang Q后第4天
6. 1微克疏水作用色谱后第3天
7. 1微克疏水作用色谱后第6天
8. 1微克TFF后第2天
9. 1微克TFF后第4天
附图80是使用8％的Tris甘氨酸的SDS-PAGE：
1.高分子量标记物
2. 1微克AUX-I参考
3. 1微克AUX-II参考
4. 1微克IEX后AUX-1第5天
5. 1微克IEX后AUX-1第12天
6. 1微克IEX后AUX-II第5天
7. 1微克IEX后AUX-II第12天
附图81是一个SDS-PAGE凝胶：
1.高分子量标记物
2. 1微克AUX-I参考
3. 1微克AUX-II参考
4. 1微克AUX-1中间产物第5天
5. 1微克AUX-1中间产物第12天
6. 1微克AUX-II中间产物第5天
7. 1微克AUX-II中间产物第12天
附图82表示的是分析型色谱分析。
附图83表示的是由UV(紫外线)测定的蛋白质浓度。
附图84表示的是对来自于20L示范的过程中的样本进行的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析，其中所述的样本是在生产时间点处连续提取的，并且保存于-20℃下。所述的凝胶被胶体蓝进行了染色，1微克的装载量：
附图85表示的是对来自于20L示范的过程中的样本进行的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析，其中所述的样本是在室温条件下连续反应22小时后提取的。所述的凝胶被胶体蓝进行了染色：
附图86表示的是对来自于20L示范的过程中的样本进行的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析，其中所述的样本是在37℃条件下连续反应22小时后提取的。所述的凝胶被胶体蓝进行了染色：
附图87表示的是对来自于20L示范的过程中的样本进行的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析，其中所述的样本是在室温条件下连续反应94小时后提取的。所述的凝胶被胶体蓝进行了染色：
附图88表示的是对来自于20L示范的过程中的样本进行的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析，其中所述的样本是在37℃条件下连续反应94小时后提取的。所述的凝胶被胶体蓝进行了染色：
附图89表示的是对选择的IEX(阴离子交换色谱)后的AUX I馏分以及IEX(阴离子交换色谱)后的AUX II馏分进行的8％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE分析。所述的馏分是从20L示范操作中选择出来的，富含所需的污染蛋白。所述的凝胶被胶体蓝进行了染色：
附图90表示的是对选择的IEX(阴离子交换色谱)后的AUX I馏分以及IEX(阴离子交换色谱)后的AUX II馏分进行的8％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE分析。所述的馏分选自由20LPP3(朊间质蛋白胨#3)发酵过程产生的纯化物质，富含大约90kDa的污染蛋白。所述的凝胶被胶体蓝进行了染色：
具体实施方式
本发明提供了一种新的胶原酶药用物质，包括高纯度的胶原酶I以及胶原酶II的混合物，两者的质量比约为1：1。已经发现，包含质量比为1：1的胶原酶I与胶原酶II的混合物的组合物能够提供高度可再生的、最佳的酶活性，并且在降低副作用的潜在性的同时给予优越的治疗作用。应当理解的是，术语“药用物质”、“药物产品”或者“胶原酶组合物”是可以相互交替使用的。
在一种实施方式中，本发明提供了一种由胶原酶I以及胶原酶II组成的药用物质，其中所述的胶原酶I以及胶原酶II分别具有溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I以及胶原酶II的序列，且两者的质量比约为1：1，具有至少95％面积的纯度(by area)，并且优选具有至少98％面积的纯度。
在另外一种实施方式中，本发明提供了一种药用物质，其中所述的药用物质具有至少一种选自下述表A的具体值：
表A
在一个方面，本发明提供了一种制备药用物质的方法，所述的药用物质由胶原酶I以及胶原酶II组成，所述的胶原酶I以及胶原酶II分别具有溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I以及胶原酶II的序列，且两者的质量比约为1：1，具有至少95％面积的纯度，该方法包括如下步骤：
a)对溶组织梭状芽孢杆菌进行发酵；
b)收集包括胶原酶I以及胶原酶II在内的粗产物；
c)使用过滤以及柱层析将胶原酶I以及胶原酶II从上述粗产物中纯化出来；以及
d)将(c)步骤中纯化得到的胶原酶I以及胶原酶II以大约1：1的比例进行混合。
在一种优选的实施方式中，所述的发酵步骤是在来自于猪的培养基、或者植物蛋白胨培养基的存在下进行的。更优选的，所述的来自于猪的培养基是朊间质蛋白胨#3。
在一种实施方式中，本发明提供了一种发酵方法，包括如下的步骤：
a)向第一部分的培养基中接种溶组织梭状芽孢杆菌，并且搅拌得到的混合液；
b)对步骤(a)得到的混合液进行培养，从而得到一个等份溶液；
c)向第二部分的培养基中接种步骤(b)得到的等份溶液，并且搅拌得到的混合液；
d)对步骤(c)得到的混合液进行培养；
e)向第三部分的培养基中接种步骤(d)得到的等份溶液并且搅拌；
f)对步骤(e)得到的混合液进行培养；
g)向第四部分的培养基中接种步骤(f)得到的等份溶液并且搅拌；
h)对步骤(g)得到的混合液进行培养；并且
i)过滤收集步骤(h)得到的培养物。
在一种优选的实施方式中，所述的发酵方法包括如下的步骤：
a)在温度设定点为37℃的条件下，向3×25毫升的PP3(朊间质蛋白胨)培养基中接种3×250微升WCB(工作细胞库)(将25毫升培养液置于3×125毫升摇瓶中培养，并置于厌氧气体罐中)，并且在125rpm条件下对得到的混合液进行搅拌；
b)对步骤(a)得到的混合液培养12小时；
c)在温度设定点为37℃的条件下，向4×200毫升的PP3(朊间质蛋白胨)培养基中接种4×5毫升等份的上述25毫升培养液中的一份(将200毫升培养液置于4×500毫升摇瓶中培养，并置于厌氧气体罐中)，并且在125rpm条件下对得到的混合液进行搅拌；
d)对步骤(c)得到的混合液培养12小时；
e)在温度设定点为37℃且pH设定点为7.00的条件下，向14.4升的PP3(朊间质蛋白胨)培养基中接种3×200毫升的培养液(将15升培养液置于20升发酵罐中培养)，并且在125rpm条件下对得到的混合液进行搅拌；
f)对步骤(e)得到的混合液培养12小时；
g)在温度设定点为37℃且pH设定点为7.00的条件下，向192升的PP3(朊间质蛋白胨)培养基中接种15升培养液中的8升(将200升培养液置于270升发酵罐中培养)，并且在125rpm条件下对得到的混合液进行搅拌；
h)对步骤(g)得到的混合液培养14小时；
i)过滤收集200升培养液(深度0.2微米)，所述的过滤使用Millipore Millistak4平米以及0.2微米过滤器(2×Millipore Express XL 10过滤器)，并且流速为200升/小时。
在一种实施方式中，本发明提供了一种纯化方法，包括如下的步骤：
a)使粗收集物通过Mustang Q阴离子交换胶囊式过滤器进行过滤；
b)加入硫酸铵；优选至最终浓度为1M；
c)过滤得到的粗收集物；优选通过0.45微米的过滤器；
d)将滤液通过疏水作用色谱(HIC)柱；优选是苯基琼脂糖6FF(低取代)；
e)向滤液中加入亮抑蛋白酶肽；优选至最终浓度为0.2毫摩至超过疏水作用色谱洗脱产物；
f)去除硫酸铵，利用TFF(正切流动过滤)进行缓冲交换从而保持亮抑蛋白酶肽与胶原酶I以及胶原酶II的正确结合；优选使用TFF(正切流动过滤)进行缓冲交换；
g)对步骤(f)得到的混合液进行过滤；优选通过一个0.45微米的过滤器；
h)使用Q-琼脂糖高效液相色谱分离胶原酶I以及胶原酶II；
i)分别为胶原酶I以及胶原酶II制备TFF(正切流动过滤)浓缩物和制剂；其中TFF是正切流动过滤，使用的是10和/或30KMWCO(分子量截留)的PES(聚醚砜)或者RC-聚醚砜(再生纤维素-聚醚砜)或者再生纤维素滤膜。提供几种方式对精选蛋白进行保留和浓缩，并且将所述蛋白从一种缓冲溶液交换至另外一种缓冲溶液中；并且
j)通过一个0.2微米的过滤系统进行过滤。
本发明所述的药用物质同时包括胶原酶I以及胶原酶II。粗胶原酶的一种优选的来源是来自于细菌的发酵过程，特别是溶组织梭状芽孢杆菌(C.his)的发酵。在本发明的一种实施方式中，描述了一种发酵方法。可以使用本领域技术人员已知的各种方法对通过溶组织梭状芽孢杆菌所获得的粗胶原酶进行纯化，包括染料配体亲和层析，肝磷脂亲和层析，硫酸铵沉淀，羟磷灰石色谱，尺寸排阻色谱，离子交换色谱，以及金属螯合色谱。粗胶原酶以及部分纯化的胶原酶可以通过许多途径商购获得，包括Advance Biofactures有限公司，Lynbrook，纽约。
胶原酶I以及胶原酶II都是金属蛋白酶，为了保持其活性，需要与锌进行紧密结合，且与钙进行疏松结合(参见Eddie L.Angleton以及H.E.Van Wart于1988年发表于Biochemistry《生物化学》，27，7406-7412的文章)。两种胶原酶对于所有类型的骨胶原都具有广泛的特异性(参见Steinbrink，D；Bond，M以及Van Wart，H于1985年发表于JBC，260，2771-2776页的文章)。胶原酶I以及胶原酶II通过在生理学条件下对骨胶原的三螺旋区域进行水解来消化骨胶原(参见Steinbrink，D；Bond，M以及Van Wart，H于1985年发表于JBC，260，2771-2776页的文章)。虽然每种胶原酶表现出不同的特异性(例如，每个胶原酶都具有不同的用于分裂的优选氨基序列)，它们会一同对骨胶原产生协同作用[参见Mandl,I.于1964年发表于Biochemistry《生物化学》，3，1737-1741页的文章；Vos-Scheperkeuter,GH于1997年发表于Cell Transplantation《细胞移植》，6，403-412页的文章]。正如文献中对于II类胶原酶以及I类胶原酶的报道，相对于胶原酶I而言，胶原酶II对于所有种类的合成肽底物都具有更高的活性。[参见Bond,M.D.于1984年发表于Biochemistry《生物化学》，23，3085-3091页的文章；Hesse,F,于1995年发表于Transplantation Proceedings《移植学报》，27，3287-3289页的文章]。
可以使用本发明所述的组合物以及方法进行治疗的由骨胶原介导的疾病的例子包括但不局限于：杜普伊特伦氏疾病(Dupuytren’s)；佩罗尼氏疾病(Peyronie’s)；冻结肩(五十肩)(粘连性囊炎)，瘢痕瘤；肥厚性瘢痕；例如由炎性痤疮引起的凹陷性瘢痕；术后粘连；寻常性瘢痕；脂肪瘤；以及损伤症状例如起皱，脂肪团形成以及肿瘤纤维化。在此引用作为参考的美国专利申请6086872以及5589171公开了胶原酶制剂在治疗杜普伊特伦氏疾病中的应用。在此引用作为参考的美国专利申请6022539公开了胶原酶制剂在治疗佩罗尼氏疾病中的应用。
除了可以用于治疗由骨胶原介导的疾病之外，本发明所述的组合物对组织进入个体细胞以及细胞群中的分裂同样有效，因而其能够用于广泛类型的实验室、诊断学以及治疗学应用中。这类应用包括对用于各种用途的许多类型的细胞进行分离，包括用于小直径合成血管嫁接播种的微血管内皮细胞，用于基因治疗、药物毒理学筛选以及体外肝脏辅助器的肝细胞，用于软骨再生的软骨细胞，以及用于治疗胰岛素依赖型糖尿病的胰岛(isletsof Langerhans)。酶处理作用于细胞外基质蛋白片段以及那些维持细胞-细胞间接触的蛋白。由于骨胶原是组织超微结构中的首要的蛋白组成，因而胶原酶被频繁的用来完成期望的组织分解。通常，当期望进行细胞的移除或者细胞外基质的修饰时，本发明所述的组合物可以有效的进行任何的应用。
本发明所述的胶原酶组合物也可以通过混合特定数量的活性单位(activityunits)或者混合特定质量的优选的纯化的酶来制备。胶原酶活性可以通过测定酶水解合成肽或者骨胶原底物的能力来进行。本领域技术人员能够认可，使用不同于本发明公开的酶检测方法同样可以用来定义并且制备功能相同的酶组合物。
本发明的另外一个方面涉及本发明所述组合物中胶原酶I以及胶原酶II的1：1的质量比的可再现优化。由于几种因素的存在，使得先前胶原酶I以及胶原酶II的比例的可再现性一直是一个挑战。首先，梭菌的工业发酵通常产生1：2比例的胶原酶I以及胶原酶II。其次，已知纯化步骤能够明显的改变这种比例，导致纯化产物的不一致比例。本发明所述组合物的优化的固定的质量比将两种不同胶原酶所产生的协同活性最大化，从而提供优秀的治疗效果。
本发明还提供了本发明所述组合物的药物制剂。本发明所述的药物制剂包括治疗有效剂量的本发明所述胶原酶组合物，以及一种或者多种药物可接受性载体或者赋形剂。
这里使用的术语“药物可接受性载体或者赋形剂”指的是非毒性的、惰性固体、半固体或者液体填充物，稀释液，囊材或者任何类型的制剂助剂。可以作为药物可接受性载体的材料的某些例子是糖，例如乳糖，葡萄糖以及蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉以及马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素以及醋酸纤维素；黄芪胶粉末；麦芽；明胶；滑石；乙二醇，例如丙烯乙二醇；酯类，例如油酸乙酯以及月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁以及氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；罗格氏溶液(Ringer’ssolution)；乙醇，以及磷酸缓冲溶液，以及其他非毒性兼容型润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，涂覆剂，芳香剂，防腐剂以及抗氧化剂，依照药剂师的判断，它们也都可以存在于本发明所述组合物中。
本发明所述的药物组合物可以经由肠道外、局部、或者通过植入式药盒(implanted reservoir)的形式给药。这里使用的术语肠道外包括皮下注射，皮内注射，静脉内注射，肌肉内注射，关节内注射，动脉内注射，滑膜内注射，胸骨内注射，鞘内注射，损伤区内注射以及颅骨内注射或者融合技术。在一种优选的实施方式中，将所述的组合物注射入损伤组织中。当存在佩罗尼氏疾病或者杜普伊特伦氏疾病或者粘连性囊炎时，将所述的组合物注射入到椎管(cord)或者斑(plaque)中。这里定义的术语“局部给药”包含了这类直接注射。
进一步的，当给药之后对注射位点进行固定，能够获得格外好的效果。例如，可以对给药位点进行4个小时或者更长时间的固定。
注射型制剂，例如，无菌注射液或者油性悬浮液，可以依照已知的技术使用适当的分散剂或者润湿剂以及悬浮剂进行配制。所述的无菌注射型制剂也可以是一种无菌注射溶液、悬浮液或者乳状液，其存在于非毒性肠道外可接受性稀释剂或者溶剂中，例如，存在于1，3-丁二醇中的溶液。在上述可接受性溶媒以及溶剂中，可以使用的是水，罗格氏溶液，U.S.P以及等渗氯化钠溶液。除此之外，无菌的不挥发性油通常被用来作为溶剂或者悬浮介质。对于这一用途，任何温和的不挥发性油都可以使用，包括合成的单甘油酯或者甘油二酯。除此之外，脂肪酸例如油酸也被用在注射剂的制备中。
所述的注射型制剂可以使用例如通过一个细菌截留过滤器过滤的方式进行灭菌，或者向其中加入灭菌剂，形成无菌固体组合物，所述的无菌固体组合物在使用之前可以溶解或者分散于无菌水或者其他无菌注射型介质中。也可以将所述的无菌溶液进行冻干，以备后续的使用。
用于进行局部给药或者透皮给药的本发明所述化合物的剂型包括药膏，贴剂，霜剂，洗剂，凝胶，粉末，溶液，喷雾剂，吸入剂或者片剂。在无菌条件下，将所述的活性成分与药物可接受性载体以及可能需要的任何防腐剂或者缓冲剂进行混合。
除了本发明所述的活性组合物之外，上述的药膏、贴剂、霜剂以及凝胶可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪，油，蜡，石蜡，淀粉，黄芪胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅树脂，斑脱土，硅酸，滑石以及氧化锌，或者它们的混合物。
除了本发明所述的组合物之外，粉末和喷雾剂可以含有赋形剂，例如乳糖，滑石，硅酸，氢氧化铝，硅酸钙和聚酰胺粉末，或者这些物质的混合物。喷雾剂还可以额外含有常规的推进剂，例如氟氯烃。
透皮片剂具有能够控制化合物向机体内的运送的额外优点。这类剂型可以通过将所述的化合物溶解或者分散于适当的介质中来制备。也可以使用吸收增强剂来提高所述化合物经由皮肤的通量(flux)。可以使用速率控制膜来控制上述速率，或者将所述化合物分散于一种聚合物基质或者凝胶当中。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的药用物质是使用乳糖配制而成的冻干的注射型组合物。在一种实施方式中，每毫克注射型胶原酶与1.9毫克乳糖进行配制。在另外一种实施方式中，每毫克注射型胶原酶优选具有大约2800个SRC单位，当使用合成底物pzGPGGPA进行效价检测(potency assay)时，其具有51000个单位。
在另外一种优选的实施方式中，本发明所述的胶原酶组合物是一种使用蔗糖、Tris在大约8.0的pH水平下进行配制的冻干的注射型组合物。最优选的，在pH约为8.0的条件下，将1.0毫克本发明所述的药用物质与60毫摩蔗糖、10毫摩Tris进行配制(这等价于在配制缓冲液中存在20.5毫克/毫升蔗糖以及1.21毫克/毫升Tris)。上述配方中的某些例子包括，但不局限于，对于0.58毫克剂量的药用物质来说，向每个小瓶中加入18.5毫克的蔗糖以及1.1毫克的Tris，其中目标小瓶填充体积为0.9毫升；以及对于0.58毫克剂量的药用物质来说，需要12.0毫克的蔗糖(multicompendial)以及0.7毫克的Tris(multicompendial)。
依照本发明，提供了用于治疗由骨胶原介导的疾病的方法，包括如下步骤：向需要接受治疗的患者施用治疗有效剂量的本发明所述的组合物，或者治疗有效剂量的本发明所述的药物制剂。本发明所述化合物的“治疗有效剂量”指的是能够为接受治疗的宿主提供治疗效果的化合物的剂量，该剂量具有任何医学治疗可应用的合理的效益/风险比。
所述的治疗效果可以是客观的(即，通过某种测试或者标记物可以测量的)或者是主观的(即，宿主给出对于效果的指示或者感觉)。有效剂量也将依赖于给药路径以及与其他试剂一同施用的可能性而发生变化。然而，可以理解的是，本发明所述组合物的每日总剂量将由主治医师决定，在合理的医学判断范围之内。针对任意特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于各种因素，包括治疗所针对的症状以及症状的严重程度；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、整体健康状况、性别以及饮食；给药时间、给药路径、以及所使用的具体化合物的代谢速率；治疗的过程；与所使用的具体化合物结合使用或者同时使用的药物；以及在药物领域熟知的类似因素。
注射型胶原酶的药用物质由两种微生物胶原酶组成，它们被称为胶原酶AUX I和胶原酶ABC I以及胶原酶AUX II和胶原酶ABC II。可以理解的是，术语“胶原酶I”、“ABC I”、“AUX I”、“胶原酶AUX I”、以及“胶原酶ABC I”代表的意思相同并且是可以相互交替使用的。类似的，术语“胶原酶II”、“ABC II”、“AUX II”、“胶原酶AUX II”、以及“胶原酶ABC II”指的是相同的酶并且也是可以相互交替使用的。这些胶原酶是由细菌细胞所分泌的。它们是通过色谱方法从溶组织梭状芽孢杆菌的培养物上清液中被分离和纯化出来的。两种胶原酶都是特异性蛋白酶，并且共有一个相同的EC编号(E.C.3.4.24.3)。
胶原酶AUX I具有一个单独的多肽链，所述的多肽链由大约1000个氨基酸组成，具有115kDa的分子量。胶原酶AUX II也具有一个单独的多肽链，所述的多肽链由大约1000个氨基酸组成，具有110kDa的分子量。
尽管文献表明在胶原酶AUX I以及胶原酶AUX II的区域中存在序列同一性，western印迹分析表明，上述两种多肽似乎不是免疫学可交叉反应的。
所述的药用物质(胶原酶浓缩物)具有质量比大约为1：1的胶原酶AUX I以及胶原酶AUX II。所述的胶原酶浓缩物具有1.528的消光系数。
这里所引用的所有参考文献，无论是以出版物、电子形式、计算机可读存储媒介或者其他形式存在的，其全部内容都清楚的在此引入作为参考，包括但不局限于，摘要，论文，杂志，出版物，课文，论述，因特网网页，数据库，专利，以及专利公开文献。
实施例
与下面描述的实施例进行联系，将会更好的理解本发明所述的组合物以及方法，所述的实施例仅仅意在描述，并不构成对本发明的范围的限制。对下述公开的实施方式的各种改变以及修饰对于本领域技术人员而言都将是显而易见的，并且这类改变以及修饰包括，但不局限于，在不背离本发明的精神以及随后的权利要求的范围的情况下，那些涉及本发明所述步骤、制剂和/或方法的改变以及修饰。
过程2：
发酵过程
这项工作展示了并进行了一种发酵过程，其目标在于从5L发酵规模的步骤中获得总量为250毫克/升的胶原酶ABC I以及胶原酶ABC II，其中所述的发酵在不含动物成分的生长培养基上进行。对各种可能的可供选择的氮源进行筛选，查看这些氮源是否会对胶原酶在植物蛋白胨上的表达产生任何影响，其中所述的植物蛋白胨是普遍用于生长培养基中的物质。进行一项试验，比较两个溶组织梭状芽孢杆菌菌株004以及013的生产力(productivities)，从而确定上述两个菌株在生长动力学、胶原酶生产力以及对生长于动物来源培养基的污染性蛋白酶的生产方面是否具有任何的区别。这种比较突出的表明，将溶组织梭状芽孢杆菌菌株置于动物来源培养基中以及不含动物成分生长培养基中将产生显著的区别。
先前的结果说明，增加植物蛋白胨以及酵母提取物的浓度表现出支持更高的生物量浓度并且因此支持更高水平的全部胶原酶的表达。为了尝试进一步增加生物量浓度以及优化了的分批发酵培养基的全部胶原酶生产力，设计出一种补料分批发酵策略。进行两个5L(5升)的发酵过程，其中一个在分批阶段使用高浓度培养基，然后在补料阶段使用低浓度培养基，另外一个在分批阶段使用低浓度培养基，然后在补料阶段使用高浓度培养基。两个发酵过程都产生了高生物量浓度，然而高浓度的分批阶段表现出了相对低水平的胶原酶表达。低浓度的分批发酵表现出非常高水平的胶原酶表达(大约280毫克/升)，然而这种培养同时生成了显著量的污染性蛋白酶，梭菌蛋白酶。
尽管低浓度的分批发酵在胶原酶的表达方面给出了非常好的结果，但高度浓缩的植物蛋白胨以及酵母提取物补料溶液的制备是非常困难的。进行两次另外的发酵过程，第一个发酵是重复进行先前成功了的补料分批发酵过程，而第二个发酵过程具有轻微的高浓度分批阶段培养基组合物，以及相对低浓度的补料溶液。两个发酵过程达到了类似的生物量浓度，并且表现出相同的胶原酶以及梭菌蛋白酶表达曲线。在两个发酵过程中生成的胶原酶的量又一次被评估为大约280毫克/升。然而，这些发酵过程生成了显著量的污染性蛋白酶梭菌蛋白酶。
对选择出的可供选择的氮源进行评价，根据它们替代植物蛋白胨用于补料分批发酵策略中的能力。溶组织梭状芽孢杆菌在蔬菜蛋白胨中生长的极好，达到4至5单位的光学密度(600纳米)。然而，对这些发酵过程进行的SDS-PAGE分析表明，没有胶原酶或者梭菌蛋白酶的表达。由于在这些蛋白胨上观察到的丰富的细胞生长，认为复合氮源的浓度太高，导致了对蛋白酶表达的抑制。因此，进行了第二组发酵过程，其中在分批策略中使用的可供选择的蛋白胨为50克/升。当使用SDS-PAGE对上述发酵过程进行分析时，再一次发现没有胶原酶或者梭菌蛋白酶的表达。使用植物蛋白胨进行补料分批发酵，其中补充三种氨基酸，谷氨酸，色氨酸以及天冬酰胺。这些氨基酸被认定为以较小的剂量存在于非动物培养基中。上述发酵过程的生长曲线与不进行氨基酸补充的补料分批发酵过程的生长曲线非常相似。SDS-PAGE分析表现出了类似的胶原酶产量，但是梭菌蛋白酶的水平是轻微降低的。梭菌蛋白酶检测表明，当与对照补料分批发酵过程进行比较时，补充氨基的发酵过程活性降低。梭菌蛋白酶的活性的降低尽管是显著的，但是没有动物培养基与非动物培养基间的区别那么明显。
对粗发酵上清液的0.2微米的滤液进行硫酸铵沉淀，用来对胶原酶的初步回收步骤进行评价。其目的在于帮助增加胶原酶的产量，并且理想的降低完成发酵过程的梭菌蛋白酶的量。对100-400克/升的初始硫酸铵浓度进行评价。硫酸铵达到400克/升会导致胶原酶的显著回收。使用更高范围的硫酸铵(400-520克/升)进行进一步的研究。除此之外，也对将pH降低至6.0以及在沉淀之前对培养基进行氧化所产生的作用进行了调查。在任意的这类条件下，没有观察到从上清液中回收的胶原酶或者梭菌蛋白酶的量的区别。由400克/升硫酸铵所产生的小球是最容易重新悬浮的。
对两个溶组织梭状芽孢杆菌菌株(004以及013)的比较研究表明，动物来源培养基对胶原酶的生产力低于优化了的非动物来源培养基对胶原酶的生产能力。SDS-PAGE分析，得到了针对梭菌蛋白酶活性的酶法检测的支持，其强调与非动物培养基相比，由动物来源培养基生成的物质中的梭菌蛋白酶的量显著降低。这强调了一个事实：在污染性蛋白酶的生产方面，由非动物来源培养基发酵过程生成的进料(feedstock)与使用动物来源培养基的发酵过程中的进料物质是显著不同的。
第一组补料分批发酵-DCFT24
过程研究工作的结果表明，与初始培养基(50克/升植物蛋白胨以及8.5克/升酵母提取物)相比，使用浓缩的培养基(100克/升植物蛋白胨以及50克/升酵母提取物)导致更高剂量的胶原酶的表达。除此之外，其最初表现出生产的梭菌蛋白酶的量降低。
随后，进行两个5L的发酵过程。第一个发酵过程，其策略由一个长的分批阶段/短的补料分批阶段组成，而第二个发酵过程由一个短的分批阶段/长的补料分批阶段组成。在上述两种策略中，在发酵结束时(20小时之后)植物蛋白胨以及酵母提取物的浓度分别为100克/升以及50克/升，如分批发酵过程的情况。表1以及表2详细描述了使用到的培养基成分表以及策略。
表1培养基成分表以及补料分批策略
表2培养基成分表以及补料分批策略
附图1表示出了来自于上述两个发酵过程的生长曲线(OD600nm vs时间)，而附图2表示的是网状生长曲线(Net OD600nm vs时间)。可以观察到，第一个发酵过程中的细胞生长的非常迅速，在大约10小时之后达到了它们最大的OD。这是因为在其分批阶段培养基是非常浓缩的。在补料分批阶段，细胞没有表现出生长。其OD值轻微减小，这可能部分归因于细胞正在死亡以及补料在发酵罐中的稀释作用。
对于第二个发酵过程而言，在6小时之后开始了补料分批阶段。在这一点上，其OD值可能是低的，如附图1中的生长曲线中所表明的。细胞继续缓慢生长，直到大约18小时时间。
值得注意的是，附图2中的网状生长曲线表明，DCFT24b发酵过程中的细胞密度比DCFT24a发酵过程中的细胞密度高。在接种之前，其培养基的OD600nm大约为1.7，而在DCFT24b中，大约为0.4。这些区别是因为发酵罐进行了高压灭菌，因而形成了沉淀。对于DCFT24a来说，其相对于DCFT24b形成了更大剂量的沉淀。
SDS PAGE凝胶：
对上述两个发酵过程中的每一个进行上清液样本的SDS PAGE分析(8％的Tris-甘氨酸凝胶)。所述的凝胶在附图3以及附图4中表示出来。同样对第二个发酵过程的收集点样本进行了半定量SDS PAGE凝胶。
附图4中的SDS PAGE凝胶分析表明，非常低剂量的胶原酶进行了表达。这可能是因为在分批阶段细胞生长非常迅速，因而在大约10小时之后达到了最大细胞浓度。相反的，在第二次发酵过程中观察到非常高水平的胶原酶表达，这可能是因为在短的分批阶段过程中细胞生长的比较缓慢，并且在补料分批阶段过程中持续生长。因此，本发明涉及一种改进的发酵溶组织梭状芽孢杆菌的方法，其中细胞生长得到了控制，并且在短的分批阶段细胞生长是缓慢的，而在补料分批阶段细胞持续生长。缓慢生长被定义为指的是在短的分批阶段过程中其生长速率不能够在补料分批阶段之前达到最大细胞浓度，例如在发酵过程开始的大约10个小时内。在一种优选的实施方式中，其生长速率大约为这里所描述的第二个发酵周期。
在第二个发酵周期的收集点处进行的半定量SDS PAGE凝胶所评估的胶原酶生产力(附图5)为：132毫克/升胶原酶ABC I以及158毫克/升胶原酶ABC II。将这些值与先前得到的值进行比较，使用补料分批策略使得表达水平增加了大约3倍。
下一个步骤是进行另外一组补料分批发酵过程，使用轻度改良了的补料分批策略以及培养基。其目标在于提高发酵过程的可测量性以及强度。
此次发酵过程使用的培养基成分表与前述内容相同，例外的是在分批阶段植物蛋白胨以及酵母提取物进行过滤灭菌来取代高压灭菌。这样做是为了避免对酵母提取物以及植物蛋白胨进行高压灭菌，该过程通过加热能够潜在的影响它们的组合物以及培养基中蛋白质的变性。在发酵过程DCFT26b中，增加了酵母提取物以及植物蛋白胨的量。这样做使得在补料中的酵母提取物以及蛋白胨的浓度低于DCFT26a中的浓度，因此更加容易准备(makeup)和过滤灭菌。对于两个发酵过程来说，下面的策略是相同的，一个6小时的分批阶段，随后是一个14小时的补料分批阶段。表3以及表4列出了培养基成分表，而附图6表示的是两个发酵过程所使用的策略。
表3培养基成分表以及DCFT26a的补料分批策略
表4培养基成分表以及DCFT26b的补料分批策略
附图7表示的是来自于上述两个发酵过程的生长曲线(OD600nm vs时间)，而附图8表示的是它们的网状生长曲线(Net OD600nm vs时间)。
DCFT26a以及DCFT26b的生长曲线与附图2中所示的DCFT24b的生长曲线非常相似。在补料分批阶段过程中细胞生长缓慢，并且达到大约为3.5的最终网状OD600nm(600纳米处的光学密度)。
发酵样本的SDS PAGE凝胶：
对上述两个发酵过程中的每一个的上清液样本进行SDS PAGE分析(8％的Tris-甘氨酸凝胶)(附图9以及附图10)。除此之外，为了对胶原酶的量进行更好的评估，在DCFT26a(附图11)以及DCFT26b(附图12)的收集样本点处进行半定量SDS PAGE凝胶。
在上述两个发酵过程中，胶原酶的水平都与DCFT24b(附图3)中胶原酶的水平相似。半定量SDS PAGE凝胶表明，DCFT24a以及DCFT24b都得到了与DCFT24b非常相似的水平(胶原酶总量在280毫克/升至300毫克/升之间)。DCFT26a发酵周期的收集点(附图11)为：胶原酶I的收集点为大约142毫克/升，而胶原酶II的收集点为大约132毫克/升。DCFT26b发酵周期的收集点(附图12)为：胶原酶I的收集点为大约147毫克/升，而胶原酶II的收集点为大约1582毫克/升。正如在DCFT24b中的情形，梭菌蛋白酶的水平仍然很高。
对硫酸铵沉淀步骤的研究：
从上述发酵过程中得到的结果表明，使用补料分批策略得到的胶原酶的水平虽然很高，但梭菌蛋白酶的水平也同样非常高。因此建立一个小规模的实验室研究，以调查硫酸铵的浓度对于从来自于滤过的发酵上清液的沉淀小球中回收到的梭菌蛋白酶以及胶原酶的量的影响。
为了对硫酸铵沉淀步骤的效率进行评价，从发酵过程DCFT26a中收集6×100毫升的上清液样本。使用6种不同浓度的硫酸铵对这些样本进行沉淀，具体浓度在下面的表格中进行描述。使用3.3毫升的WFI(注射用水)对小球进行重新悬浮，并且使用100毫摩的磷酸氢二钾(pH6.7)进行透析(dialysed)。
表5用于沉淀100毫升来自于DCFT26a的上清液样本的硫酸铵浓度
然后，使用SDS PAGE分析方法对透析后的样本进行分析。
附图13：使用15％以及22.5％(的饱和度)进行沉淀的透析后收集点样本
附图14：使用30％以及37.5％(的饱和度)进行沉淀的透析后收集点样本
附图15：使用45％以及60％(的饱和度)进行沉淀的透析后收集点样本
上述凝胶表明，当使用具有15％的饱和度至45％的饱和度的硫酸铵时，在透析后的样本中的胶原酶的水平非常低。在这些情况中，回收率看上去低于5％。
当使用饱和度为60％的硫酸铵(400克/升)时，在透析后样本中的胶原酶的水平非常高(附图15)。通过对比带的亮度(样本与参考)，我们可以估算出在透析后的样本中存在的每种胶原酶的量大约为70毫克/升。这表明具有大约50％至60％的回收率，因为根据对DCFT26a进行的半定量凝胶检测(附图11)，在收集点样本中的每种胶原酶的量大约为130毫克/升。
因此，本发明涉及在DCFT26b中如上所述的培养基成分表的使用(当然，上述列出的量都是近似的)以及使用硫酸铵对胶原酶进行沉淀，其中向所述的含有胶原酶的培养基中加入的硫酸铵的量大约为400克/升。
第三组补料分批发酵过程
这里的首要目标在于对进行的补料分批策略的可再现性进行评价。进行一个补料分批发酵过程，其复制DCFT26b的发酵过程。除此之外，通过更多的细节对硫酸铵/沉淀步骤进行调查，与先前的小规模研究进行比较。更具体的，其目标在于检验不同浓度的硫酸铵对于存在于沉淀后/透析后样本中的胶原酶以及梭菌蛋白酶的回收所产生的影响，其中所述的硫酸铵的浓度从60％(400克/升)直至80％(530克/升)。除此之外，也对处理收集到的上清液样本的两种方法进行了评价，所述的两种方法即改变pH的方法以及氧化培养基的方法。
生长曲线：
使用的培养基以及补料分批策略与DCFT26b完全相同。附图16表示的是所述发酵过程的生长曲线(OD600nm vs时间)以及网状生长曲线(Net OD600nm vs时间)。上述生长曲线与DCFT26b的生长曲线非常相似，这表明该过程具有良好的可再现性。
在上述发酵过程中对上清液样本进行的SDS PAGE分析(8％的Tris-甘氨酸凝胶)表明，其生成的胶原酶以及梭菌蛋白酶的水平与DCFT26b所生成的胶原酶以及梭菌蛋白酶的水平非常相似(SDS PAGE凝胶未示出)。对收集点样本进行半定量SDS PAGE凝胶(8％的Tris-甘氨酸凝胶)(附图17)。上述凝胶表明，与在DCFT26b中观察到的相类似，存在的每种胶原酶的量多于120毫克/升。
对发酵收集样本进行硫酸铵沉淀：
为了对硫酸铵沉淀步骤的效率进行评价，收集7×500毫升的上清液样本。使用下述七种方法对其进行沉淀。
在所有种方法中，将小球重新悬浮于16.5毫升的WFI(注射用水)中，并且使用100毫摩的磷酸氢二钾(pH6.7)进行透析，方法4例外，在该方法中将小球重新悬浮于16.5毫升100毫摩的磷酸氢二钾(pH6)中，并且使用相同的缓冲液进行透析。之后，进行SDS PAGE凝胶，用来评估在透析后样本中的胶原酶的量并且评价上述沉淀/透析步骤的回收率。
接下来的沉淀/透析方法如下：
1使用400克/升的硫酸铵进行沉淀，将硫酸铵一次性加入到上清液样本中。使用100毫摩的磷酸氢二钾进行透析，pH6.7。
2使用400克/升的硫酸铵进行沉淀，将硫酸铵缓慢加入(大约30分钟)到上清液样本中。使用100毫摩的磷酸氢二钾进行透析，pH6.7。
3使用400克/升的硫酸铵进行沉淀，将硫酸铵缓慢加入(大约30分钟)到上清液样本中，其中所述的上清液样本是经过预先氧化的。通过对从发酵罐中收集到的500毫升细胞培养物进行大约10分钟的氧化来完成这一步骤。随后对所述的培养物进行过滤灭菌。当使用硫酸铵进行沉淀之后，使用100毫摩的磷酸氢二钾对生成的小球进行透析，pH6.7。
4使用400克/升的硫酸铵进行沉淀，将硫酸铵缓慢加入(大约30分钟)到上清液样本中，通过加入5N的盐酸将pH变为6。使用100毫摩的磷酸氢二钾对在此之后生成的小球进行透析，pH6。
5使用440克/升的硫酸铵进行沉淀，将硫酸铵缓慢加入(大约30分钟)到上清液样本中。使用100毫摩的磷酸氢二钾进行透析，pH6.7。
6使用480克/升的硫酸铵进行沉淀，将硫酸铵缓慢加入(大约30分钟)到上清液样本中。使用100毫摩的磷酸氢二钾进行透析，pH6.7。
7使用520克/升的硫酸铵进行沉淀，将硫酸铵缓慢加入(大约30分钟)到上清液样本中。使用100毫摩的磷酸氢二钾进行透析，pH6.7。
当向上清液样本中加入480克/升以及520克/升的硫酸铵时，硫酸铵不能够完全溶解，而当其以400克/升以及440克/升的浓度加入时，可以完全溶解。
SDS PAGE结果表明，在沉淀步骤中使用到的不同水平的硫酸铵(400克/升，440克/升，480克/升，520克/升)或者使用到的其他方法(氧化，改变pH)似乎没有对存在于透析后样本中的胶原酶的量产生明显的作用。在所有的情况中，存在于透析后的样本中的每种胶原酶的浓度在50毫克/升至60毫克/升的范围内。附图18a表示的是一个代表性的SDS PAGE凝胶，正如使用400克/升的硫酸铵进行沉淀的透析后样本的SDS PAGE凝胶。由于所有的凝胶都非常相似，在该报告中没有列出其他的SDS PAGE凝胶。
考虑在收集点样本中估算的胶原酶浓度(附图17)以及在透析后样本中估算的胶原酶浓度，在沉淀/透析步骤之后胶原酶的回收率为大约50％。为了调查50％回收率这一值是否准确，因为由SDS凝胶对胶原酶浓度进行估算的错误率通常很高，因而实施下述SDSPAGE凝胶。
●针对全部上清液进行的一种SDS PAGE凝胶，其中所述的上清液是在对硫酸铵沉淀样本进行离心后得到的(附图18a)。其目标在于评价在上清液中是否发生了任何量的胶原酶的损失。
●对收集点上清液样本以及透析后硫酸铵(400克/升)沉淀的样本进行适当的稀释，使其含有等量的胶原酶，并且装载相同的凝胶而进行的SDS PAGE凝胶(附图19)。
●对收集点上清液样本以及透析后硫酸铵(520克/升)沉淀的样本进行适当的稀释，使其含有等量的胶原酶，并且装载相同的凝胶而进行的SDS PAGE凝胶(附图20)。
从附图18a中可以看出，在对硫酸铵沉淀样本进行离心之后，得到的上清液中存在的胶原酶的量是非常低的。在附图19以及附图20中，沉淀/透析步骤之后的胶原酶的量与上清液收集样本中的胶原酶的量非常接近。因此，通过对上清液以及透析后样本的半定量SDSPAGE凝胶进行比较，从而得到的回收率的值可能实际上更高。
使用动物来源的TSB/朊间质的基准发酵试验：
在含有动物来源的成分的培养基中对溶组织梭状芽孢杆菌菌株013以及004进行发酵。其目标在于对菌株013以及菌株004进行比较，并且在细胞生长、胶原酶表达以及污染物水平方面对所述动物成分的作用进行评价。
溶组织梭状芽孢杆菌013：
将冻干的菌株在PBS(磷酸缓冲液)中再生，并且使其在TSB/朊间质琼脂平板上析出(30克/升TSB，10克/升朊间质蛋白胨，12克/升琼脂)。当存在厌氧气体包(anaerobic gaspacks)时，在厌氧罐中对上述平板进行培养。选取单个菌落，将其用于培养5毫升的TSB/朊间质培养基。在37℃下培养15小时之后，所述培养物的OD600nm(在600纳米处的光学密度)为大约1.0单位。之后，将5毫升的培养物与1毫升的无菌水进行混合，并且储存于-70℃中。
PBFT58发酵过程
生长曲线：
进行两个5L的分批发酵过程，PBFT58c(菌株004)以及PBFT58d(菌株013)。表6表示的是使用到的TSB/朊间质培养基的成分表。附图21表示的是得到的生长曲线(Net OD600nmvs时间)。
表6TSB/朊间质培养基成分表
| 成分 | 浓度 |
| 朊间质蛋白胨 | 50克/升 |
| TSB | 15克/升 |
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O(七水合硫酸镁) | 0.08克/升 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>磷酸二氢钾 | 1.92克/升 |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>磷酸氢二钠 | 3.5克/升 |
| 微生物溶液(无菌过滤) | 10毫升/升 |
从附图21中可以看出，与菌株004相比，菌株013生长至更高的光学密度(OD)。然而，在上述两种菌株中，最终的OD600nm都高于2.5，这表明动物来源的培养基都给予了上述两个菌株良好的生长支持。
值得注意的是，菌株013持续缓慢生长直至到达收集点(20小时)，而菌株004生长至大约2.7的网状OD600nm后停止生长。与之前进行的使用非动物来源的培养基的补料分批发酵过程相比，使用动物来源的TSB/朊间质培养基得到的最终光学密度(OD)较低。
SDS PAGE分析：
对从上述发酵过程中选取的上清液样本进行的SDS PAGE凝胶(8％的Tris-甘氨酸凝胶)在附图22以及附图23中有所表示。
在上述发酵上清液中似乎没有看到任何的梭菌蛋白酶，尤其是在菌株013的情况中。这是一个非常重要的发现，因为这可以解释为什么发明人没有对胶原酶的纯化过程进行讨论或者简化了的讨论。相反，关于胶原酶分解的显著问题在先前的纯化过程中有所经历。这可能部分归因于在发酵过程中梭菌蛋白酶的存在。
为了对存在于发酵过程中的胶原酶的量进行更好的估算，对收集点样本进行一个半定量SDS PAGE凝胶(附图24以及附图25)。所述凝胶表明，与使用植物培养基的补料分批发酵过程相比(PBFT57)，使用TSB/朊间质培养基的分批发酵过程(PBFT58c)所产生的胶原酶的量更低。这可能归因于在前者的情况中，得到了更高的细胞密度(OD600nm约为4至OD600nm约为2.7)。表7概括了来自于上述半定量凝胶的结果。
表7对PBFT57以及PBFT58c、PBFT58d进行的半定量SDS PAGE凝胶结果
对发酵收集样本进行硫酸铵沉淀：
在每个发酵过程中，使用400克/升(60％)以及520克/升(80％)的硫酸铵对2×500毫升的收集点样本进行沉淀。将得到的小球(pellets)重新悬浮于16.5毫升的WFI(注射用水)中，并且使用100毫摩的磷酸氢二钾(pH6.7)进行透析。随后，对透析后的样本进行SDSPAGE分析(8％的Tris-甘氨酸凝胶)(附图26以及附图27)。
这些凝胶的结果表明，即使在非常浓的透析后样本中，梭菌蛋白酶的水平也是相当低的(附图26以及附图27中的带6以及带7)。与菌株004相比，在菌株013中此种情况更为明显。
因此，本发明涉及不含有梭菌蛋白酶的胶原酶组合物，例如通过这里所描述的发酵方法所产生的胶原酶组合物。
对梭菌蛋白酶活性的测定：
为了进一步调查梭菌蛋白酶的作用，设定一个酶检测法，用来测定透析后样本中的梭菌蛋白酶的活性。使用如下所述的方法：
梭菌蛋白酶的酶检测：
BAEE＝N-a-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
条件：T＝25℃，pH＝7.6，A253nm，光程(Light path)＝1厘米
方法：连续分光光度法的速率测定
单位定义：当存在2.5毫摩的DTT(二硫苏糖醇)时，在pH7.6、25℃的条件下，一个单位在每分钟将水解1.0微摩的BAEE(N-a-苯甲酰-L-精氨酸乙酯)。
对透析后的样本进行梭菌蛋白酶活性的分析：
进行梭菌蛋白酶活性检测，用来对使用TSB/朊间质的发酵过程(PBFT58)所产生的透析后样本以及使用植物基质的补料分批发酵过程(PBFT57)所产生的透析后样本进行分析。表8概括了上述结果。
上述结果证明，当使用TSB/朊间质进行发酵时，梭菌蛋白酶的活性非常低。相反，在补料分批PBFT57情况中，梭菌蛋白酶的活性非常高。
表8透析后样本的酶活性
*在沉淀后/透析后样本中测定的梭菌蛋白酶活性
对可供选择的蛋白胨的调查
在摇瓶中的筛选试验：
在这项工作中，将各种蔬菜蛋白胨用来作为可供选择的植物蛋白胨。其目标在于评价它们对胶原酶以及梭菌蛋白酶的表达水平的影响。所有参与检验的蛋白胨都来源于蔬菜，并且都购买于Sigma公司。
上述使用的试验步骤在附图28中进行了描述。所使用的培养基成分表详细列于表9中，而所使用的蛋白胨列表在表10中示出。同样准备了一个含有植物蛋白胨的对照摇瓶。在所有的情况中，使用了50克/升的酵母提取物以及100克/升的每种蛋白胨，目的在于模拟这些成分在成熟的(developed)补料分批发酵过程中的收集点处的浓度(参见表4)。
表9在摇瓶试验中使用到的培养基的组分。所有的培养基都是经过过滤灭菌的。
对上述摇瓶进行18小时的培养。分析培养物的OD600nm以及活细胞计数。对培养物进行过滤，并且对上清液进行SDS PAGE分析。OD600nm测量值以及活细胞计数在表10中进行了概括。
大部分的蔬菜蛋白胨得到了比植物蛋白胨更高的网状OD值。然而，OD值与活细胞计数并不是相互关联的。这可能部分归因于活细胞计数方法的多样性或者归因于在预先选定的收集点(18小时)之前，细胞已经开始溶解了。
有趣的是，SDS PAGE凝胶表明，在所有的烧瓶中都不存在胶原酶的表达(凝胶未示出)，包括对照组(植物蛋白胨)。这种现象的一个可能的原因在于所使用的植物蛋白胨以及酵母提取物的浓度过高，因而它们抑制了胶原酶的表达。
表10第一次筛选试验得到的结果
使用可供选择的蛋白胨进行的补料分批发酵——DCFT27a，DCFT27b：
基于前述摇瓶试验所得到的信息，即没有观察到胶原酶的表达，因此决定使用成熟的(developed)补料分批策略对这些可供选择的蛋白胨进行评价。
进行两个补料分批发酵过程，DCFT27a(蔬菜提取物2)以及DCFT27b(蔬菜水解物2)。在上述两个发酵过程中，所使用到的补料分批策略是在含有植物蛋白胨的培养基中所使用的策略。表11描述了所述的培养基成分表，而附图29描述了所使用的策略。
表11补料分批发酵过程DCFT27a以及DCFT27b中使用的培养基成分表
生长曲线：
DCFT27a以及DCFT27b的生长曲线(Net OD600nm vs时间)在附图30中有所描述。在上述两个发酵过程中，细胞的生长都达到了比含有植物蛋白胨的培养基(发酵过程PBFT57，附图16)略微升高的OD600nm。这与活细胞计数相一致(对于DCFT27a以及DCFT27b而言，大约为2×109CFU/毫升，而PBFT57中为1.5×109CFU/毫升)。
SDS PAGE凝胶：
由于进行了上述摇瓶试验，SDS PAGE分析表明，在DCFT27a以及DCFT27b中都没有发现胶原酶的表达(凝胶未示出)。
这可能归因于下述事实：当使用植物蛋白胨时，由高含量的蛋白胨构成的培养基支持胶原酶的表达，但当使用一种可供选择的蛋白胨时，培养基过浓(rich)，因而抑制了任何代谢物的表达，包括胶原酶以及梭菌蛋白酶。细胞在含有上述可供选择的蛋白胨的培养基中历经了丰富的生长条件，因此不需要生产任何蛋白酶。
使用可供选择的蛋白胨进行的分批发酵——PBFT59a，PBFT59b，PBFT59c：
从DCFT27a以及DCFT27b补料分批发酵过程中得到的结果指引我们进一步对其他三种可供选择的蛋白胨进行研究，尽管所使用的浓度比先前使用到的浓度低。
进行三个5L的分批发酵过程，PBFT59a(蔬菜蛋白胨)，PBFT59b(蔬菜提取物)以及PBFT59c(蔬菜提取物1)。在18小时之后收集发酵液。
所使用的所有蛋白胨的浓度为50克/升，目的在于模拟先前使用到的在动物培养基(朊间质/蛋白胨)中的朊间质蛋白胨浓度以及植物蛋白胨的浓度。表12列出了所使用的培养基成分表。
表12PBFT59a、PBFT59b、PBFT59c的5L发酵过程所使用的培养基成分表以及发酵策略
| 成分 | 浓度 |
| 可供选择的蛋白胨 | 50克/升 |
| 酵母提取物 | 8.5克/升 |
| 葡萄糖 | 5克/升 |
| 磷酸二氢钾 | 1.92克/升 |
| 磷酸氢二钾 | 1.25克/升 |
| 磷酸氢二钠 | 3.5克/升 |
| 氯化钠 | 2.5克/升 |
| 镁 | 0.08克/升 |
| 维生素溶液 | 10毫升/升 |
| 体积 | 5升 |
生长曲线：
从PBFT59a、PBFT59b、PBFT59c发酵过程中得到的生长曲线在附图31中有所描述。在上述所有的情况中，细胞生长至低于DCFT27补料分批发酵过程的OD600nm(在1.8至2.8之间)。这也与其活细胞计数相一致(对于PBFT59a、PBFT59b、PBFT59c而言，在0.7×109CFU/毫升至1.2×109CFU/毫升之间，而对于DCFT27a以及DCFT27b而言，为2×109CFU/毫升)。在含有胰胨的培养基中，细胞表现出了最缓慢的生长速率，并且在18小时之后得到最低细胞密度。
SDS PAGE凝胶：
在摇瓶试验以及DCFT27a、DCFT27b补料分批发酵过程中，在SDS PAGE凝胶中没有看到胶原酶的表达(凝胶未示出)。
这些结果表明，上述可供选择的蛋白胨尽管能够支持细胞生长，但其不允许胶原酶进行表达。如前所述，这可能归因于这些蛋白胨富含营养，例如游离氨基酸，小肽。
第四组补料分批发酵——DCFT27d
由于使用可供选择的蔬菜蛋白胨进行的试验达到的效果不成功，本项工作的下一个目标在于对成熟补料分批发酵过程中梭菌蛋白酶的水平降低的可能性进行调查研究，其中发酵过程使用植物蛋白胨培养基。如前所述，梭菌蛋白酶可能导致在纯化过程中的胶原酶的分解。
使用标准的植物蛋白胨培养基进行一个补料分批发酵过程，其中向所述培养基中补加三种氨基酸，即谷氨酸，色氨酸以及天冬酰胺。这一发酵过程在下述条件下进行：使上述三种特定氨基酸在植物蛋白胨中的浓度低于在动物TSB/朊间质培养基中的浓度，基于这些成分的氨基酸组合物而言，由生产者提供。
这样做的目标在于调查这些氨基酸的加入是否能够减少作为梭菌蛋白酶表达的影响因素的任何的营养限制。表13列出了所使用的培养基成分表。所使用的发酵策略是用于DCFT26以及PBFT57发酵过程中的标准补料分批策略(参见附图6)。
表13用于补料分批发酵过程DCFT27d的培养基成分表
生长曲线：
从DCFT27d发酵过程中得到的生长曲线在附图32中有所描述。所述的生长曲线与先前示出的不添加氨基酸的标准补料分批发酵过程(DCFT26b以及PBFT57)获得的生长曲线非常相似。
SDS PAGE凝胶：
附图33a表示的是对从发酵过程中选取的上清液样本进行的SDS PAGE凝胶。其胶原酶水平与从标准的补料分批发酵过程中观察到的胶原酶水平相近(参见附图10，DCFT26b的SDS PAGE凝胶)。尽管在所述发酵过程中仍然存在梭菌蛋白酶，但其浓度看上去的确低于DCFT26b中梭菌蛋白酶的浓度。
为了对该问题进行深入的调查，使用梭菌蛋白酶活性检测对透析后收集点样本中的梭菌蛋白酶活性进行评估。除此之外，也对从20L的冻干法分批发酵过程中提取的透析后收集点样本的梭菌蛋白酶活性进行了评估。由于这种特定的分批在纯化时没有表现出明显的胶原酶的分解，因而其梭菌蛋白酶活性的知识是具有信息性的(informative)。表14概述了所述透析后样本的酶活性。上述表中也包括了表8中所示的标准补料分批发酵过程PBFT57以及动物TSB/朊间质蛋白胨中的酶活性，以达到比较的目的。
表14透析后样本的酶活性
DCFT27d得出的结果表明，氨基酸的加入能够降低由菌株产生的梭菌蛋白酶的活性。与对照组补料分批发酵过程相比，在补充氨基酸的发酵过程中，梭菌蛋白酶与胶原酶的比值低了大约四倍。在动物来源的发酵过程中，梭菌蛋白酶与胶原酶的比值比补充氨基酸的补料分批发酵过程中的比值低十倍。梭菌蛋白酶活性的降低可能导致纯化过程中胶原酶的分解反应的显著降低。
进行一系列的5L发酵过程，用来评价几种补料分批发酵策略。对所述策略的评价是基于它们生成的胶原酶的产量、污染物的量以及可测量性(scalability)来进行的。根据这些结论，确定出一种最优化的补料分批策略，能够使胶原酶的总产量达到大约280毫克/升。通过轻微的增加分批培养基的浓度以及降低补料分批培养基的浓度来对所述的发酵策略进行改进，从而提高其可测量性。对于上述发酵策略的这种改变不会对污染物的产量或者水平产生影响。
第二个目的在于对胶原酶的初步回收步骤进行优化。对这一步骤所进行的优化包括：提高处理步骤的产量，或者减少回收到的污染物的量，或者增加其可测量性。对从100克/升至520克/升的一系列的硫酸铵浓度进行评价。同样也对降低pH至6.0的作用以及氧化培养基的作用进行评价。低于400克/升的所有硫酸铵的浓度显示出非常低的胶原酶回收率。在400克/升至520克/升范围内的任意硫酸铵浓度中没有观察到胶原酶回收率或者梭菌蛋白酶回收率上的任何差别。来自于400克/升的沉淀的小球最容易被重新悬浮，因此将这一浓度定义为最佳水平。
进行一个基准试验，用来对溶组织梭状芽孢杆菌菌株013以及菌株004在动物来源培养基中的胶原酶以及梭菌蛋白酶的生长和生产进行确定以及比较。其中所述的动物来源培养基成分表是选取自过程1(Process 1)发酵过程培养基，利用TSB以及朊间质蛋白胨。这项试验同样也对菌株004在动物培养基以及非动物培养基中的生长进行了比较。来自于SDSPAGE分析的结果表明，生长于动物来源的培养基中的溶组织梭状芽孢杆菌产生的梭菌蛋白酶的量要低很多。对梭菌蛋白酶活性所进行的酶检测证实了上述结果。所述的检测证明，使用动物来源的培养基的发酵过程中的梭菌蛋白酶活性得到了显著的降低。当将两个菌株进行比较时，004表现出了比013更高的梭菌蛋白酶活性。
对可供选择的氮源的选择进行评价，所述的评价是针对它们在补料分批发酵策略中对植物蛋白胨的取代能力来进行的。这些蛋白胨是蔬菜提取物2(Sigma，49869)以及蔬菜水解物2(Sigma，07436)。溶组织梭状芽孢杆菌在上述蔬菜蛋白胨中生长的非常好，达到了4个单位至5个单位的光学密度(600纳米)。对上述发酵过程进行的SDS-PAGE分析表明，不存在胶原酶或者梭菌蛋白酶的表达。由于在这些蛋白胨中观察到了丰富的细胞生长，因此认为是复合氮源的浓度过高，产生了对蛋白酶表达的抑制。因此，进行第二组发酵过程，在分批策略中使用50克/升的可供选择的蛋白胨。蔬菜胰胨(Sigma，16922)，蔬菜提取物(Sigma，05138)以及蔬菜提取物1(Sigma，04316)在这些试验中作为可供选择的蛋白胨来使用。当使用SDS-PAGE对上述发酵过程进行分析时，没有看到胶原酶或者梭菌蛋白酶的表达。使用植物蛋白胨进行一个补料分批发酵过程，其中向植物蛋白胨中补充三种氨基酸，谷氨酸，色氨酸以及天冬酰胺。这些氨基酸被认为是以较低的量存在于非动物培养基中的。上述发酵过程的生长曲线与不进行氨基酸补充的补料分批发酵过程的生长曲线非常接近。SDS-PAGE分析表明，胶原酶的产量接近，但梭菌蛋白酶的水平些许降低。梭菌蛋白酶检测表明，与对照组补料分批发酵过程相比，在补充氨基酸的发酵过程中梭菌蛋白酶的活性降低了。但梭菌蛋白酶活性的降低水平仍然没有在动物培养基以及非动物培养基之间所存在的差别那样显著。
原料以及方法：
用于使用蔬菜培养基的发酵过程中的接种培养基
在下面进行的研究中，使用含有下述成分的接种培养基。
接种培养基–蔬菜
| 成分 | 浓度 |
| 蔬菜蛋白胨 | 50克/升 |
| 酵母提取物 | 8.5克/升 |
| 葡萄糖 | 0.9克/升 |
| 磷酸二氢钾 | 1.92克/升 |
| 磷酸氢二钾 | 1.25克/升 |
| 磷酸氢二钠 | 3.5克/升 |
| 氯化钠 | 2.5克/升 |
| 镁 | 0.08克/升 |
| 微生物溶液 | 10毫升/升 |
所述培养基是经过过滤灭菌的。
接种程序
将来自于内部细胞库(internal cell bank)的小瓶进行解冻，并且将其中的0.025毫升接种至存在于30毫升万用瓶(universal)中的5毫升接种培养基中。在厌氧气体发生器存在的条件下，将上述5毫升的培养物置于厌氧罐中在37℃下进行培养。培养大约进行13小时至15小时后，将4毫升所述培养物接种至存在于500毫升长颈瓶中的200毫升接种培养基中。如前所述，将所述的长颈瓶在厌氧气体发生器存在的条件下放置于厌氧罐中。在37℃以及75rpm的条件下培养大约13小时至15小时后，将所述长颈瓶中的全部物质接种至发酵罐中。
将所述发酵罐的pH以及温度分别控制在7.0以及37℃。将氮气流速设置为1升/分钟(大约0.02vvm)，并且将搅拌速度设定为100rpm。在规定的时间间隔内从发酵罐中提取样本，进行OD600nm的测定以及活细胞计数。将样本经过0.22微米的过滤器进行过滤。将滤液储存于-20℃下，并且在-20℃下对其进行冷冻，以进行SDS PAGE分析。附图33b描述的是上述接种程序的示意图。
用于上述补料分批发酵过程的优选的成分表如下表所列出。
同样希望的是，在不减损胶原酶产物的质量或者产量的前提下扩大规模的发酵过程。因此，本发明进一步涉及一种大约200升的补料分批过程，如附图33c中的流程图所示。
活细胞计数方法
将从摇瓶中提取的样本在10-4至10-7的因素下进行稀释，并且将其析出(platedout)于TB琼脂平板上。将上述平板在37℃下置于Genbox罐中培养大约48小时。使用一个厌氧气体发生器组，用来在所述的罐中建立厌氧环境。之后，计算菌落的数量。
硫酸铵沉淀：
材料：索福高速离心机(Sorvall Evolution centrifuge)
化学试剂：硫酸铵，GPR等级(BDH)
将上清液样本(100毫升至500毫升)通过一个0.22微米的过滤器进行过滤。依照试验加入不同剂量的硫酸铵(从15％饱和度至80％饱和度)。使用磁力搅拌器对得到的溶液进行缓慢的搅拌，大致搅拌15分钟，直至所有的硫酸铵都发生溶解。之后，在不进行搅拌的情况下在+2–8℃下保持大约3.5小时。在此步骤之后，可以生成显著量的沉淀。随后，在4℃下在7200x g下对所述溶液进行20分钟的离心。倒出上清液，并且将小球储存于-20℃下。
透析
材料：10kDa分子量的蛇皮透析管(SnakeSkin Dialysis Tubing)(68100，Pierce)
磁力搅拌器
化学试剂：分析纯级磷酸氢二钾(BDH)
注射用水(WFI)
将从100毫升的硫酸铵样本中得到的小球重新悬浮于3.3毫升的注射用水中。将重新构建的小球转移至预润湿的10kDa分子量的蛇皮透析管中，并且在2-8℃下使用100毫摩的磷酸氢二钾(pH6.7)进行大约12至16小时的透析。随后，更换注射用水，并且继续透析2至4小时。回收透析后的物质，并且测定其体积。将透析后的样本储存于-20℃下。
SDS-PAGE分析(8％的Tris-甘氨酸凝胶)
材料：Xcell SureLock Mini-Cell
化学试剂：
SDS-PAGE标准高分子量(161-0303，Bio Rad公司)
Novex 8％的Tris-甘氨酸凝胶，1.5毫米，10孔(EC6018BOX，Invitrogen公司)
Novex 8％的Tris-甘氨酸凝胶，1.5毫米，15孔(EC60185BOX，Invitrogen公司)
Novex Tris-甘氨酸十二烷基磺酸钠(SDS)电泳缓冲液(10×)(LC2675，Invitrogen公司)
Novex Tris-甘氨酸十二烷基磺酸钠(SDS)电泳缓冲液(2×)(LC2676，Invitrogen公司)
NuPAGE样本还原剂(10×)(NP0009，Invitrogen公司)
胶体蓝染色试剂盒(LC6025，Invitrogen公司)
分析纯级乙二胺四乙酸二钠(BDH)
制备用于进行还原SDS-PAGE的样本，将10微升的样本加入到10微升的样本缓冲液(2×)、2.5微升的还原剂(10×)以及2微升0.1摩的EDTA(乙二胺四乙酸)中(达到10毫摩的最终浓度)。制备高分子量(HMW)标记物，将10微升浓缩的储备液(stock)加入到80微升的还原剂(10×)、310微升的注射用水以及400微升的样本缓冲液(2×)中。随后，将得到的稀释的高分子量标准在95℃下加热5分钟，然后将其进行等分并且在-20℃下进行储存，以备在随后的凝胶中使用。使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液，将含有胶原酶的样本(15微升)直接(即，在此之前不进行热处理)在8％的Tris-甘氨酸凝胶中进行电泳，条件为130伏，大约进行1小时50分钟。在电泳之后，按照生产制造商的说明书使用胶体蓝染色剂对所述凝胶进行染色。
纯化过程
5L纯化过程方法的概述：
步骤1.对培养物培养基上清液(分泌蛋白)进行硫酸铵沉淀。
重新构建并且在0.1摩的磷酸钾，0.1摩的精氨酸pH6.7的条件下进行透析。
步骤2.羟磷灰石色谱法(存在200微摩的亮抑蛋白酶肽)
使用梯度为0-100％的0.264摩的pH6.7的磷酸钾进行超过4倍柱体积(CV)的洗脱。
收集两个后洗脱峰值，其中A280>A260，直接装载于TMAE上
步骤3.Fractogel TMAE离子交换(存在200微摩的亮抑蛋白酶肽)
去除核酸(也可以使用一种Pall Mustang Q过滤器)
收集并且收集(pool)未结合的流通物(flowthrough)。
步骤4.使用10毫摩的Tris在pH8.0的条件下透析
步骤5.季胺琼脂糖高效液相色谱离子交换(存在200微摩的亮抑蛋白酶肽)
将AUX I与AUX II进行分离
使用梯度为0-40％的10毫摩的Tris，3毫摩的氯化钙，360毫摩的氯化钠在pH8.0的条件下进行超过20倍柱体积的洗脱
收集到两个峰值：峰值1＝AUX II
峰值2＝AUX I
向含有小片段的AUX I以及AUX II中加入0.1摩的精氨酸
步骤6.通过加压搅拌细胞(pressurized strirred-cell)对AUX I以及AUX II收集物(pools)进行浓缩
步骤7.Superdex 75凝胶过滤
从AUX I以及AUX II中除去梭菌蛋白酶以及明胶酶
使AUX I以及AUX II分别在单独的柱上过滤
样本以5％柱体积的水平装载
缓冲液：10毫摩的Tris，3毫摩的氯化钙，150毫摩的氯化钠，0.1摩的精氨酸，pH8
步骤8.分别对AUX I以及AUX II进行收集和浓缩，在水中进行渗滤(diafilter)，随后进行收集以生成最终的药物产品。
柱的详细信息：
表15用于5L过程的柱的具体规范
装柱
·在可能的情况下依照制造商的说明书进行装柱。
·TMAE柱——没有遭遇任何问题。
·季胺琼脂糖以及Superdex 75——由于该柱的尺寸，在装柱的正确压力方面遇到了困难。然而，上述的柱可以在推荐的压力下运行。
·羟磷灰石——以50％的匀浆装柱，并且在10毫升/分钟的条件下进行。
从5L过程中得到的产量/回收率：
表16从硫酸铵沉淀(AS ppt)到季胺-琼脂糖阴离子交换色谱的纯化，使用黑体下划线表示步骤产量
表17从Q-琼脂糖阴离子交换色谱到Superdex 75 GPC(凝胶渗透色谱)之后的纯化
从5L的操作过程中得到的产量为ABC I以及ABC II大约各为60-75毫克。至于扩大规模，取决于发酵过程，可以预期的是，20L发酵过程的产量可以达到250-300毫克，而200L发酵过程的产量可以达到250-3000毫克。
5L规模的过程中的各种色谱操作：
羟磷灰石色谱
柱的尺寸：2×300毫升，XK50/30(分别为15厘米床高)
缓冲剂A：0.1摩磷酸钾，200微摩亮抑蛋白酶肽，pH6.7
缓冲剂B：0.264摩磷酸钾，200微摩亮抑蛋白酶肽，pH6.7
样本：大约350毫升(存在于0.1摩磷酸钾、0.1摩精氨酸中，pH6.7)以1.0毫克/毫升培养基*的量装载
流速：9.8毫升/分钟
洗脱：0-100％B，4倍柱体积(CV)
附图34描述的是进行羟磷灰石色谱得到的色谱图，其中装载量为1.0毫克/毫升培养基，并且考虑了分辨率的损失以及发生的目标的分解。
Fractogel TMAE阴离子交换
柱的尺寸：58毫升，XK26/20(10厘米床高)
缓冲剂A：10毫摩磷酸钾，0.2摩氯化钠，200微摩亮抑蛋白酶肽，pH6.7
缓冲剂B：10毫摩磷酸钾，2摩氯化钠，pH6.7
样本：约为650毫升0.5毫克/毫升(存在于磷酸钾中，pH6.7，直接来自于羟磷灰石柱)，以大约5.5毫克/毫升培养基的量装载
流速：8.8毫升/分钟
洗脱：(100％B至洗脱核酸)
附图35描述的是进行Fractogel TMAE阴离子交换色谱得到的色谱图。未结合片段以0.5毫克/毫升的水平收集至大约650毫升。使用10毫摩的Tris在pH8的条件下进行透析。
附图36描述的是来自于5L规模的处理过程中的羟磷灰石前、羟磷灰石后以及TMAE后物质的SDS-PAGE凝胶。所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色。
使用初始洗脱梯度的季胺琼脂糖高效液相色谱阴离子交换柱的尺寸：100毫升，XK50/20(5.0厘米床高)
缓冲剂A：10毫摩Tris，3毫摩氯化钙，200微摩亮抑蛋白酶肽，pH8.0
缓冲剂B：10毫摩Tris，3毫摩氯化钙，360毫摩氯化钠，200微摩亮抑蛋白酶肽，pH8.0
样本：约为650毫升0.5毫克/毫升(存在于10毫摩Tris中，pH8.0，+200微摩亮抑蛋白酶肽)，以大约3.0毫克/毫升培养基的量装载
流速：18.0毫升/分钟
洗脱：0-40％B，20倍柱体积
附图37描述的是使用初始洗脱梯度的季胺琼脂糖高效液相色谱阴离子交换后得到的色谱图。向含有ABC I以及ABC II的部分中加入0.1摩的精氨酸。峰1部分(ABC II)以0.55毫克/毫升的水平收集至大约220毫升，当通过搅拌细胞进行浓缩后，可以以2.8毫克/毫升的水平得到大约45毫升。峰2部分(ABC I，包括明胶酶承载)以0.45毫克/毫升的水平收集至大约190毫升，当通过搅拌细胞进行浓缩后，可以以2毫克/毫升的水平得到大约42毫升.
附图38表示的是当峰1(ABC II)中存在亮抑蛋白酶肽时，TMAE之后的物质季胺琼脂糖阴离子交换色谱的SDS-PAGE凝胶。所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色。
附图39表示的是当峰2(ABC I)中存在亮抑蛋白酶肽时，TMAE之后的物质季胺琼脂糖阴离子交换色谱的SDS-PAGE凝胶。所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色。
使用改进梯度的季胺琼脂糖高效液相色谱阴离子交换
将氯化钠加入到缓冲剂A中，并且使用一个更陡(steeper)/更快的梯度进行一个小规模的测试。
柱的尺寸：1毫升
缓冲剂A：10毫摩Tris，30毫摩氯化钠，3毫摩氯化钙，200微摩亮抑蛋白酶肽，pH8.0
缓冲剂B：10毫摩Tris，3毫摩氯化钙，360毫摩氯化钠，200微摩亮抑蛋白酶肽，pH8.0
样本：TMAE后、使用10毫摩Tris、30毫摩氯化钠、200微摩亮抑蛋白酶肽、pH8.0的透析后，3毫克。以3毫克/毫升培养基的量装载。
梯度：0-25％2倍柱体积，25％B 2倍柱体积，25-40％7.5倍柱体积
附图40描述的是使用经过改进梯度的洗脱的季胺琼脂糖高效液相色谱阴离子交换得到的色谱图。可以观察到ABC I与ABC II的很好的分离。第二部分的梯度可以进行的更陡，从而得到更加锋利的ABC I峰。可以使用5毫升的柱体积以3毫克/毫升培养基以及10毫克/毫升培养基的量进行装载，从而对峰进行改进。
ABC II的Superdex 75凝胶渗透色谱(峰1来自于阴离子交换色谱)
柱的尺寸：880毫升，XK50/60(54厘米床高)
缓冲剂：10毫摩Tris，3毫摩氯化钙，150毫摩氯化钠，0.1摩精氨酸，pH8.0
样本：大约44毫升，2.5毫克/升(存在于10毫摩Tris，3毫摩氯化钙，大约60毫摩氯化钠，0.1摩精氨酸中，pH8.0)
流速：8.8毫升/分钟
附图41描述的是进行ABC II的Superdex 75凝胶渗透色谱得到的色谱图(峰1来自于阴离子交换色谱)。收集峰，从而得到1.2毫克/毫升的ABC II大约60毫升。
附图42表示的是在精氨酸存在的条件下时，对浓缩的ABC II的Superdex 75凝胶渗透色谱进行的SDS-PAGE凝胶。所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色。
ABC I的Superdex 75凝胶渗透色谱(峰2来自于阴离子交换色谱)：
柱的尺寸：880毫升，XK50/60(54厘米床高)
缓冲剂：10毫摩Tris，3毫摩氯化钙，150毫摩氯化钠，0.1摩精氨酸，pH8.0
样本：大约42毫升(5％柱体积)，2.0毫克/升(存在于10毫摩Tris，3毫摩氯化钙，大约60毫摩氯化钠，0.1摩精氨酸中，pH8.0)
流速：8.8毫升/分钟
附图43描述的是进行ABC I的Superdex 75凝胶渗透色谱得到的色谱图(峰2来自于阴离子交换色谱)。收集峰，从而得到1.1毫克/毫升的ABC I大约60毫升。
附图44描述的是在精氨酸存在的条件下时，对浓缩的ABC I的Superdex 75凝胶渗透色谱进行的SDS-PAGE凝胶。所述的凝胶使用胶体蓝进行了染色。
升级柱的尺寸
表18
*柱的类型以及相应的床高还需要进一步进行优化。培养基体积随着5升的规模线性扩大。
在本发明的另外一种实施方式中，如上所述的纯化过程中的透析步骤可以被超滤/渗滤(UF/DF)操作所取代，其中所述的超滤/渗滤步骤将使用TFF正切流动过滤来取代透析并且搅拌细胞。如上所述的TMAE步骤是可以任选的。
本发明包括由上述纯化过程所生成的(或者可以生成的)胶原酶产品。这类胶原酶产品具有异常高的纯度以及保持的酶活性。例如，所述的组合物不含梭菌蛋白酶(例如，具有可以忽略水平的或者不可检测水平的梭菌蛋白酶)。
对制备过程的优化：
为了支持临床研究并且提供一种商业规模的操作方法，对制备过程进行的早期优化已经完成。对于改变了的操作在下面进行了简要的描述，并且将其概括于表19中。
表19在BTC(方法1)以及Auxilium Supplies(方法2以及方法3)间存在的操作变化的概括
发酵过程的优化
从上述的初始细胞库中去除来源于牛肉的生物质，并且进行发酵操作。对溶组织梭状芽孢杆菌菌株004进行繁殖，作为主细胞库，基于扩大所需的通道存活力。对于所述主细胞库的具体规范以及对其分析的结果在表20中列出。为了提高胶原酶的生物量以及产量，进行一种补料分批发酵策略，该策略在生长培养基中使用不含动物来源的生物质，并且具有20升的发酵规模。已经观察到，进一步将发酵过程扩大至200升需要使用到来源于猪肉的培养基成分(即，朊间质蛋白胨#3，infra)，以确保恒定的细胞生长，胶原酶表达，以及改进的杂质分布(impurity profile)。随后进行某些改变，以增加下游操作过程中的胶原酶的产量以及纯度。这些改变包括加入新的分离和过滤步骤，以及扩大生产仪器使其支持200升的分批发酵规模。附图45描述的是方法3的发酵过程的流程图。
表20：对主细胞库的具体分析值以及检测结果
对初步回收以及纯化过程的优化
进一步的研究对初始回收以及下游纯化过程进行的优化。利用苯基琼脂糖快速流动低取代柱色谱法替代硫酸铵沉淀法，用以捕获胶原酶，以提高产量，消除对大量硫酸铵的使用并且改进无菌操作。
关于纯化过程，使用Pall Mustang Q过滤器对残留的DNA以及杂质进行清除，以进一步提高产量并且简化生产操作处理以及确认需求。对季胺琼脂糖高效液相色谱(Q HP)的操作参数进行优化，以去除凝胶渗透色谱(GPC)步骤。除如上所述的操作变化之外，对药用物质的配制进行了改进，包括10毫摩的Tris，60毫摩的蔗糖，pH8.0，以同时提高产品的可溶性以及药用物质和药物产品的稳定性。
所述的优化操作发生在两个阶段中。初始阶段(方法2)对所有的细胞库使用不含动物的培养基，而使用补料分批发酵的发酵阶段在20升的规模下进行。根据方法1(Process1)对下游操作进行改变，包括使用Mustang Q过滤除去残留DNA，并且使用Superdex 75凝胶渗透色谱对其他的宿主细胞污染物进行清除。同时在色谱缓冲系统中加入亮抑蛋白酶肽，用以防止蛋白水解分解。方法2中的物质已经与方法1中的物质进行了分析性的桥接(bridged)(表21A)，并且在这里所列出的并行的(side-by-side)临床前研究中进行了检测。方法2中的物质被提议用在阶段3临床计划的早期阶段中。方法2的中间产物以及药用物质的具体规范已经分别被详细描述于表22以及表23中。进一步的操作、配制以及冻干的发展提供了一种最优化的制备过程(方法3)。这些改变包括加入新的分离和过滤策略，以及扩大生产仪器使其支持200升的分批发酵规模，如表19中所列。附图46描述的是方法3的纯化过程的流程图。
剂量的宣布：首次的体外药效检测是牛类胶原酶检测，并且不对胶原酶类型I以及胶原酶类型II进行区分。这项检测应用于那些开放式(open label)使用形式的物质，仅仅为DUPY101以及DPY202临床研究，0.58毫克的剂量通常产生10000单位的药效。对方法1中的物质进行的分析利用的是当前对类型I胶原酶以及类型II胶原酶分别进行的体外药效检测，通常得到这样的结果：对于类型I胶原酶而言，为1700至3500单位/剂量(0.58毫克的剂量)，而对于类型I胶原酶而言，为43000至69000单位/剂量(0.58毫克的剂量)。对方法2中的物质进行的当前的体外药效检测证实，与方法1中的物质通常达到的药效值相比，其产生了类似的相对药效值。
对方法1以及方法2之间存在的分析相似性的证明：为了支持在方法1以及方法2之间进行的改变，以释放检测以及分析性描述的形式给出了比较数据。这些数据被列于表21中。
对先前方法(方法1；参考)生成的中间产物以及药用物质与本发明的方法(方法2)生成的中间产物以及药用物质进行比较，其中两者被表示为AUX-I以及AUX-II。这种分析性比较表明，通过方法2生产出的物质与通过方法1生产出的物质是相当的。特别的，这些物质的一致性、药效以及纯度都是相当的。
方法2中的中间产物的纯度水平在附图47中示出，该图为还原的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶。所述的凝胶显示，每个中间产物只有一条带，没有其他明显的次要的带。AUX-I明显具有115kDa的分子量，并且与参考(ABC I)相当，而AUX-II明显具有110kDa的分子量，并且与参考(ABC II)相当。附图48描述的是一个还原的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶，该凝胶描述的是药用物质。与上述中间体相同，由方法2制得的药用物质与参考(方法1)相当。一种银染色的SDS-PAGE凝胶在附图49中进行了描述，其进一步证实了方法2得到的药用物质的高纯度水平。概括而言，对使用方法2制得的中间产物(AUX-I以及AUX-II)以及药用物质进行的释放检测以及分析性描述清楚的证明其与方法1(参考)得到的物质是具有相似性的。此外，对方法2中的物质进行了进一步的释放检测，其列于表21B中。总之，对方法1以及方法2的物质间进行的直接分析性比较(表21)，以及进一步的中间产物和释放检测(表22)表明，方法2中的物质适合用于人类研究中。表23以及表24进一步列出了来自于方法2的制备过程中的分析性规范。
表21：(方法1)与Auxilium(方法2)的中间产物以及药用物质间的分析性相似性
*方法1的规范操作参数没有包括在内
**药用物质不可应用于上述检测中，限制现有的供应(lmited supplies onhand)
***为AUX-I进行N-末端测序(与参考相同)，但进一步的研究需要对AUX-II的N-末端进行侧率，因为N-末端看上去是被阻断的。
表22：对方法2中的中间产物以及药用物质的分析结果
*上述结果是取先前的残留DNA方法的下限
表23：对方法2中的AUX-I以及AUX-II中间产物的分析性具体规范
*上述检测需要用于进一步生产的中间产物进行临时的释放
表24：方法2中的药用物质进行的分析性具体规范
*上述检测需要用于进一步生产的中间产物进行临时的释放
针对方法3的具体试验：
方法3的发酵过程：
在方法2中使用到的利用植物蛋白胨的发酵过程在提供DSP(下游方法)发展以及GMP生产方面已经表现出显著的可变性。
在先前的研究中，动物来源的朊间质蛋白胨已经表现出能够支持溶组织梭状芽孢杆菌进行非常良好的生长。与从方法2的过程中观察到的相比，所述动物来源的朊间质蛋白胨培养物生成显著减少的梭菌蛋白酶，并且以1：1的比例表达AUX I以及AUX II。因此，在一个5升的发酵罐中，对一种调整过的可接受性动物来源的蛋白胨、来自于Becton Dichinson的朊间质蛋白胨#3(PP3)进行评价。与现有的基于蛋白胨的方法(方法2)进行的初始比较表明，使用50克/升的朊间质蛋白胨#3能够以快速的指数生长速率生成高生物量浓度。与方法2得到的大约230毫克/升的量相比，上述的发酵过程得到了更高的产物产量，胶原酶总量达到大于350毫克/升(通过半定量SDS-PAGE分析)。使用朊间质蛋白胨#3的进一步的发酵过程证明，使用动物来源的发酵培养基能够生成显著减少量的梭菌蛋白酶。第一组三个发酵过程(使用一批朊间质蛋白胨#3)表现出了非常恒定的生长曲线。当使用SDS-PAGE对产物进行分析时，发现在上述三个发酵过程中，胶原酶的产量以及纯度是非常可再现的。
为了给DSP(下游方法)提供原料以进行方法的发展，使用朊间质蛋白胨#3进行几个发酵过程。针对这种提供的原料，使用到三个朊间质蛋白胨#3的分批。值得注意的是，当已经使用了这三个批次中的两个时，所述培养物的生长曲线与先前的PP3(朊间质蛋白胨#3)发酵过程不一致，这证明了在上述发酵过程的生长曲线之间存在可变性。一个小规模的调查表明，是PP3(朊间质蛋白胨#3)的批次与批次之间的可变性引起了这种变化。上述小规模的研究同样证明，当PP3(朊间质蛋白胨#3)的浓度增加至100克/升时，可以避免这种变化。
使用100克/升的PP3进行两个5升的发酵过程，其中使用两个批次的蛋白胨，其中一个能够产生典型的生长曲线，而另外一个不能(正如上述小规模试验中所证明的)。所述的试验表明，浓度的增加确保了使用两个不同批次PP3的发酵过程是可再现的。上述生长曲线是高度类似的，并且所述的产物以类似的产量以及纯度进行表达。
利用100克/升PP3的优化了的发酵过程最终被扩大至200升。200升的生长曲线与5升规模所观察到的生长曲线非常相似。对上述发酵过程的滤液进行的SDS-PAGE分析表明，从200升的发酵过程中能够获得高的产量，大约320毫克/升的胶原酶总量(通过定量密度计量分析)。在5升规模以及200升规模的发酵过程中得到的胶原酶产物(发酵之后)的纯度是接近的。DSP(下游方法)基团对200升发酵过程产生的20升滤液进行了处理，用以代表对下游处理的一个部分扩大(infra)。
与现有的蛋白胨发酵方法相比，朊间质蛋白胨#3发酵方法(方法3)生成了更高产量的胶原酶以及更少的梭菌蛋白酶。尽管使用了不同批次的PP3，当使用100克/升的PP3时，能够生成具有可再现性生长曲线的溶组织梭状芽孢杆菌培养物。当使用不同型号(lotsof)的PP3时，胶原酶的产量以及纯度同样也表现出可再现性。
对朊间质蛋白胨#3作为一种原料物质用于从溶组织梭状芽孢杆菌中生产胶原酶的评价
由于在利用植物蛋白胨作为复合氮源的发酵过程中观察到可变性，因而对朊间质蛋白胨#3(Bection Dickinson，212230)(PP3)在5升的发酵过程中的适宜性进行评价。使用一个利用到50克/升PP3的简单的分批策略。在材料与方法部分记载了确切的培养基组成。
附图51将50克/升PP3(与方法2中的植物蛋白胨浓度相比较低)发酵过程的生长曲线与植物蛋白胨补料分批发酵过程的生长曲线进行了比较。所述的PP3培养表明，在接种之后大约8个小时，进入稳定时期之前，在指数生长时期具有非常快速的特异性生长速率。所述的PP3发酵过程达到了4.7单位的最大光学密度(600纳米)。将所述的培养物质于固定相中进一步放置12小时，以监测产物的形成/分解。
附图52表示的是对胶原酶产物的浓度进行的SDS-PAGE半定量分析，其中所述的胶原酶产物来自于上述PP3培养过程中的20小时的时间点处。附图53表示的是对植物蛋白胨补料分批方法进行的同样的分析。可以观察到，与基于植物蛋白胨的方法相比，所述的PP3发酵过程生成了更多的产物(胶原酶的总量从230毫克/升增加至360毫克/升，基于附图52以及附图53中的半定量分析)。所述的PP3培养同样以1：1的比例表达了AUX I以及AUX II，而上述方法2生产的两种蛋白的比例为1：1.6。
朊间质蛋白胨#3分批发酵过程的可再现性
使用型号(lot)为#5354796的朊间质蛋白胨#3对上述PP3分批方法的可再现性进行进一步的检验。附图54描述了全部的三次操作，该附图表明，在8小时之后获得的恒定的生长曲线具有大约为4.5的最大光学密度(600纳米)。
对发酵过程的收集点进行的半定量SDS-PAGE分析表明，全部的胶原酶产量达到大约350至400毫克/升。
在这项研究中，同样对所述发酵过程的收集点进行了评价。在8小时、11小时以及20小时对所述发酵过程进行了收集。附图55以及附图56表示的是对PP3发酵过程GCFT05d的时间过程(time course)进行的SDS-PAGE分析(在11小时处进行收集)。附图55中所描述的凝胶使用胶体蓝进行了染色，而附图56中所描述的凝胶使用银进行了染色。在附图55以及附图56的凝胶中，可以观察到在上述两个胶原酶带之上存在第三条更高分子量的带。这条带被认为是与AUX I前体蛋白相对应的，所述的AUX I前体蛋白在文献中有所报道。所述的前体带出现在指数生长期的过程中。在指数生长的末期，所述的前体带的强度减弱，并且在11小时之后消失(在GCFT05d中)。在银染色的凝胶中，在大约90kDa、60kDa、55kDa、45kDa以及40kDa处可以观察到主要的较低分子量的污染物。必须注意的是，这些污染物以低水平的状态存在，并且仅仅在银染色的凝胶中能够清楚的检测到。所述发酵过程的最佳收集点被确定为在这一阶段的大约第11小时。附图57表示的是对来自于标准的植物蛋白胨补料分批发酵过程的时间过程(time course)中的样本进行的SDS-PAGE分析。在附图57所示的凝胶中，可以观察到一个40kDa的污染物。在植物蛋白胨补料分批方法中产生的这条40kDa的污染物带被认定为是蛋白酶梭菌蛋白酶。通过对附图55以及附图57所示的凝胶进行比对，我们可能确定：使用PP3的发酵方法生成的梭菌蛋白酶的量明显低于基于植物蛋白胨的发酵过程。
用于下游方法的发展的供给原料的生成
为了支持下游方法(DSP)的发展，使用50克/升PP3进行几个发酵过程。在这些发酵过程当中，使用两种不同型号的PP3(5332398以及5325635)。附图58描述的是这些发酵过程的生长曲线(表示为菱形)，并且与使用型号为#5354796的发酵过程(DCFT05d)的生长曲线(表示为正方形)进行了比较。使用新批次的PP3的发酵过程显示出高度变化的生长曲线。尽管上述培养物初始的生长速率都非常接近，但它们进入稳定时期的点以及因此而达到的最大生物量浓度是相当不同的。接种培养物的光学密度(600纳米)表现出非常微小的变化(在5毫升时期的OD600为2.9至3.6单位；在200毫升时期的OD600为4.5至5.9单位)，并且与先前使用PP3型号#5354796的接种相比没有发生缩减。所述的变化以及减小的光学密度(600纳米)仅仅在上述培养的最后时期(发酵阶段)才自己显现出来。这表示上述变化的原因在于PP3中所产生的营养限制，以及在不同批次的PP3之间存在的限制性营养成分的量的不同。
尽管这些发酵过程已经成功的用于DSP(下游方法)的发展，并且SDS-PAGE分析表明，在生产的胶原酶的量方面没有显著的变化(350至400毫克/升的胶原酶总量，基于半定量SDS-PAGE分析，数据未显示)，但对于这种变化的原因进行调查仍然是至关重要的。生长曲线中存在的变化将使得预测发酵过程的收集点变得非常困难。还涉及到其他的方面，即营养限制可能导致其他蛋白酶的表达，特别是梭菌蛋白酶，正如在植物蛋白胨补料分批方法中所看到的。
对不同批次的朊间质蛋白胨#3之间存在的变化进行的调查
针对PP3的初始研究已经证明了是一个具有更高产物产量以及较低蛋白酶梭菌蛋白酶水平的高度稳健(robust)的方法。当使用新的批次的PP3时，可以观察到上述方法的稳健性(robustness)显著降低，伴随着高度变化的生长曲线。进行一个摇瓶试验，用来对到目前为止所使用的三个批次的PP3进行直接的比较(型号5354796，5325635以及5332398)。所述的试验重复进行前述5升方法中使用的两阶段式接种方法，但使用另外一个200毫升的培养来代替最后的发酵阶段。进行这个第三阶段是至关重要的，因为在先前的试验中，仅仅在方法的最终发酵阶段才观察到所述的变化。在每个转变时期测量培养物的光学密度(600纳米)，并且将所测量的培养物用来接种至下一时期。使用三个不同批次的PP3以50克/升的水平制备培养基。在5升的试验中使用到的导致溶组织梭状芽孢杆菌的较低生物量浓度的两个批次中的一个(型号为#5332398)也参与了制备，其水平为100克/升。
附图59表示的是上述小规模试验得到的结果。可以观察到，在第三阶段，型号5325635以及5332398表现出了降低了的光学密度(600纳米)，大约为2.5单位，它们被看做是“差”批次的PP3。型号5354796在培养的第三阶段保持了5单位的光学密度(600纳米)，它被看做是“好”批次的PP3。有趣的是，当将“差”批次的PP3(5332398)的浓度增加至100克/升时，在上述培养的第二阶段以及第三阶段达到相同的光学密度(600纳米)。这一数据确实支持了下述理论：生长曲线的背离是由不同批次的PP3之间的限制性营养的量的差异而引起的。不可能通过对上述各个批次的PP3进行分析性检验来识别这种营养。
对5升发酵过程中以100克/升水平存在的朊间质蛋白胨#3进行的评价
上述小规模研究的结果证明，将PP3的浓度从50克/升增加至100克/升能够消除批次与批次之间的差异的问题。使用一个“好”批次的PP3以及一个“差”批次的PP3(分别为型号5354796以及5325635)在5升的规模中对这种方法的变化进行测试，其中所述的“好”批次以及“差”批次是在上述针对PP3差异的小规模调查中确定的。附图60表示的是上述两个发酵过程的生长曲线。所述的两个培养在指数时期表现出相同的特异性生长速率。发酵过程进入稳定时期，并且达到非常相近的光学密度(600纳米)，为大约6.5单位。这一数据证明，增加PP3的浓度能够避免PP3的批次与批次之间的差异的问题。由于在上述发酵过程中达到了更高的生物量浓度，且具有更长的指数时期，因而将收集点延长至12小时。
附图61以及附图62表示的是对利用100克/升PP3的上述两个发酵过程进行的SDS-PAGE分析。得到的凝胶证明，在上述两个发酵过程中都存在胶原酶的恒定表达。如附图56中所描述，来自于上述发酵过程的样本都含有类似水平的污染物，尽管PBFT70d含有些许更多的40kDa带(梭菌蛋白酶)。这些小的差别可能是由于染色或者装载的差异。同样，使用PP3的方法所产生的梭菌蛋白酶的量明显低于使用植物蛋白胨的方法。所述的前体带在上述发酵过程的时间过程中持续的更长。值得推荐的是，以100克/升的水平进行的未来发酵过程应当延长至在14小时处进行收集。
前体带的出现强调了定义收集点以及在方法确认过程中对收集点的确定的重要性。
附图63显示的是对附图61中所示的凝胶进行的密度计量分析得到的数据。上述图表将产物以及前体的形成(密度峰面积)与细胞生长进行了比较(OD600)。产物的形成与细胞生长一致，而生产速率随着培养过程进入稳定时期而降低。随着指数生长的结束，所述前体带的亮度减弱，但其在发酵过程的收集点处依然存在。
将使用100克/升朊间质蛋白胨#3的发酵过程规模扩大至200升
随着PP3的浓度增加至100克/升，将所述的方法扩大至200升。为了生成接种至200升器皿所需的接种物的量，导入一个第三接种阶段，该阶段使用一个具有15升工作体积的发酵罐。将3×200毫升的培养物接种至所述的15升发酵罐中，生长12小时之后，将上述15升中的8升接种至所述的200升的器皿内。附图64中对所述200升发酵过程的生长曲线与上述两个使用100克/升PP3的5升发酵过程的生长曲线进行了比较。如前文所建议，将生长曲线延长至12小时，以确保所述的前体带在方法开始之前已经完全消失。上述200升发酵过程的生长曲线与5升规模的前述发酵过程的生长曲线非常相似，这证明对所述培养进行了成功的扩大。
附图65表示的是对上述200升发酵过程的时间过程进行的SDS-PAGE分析。得到的凝胶表示出了在发酵过程中产物的形成。所述物质在14小的收集点处含有检测不到的前体以及非常低水平的污染物。从上述200升发酵过程中得到的产物与从5升方法中得到的产物非常相近，这表明所述200升方法中增加的代的数量(generation number)不具备有害的影响。附图66显示出了对附图64所示的凝胶进行的密度计量分析得到的数据。上述图表将产物以及前体的形成(密度峰面积)与细胞生长进行了比较(OD600)。产物的形成与细胞生长一致，而生产速率随着培养过程进入稳定时期而降低。随着指数生长的结束，所述前体带的亮度减弱。与5升的培养PBFT70c相比(附图63)，在上述200升的发酵过程中，前体带亮度的减弱更加迅速。附图67表示的是使用4-12％的Bis-Tris凝胶对上述200升发酵过程的时间过程进行的SDS-PAGE分析。检测到的污染物的大致分子量被标注于所述的凝胶之上。
在200升规模的发酵过程中，对用于方法2中的收集方法(过滤澄清)进行了评价。使用现有的方法对所述的细胞培养物进行了成功的澄清，没有发生对过滤器的阻滞。所使用的收集方法在材料以及方法部分有所描述。使用DSP(下游方法)对来自于上述200升发酵过程的20升滤液进行处理，证明下游方法3的一种部分扩大(infra)。
使用密度计量分析对产物的产量进行定量分析
需要一种比半定量SDS-PAGE分析(附图62以及附图63)更加准确以及更加可以计量的方法，来确定在上游处理步骤中得到的产物的浓度。所述的发酵滤液具有大量的染料以及来自于生长培养基中的肽，因而使得例如紫外线(UV)以及考马斯亮蓝法(Bradford)检测之类的标准蛋白量化技术无法使用。通过对考马斯染色的凝胶进行密度计量学分析，从而对先前使用的半定量分析进行改进和更新。所述的方法包括装载一系列量(0.2微克/带至1.2微克/带)的混合的AUX I以及AUX II参考原料，并且使用Tris甘氨酸凝胶对所述样本的稀释液进行定量分析。之后，对得到的扫描图像进行分析，并且对标准以及样本的峰面积进行评价。之后，构建一个标准曲线(胶原酶总量)，并且用来对样本稀释液中的全部胶原酶剂量进行量化。附图68表示的是一个胶原酶标准曲线的例子，并且强调了上述定量分析方法在预期范围的样本内的线性关系。所述的Tris甘氨酸凝胶不能够完全溶解AUX I以及AUXII，因此对全部胶原酶进行量化，而不是试图分别量化上述两种蛋白。
对PCFT70c、PBFT70d以及上述200升扩大规模的发酵过程中的胶原酶的量进行了分析。在上述三个发酵过程中，发现全部胶原酶的量均为大约280毫克/升至350毫克/升。
材料以及方法
培养基的制备：
1升培养基的制备
在1升的瓶中对用于接种物制备过程中的磷酸盐(表25)进行121℃的高压灭菌20分钟。先将主要(bulk)培养基(表26)在微波炉中加热至60℃使成分完全溶解，再在1升的瓶中进行121℃的高压灭菌20分钟。将PSA1(表27)通过一个0.2微米的Sartopore 2 150平方厘米过滤器进行过滤，使其流入250毫升的无菌瓶中。将300毫升高压灭菌后的磷酸盐、600毫升高压灭菌后的主要培养基以及100毫升无菌过滤的PSA1混合，然后将其等分并且装入30毫升经过γ射线照射的万用瓶中(8×5毫升)以及500毫升锥形烧瓶(爱伦美氏烧瓶)中(4×200毫升)。
表25：用于接种物制备过程的磷酸盐组成
| 成分 | 所需质量 |
| 磷酸二氢钾 | 1.92克 |
| 磷酸氢二钾 | 1.25克 |
| 磷酸氢二钠 | 3.5克 |
| 氯化钠 | 2.5克 |
| 去离子水 | 补足至300毫升 |
表26：用于接种物制备过程的主要培养基组成
| 成分 | 所需质量 |
| 朊间质蛋白胨#3 | 50克或者100克* |
| 酵母提取物 | 8.5克 |
| 去离子水 | 补足至600毫升 |
*培养基成分表包括50克/升的PP3以及100克/升的PP3。
表27：用于接种物制备过程的PSA1镁/葡萄糖组成
| 成分 | 所需质量 |
| 七水合硫酸镁 | 0.08克 |
| 葡萄糖 | 5克 |
| 维生素溶液 | 10毫升 |
| 去离子水 | 补足至100毫升 |
表28：用于接种物制备过程的维生素溶液
5升培养基的制备
在1升的瓶中对用于5升规模的磷酸盐溶液(表29)进行121℃的高压灭菌20分钟。向5升的器皿中直接加入下述的主要培养基(表30)，并且在121℃下进行20分钟的高压灭菌。将下述的PSA1(表31)通过一个0.2微米的Sartopore 2 150平方厘米过滤器进行过滤，使其流入500毫升的无菌瓶中。向进行了高压灭菌的5升器皿中分别倒入250毫升上述的磷酸盐溶液以及200毫升PSA 1，并且对所述器皿进行冷却。
表29：用于5升发酵过程的磷酸盐组成
| 成分 | 所需质量 |
| 磷酸二氢钾 | 9.22克 |
| 磷酸氢二钾 | 6克 |
| 磷酸氢二钠 | 16.8克 |
| 氯化钠 | 12克 |
| 去离子水 | 补足至250毫升/278.35克 |
表30：用于5升发酵过程的主要培养基组成
*培养基成分表包括50克/升的PP3以及100克/升的PP3。
表31：用于5升发酵过程的PSA 1镁/葡萄糖组成
| 成分 | 所需质量 |
| 七水合硫酸镁 | 0.38克 |
| 葡萄糖 | 24克 |
| 维生素溶液 | 48毫升 |
| 去离子水 | 补足至200毫升/200克 |
表32：用于5升发酵过程的维生素溶液
| 成分 | 所需质量 |
| 七水合硫酸亚铁 | 1.2克 |
| 核黄素 | 50毫克 |
| 烟酸 | 100毫克 |
| 泛酸钙 | 100毫克 |
| 庚二酸 | 100毫克 |
| 吡哆醇(维生素B6) | 100毫克 |
| 硫胺(维生素B1) | 100毫克 |
| 去离子水 | 补足至1升 |
15升培养基的制备
将下述的磷酸盐溶液(表33)通过一个0.2微米的Sartopore 2 300平方厘米的过滤器进行过滤，并且流入一个无菌的2升的瓶中。将下述的主要培养基(表34)直接加入到20升的器皿中，随后对所述的器皿进行原位蒸汽(SIP)灭菌。将下述PSA1(表35)通过一个0.2微米的Sartopore 2 300平方厘米的过滤器进行过滤，并且流入一个1升的无菌瓶中。向进行了原位蒸汽(SIP)灭菌的20升器皿中分别倒入750毫升上述的磷酸盐以及600毫升PSA 1，并且对所述器皿进行冷却。
表33：用于15升发酵过程的磷酸盐组成
| 成分 | 所需质量 |
| 磷酸二氢钾 | 27.66克 |
| 磷酸氢二钾 | 18克 |
| 磷酸氢二钠 | 50.4克 |
| 氯化钠 | 36克 |
| 去离子水 | 补足至750毫升/838.05克 |
表34：用于15升发酵过程的主要培养基组成
| 成分 | 所需质量 |
| 朊间质蛋白胨#3 | 1.44千克 |
| 酵母提取物 | 122.4克 |
| 去离子水 | 补足至13.05升 |
表35：用于15升发酵过程的PSA 1镁/葡萄糖组成
表36：用于15升发酵过程的维生素溶液
| 成分 | 所需质量 |
| 七水合硫酸亚铁 | 1.2克 |
| 核黄素 | 50毫克 |
| 烟酸 | 100毫克 |
| 泛酸钙 | 100毫克 |
| 庚二酸 | 100毫克 |
| 吡哆醇(维生素B6) | 100毫克 |
| 硫胺(维生素B1) | 100毫克 |
| 去离子水 | 补足至1升 |
200升培养基的制备
将下述的磷酸盐溶液(表37)通过一个0.2微米的Sartopore 2 300平方厘米过滤器进行过滤，并且使其流入Gammasart Biosystem SA10的10升的袋中。向一个200升的器皿中直接加入下述的主要培养基(表38)，随后对该器皿进行原位蒸汽灭菌。将下述的PSA 1溶液(表39)通过一个0.2微米的300平方厘米过滤器进行过滤，并且使其流入GammasartBiosystem SA10的10升的袋中。向进行了原位蒸汽(SIP)灭菌的200升器皿中分别倒入10升上述的磷酸盐以及8升PSA 1，并且对所述器皿进行冷却。
表37：用于200升发酵过程的磷酸盐组成
| 成分 | 所需质量 |
| 磷酸二氢钾 | 368.8克 |
| 磷酸氢二钾 | 240克 |
| 磷酸氢二钠 | 672克 |
| 氯化钠 | 480克 |
| 去离子水 | 补足至10升/11.134千克 |
表38：用于200升发酵过程的主要培养基组成
| 成分 | 所需质量 |
| 朊间质蛋白胨#3 | 19.2千克 |
| 酵母提取物 | 1.632千克 |
| 去离子水 | 补足至174升 |
表39：用于200升发酵过程的PSA 1镁/葡萄糖组成
| 成分 | 所需质量 |
| 七水合硫酸镁 | 15.2克 |
| 葡萄糖 | 960克 |
| 维生素溶液 | 1.92升 |
| 去离子水 | 补足至8升/8千克 |
表40：用于200升发酵过程的维生素溶液
发酵过程
附图69描述的是对5升规模以及200升规模的使用植物蛋白胨以及PP3的发酵过程的操作流程的总观图。
5升规模的发酵过程
将一小瓶的WCB(工作细胞库)(2005#1019D)进行解冻，并且使用50微升的等份接种于8×5毫升的接种培养基中，所述的接种培养基存在于30毫升经过δ射线照射的万用瓶中。在37℃下在厌氧罐中对上述5毫升的培养物进行培养，其中所述的厌氧罐中存在三个厌氧气体包(packs)。经过大约12小时的培养后(OD600 3.0至4.0)，选取2×5毫升的培养物用来接种至2×200毫升的接种培养基中，所述的接种培养基存在于500毫升的锥形烧瓶中。将上述两个烧瓶一起放置于带有三个气体包的厌氧罐中，并且在37℃的条件下在振荡培养器(70rpm)中培养12小时。在经过12小时的培养之后(OD600 6.0至7.0)，将每个200毫升的接种物接种至5升的器皿中。
5/7升的器皿FT Applikon器皿的工作体积是5升，其中的4％(v/v)是来自于200毫升阶段的接种物。将搅拌速率设定为100rpm。将pH、氧气输送(dO2)以及温度分别控制在7.00单位、饱和度0％以及37℃。通过加入盐酸(5M)或者氢氧化钠(5M)来控制pH。通过持续的喷射氮气将氧气浓度保持在0％，氮气的流速为1升/分钟。在发酵过程中提取样本，并且将其通过0.2微米的过滤器进行过滤，之后储存于-20℃，用于进行分析。在达到6.0至7.0的OD600时，上述发酵过程开始进入稳定时期。经过12小时之后，将上述发酵罐冷却至10-20℃，随后开始着手进行收集回收。
200升规模的发酵过程
将一小瓶的WCB(工作细胞库)(2005#1019D)进行解冻，并且使用50微升的等份接种于8×5毫升的接种培养基中，所述的接种培养基存在于30毫升经过δ射线照射的万用瓶中。在37℃下在厌氧罐中对上述5毫升的培养物进行培养，其中所述的厌氧罐中存在三个厌氧气体包(packs)。经过大约12小时的培养后(OD600 3.0至4.0)，选取4×5毫升的培养物用来接种至4×200毫升的接种培养基中，所述的接种培养基存在于500毫升的锥形烧瓶中。将上述两个烧瓶一起放置于带有三个气体包的厌氧罐中，并且在37℃的条件下在振荡培养器(70rpm)中培养12小时。在经过12小时的培养之后(OD600 6.0至7.0)，将上述四个烧瓶中的三个汇集在一起，并且将其接种至20升的器皿当中。
20升的器皿的工作体积是15升，其中的4％(v/v)是来自于200毫升阶段的接种物。将搅拌速率设定为100rpm。将pH、氧气输送以及温度分别控制在7.00单位、饱和度0％以及37℃。通过加入盐酸(5M)或者氢氧化钠(5M)来控制pH。通过持续的喷射氮气将氧气浓度保持在0％，氮气的流速为20升/分钟。
在20升的器皿中经过12小时的生长之后(OD600 6.0至7.0)，将8升的培养物接种至200升的器皿当中。其操作条件与上述20升规模的条件相同。收集时最终的光学密度(600纳米)为6.0-7.0。14小时之后，将上述发酵罐冷却至10-20℃，随后开始着手进行收集回收。
收集
5升的收集
以5升/小时的流速将上述5升的培养物泵出，使其通过Millistak+10Opticap厚度过滤器(Millipore，KC0HC10FF1)以及0.2微米的Sartopore 2 300平方厘米的过滤器，并且流入250毫升的生物容器中。经过上述处理的材料可以储存于-20℃下，或者储存于4℃下过夜，随后使用DSP(下游方法)对其进行处理。
200升的收集
使用过滤收集板(filtration harvest train)进行200升的收集。以200升/小时的流速将上述培养物泵出，使其通过Millistak+(MC0HC10FS1)可置换厚度过滤器，所述的可置换厚度过滤器的过滤面积为4×1平方米，之后使用两个0.2微米的Express OpticapXL 10过滤器、2×0.49平方米(Millipore，KHGES10TT1)进行过滤。首次澄清的操作时间是1小时。在收集结束的时候可以再进行10分钟的澄清，重新得到被拦截在过滤器中的残留产物。将澄清得到的上清液收集至200升的Stedim Palletank储存箱中，并且记录滤液的重量。使20升的滤液流经Mustang Q高亲和DNA柱，流速为大约6升/分钟，并且将其收集于两个无菌20升Stedim袋中，随后在4℃下储存过夜。
分析
光学密度测量
使用PBS(磷酸缓冲液)在600纳米波长的条件下对分光光度计进行空白处理。使用PBS(磷酸缓冲液)在因素10、20或者100的水平对发酵样本进行稀释(取决于细胞密度)。
将1毫升的每种稀释样本转移至1毫升的试管中；将试管顶端密闭，并且倒转五次，随后将在600纳米的波长处读取的光学密度一式三份的进行记录。
Tris-甘氨酸凝胶
将发酵样本经过0.2微米的过滤器进行过滤，随后对其进行SDS-PAGE分析。将10微升过滤后的样本加入到10微升的样本缓冲液(2×)、2.5微升的还原剂(10×)以及2微升0.1摩的EDTA(乙二胺四乙酸)中(达到10毫摩的最终浓度)。制备高分子量(HMW)标记物，将10微升浓缩的储备液(stock)加入到80微升的还原剂(10×)、310微升的注射用水以及400微升的样本缓冲液(2×)中。随后，将得到的稀释的高分子量标准在95℃下加热5分钟，然后将其进行等分并且在-20℃下进行储存，以备在随后的凝胶中使用。对15微升的发酵样本以及10微升的高分子量标记物在8％的Tris-甘氨酸凝胶上进行电泳处理，其中使用经过预冷却(4℃)的Tris-甘氨酸操作缓冲液，在130伏、400毫安以及100瓦的条件下运行大约1小时50分钟。电泳反应之后，将所述的凝胶浸泡在100毫升胶体蓝染色试剂中(55毫升注射用水，20毫升甲醇，5毫升染料A，20毫升染料B)，在60rpm的轨道式振荡器(orbital shaker)中保持染色5小时。使用200毫升的注射用水对上述凝胶进行退色反应。将所述的凝胶放置于注射用水中15至20小时，直至多余的染料被除去，在此之后，对凝胶进行扫描，并且根据制造商提供的说明书对其进行干燥。
Bis-Tris凝胶
准备发酵样本，用于进行SDS-PAGE分析，所述样本通过下述方法来制备：将10微升经过0.2微米过滤的样本加入到4微升的样本缓冲液(4×)、1.5微升的还原剂(10×)以及1.7微升0.1摩的EDTA(乙二胺四乙酸)中(达到10毫摩的最终浓度)。将15微升的发酵样本与10微升标记为12的标记物在4-12％的Bis-Tris凝胶上进行电泳，所述的电泳使用MES操作缓冲液，在200伏、400毫安以及100瓦的条件下进行大约40分钟。电泳反应之后，将得到的凝胶浸泡在100毫升的固定溶液中(40毫升的蒸馏水，50毫升的甲醇，10毫升的醋酸)10分钟，然后使用95毫升的染色溶液(55毫升的蒸馏水，20毫升的甲醇，20毫升的染料A)代替固定溶液再浸泡10分钟。向所述的染色溶液中加入染料B，在60rpm的轨道式振荡器(orbitalshaker)中使凝胶保持染色5小时，之后使用200毫升的注射用水对上述凝胶进行退色反应。将所述的凝胶放置于注射用水中15至20小时，直至多余的染料被除去，在此之后，对凝胶进行扫描，并且根据制造商提供的说明书对其进行干燥。
方法3的纯化过程：
最新发展的方法(方法3)的第一个20升规模的全程(run-through)是用于对来自于溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶进行纯化，该方法是从方法2中改进得来的，以20升的规模在GMP中进行。在方法3的进行中引入显著的操作变化，其目的在于使得纯化过程更加稳健并且更容易被修正以进行扩增及其随后的操作确认。促进这种操作变化的一个重要的因素在于对发酵成分的选择。方法2是基于对维持基于植物蛋白胨的发酵培养基的需要，而方法3中使用的是朊间质蛋白胨#3。上述方法全程被划分为两个关键步骤，下游纯化以及胶原酶AUX I和AUX II。其中包括对所述发酵滤液的处理，所述的处理使用Mustang Q胶囊，疏水作用色谱，正切流动过滤步骤1(表示为TFF1)，阴离子交换色谱以及正切流动过滤步骤2(表示为TFF2)。在上述纯化过程的初始步骤中，AUX I以及AUX II是被共同纯化的，它们仅仅在阴离子交换色谱步骤中(使用季胺琼脂糖高效液相色谱培养基来完成)才被分离。之后，分别对AUX I以及AUX II进行处理和配制。之后，将所述的中间产物以1：1的比例(基于由紫外光测定的蛋白含量)进行混合，并且过滤以生成药用物质。在改进的方法3中，与方法2相关联的关键步骤被取消。值得注意的是，硫酸铵沉淀步骤、两个色谱步骤(羟磷灰石色谱以及凝胶渗透色谱)以及需要在-20℃下进行的所有步骤都被取消了。不可扩大的步骤例如搅拌细胞以及透析的使用也被去除并且被正切流动过滤(TFF)进行了取代。产物不稳定性的问题在方法2中很显著(以及取消了正切流动过滤的使用)，但在方法3的20升规模的操作中表现的不明显。然而，与方法3相关联的污染物曲线与方法2的曲线不同，其中在方法2的曲线中梭菌蛋白酶以及明胶酶占污染物的主要成分。最值得注意的是，使用SDS-PAGE检测到了一个40kDa的污染物、55kDa的污染物以及两个90kDa的污染物(一个与AUX I一同进行纯化，而另外一个与AUX II一同进行纯化)。由于这些新的污染物的存在，某些QC(质量控制)检测(例如反相高效液相色谱以及尺寸排阻高效液相色谱)的使用受到了限制，因为它们不能够溶解方法3中所有的杂质。由于不能够利用已经建立的QC(质量控制)检测法在操作过程中进行纯度测定，因而需要定义一种方法，该方法用来确定形成季胺琼脂糖柱的哪些物质是适合于进行进一步的纯化过程的。需要这样一种方法，因为不能够将污染物从所述季胺琼脂糖柱上的AUX I以及AUX II中明显的分解出来，并且因此必须对离散状态的被洗脱物质进行收集，所述的被洗脱物质可以被进行回顾性(retrospectively)分析。使用SDS PAGE进行分析，对上述20升全程(run-through)的收集决定(pooling decision)是基于对杂质以及产物的相对染色亮度的经验来确定的，所述的染色使用的是标准化的1微克装载量。
SDS-PAGE的回顾性密度计量分析使得所述的收集标准(pooling criteria)被表述为基于产物纯度的相对百分数。对来自于200升发酵过程中的物质进行的进一步的密度计量分析使得一种标准化的方法得以确立，并且确定了检测变化的近似值。这使得可以在第一个GMP车间中进行操作过程部分中的收集步骤。
除了对上述的方法描述，还对描述缓冲液稳定性以及操作过程中样本稳定性研究的初步工作进行了描述，以及与方法3相关联的某些杂质的初始性质。
方法3与方法2在三个主要的方面存在差异。首先，其中的硫酸铵沉淀步骤以及羟磷灰石色谱步骤被取消；其次，其中的凝胶渗透色谱(GPC)步骤被取消，并且第三，所有的缓冲交换步骤都是通过正切流动过滤来完成的。在委托人的推荐下使用疏水作用色谱(HIC)来代替上述沉淀步骤。这一步骤的改进使得疏水作用色谱得以成功进行，用以进行(i)蛋白的捕获(从而作为一个浓缩步骤)以及(ii)某些蛋白以及色素污染物的去除。所述的疏水作用色谱步骤随后也表现出对dsDNA(双链DNA)水平的降低。作为上述方法改进计划的结果，疏水作用色谱的引入以及Mustang Q步骤的涵盖消除了对硫酸铵沉淀步骤以及羟磷灰石色谱步骤的需要。其全部的作用在于简化了产物的在先捕获(up front capture)并且取消了与方法2相关联的可能的保存步骤。后面的一点具有重要的意义，因为在此之前所述的发酵过程可以在进行下游纯化之前被评价，因为从所述沉淀步骤得到的小球在进行处理之前可以被保存在-20℃下。
在疏水作用色谱步骤之后，使用正切流动过滤(TFF)对产物进行缓冲交换。使用30kDa截留分子量(MWCO)的膜来进行这一步骤，并且用该步骤来替代方法2中使用到的透析步骤。聚集的污染物，在阴离子交换色谱步骤(IEX)中被除去，其中，当所述的污染物存在时，其被检测为来源于AUX II。因此，所述的凝胶渗透色谱(GPC)被取消了，因为在疏水作用色谱(IEX)之后AUX I以及AUX II都在聚集的具体规范范围之内。最后，使用正切流动过滤(TFF)取代先前方法中使用到的搅拌细胞，对AUX I以及AUX II中间产物进行最终的浓缩以及配制。
总之，方法3代表了一种更加简单的方法，与方法2相比，其更容易修正以进行扩大和确认。除此之外，由于消除了对羟磷灰石以及凝胶渗透介质的需要，并且由于需要使用亮抑蛋白酶肽的步骤的数量的减少，使得对可消耗成本的降低是显而易见的。附图46中给出了方法3的纯化过程示意图的总观。
以20升规模进行的非GMP验证
在方法研究实验室中以20升的规模完成方法3，其目的在于验证在20升的规模下使用这种改进的方法能否生成适当量的物质。该操作的关键需求在于限制潜在的蛋白酶活性的能力，在可能的情况下在冷冻的条件下进行步骤并且在操作的关键时期引入半胱氨酸蛋白酶抑制剂——亮抑蛋白酶肽。对完整的20升的发酵滤液进行处理，上述进料(feedstock)是来自于200升的发酵过程PP3中的。上述发酵过程的细节以及随后的收集和过滤在另外一份报告中进行了描述。
对发酵滤液进行的Mustang Q处理
进行了0.2微米的过滤之后，如前所述将大约22升的发酵滤液装载至Mustang Q色谱胶囊中。在对第一个10升的滤液进行过滤的过程中，某些可见的色素污染物(绿色/褐色)似乎被Mustang Q胶囊所除去，因为第一个10升的Stedim袋中的内含物看上去颜色显然浅于第二个。在该步骤之后，对Mustang Q处理之前的样本以及Mustang Q处理之后的样本(表41)进行pico green(一种荧光染料)分析，用来监测Mustang Q胶囊去除双链DNA的能力。操作过程中的分析表明，与先前小规模方法得到的数据不同，大量核酸的除去在Mustang Q步骤中并不明显。这一步骤的稳健性及其应用因此需要进行进一步的调查。
表41
疏水作用色谱(HIC)
疏水作用色谱的使用在纯化过程中提供了三种功能。首先，产物的体积减小了，因为已经认定了胶原酶是结合于树脂上的。其次，某些色素以及蛋白污染物在这一阶段被除去，并且第三，该项操作中的pico green分析表明双链DNA减少了。所述的疏水作用色谱直接作用于来自发酵过程中的经过处理的上清液(在Mustang Q处理之后)，并且因此，在方法3中不再存在保存的步骤(明显存在于方法2中的硫酸铵小球)。
为了给胶原酶结合于疏水作用色谱柱提供条件，使用3摩的硫酸铵溶液对来自于Mustang Q步骤的产物(20升)进行稀释，使其最终浓度达到1摩。进行过滤之后，将产物装载于上述柱中，并且使用两步无梯度洗脱进行洗脱。
很难对疏水作用色谱中的装载物质的蛋白浓度进行准确的测定，可以使用两种方式进行估算。首先，在加入硫酸铵之前，可以对上述物质进行考马斯亮蓝法检测。这种方法针对的是未被稀释的原料，其目的是将存在于所述发酵培养基中的色素的作用标准化，其中已知所述的作用可以对检测进行干扰。其次，所述的估算基于每毫升柱树脂中装载的发酵培养基的体积。利用考马斯亮蓝法检测估算的柱的装载量为5.9毫克蛋白质总量/毫升树脂，或者每毫升树脂约为13毫升发酵培养基。利用紫外光(UV)测定的从上述柱中洗脱出的目标蛋白的总量的估算值为3.4克(参见表42)。假定在疏水作用色谱装载物中存在的蛋白质总量为9克(考马斯亮蓝检测)，这相当于38％的回收率。然而，这一值仅仅被看作是一个相对测量，其原因在于针对含有发酵培养基成分的样本的检测所具有的不准确性。
另外一种估算疏水作用色谱装载浓度的方法是使用密度计量法来确定，尽管认为这种估算将得出的是胶原酶的含量而不是蛋白质的总量(在不同的发酵过程之间存在变化)。使用这一方法，估算得到的胶原酶总量为360毫克/升，其中AUX I与AUX II的大致比例被估算为40：60。利用这一数据，在疏水作用色谱中装载的预期的胶原酶总量可以达到7.2克，该步骤的产量为47％。
疏水作用色谱步骤得到的色谱在附图70中所示。在流通物中明显存在可见的色素，并且可以看见其结合于柱中。使用平衡缓冲液对所述的柱进行洗涤，除去流通过的污染物之后，使用中间浓度的硫酸铵溶液(0.3摩)对峰1进行洗脱。
尽管某些AUX II在这一阶段也被洗脱出来，这个峰显示出含有蛋白污染物(附图71)。这种产物的损失是预先想到的，也是之前所注意到的。为了使产物损失的量最小化，且不降低纯度，将峰1的洗脱体积设定为5倍的柱体积。之后，使用不含硫酸铵的缓冲液对含有大部分产物的峰2进行洗脱。使用计划的色谱方法以单一收集物的形式收集峰2，因而在将占四分之三柱体积的洗脱缓冲液注入柱中之后才开始收集。随后，在收集到柱体积四倍的总量之后，停止收集。为了使该方法的这一阶段中产物潜在的蛋白酶水解最小化，向经过疏水作用色谱处理后的洗脱液中加入亮抑蛋白酶肽，并且将所述的物质保持在2-8℃。对经过疏水作用色谱处理后的洗脱液的保留时间为2天的过程。
正切流动过滤(TFF1)
在上述疏水作用色谱之后，引入一个使用30kDa膜的正切流动过滤步骤，其目的在于减少产物的体积(5倍)，并且对缓冲液进行交换，使其达到适合与阴离子交换柱发生结合的条件。特别重要的是硫酸铵的充分减少，这样一来所述阴离子交换色谱的装载样本的传导率<1.8毫秒(mS)。在用来降低蛋白酶水解的可能性之前，将所述的渗滤缓冲液进行冷却，并且向其中加入亮抑蛋白酶肽。在这一步骤的过程中没有估算蛋白质的损失(回收率>100％)，尽管这可能表现为在该方法的这一阶段对蛋白浓度的估算值的错误，其中所述的错误归因于在进行正切流动过滤1之前的物质中存在色素。在所述的截留物中回收到蛋白质总量的大约97.5％(3325毫克)，另外在第一次膜漂洗时又回收到204.8毫克(infra)。对来自于混合的截留物中的全部蛋白质进行过滤，并且在正切流动过滤步骤结束时进行漂洗，在此之后将得到的物质在2-8℃下保存过夜。SDS-PAGE凝胶表明，在正切流动过滤步骤之前以及之后进行的检测没有发现明显的差异(附图71)。
季胺-琼脂糖(Q-Sepharose)色谱
以最大的容量对季胺-琼脂糖柱进行装载，所述的量为每毫升树脂中5毫克蛋白质总量。作为结果，在此步骤中并不是利用来自于正切流动过滤步骤中的所有可利用物质(参见表42)。所述的季胺-琼脂糖柱预期的分解出AUX I以及AUX II胶原酶(附图72)。在大约13.6％B时开始进行AUX II的洗脱(其中缓冲剂A＝10毫摩的Tris，0.2毫摩的亮抑蛋白酶肽，pH8.0，而缓冲剂B＝缓冲剂A+360毫摩的氯化钠)，该值换算的柱传导率为5.7毫秒(mS)。在AUX II的洗脱过程中收集馏分(100毫升)，直至吸收值跌至峰高的25％(550mAU)。在AUXII的洗脱之后，以大概8毫秒的水平(20.3％B)对小峰进行洗脱。在先前的小规模试验中对该峰进行的过程分析表明这是来自于AUX II的聚集物。在大约27％B时(该值换算的传导率为10.4毫秒)开始进行AUX I的洗脱。如前所述，收集100毫升的馏分，直至吸收值跌至所需的25％的值(190mAU)。
对收集到的每个AUX I以及AUX II馏分进行SDS-PAGE分析，并且进行密度计量分析(附图73至附图76)。进行回顾性密度计量分析，因而对馏分收集的决定是基于对污染物水平的经验来确定的，其中所述的污染物经过胶体蓝染色而变得可见。经过与Auxilium进行的磋商，收集6-12馏分作为AUX II产物，而收集19-26馏分作为AUX I。所述的步骤产量以及存在于上述从季胺-琼脂糖操作中收集到的物质中的蛋白浓度包含在表42中。
对来自于20升发酵过程操作的、经过阴离子交换色谱处理后的AUX I以及AUX II的产品进行SDS-PAGE分析(附图77以及附图78)，SDS PAGE观察到很少的污染物。除此之外，检测到的污染物与先前的小规模试验相符合，尽管在上述污染物的溶解性方面存在着值得注意的差异，在小规模的模型中所述的污染物似乎更加精细(即，分离峰或者肩峰)。这些污染物与方法2中认定的污染物间也存在差异，在方法2中，梭菌蛋白酶以及明胶酶是主要成分。因此，为方法2建立的QC(质量控制)方案不能用来对与方法3相关联的新的污染物的检测进行优化。
对收集到的物质进行的回顾性密度计量分析估算得到的纯度为AUX I纯度为95.1％，而AUX II纯度为99.4％。然而，当前≥97％的纯度规范是由反相高效液相色谱(RP-HPLC)确定的，没有任何最终产物的规范是由密度计量分析建立的。
AUX I以及AUX II的浓缩以及缓冲交换
使用正切流动过滤对从上述季胺琼脂糖柱中分离出的AUX I以及AUX II产物分别进行处理，其中所述的正切流动过滤使用的是30kDa的膜。这一步骤需要做到(i)去除/减少最终产物中的亮抑蛋白酶肽(ii)将所述的中间产物配制到正确的缓冲剂中(10毫摩Tris，60毫摩蔗糖，pH8)以及(iii)达到0.9毫克/毫升-1.1毫克/毫升的所需目标蛋白浓度。将总量为799毫克的AUX II(大约683毫升，1.17毫克/毫升)以及860毫克的AUX I(796毫升，1.08毫克/毫升)浓缩至1.75毫克/毫升的目标浓度。这种理论上的浓度是基于对减少的体积的计算，其中需要假定在上述浓缩步骤中没有发生产物的损失。随后进行渗滤，至所需的配制缓冲液中，使用最小体积的正切流动过滤系统(大约250毫升)对所使用的膜进行洗涤，并且与所述的浓缩物进行混合，使总量达到0.9毫克/毫升-1.1毫克/毫升的所需目标浓度。过滤之后，可以得到总量为819.5毫克的AUX II(1.03毫克/毫升)以及797.0毫克的AUX I(1.09毫克/毫升)。在上述两种情况中，大部分的产物是从截留物中回收到的，并且估计含有95.4％的AUX II(762毫克)以及83.1％的AUX I(715毫克)。其余的物质是由膜的漂洗得到的，该值分别被估计为153毫克的AUX II以及89.6毫克的AUX I。
混合中间产物以形成药用物质
对大约200毫克的每种中间产物进行混合，从而得到400毫克的药用物质。之后，过滤所述药用物质，选取大约26毫克进行QC(质量控制)测试。对于AUX I中间产物、AUX II中间产物以及药用物质的QC测试结果在表43中所示。对于药用物质以及AUX II中间产物的所有测试均通过了要求的具体规范。然而，对于中间产物AUX I的药效的测试没有落入规定的范围之内，尽管其他所有测试均通过了规范。除了上述AUX I药效测试的结果，这些数据表明，当以20升的规模进行纯化时，方法3具有生成具备所需规范的物质的能力。
除了进行QC(质量控制)测试，对来自于20升的验证操作的物质进行方法确认，所述的方法确认在KBI BioPharma公司进行。应委托人的要求，利用干冰将200毫克的药用物质运输至KBI，用来进行药用物质以及药物产品的方法确认。后者的测试过程是在KBI进行了药用物质的冻干之后进行的。除此之外，将25毫克的每种中间产物提供给KBI，用来进行分析方法的确认。
上述20升验证操作中的各个步骤的产量在表42中给出。对装载于所述季胺-琼脂糖柱中的可利用物质的数值进行的推断表明，来自于该方法全程的可获得的药用物质的最大总量为1.6克(假定通过截留物时没有物质的损失)。这可以换算出总体的产量大约为17.8％，所述的换算是基于可以装载于疏水作用色谱柱中的蛋白质总量的初始估算值9克(使用考马斯亮蓝检测)来进行的。由于所述季胺-琼脂糖柱的装载量的限制，如果将可以获得的中间产物全部进行混合以形成药用物质，则当前的全程操作(run-through)可以获得的药用物质的最大的量为1.4克。
表42
*上述计算是基于加入硫酸铵之后的稀释因素而进行的
表43
样本的稳定性研究
在上述20升的验证操作中，样本的选取是在关键的操作点中进行的。由于所述的验证操作是一个连续的过程(没有保持的步骤)，因而尝试对该操作过程中的物质在用于为GMP批次进行沉淀的保持时间内的稳定性进行评价。GMP预先设想的延长的操作周期由于对操作步骤之间获得的设备清除数据的需要而被认可。将该操作过程中的物质保持于2-8℃下，保持时间为GMP生产所预期的大致时间周期内。除此之外，将样本保持一段更长的时间，长度为GMP生产预期时间的两倍。对样本的选取以及各自的保持时间的详细描述在表44中给出。上述20升的验证操作的处理时间在表45中给出。对所有的样本进行SDS-PAGE分析、反相高效液相色谱分析、尺寸排阻高效液相色谱分析以及紫外光分析从而进行质量控制(附图79-附图83)。
总之，上述结果表明，在第一个保持点(hold point)过后没有检测到关于纯度(利用反相高效液相色谱进行测定)、分解(利用8％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE进行检测)以及聚集(利用尺寸排阻高效液相色谱进行测定)的恶化现象。然而，某些检测被认定为是受到限制的，因为使用8％的SDS-PAGE不能够检测到低分子量的成分，而反相高效液相色谱分析也不能被用来检测与方法3相关联的40kDa、55kDa以及90kDa污染物。某些检测对于粗样本而言也是较少相关的，例如在发酵样本中使用紫外光检测以及尺寸排阻高效液相色谱检测。尽管有上述这些限制，在产物曲线中仅仅探测到的变化被认定为是在第二保持点(第12天)上，变化针对的是选取自季胺-琼脂糖柱中的AUX II处理中样本。这种变化显示，在第5天至第12天之间聚集物水平增加，尽管这种增加仅仅是从0增加至0.62％。
针对处理过程中的截留物进行了另外一个稳定性研究，其中所述的截留物选取自20升验证操作过程中的生产点上(the point of manufacture)，并且保持于-20℃中。在这项研究中，对样本进行解冻，并且在室温下对其进行培养，在37℃下使用4-12％的SDS-PAGE分析进行监测，用来估算全部分子量范围内的污染物(附图84-附图88)。这些数据证明，在季胺-琼脂糖阴离子交换处理之前的样本容易发生分解。在对胶原酶AUX I以及AUX II进行分离之后(使用季胺-琼脂糖柱)，得到的样本似乎变得相对稳定，并且看上去与SDS-PAGE分析计时起点(time zero)处的样本相当。
综合考虑，两项研究都表明，将提供的温度保持在2-8℃之间，那么在操作过程中所涉及的物质在经过调查的保持时间内不会发生预期的恶化现象。这给了我们信心，在GMP所涉及的时间段内进行操作，亮抑蛋白酶肽的使用以及温度的控制足以限制产物分解的水平。
表44
表45
缓冲剂稳定性的研究
缓冲剂样本在表46中进行了描述，上述样本是从所述的20升验证操作中保留下来的，并且在进行了2-8℃的储存之后进行重新检测。在完成验证操作时以及经过12-13天的储存之后，对所述缓冲剂的pH、传导率、温度以及外观进行了留意。这项研究的结果在表47中示出。在pH值以及传导率数值中观察到了小的差异，这可能是归因于初始缓冲剂与上述检测用缓冲剂在温度上的差异。特别的，疏水作用色谱(HIC)缓冲剂表现出在传导率以及温度上的最大变化。因此，针对缓冲液稳定性的未来研究应当包括记录所有参数的可接受的温度范围的具体规范。在所有的情况中，在计时零点以及经过所需的保持时间(hold time)之后，得到的缓冲保留物的外观都是透明的。
表46
表47
通过N-末端测序进行污染物的识别
使用SDS-PAGE分析从方法3中检测到三种主要的杂质。这些杂质似乎与AUX I以及AUX II胶原酶一同被洗脱出来，并且只能通过对从季胺-琼脂糖柱中洗脱出来的峰进行分馏来达到分解(resolved)。上述污染物通过它们在SDS-PAGE上的表观分子量(apparentmolecular mass)被命名为40kDa污染物、55kDa污染物以及90kDa污染物。在切除来自于SDS-PAGE的带之后，对含有升高水平的具体污染物的馏分进行N-末端测序。
对于从上述20升验证操作中分离得到的55kDa污染物以及40kDa污染物的序列分析是成功的。与AUX I相关联的所述55kDa污染物带的N-末端(带1-5；附图89)与AUX I的ColG序列的区域相匹配，而来自于AUX II的所述40kDa污染物带(带6-10；附图89)与胶原酶AUXII的Col H序列的区域相同。先前曾经尝试对与AUX I以及AUX II产物都相关联的所述90kDa的带进行测序(附图90)。对与AUX I产物相关联的90kDa污染物的测序是成功的，因为同一性与AUX I序列的N-末端是相关的。相反，不可能获得与AUX II相关联的90kDa污染物的完整序列，这表明，上述两种90kDa污染物是不同的产物。
与方法3相关联的主要污染物似乎是与产物相关的，并且可以将其识别为AUX I(55kDa)以及AUX II(40kDa)的N-末端断裂产物，或者被识别为AUX I(90kDa)的C-末端断裂产物。由于这些污染物不同于在方法2中识别出的那些污染物，用于对中间产物以及药用物质进行规范化的QC(质量控制)检测不能够分解上述新的污染物，因为上述检测方法是围绕方法2而建立并且发展的。具体的，不能使用标准的纯度检测(反相高效液相色谱法)探测所述40kDa污染物以及55kDa污染物的水平。
密度计量分析
20升验证操作
使用SDS-PAGE对与方法3相关联的40kDa污染物、55kDa污染物以及90kDa污染物进行识别和分解。在从季胺-琼脂糖柱中洗脱出来的馏分中可以清楚的检测到这些污染物的存在，其中所述的洗脱发生在峰曲线的前沿(leading edge)以及后缘(trailing edge)(参见附图72-76)。根据对于在胶体蓝染色凝胶中的污染物染色的相对亮度以及产物的相对亮度的经验，来决定哪些馏分是被包含于或者排除于进一步的纯化过程中的。为了使其成为具有较少主观性的评估，利用密度计量分析来确定在季胺-琼脂糖步骤之后得到的馏分的具体收集标准。密度计量分析优于当前用于检测纯度的QC(质量控制)检测(反相高效液相色谱法)，因为这种检测不会分解与方法3相关联的新的污染物。
来自于20升验证操作过程的季胺-琼脂糖处理后的馏分的密度计量数据
取针对阴离子交换色谱处理后的馏分进行的两次单独的分析得到的密度计量值的平均值，并将其表示于表48中。馏分1-12以及峰1的最后25％(峰尾)含有AUX II以及相关的40kDa污染蛋白、75kDa污染蛋白和90kDa污染蛋白。馏分13-27以及峰2的最后25％(峰尾)含有AUX II以及相关的55kDa污染蛋白和90kDa污染蛋白。根据SDS-PAGE而不是密度计量分析而选取的馏分的收集物(pool)是突出的。
表48
对来自于200升规模的季胺-琼脂糖处理之后(post Q)的馏分进行的密度计量分析的概述
密度计量分析概述
已经对来自于200升工程化操作的经阴离子交换色谱处理后的馏分进行了几次分析，确立了一套可以记载入用于GMP生产的IEX BMR中的收集标准。这一收集标准是基于下述假设而建立的：(i)从上述工程化操作中生成的物质的质量适合做GMP原料，并且(ii)密度计量方法得到的近似值是可以接受的。如果其目标在于在GMP生产中生成更高质量的物质，那么对于收集标准的具体规范则需要进行重新修正。
从阴离子交换色谱中进行收集的具体规范
对来自于200升工程化操作中的样本进行了共计6次的分析(两位操作者，以及对每种凝胶进行的三次重复)，其平均值被列于表49中。用红色突出的表示了为上述工程化操作所收集的馏分。从这项分析中，可以确立下述收集标准：
(i)纯度大于或者等于88.5％的任何馏分都可以被收集
(ii)具有大于或者等于10％的单一杂质的任何馏分都不可以被收集
(iii)被收集的馏分必须来自于连续的馏分。
(iv)对所述的收集所计算的理论纯度应当是：
对于AUX I而言，大于或者等于93％的理论纯度
对于AUX II而言，大于或者等于96％的理论纯度
上述最后一点是基于对200升工程化操作的估算值而言，其中可获得馏分中的蛋白质总量是估算的(尽管存在这样的限制：对于AUX I而言，不是所有的馏分都进行紫外光分析)。来自于此项分析的数据在表50中所示。
**注释：现在可以从上述标准中排除AUX II峰的馏分7。
检测变化
根据来自于200升工程化操作中的经阴离子交换色谱处理后的馏分的数据，可以估算出下列准确率水平：
(i)对于产物而言(AUX I以及AUX II)，其估算的％柱体积为2.1％(AUX I)以及2.3％(AUX II)。因此，用于收集的88.6％的纯度规范应当在86.3-90.9％的范围之内。
(ii)对于杂质而言，其％柱体积要大的多，并且依据杂质的类型，将其估算在18.5％-33.7％的范围之内。因此，具有不超过10％的单一杂质的被排除馏分的纯度规范应当是具有6.63-13.37％的实际杂质范围的馏分。因此对于收集规范而言，产物的纯度值(而不是杂质的纯度值)是最可信的。
通过密度计量分析得到的最终物质纯度的估算值
通过密度计量分析也对200升工程化操作中的最终物质(药用物质以及中间产物)进行了确定，结果如下：
AUX I＝96.0％(90kDa的污染物占3.1％)
AUX II＝98.7％(90kDa的污染物占1.2％)
药用物质(DS)＝97.6％(90kDa的污染物占2.1％)
(注释：上述范围是由单一的SDS-PAGE分析所确定的，所述的分析由三位不同的操作者进行了三次)。
方法的标准化
在进行重复分析的过程中，上述密度计量方法已经被进行了标准化处理，将操作者间以及凝胶间的变化所产生的误差最小化，这将被记载于SOP中。特别需要注意的是：
(i)在所述凝胶的每条带中的全部蛋白质的装载量将是1微克。
(ii)从每个产物峰(AUX I以及AUX II)中选取出的用于进行分析的馏分最多为16个。这将用于进行密度计量分析的凝胶的数量限制为4个。
(iii)在每个峰中对所述16个馏分的选取应当在最后一个馏分被收集后才开始，并且进行连续的操作。这样做是为了确保用于计算平均纯度的数字的准确性(因为要被收集的所有馏分都可能是被包含在内的)。
表49：在来自于200升工程化操作中的经过阴离子交换色谱处理后的馏分中，产物以及杂质的平均相对量，上述数值是由密度计量分析测定的。用红色部分突出表示了收集到的馏分。
表50：在来自于200升工程化操作中的经过阴离子交换色谱收集后的收集物(pools)中，产物以及杂质的理论相对量，上述数值是由密度计量分析测定的。用红色部分突出表示了收集到的馏分。对于AUX I以及AUX II中间产物而言，分别将其理论平均产物纯度计算为92.3％以及95.8％。
经季胺-琼脂糖处理后的馏分的GMP收集标准
在离子交换BMR中需要进行规范的细节
A.针对来自于AUX I峰以及AUX II峰的馏分，需要对下述收集标准进行规范，其中使用的是密度计量方法进行的分析：
(i)从每个产物峰(AUX I以及AUX II)中选取出的用于进行分析的馏分最多为16个。这将用于进行密度计量分析的凝胶的数量限制为4个。
(ii)纯度大于或者等于90.00％的任何馏分都可以被收集(计算到小数点后两位)。
(iii)具有大于或者等于9.00％的单一杂质的任何馏分都不能被收集(计算到小数点后两位)。
(iv)被收集的馏分必须来自于连续的馏分。
B.针对来自于AUX II峰的馏分，需要对下述收集标准进行规范，其中使用的是尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)进行的分析：
(i)进行尺寸排阻高效液相色谱分析的样本的最大数量为10个，并且所述的样本必须来自于该峰收集的最后一个馏分，并且必须是向前连续的馏分。
(ii)具有大于或者等于2.00％的聚集物的任何馏分都不能被收集(计算到小数点后两位)。
仅作为信息被记录的细节
A.对于所述的收集物(pool)的估算的理论纯度应当是仅仅作为信息被计算的，并且所述的理论纯度预期为：
对于AUX I而言，大于或者等于93.00％的理论纯度
对于AUX II而言，大于或者等于97.00％的理论纯度
B.如果在今后使用到含有小于0.5克的蛋白的馏分应当被排除在外这一标准，则应当注意确定每个收集物中蛋白的最小量。
C.将对AUX I峰中的馏分进行反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)，但这种分析是回顾性的，并且仅仅作为信息。这些数据将不会作为收集标准的一部分被考虑。
收集的预期效果
下述表51中所示的是从平均数值中计算得来的，反映的是所述新的收集标准对产量以及馏分选取所产生的影响：
表51
表52：在来自于200升工程化操作中的经过阴离子交换色谱处理后的馏分中，产物以及杂质的平均相对量，上述数值是由密度计量分析测定的。
表53：在来自于200升工程化操作中的经过阴离子交换色谱收集后的收集物(pools)中，产物以及杂质的理论相对量，上述数值是由密度计量分析测定的。用红色部分突出表示了收集到的馏分。对于AUX I以及AUX II中间产物而言，分别将其理论平均产物纯度计算为92.3％以及95.8％。
对两组数据(即，不同操作者使用不同的凝胶处理的相同的过程中样本)进行的比较引起了我们对下述回顾性的收集标准中的平均数值组的注意，尽管还应该包括另外一个馏分(来自于AUX I的馏分27)，所述的馏分实际上是从20升的操作中收集到的：
·AUX I
收集纯度≥87％的所有馏分，但所述的馏分不含有≥10％的单一杂质。
·AUX II
收集纯度≥94％的所有馏分，但所述的馏分不含有≥4％的单一杂质。
对来自于20升验证操作的最终物质进行分析得到的QC(质量控制)数据表明，所述AUX II中间产物的纯度为99.4％，而AUX I中间产物的纯度为99.1％，并且所述的药用物质为99.9％的胶原酶，上述结果是通过反相高效液相色谱分析测得的。因此，可以预期上述收集过程的标准规范将使得产物通过了所述最终物质的出厂规范(releasespecification)。
200升的验证操作
先前提及的针对20升的验证操作而建立的标准与200升的工程化操作所执行的标准是不同的。在这种情况下，针对AUX I产物以及AUX II产物的收集的具体规范为：收集的馏分具有≥86.5％的纯度，并且其中不含有≥10％的单一杂质污染物。使用尺寸排阻高效液相色谱法检测到的含有≥2％的杂质水平的AUX II样本同样是被排除在外的。同样使用标准化的方法，利用密度计量分析对得到的AUX I/AUX II中间产物以及药用物质进行分析，基于对单个凝胶进行的三次分析(三位不同的操作者)，得到下述估算的纯度：AUX I＝96.0％(90kDa的污染为占3.1％)；AUX II＝98.7％(90kDa的污染物占1.2％)；DS(药用物质)＝97.6％(90kDa的污染物占2.1％)。
除此之外，经过QC(质量控制)确定的中间产物以及药用物质的纯度通过了由反相高效液相色谱检测确定的规范(AUX I＝98.2％；AUX II＝98.1％；药用物质＝99.4％)。因此，基于当前可以利用的分析方法，为200升的工程化操作提供的收集标准能够成功的提供具有适当纯度的产物。
材料以及方法
Mustang Q色谱(20升规模的操作)
设备：
Mustang Q色谱胶囊，60毫升(CL3MSTGQP1，Pall)
传导率仪以及pH计4330(Jenway)
化学试剂：
氯化钠(USP等级，Merck)
氢氧化钠溶液(测定体积4M)(分析纯，BDH)
Tris(羟甲基)甲胺(USP等级，Merck)
硫酸铵(特纯级，Merck)
Hyclone注射用水-水质(Quality Water)(WFI-QW)
使用1摩的氢氧化钠在30毫升/分钟的流速状态下对60毫升床体积(bed volume)的Mustang Q色谱胶囊进行30分钟的清洗。之后，使用1摩的氯化钠在相同的时间以及相同的流速条件下对所述的胶囊进行预处理。使用2升的Mustang Q平衡缓冲液(10毫摩Tris，1摩硫酸铵，pH8)对所述胶囊进行平衡，所述缓冲液的流速为60毫升/分钟。对流出流(outletflow)进行检查，以确保其pH≤8。将来自于200升发酵过程PP3中的上清液(22升)(所述上清液经过了0.2微米的过滤)以540毫升/分钟的流速装载至所述胶囊之中(大约为40分钟的过程)。所述胶囊的最大推荐操作流速为600毫升/分钟。将过滤后的物质储存于2×10升的Stedim袋中，在2-8℃条件下过夜。
疏水作用色谱(20升规模的操作)
设备：
安装了Unicorn 5.01版本软件的AKTA Pilot(GE Healthcare)
Vantage S130柱(横截面积125平方厘米，Millipore)
传导率仪以及pH计4330(Jenway)
Sartopore 2 0.8+0.45微米过滤胶囊(Sartorius)
医用冷藏单元(Medical Refrigeration Unit)MP150(Electrolux)
化学试剂：
苯基琼脂糖6FF低取代(GE Healthcare)
氢氧化钠溶液(测定体积4M)(分析纯，BDH)
氯化钠(USP等级，Merck)
Tris(羟甲基)甲胺(USP等级，Merck)
硫酸铵(特纯级，Merck)
亮抑蛋白酶肽(MP生物制药有限公司)
Hyclone注射用水-水质(Quality Water)(WFI-QW)
疏水作用色谱柱的装载
将2400毫升的苯基琼脂糖6FF低取代(型号#312089)浆液静置沉淀3小时，除去乙醇，并且使用1800毫升的注射用水进行取代。对培养基进行重新匀浆(reslurried)(50％)，放置并且使用注射用水洗涤一次，再使用1800毫升200毫摩的氯化钠洗涤两次，在上述两次洗涤之间，经过了一夜的静置沉淀。使用1800毫升200毫摩的氯化钠对培养基进行重新匀浆，将其倒入柱内并且允许其静置沉淀1小时。将适配器(adaptor)降低至高于树脂床大约1厘米处(除去所有的空气气泡)，将所述培养基以400毫升/分钟的流速(192厘米/小时)装载至200毫摩的氯化钠中，装载时间为10分钟。这种装载流速与GMP中可利用的K-prime系统的最大操作流速是相等的。将适配器降低值床的顶部，并且以192厘米/小时的速度对柱进行10分钟的装载，之后将适配器拧进树脂的顶部，并且以192厘米/小时的速度再进行10分钟的装载，在这期间，没有观察到树脂的压缩。使用AKTA Pilot方法进行所述的装载测试：疏水作用色谱1500毫升装载测试。为了进行这一测试，使用1倍柱体积(CV)的存在于注射用水中的200毫摩氯化钠对所述的柱进行平衡，并且以313毫升/分钟(150厘米/小时)的流速使用15毫升(1％的柱体积)存在于注射用水中的1摩氯化钠进行装载测试。使用两倍柱体积(2CV)的注射用水对所述的柱进行冲洗，并且使用两倍柱体积的10毫摩氢氧化钠对其进行储存。被装载的柱具有1.2的不对称性，2659plates/meter的平板计数，1525毫升的柱体积以及12.2厘米的床高。
柱的清洗以及平衡
使用0.5摩的氢氧化钠对苯基琼脂糖6FF(低取代)柱进行60分钟的清洗，之后使用两倍柱体积(CV)的注射用水进行洗涤，使用五倍柱体积、10毫摩的Tris(疏水作用色谱缓冲剂B)对所述的柱进行平衡，之后使用五倍柱体积的10毫摩的Tris以及1.0摩的硫酸铵(疏水作用色谱缓冲剂A)对柱进行平衡，其中所述的Tris以及硫酸铵的pH为8。
疏水作用色谱装载物的制备
在经过Mustang Q处理之后(3.1节)，向22.1千克的发酵滤液中加入13.48千克(11.05升)的3.0摩的硫酸铵、10毫摩的Tris，其pH为8。将滤液进行5分钟的混合，之后使其通过一个0.05平方米的过滤胶囊(0.8+0.45微米)进行过滤。将滤过的物质(表示为疏水作用色谱装载物)储存于冰上(大约30分钟的过程)直至使用。
疏水作用色谱柱操作
在150厘米/小时的恒定线性流速条件下进行疏水作用色谱操作，使用冷冻的缓冲剂维持2-8℃的温度。将30升的给料液(feedstock)(等价于20升Mustang Q处理后的滤液)装载于1525毫升苯基琼脂糖6FF(低取代)柱中，其中所述的柱先前使用了两倍柱体积的10毫摩的Tris以及1.0摩的硫酸铵(疏水作用色谱缓冲剂A)进行了平衡，其中所述的Tris以及硫酸铵的pH为8。使用10倍柱体积的疏水作用色谱缓冲剂A将未结合的物质从柱中洗脱下来。之后，使用五倍柱体积的10毫摩的Tris以及0.3摩的硫酸铵(疏水作用色谱缓冲剂A2)对柱进行洗涤，并且使用10倍柱体积的10毫摩的Tris(疏水作用色谱缓冲剂B)对结合蛋白进行洗脱，其中所述的Tris以及硫酸铵的pH为8。弃去第一个0.67倍柱体积(1升)的洗脱缓冲剂，并且收集四倍柱体积的疏水作用色谱处理后的收集物。向所述的疏水作用色谱处理后的收集物中(6191.3克)加入亮抑蛋白酶肽(126.4毫升)，至最终浓度达到200微摩，其中所述的亮抑蛋白酶肽来自于由10毫摩的亮抑蛋白酶肽、10毫摩的Tris构成的pH为8的储备溶液。将混合后的溶液(6.3千克)在2-8℃下储存两天，之后使用正切流动过滤对其进行进一步的处理。
正切流动过滤步骤1(TFF1 20升规模的操作)
设备：
ProFlux M12正切流动过滤系统(Millipore)
传导率仪以及pH计4330(Jenway)
Sartopore 2 0.8+0.45微米过滤胶囊(Sartorius)
Pellicon 2“迷你”过滤器带0.1平方米30kDa截留分子量PES(聚醚砜)膜(Millipore)
医用冷藏单元MP150(Electrolux)
原料/化学试剂：
氢氧化钠溶液(测定体积4M)(分析纯，BDH)
Tris(羟甲基)甲胺(USP等级，Merck)
亮抑蛋白酶肽(MP生物制药有限公司)
Hyclone注射用水-水质(Quality Water)(WFI-QW)
系统的建立
根据制造商的说明书，使用两个带有0.1平方米30kDa截留分子量PES(聚醚砜)膜的Pellicon 2“迷你”过滤器建立ProFlux M12正切流动过滤系统，使用0.5摩的氢氧化钠进行60分钟的清洗，并且储存于0.1摩的氢氧化钠中直至使用。将所述系统的水排干，并且使用14升注射用水对其进行冲洗，在25℃、23升/平方米/小时/psi、透膜压力(TMP)为15psig(20psig的入口压力以及10psig的出口压力)的条件下测量正常水渗透性(NWP)。使用0.5升pH为8的10毫摩的Tris(渗滤缓冲剂)对上述系统进行冲洗，并且使用1升相同的缓冲剂进行10分钟的平衡。对渗透物的传导率以及pH进行测定，并且使用渗滤缓冲剂的传导率以及pH对其进行检查，以确保所述的膜在使用之前是平衡的。
浓缩以及渗滤
使用含有200微摩亮抑蛋白酶肽的冷冻的渗滤缓冲剂(10毫摩的Tris，pH为8)进行所述的浓缩以及渗滤步骤。在使用之前，利用1升冷冻的缓冲剂对正切流动过滤系统进行冲洗。将2升的经过疏水作用色谱处理后的物质(总体积6.3升)泵入正切流动过滤系统的反应池中，并且在不存在背压的条件下进行10分钟的再流通，使膜得到适应。将反应池上的水平传感器设定为1.2升，并且在15psig的透膜压力(TMP)条件下(20psig的入口压力以及10psig的出口压力)对经过疏水作用色谱处理后的物质进行浓缩，直至所有的物质都进入到系统当中。收集渗透物，并且将其储存于2-8℃下，用于进行分析。将进口管与渗滤缓冲剂相连接，并且在15psig的透膜压力(TMP)条件下(20psig的入口压力以及10psig的出口压力)完成对原料的渗滤，所述的渗滤具有大约8.5的翻转体积(TOV)，将反应池中的物质的体积保持在1.2升。经过5倍翻转体积、7倍翻转体积以及8.5倍的翻转体积后，测定渗透物的传导率以及pH，并且使用渗滤缓冲剂的传导率以及pH对其进行检查。将截留物从所述系统中排出，并且储存于2-8℃下。将250毫升的渗滤缓冲剂泵入上述反应池中，在不存在背压的条件下在所述系统中进行10分钟的再循环，用来对系统进行漂洗，排干，重复漂洗过程，并且将两次漂洗物分别储存于2-8℃下。对截留物以及漂洗物中的蛋白浓度进行测定(通过紫外光)，并且将第一次漂洗物(204.8克重量)加入到截留物中(1231.4克重量)。之后，对这一经过正切流动过滤步骤1处理后的物质(1.4千克)进行过滤，使其通过一个Sartopore 20.8+0.45微米过滤胶囊，并且将其储存于2-8℃下过夜，直至使用季胺琼脂糖离子交换对其进行进一步的处理。
离子交换色谱(20升规模的操作)
设备：
安装了Unicorn 5.01版本软件的AKTA Pilot(GE Healthcare)
传导率仪以及pH计4330(Jenway)
Vantage S90柱(横截面积62平方厘米，Millipore)
医用冷藏单元MP150(Electrolux)
化学试剂：
氢氧化钠溶液(测定体积4M)(分析纯，BDH)
氯化钠(USP等级，Merck)
Tris(羟甲基)甲胺(USP等级，Merck)
二水合氯化钙(USP等级，Merck)
亮抑蛋白酶肽(MP生物制药有限公司)
季胺琼脂糖高效液相色谱(GE Healthcare)
Hyclone注射用水-水质(Quality Water)(WFI-QW)
柱的装载以及制备
通过AKTA Pilot色谱系统，使用存在于注射用水中的季胺琼脂糖高效液相色谱培养基对Vantage S90柱进行装载，使装载后的柱具有10厘米的床高，因此具有620毫升的柱体积(CV)。依照制造商的说明书进行所述的装载，但使用使Vantage柱重叠(imposed)的压力极限(0.3兆帕)，这等价于使用210厘米/小时的流速以及0.28兆帕的压力极限。在装柱之后，使用两倍柱体积的0.2摩的氯化钠对所述的柱进行平衡，并且使用1％柱体积(6.2毫升)的1摩的氯化钠在100厘米/小时(103毫升/分钟)的流速条件下对装载的柱进行测试。装载后的柱具有1.6的不对称性，以及12605plates/meter的平板计数，上述数值在培养基的规范范围内(不对称性在0.8至1.8的范围内，且平板计数>10000)。将所述的柱储存于10毫摩的氢氧化钠中，直至使用。
在使用之前，先使用1.5倍柱体积(CV)的注射用水对季胺琼脂糖柱进行洗涤，以除去储备缓冲液，使用0.5摩的氢氧化钠在40厘米/小时的条件下进行60分钟的清洗，之后使用1.5倍柱体积的注射用水再次进行冲洗。之后，进行装柱，并且依照制造商的说明书使用两倍柱体积的10毫摩的Tris、3毫摩的氯化钙进行平衡，随后使用两倍柱体积的10毫摩的Tris、3毫摩的氯化钙、360毫摩的氯化钠进行平衡，最后使用五倍柱体积的10毫摩的Tris、3毫摩的氯化钙进行平衡，其中所使用的Tris、氯化钙、氯化钠的pH为8。
柱运行(column run)
在将样本装载于柱中之前，快速使用冷冻的10毫摩的Tris、3毫摩的氯化钙以及200微摩的亮抑蛋白酶肽(阴离子交换色谱缓冲剂A)对柱进行重新平衡，其中所述的Tris、氯化钙以及亮抑蛋白酶肽的pH为8。将1216毫升冷冻的、经过正切流动过滤步骤1处理的物质以2.55毫克/毫升的浓度(由紫外光测定)装载于柱中，其中流速为100厘米/小时(103毫升/分钟)。这等价于每毫升培养基中5毫克蛋白质总量的柱装载量。进行产物的装载之后，使用三倍柱体积(CV)的阴离子交换色谱(IEX)缓冲剂A对柱进行洗涤，并且在0-40％梯度的洗脱缓冲剂(A或者B)的存在下，使用10毫摩的Tris、3毫摩的氯化钙、360毫摩的氯化钠、200微摩的亮抑蛋白酶肽(阴离子交换色谱缓冲剂B)对蛋白进行洗脱，其中所述的Tris、氯化钙、氯化钠以及亮抑蛋白酶肽的pH为8，且体积为超过20倍的柱体积，流速为70.2毫升/分钟(68厘米/小时)。在280纳米处以及260纳米处对洗脱物进行监测，并且在含有AUX II以及AUX II的两个产物峰处收集到100毫升的馏分。馏分的收集开始于峰的临界点处(breakthrough)，并且持续至后缘(trailing edge)上25％的峰高处。从AUX II峰中收集到共计12个馏分，从AUX I峰中收集到共计15个馏分。在18-23℃的标准实验室温度下进行季胺琼脂糖高效液相色谱分析，尽管所使用到的缓冲剂是预先冷却的。将馏分储存在2-8℃下，直至通过SDS PAGE分析获得一个结果。收集馏分6至馏分12(峰1)，作为AUX II胶原酶，其体积被测定为683克(在取样之后)，并且通过紫外光分析测定的浓度为1.17毫克/毫升。收集馏分19至馏分26(峰2)，作为AUX I胶原酶，其体积被测定为796克(在取样之后)，并且通过紫外光分析测定的浓度为1.08毫克/毫升。
正切流动过滤步骤2(TFF 2 20升规模的操作)
设备：
ProFlux M12正切流动过滤系统(Millipore)
传导率仪以及pH计4330(Jenway)
Pellicon 2“迷你”过滤器带0.1平方米30kDa截留分子量PES(聚醚砜)膜(Millipore)
90毫米过滤单元(1升)带0.2微米PES(聚醚砜)膜(Nalgene)
医用冷藏单元(Medical Refrigeration Unit)MP150(Electrolux)
原料/化学试剂：
氢氧化钠溶液(测定体积4M)(分析纯，BDH)
Tris(羟甲基)甲胺(USP等级，Merck)
蔗糖(BP等级，Merck)
亮抑蛋白酶肽(MP生物制药有限公司)
Hyclone注射用水-水质(Quality Water)(WFI-QW)
Frensius Kabi注射用水(WFI)
系统的建立
根据制造商的说明书，使用一个带有30kDa截留分子量PES(聚醚砜)膜的Pellicon2“迷你”过滤器建立ProFlux M12正切流动过滤系统，使用0.5摩的氢氧化钠进行60分钟的清洗，并且储存于0.1摩的氢氧化钠中直至使用。将所述系统的水排干，并且使用14升注射用水对其进行冲洗，并且在25℃以及15psig的透膜压力(TMP)(20psig的入口压力以及10psig的出口压力)的条件下，以19.5升/平方米/小时/psi的参数针对AUX I所使用的膜测量其正常水渗透性(NWP)，以14.5升/平方米/小时/psi的参数针对AUX I所使用的膜测量其正常水渗透性(NWP)。使用0.5升10毫摩的Tris、60毫摩的蔗糖(配制缓冲剂)对上述系统进行冲洗，其中所述的Tris以及蔗糖的pH为8，并且使用1升相同的缓冲剂进行10分钟的平衡。对渗透物的传导率以及pH进行测定，并且使用配制缓冲剂的传导率以及pH对其进行检查。
浓缩以及配制
分别对经阴离子交换色谱处理后的AUX I收集物以及AUX II收集物进行浓缩以及渗滤步骤。所有的步骤都使用冷冻的配制缓冲剂(10毫摩的Tris，60毫摩的蔗糖，pH为8)，保持温度在2-8℃。在使用之前，先利用1升冷冻的缓冲剂对所述正切流动过滤系统进行冲洗。将经过阴离子交换色谱处理后的收集物(683克重量的AUX II以及796克重量的AUX II)泵入所述的正切流动过滤系统反应池中，在不存在背压的情况下以10％的泵速进行10分钟的再流通，使膜得到适应。将所述反应池上的水平传感器设置为大约400毫升，并且在15psig的透膜压力下(20psig的入口压力以及10psig的出口压力)对得到的AUX I收集物以及AUXII收集物进行浓缩，直至反应池中的体积被减少至大约360-390毫升(此时假定系统的滞留体积为100毫升)。上述目标体积减少量的依据是：假定不发生蛋白的损失，在浓缩操作过程中达到1.75毫克/毫升的产物理论浓度。收集渗透物，并且将其储存于2-8℃下，用于进行分析。在渗滤操作中，将进口管与配制缓冲剂相连接，并且在15psig的透膜压力(20psig的入口压力以及10psig的出口压力)条件下完成渗滤。对于AUX II进行大约12倍的翻转体积(TOV)，而针对AUX I进行大约8.5倍的翻转体积(TOV)，保持反应池中的物质的体积在大约400毫升。对于AUX II而言，在12倍的翻转体积之后测定渗透物的传导率以及pH，而对于AUXI而言，在6倍的翻转体积、7倍的翻转体积以及8.5倍的翻转体积之后测定渗透物的传导率以及pH，并且使用所述配制缓冲剂的传导率以及pH对其进行检查。将系统中的截留物排出，并且将所述截留物储存于2-8℃下。
使用250毫升的配制缓冲剂从膜中洗涤残留产物，将所述的缓冲剂在系统中进行10分钟的再循环(不存在背压)。排出漂洗溶液之后，再进行一次洗涤，并且将漂洗物1以及漂洗物2一同储存于2-8℃下。对截留物以及漂洗物进行紫外光蛋白含量测定之后，向所述的截留物中加入第一次漂洗物，混合并且对得到的混合物进行紫外光蛋白浓度的测定。对于AUX II而言，将122克第二次漂洗物也加入到截留物与漂洗物1中，得到1.1毫克/毫升的理论AUX II浓度。对于AUX I而言，将94克的第二次漂洗物加入到上述物质当中，得到1.1毫克/毫升的理论AUX I浓度。将AUX I物质以及AUX II物质都经过一个1升的II类Nalgene0.2微米过滤单元进行过滤，并且测定滤过的蛋白浓度。将AUX I中间产物以及AUX II中间产物储存于2-8℃下。
蛋白浓度的测定
吸光率
设备：
DU 800分光光度计(Beckman)
使用紫外光分光光度计对方法中的样本进行分析，其中在220纳米至330纳米的范围内对样本进行紫外光扫描。将适当的缓冲剂作为空白，并且在扫描样本之前先进行对缓冲空白组的扫描。如果需要，使用相同的缓冲剂对样本进行稀释，以确保A280<1.0AU。根据比尔朗伯定律(Beer-Lambert law)c＝A/b.ε确定蛋白浓度(毫克/毫升)，其中A是吸光率(A280-A330)，b是光程长度(1.0厘米)，而ε是蛋白的消光系数。所使用到的AUX I的消光系数是1.48毫升/毫克/厘米，AUX II的消光系数是1.576毫升/毫克/厘米，而AUX I/AUX II混合物的消光系数是1.428毫升/毫克/厘米。
考马斯亮蓝法检测(Bradford Assay)
材料：
冻干的BSA(牛血清白蛋白)(水解至1.4毫克/毫升)
化学试剂：
蛋白检测染料试剂浓缩物(500-0006，Bio-Rad)
通过用水将牛血清白蛋白稀释至已知浓度，来制备牛血清白蛋白标准曲线。通过使用四份的水稀释一份的浓缩物，来制备Bio-Rad蛋白检测染料试剂。通过加水稀释来制备测试样本。将50微升或纯或稀释的测试样本加入到试管中，并且加入2.5毫升的稀释剂。一式两份的准备样本。将样本进行10分钟的培养，之后读取OD值(光学密度)。通过测量已知浓度的牛血清白蛋白溶液在595纳米处的光学密度(OD595nm)，从而得到OD595nm与蛋白浓度间的标准曲线。之后，对测试样本进行分析，并且从所述的标准蛋白检测曲线中确定蛋白浓度。为了使色素产生的作用标准化，对经过Mustang Q步骤处理后的样本进行分析时从不对样本进行稀释。在这种情况中，在所述的检测中利用的是50微升未经稀释的经过Mustang Q处理的物质。
SDS-PAGE分析
设备：
Xcell SureLock小细胞电泳系统(Invitrogen)
电泳仪电源EPS 601(Amersham制药生物科技)
Rocky振动平台(shaker platform)(科学实验室提供)
化学试剂：
SDS-PAGE标准高分子量(161-0303，Bio Rad)
Mark 12(标记为12的)未染色标准(LC5677，Invitrogen)
Novex 8％Tris-甘氨酸凝胶，1.5毫米，10孔(EC6018BOX，Invitrogen)
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶，1.0毫米，12孔(NP0322BOX，Invitrogen)
Novex Tris-甘氨酸SDS(十二烷基磺酸钠)操作缓冲液(10x)(LC2675，Invitrogen)
NuPAGE MES SDS操作缓冲液(20x)(NP0002，Invitrogen)
Novex Tris-甘氨酸SDS(十二烷基磺酸钠)样本缓冲液(2x)(LC2676，Invitrogen)
NuPAGE LDS样本缓冲液(4x)(NP0007，Invitrogen)
NuPAGE样本还原剂(10x)(NP0009，Invitrogen)
胶体蓝染色试剂盒(LC6025，Invitrogen)
分析纯级乙二胺四乙酸二钠(BDH)
Tris-甘氨酸凝胶
将12微升的样本加入到20微升的样本缓冲液(2x)、4微升的还原剂(10x)以及4微升0.1摩的乙二胺四乙酸(EDTA)中(达到10毫摩的最终浓度)，用来制备用于进行还原SDS-PAGE分析的样本。将10微升的浓缩储备液(stock)加入到80微升的还原剂(10x)、310微升的注射用水以及400微升的样本缓冲液(2x)中，以制备高分子量(HMW)标记物。随后，将稀释过的高分子量标准加热至95℃下保持5分钟，之后进行等分并且储存于-20℃下，以便在随后的凝胶中进行使用。使用Tris-甘氨酸操作缓冲液，在130伏条件下将含有胶原酶的样本(20微升的装载体积)直接(即，不经过预先的热处理)在8％的Tris-甘氨酸凝胶中进行电泳操作，操作时间为大约2小时。电泳之后，按照制造商的说明书，使用胶体蓝染色试剂对得到的凝胶进行染色。
Bis-Tris凝胶
将16.5微升的样本加入到7.5微升的样本缓冲液(4x)、3微升的还原剂(10x)以及3微升0.1摩的乙二胺四乙酸(EDTA)中(达到10毫摩的最终浓度)，用来制备用于进行还原SDS-PAGE分析的样本。整齐的装入标记为12(Mark 12)的标记物(10微升)。使用MES操作缓冲液在200伏的条件下将含有胶原酶的样本(15微升的装载体积)直接(即，不经过预先的热处理)在4-12％的Bis-Tris凝胶中进行电泳操作，操作时间为大约40分钟。电泳之后，可以按照制造商的说明书使用胶体蓝染色试剂对得到的凝胶进行染色，或者使用标准的程序进行银染色(GE Healthcare)。
对经过阴离子交换色谱处理后的馏分进行的密度计量分析
设备：
Xcell SureLock小细胞电泳系统(Invitrogen)
电泳仪电源EPS 601(Amersham制药生物科技)
Rocky振动平台(shaker platform)(科学实验室提供)，平板扫描仪(HewlettPackard)
材料/化学试剂：
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶，1.0毫米，12孔(NP0322BOX，Invitrogen)
NuPAGE MES SDS操作缓冲液(20x)(NP0002，Invitrogen)
NuPAGE LDS样本缓冲液(4x)(NP0007，Invitrogen)
NuPAGE样本还原剂(10x)(NP0009，Invitrogen)
Mark 12(标记为12的)未染色标准(LC5677，Invitrogen)
胶体蓝染色试剂盒(LC6025，Invitrogen)
分析纯级乙二胺四乙酸二钠(BDH)
纯水
还原SDS-PAGE
使用MES操作缓冲液，使经过阴离子交换色谱处理的样本在4-12％的Bis-Tris凝胶中进行电泳，其装载量为1微克/带。将20微升稀释过的经过阴离子交换色谱处理后的物质加入到8微升的样本缓冲液(4x)、3微升的还原剂(10x)以及3.4微升0.1摩的乙二胺四乙酸(EDTA)中，从而制备出样本。在经过混合之后，将15微升的每种样本直接加入到孔中(即，不经过热处理)，并且在200伏的条件下运行40分钟。经过电泳之后，按照制造商的说明书使用胶体蓝染色试剂对得到的凝胶进行染色，但使用固定的染色时间段，以减少染色的变化(固定10分钟，染色5小时，使用纯水退色15-20小时)。
凝胶扫描以及密度计量分析
将凝胶置于两片醋酸板之间，以确保除去了所有的空气气泡，以600dpi的分辨率在平板扫描仪中进行扫描，并且使用HP Image zone软件(惠普照片和图像处理软件)对图像进行裁切、调整大小以及修正颜色。使用Alpha EaseFC软件将所述的图像转换成8-bit的灰度TIFF图像，并且使用QuantityOne凝胶文件软件(BioRad)对蛋白带进行分析。在进行了背景替换之后，将选取的带的峰强度面积转化为每条带中的产物(AUX或者AUX II)以及杂质的相对百分含量值。
缓冲液稳定性
设备：
蠕动泵(Watson Marlow)
125毫升PETG(共聚酯)生物容器(biotainers)(Cellon)
用于蠕动泵中的Watson Marlow管
传导率仪以及pH计4330(Jenway)
Sartopore 2 300(0.45/0.2微米)过滤胶囊(Sartorius)
制备用于20升验证操作的缓冲液，随后将其通过一个0.45/0.2微米的过滤胶囊进行过滤，并且使其流入10升或者20升的Stedim袋中，在使用之前保存于2-8℃下。
当大部分的缓冲液已经滤过时，将大约75毫升的剩余缓冲液收集至预先标记过的125毫升的PETG(共聚酯)生物容器中，并且储存于2-8℃下。记录缓冲液制备物的pH、传导率、温度以及日期。在完成了20升的验证操作之后，将缓冲液样本从冷冻储存的状态中取回，并且重新测试其pH、传导率、以及外观。同时对测试时所述缓冲液的温度进行记录。
用于进行N-末端测序分析的样本的制备
设备：
电泳仪电源EPS 601(Amersham制药生物科技)
Xcell SureLock小细胞电泳系统(Invitrogen)
Rocky振动平台(shaker platform)(科学实验室提供)
化学试剂：
Novex 8％Tris-甘氨酸凝胶，1.5毫米，10孔(Invitrogen)
高分子量标记物(BioRad)
NuPAGE样本还原剂(10x)(Invitrogen)
Novex Tris-甘氨酸SDS(十二烷基磺酸钠)操作缓冲液(10x)(Invitrogen)
Novex Tris-甘氨酸SDS(十二烷基磺酸钠)样本缓冲液(2x)(Invitrogen)
胶体蓝染色试剂盒(LC6025，Invitrogen)
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(分析纯级，BDH)
甲醇，分析纯级(BDH)
乙酸，分析纯级(BDH)
注射用水(WFI)
纯水
制备用于进行N-末端测序的样本，并且按照先前概述的方法使用8％的Tris-甘氨酸凝胶进行分离。将被鉴定为富含40kDa污染物的样本(来自于经过阴离子交换色谱处理后得到的AUX II峰的馏分2，CTL2006#0610H；)以及被鉴定为富含55kDa污染物的样本(来自于经过阴离子交换色谱处理后得到的AUX I峰的馏分16，CTL2006#0611H；)分别装载于凝胶的5条带上，从而为测序提供足够的原料(附图89)。来自于先前所述的20升发酵过程(20升PP3)中的经过阴离子交换色谱处理后得到的馏分也被装载于多条带中(附图90)，其中所述的馏分富含与AUX I(馏分B7 R2，CTL2006#0581P)以及AUX II(馏分D1，CTL2006#0582P)相关联的90kDa污染物。在进行电泳之后，按照制造商的说明书使用胶体蓝染色试剂对得到的凝胶进行染色，并且将污染物带切离并送至Alta生物科学中心(伯明翰大学，英国)进行N-末端的测序。来自于20升验证操作中的与AUX I相关联的90kDa污染物(CTL2006#0612H)也被送至进行测序，但未获得数据。
方法3的制造业的概述
发酵过程
由于在植物蛋白胨的批次与批次之间存在的差异性，使得通过溶组织梭状芽孢杆菌生产胶原酶的植物蛋白胨补料分批发酵方法(方法2)表现出高度的变化性。由于这一原因，在5升的发酵过程中对朊间质蛋白胨#3(PP3)进行了评估。上述的评估证明，当以50克/升的水平使用一个特定批次的PP3时，所述的发酵方法是稳健的以及可再现的。然而，当使用50克/升其他批次的PP3时，在上述培养所产生的生长曲线中可以观察到大的差异。在一个小规模的评估中，对各个批次的PP3能够支持的最大生物量浓度进行了评价。根据它们各自所支持的溶组织梭状芽孢杆菌的高生物量浓度或者低生物量浓度，将这些批次认定为“好的”或者“差的”。当以100克/升的水平利用“差的”批次的PP3以及“好的”批次的PP3进行两个5升规模的发酵过程时，两个过程都表现出了高度相似的生长曲线以及产物产量。这项试验表明，将PP3的浓度增加至100克/升缓解了蛋白胨的批次与批次之间存在的差异的问题。
以200升的规模进行一次扩大的发酵过程。所述的发酵过程使用PP3的优化浓度(100克/升)。上述发酵过程是成功的，并且复制了在5升规模中观察到的生长曲线以及产物产量/质量。在所述的200升规模扩大的发酵过程中，对方法2中使用的收集方法(过滤澄清)进行了评价。使用现有的方法成功的对细胞培养物进行了澄清，没有发生对过滤器的阻滞。
通过对考马斯染色的Tris甘氨酸凝胶进行的密度计量分析，使得对粗发酵样本中的胶原酶浓度的量化得到了改进。使用发酵样本的稀释液装载AUX I与AUX II混合物的标准曲线。在上述样本稀释液的范围之内，胶原酶浓度与密度峰面积之间表现出线性关系。随后，利用样本的峰面积以及标准曲线推断出样本中的胶原酶浓度。这种方法估算出的胶原酶的产量为280毫克/升至350毫克/升，其中所述的发酵过程为5升规模以及200升规模，且使用100克/升的PP3。
与植物蛋白胨补料分批方法相比，上述经过优化的PP3发酵方法生成了更高的生物量浓度(OD600 7单位)以及增加了的产物产量(280毫克/升-350毫克/升胶原酶总量，通过量化密度计量分析测得)。与使用植物蛋白胨的方法相比，得到的发酵滤液含有明显减少的梭菌蛋白酶。与对方法2进行的评价中观察到的相比，其AUX I：AUX II的比例更加接近1。总之，上述PP3方法增加了产物的产量、纯度(发酵之后)以及发酵过程的可再现性。
纯化过程
为了对先前在Cobra(方法2)中使用到的方法进行改进并且在GMP中进行20升规模的生产，在一段加速的时间期限内对方法3进行改善。对该方法进行的主要改进是为了简化其纯化步骤，提高稳健性以及使该方法更容易进行修正以适应200升的规模扩大。这些改进对于减少方法差异也起到关键作用。
使用来自于溶组织梭状芽孢杆菌的200升发酵过程的物质来实施方法3，其中对所述全部的20升发酵液进行了纯化。直接对来自于发酵过程中的物质进行处理，不进行保持的步骤(hold steps)。在过滤之后，使产物通过一个Mustang Q过滤器，因为在小规模的试验中证明了使用这一步骤会减少双链DNA(通过pico green分析进行的检测)。然而，对来自于20升验证过程中的样本进行的分析显示没有发生双链DNA的减少，这表明其稳健性以及这一步骤的应用还需要进行进一步的调查。对所述的20升的连续操作以及先前的小规模试验中使用到的参数进行的比较证明，当使用1000的因素扩大胶囊的尺寸时，双链DNA被除去(基于制造商所描述的15-25毫克DNA/毫升的DNA结合能力的胶囊)。在上述比较中，使用大约177-296的因素对20升连续操作中使用到的胶囊的尺寸进行扩大。将从Mustang Q胶囊中获得的物质在2-8℃下保持过夜。对取自该方法的这一阶段中的样本物质进行的间接(off-line)稳定性研究表明，在该方法的这个时间点处，低温是产物稳定性的关键，因为正如SDS-PAGE分析所示，在室温下以及在37℃下培养的样本容易发生分解。
对从Mustang Q胶囊中获得的产物进行准备，以用于疏水作用色谱(HIC)，所述的准备是将其加入并且混合至硫酸铵溶液(3摩)中，达到1摩的最终浓度。这提供了适于胶原酶与苯基琼脂糖FF(低取代)培养基发生结合的条件。之后，使用一个0.3摩硫酸铵的洗脱步骤，以及随后使用不含硫酸铵的溶液对胶原酶产物的洗脱步骤，使得一部分蛋白污染物以及色素从疏水作用色谱柱中洗脱出来。将四倍柱体积的固定体积确立为产物峰的收集标准(尽管在随后的200升规模的验证操作中将这一参数扩大至五倍柱体积)。在洗脱之后立即加入亮抑蛋白酶肽，并且将得到的物质在2-8℃下放置2天时间。由于给料(feedstock)的复杂性质，使得难以对这一步骤的产量进行准确的测定。上述方法的步骤产量被估算为(i)38％，基于对装载物的考马斯亮蓝法分析以及对被洗脱物质的紫外光分析，或者(ii)47％，基于使用密度计量分析对装载物中胶原酶含量的估算以及对被洗脱物质的紫外光分析。或者，从疏水作用色谱柱中洗脱的蛋白质总量为0.17克，等价于每1升发酵滤液的应用。
对经过疏水作用色谱处理后的收集物进行季胺-琼脂糖纯化步骤的准备，所述的准备是对其进行浓度(5倍)并且使用带有2×0.1平方米的30kDa的膜的正切流动过滤(TFF1)进行缓冲交换。经过这一步骤后没有检测到损失，并且所报道出的蛋白回收量的增加能反映出在该方法的这一时间点处紫外光分析的错误。这种错误可能归因于色素污染物或者针对胶原酶所使用的消光系数，当可能存在蛋白复合物时，所述的早期纯化过程中的物质的消光系数将不会那么准确。通过产物的过滤步骤来完成正切流动过滤步骤，之后将得到的物质在2-8℃下保持过夜。
与方法2相同，季胺-琼脂糖柱是方法3中的一个关键的纯化步骤，其导致了AUX I胶原酶与AUX II胶原酶的分离。然而，与方法3相关联的污染物与方法2中的那些污染物不同，它们似乎与AUX I以及AUX II产物紧密的进行共同纯化。但是，通过产物峰的分馏从产物中去除污染物是可能的，因为上述污染物似乎可以从两个峰的前沿或者后缘中被洗脱出来。使用上述污染物在还原SDS-PAGE凝胶中的相对分子量来表示这些污染物。那些与AUXII产物(从季胺-琼脂糖柱中首先被洗脱出来的峰)相关联的污染物被识别为(i)40kDa(与峰的前沿相关联)以及(ii)75kDa和90kDa(与峰的后缘相关联)。N-末端氨基酸测序表明所述的40kDa是与AUX II相关的，因为其序列与Col H序列的区域具有同一性匹配。通过比较，因为低信号的原因，没有确定90kDa污染物具有同一性。那些与AUX I产物(从季胺-琼脂糖柱中第二个被洗脱出来的峰)相关联的污染物被识别为(i)55kDa(与峰的前沿相关联)以及(ii)90kDa(与峰的后缘相关联)。N-末端测序表明所述的55kDa污染物以及90kDa污染物均被识别为与AUX I相关，其中所述的55kDa污染物与Col G序列的中间区域表现出序列同一性，而所述的90kDa污染物表现出与AUX I相匹配的相同的N-末端。因此，在该方法的这一步骤中识别出的主要杂质都是与产物相关的，并且它们或者为AUX I(55kDa)以及AUX II(40kDa)的内在分裂产物，或者为AUX I的C-末端分裂产物(90kDa)。
在季胺-琼脂糖柱之后，一个关键的处理步骤在于决定哪些馏分应当继续进行进一步的纯化。对于20升的验证操作而言，这一标准是基于污染物的相对染色亮度而言的，所述的相对染色亮度是相对于产物的染色亮度，且使用的是4-12％的SDS-PAGE分析，且使用胶体蓝染料进行的染色。这种决定是主观的，并且以方法改进工作组的收集经验以及委托人的要求为根据。为了建立用于描述收集步骤的确定的标准，对SDS PAGE进行密度计量分析。通过这项分析，将所述的收集描述为：对于AUX I而言，包括那些纯度≥87％的馏分(且不含有≥10％的单一杂质)，而对于AUX II而言，包括那些纯度≥94％的馏分(且不含有≥4％的单一杂质)。这分别导致了27.7％的AUX I的步骤产量以及25.8％的AUX II的步骤产量，其中所述的数值是根据紫外光分析估算得到的。利用从200升规模的验证操作中获得的数据对所述的密度计量方法进行了进一步的精致以及标准化处理，这确定了用于随后的GMP操作中的经过改进的标准。
分别使用正切流动过滤(表示为TFF2)对来自于季胺-琼脂糖柱中的含有AUX I产物或者AUX II产物的馏分进行了配制，其中针对每种胶原酶使用的是1×0.1平方米的30kDa的膜。由10毫摩Tris、60毫摩蔗糖组成的pH为8的配制缓冲液由KBI生物制药公司制备。在经过正切流动过滤步骤2(TFF2)之后，对产物进行过滤，正切流动过滤以及过滤步骤达到的总体步骤产量被估算为：AUX I为97.5％而AUX II为92.2％。在这一阶段，样本指的是中间产物，并且在将其混合成药用物质之前，将中间产物保持在2-8℃下以进行QC(质量控制)分析。回顾性的稳定性研究表明，在2-8℃下，所述中间产物在至少5天的时期内可以保持稳定，所述的结果是由SDS-PAGE分析、紫外光分析、反相高效液相色谱分析以及尺寸排阻高效液相色谱分析来确定的。唯一检测到的中间产物的恶化被认为是AUX II中间产物在经过12天的保持后发生的，其中聚集物的水平由0增加至0.62％。
以相等的比例(由紫外光测定)混合AUX I中间产物以及AUX II中间产物以生成药用物质，之后进行最终产物的过滤。仅制备得到400毫克的药用物质，将其中的200毫克与25毫克每种胶原酶一同运送至KBI生物制药公司。为20升的验证操作估算总体产量，其中对来自于所述20升发酵给料过程的全部可利用的物质进行了处理，并且假定将所有的物质进行了混合作为药用物质。所述20升规模的纯化过程得到的预测产量为1.6克药用物质。如果假定对于可以获得的装载至疏水作用色谱柱中的蛋白质总量的估算值9克(使用考马斯亮蓝检测)是准确的，则可以换算出17.8％的方法回收率。或者，如果全部可以获得的蛋白与疏水作用色谱装载物中的胶原酶含量相关(由密度计量法所估算)，则计算出的该方法的全部产量为22％。
除了连续的操作方法，对取自上述方法中的样本以及缓冲保留物进行某些预先的研究，以评价稳定性。这些数据表明，对于产物而言，低温是控制分解的一个关键因素，并且取自纯化前期(在季胺-琼脂糖柱之前)的样本更容易发生蛋白酶的水解。然而，一项产物保持研究(hold study)显示，对亮抑蛋白酶肽以及温度控制(2-8℃)的结合在GMP方法所预期的整个时间过程内保持产物质量的方面是成功的。
表54以及表55详细记载了AUX-I以及AUX-II中间产物以及方法3中的药用物质的分析性规范。
表54：方法3中的AUX-I中间产物以及AUX-II中间产物的分析性规范
*上述检测需要用于进一步生产的中间产物进行临时的释放
表55：方法3中的药用物质的分析性规范
*上述检测需要用于进一步生产的中间产物进行临时的释放
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虽然本发明通过优选的实施方式进行了具体的展示以及描述，但本领域技术人员应当理解，在不背离后附的权利要求所围绕的保护范围的情况下，可以在形式以及细节上进行各种改变。
Claims (35)
1.一种药物产品，其包括作为唯一活性成分分离和纯化的胶原酶I以及胶原酶II，所述的胶原酶I以及胶原酶II分别具有溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I以及胶原酶II的序列，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述的药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
2.根据权利要求1所述的药物产品，其中通过反相高效液相色谱确定所述的药物产品含有少于约2％面积的聚集蛋白。
3.根据权利要求1所述的药物产品，其中所述的药物产品含有少于1cfu/毫升的生物计数，且其中所述的药物产品是无菌的。
4.根据权利要求1所述的药物产品，进一步包括药物可接受性载体或赋形剂，其选自由以下组成的组：糖；淀粉；纤维素及其衍生物；黄芪胶粉末；麦芽；明胶；滑石；乙二醇；丙烯乙二醇；酯类；油酸乙酯；月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；罗格氏溶液；乙醇；磷酸缓冲溶液；十二烷基硫酸钠；硬脂酸镁；着色剂；释放剂；涂覆剂；芳香剂；防腐剂；抗氧化剂；及前述任意组成。
5.一种药物产品，其包括作为唯一活性成分分离和纯化的胶原酶I以及胶原酶II，所述的胶原酶I和胶原酶II分别具有溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I以及胶原酶II的序列，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述的药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽，所述药物产品的制备方法包括如下步骤：
a)对溶组织梭状芽孢杆菌进行发酵；
b)收集包括胶原酶I以及胶原酶II的粗发酵液；
c)通过过滤以及柱层析从所述的粗收集物中纯化胶原酶I以及胶原酶II，其包括如下步骤：
i)通过阴离子交换过滤器对所述粗收集物进行过滤；
ii)加入硫酸铵；
iii)使所述粗收集物经过HIC柱；
iv)向所述滤液中加入亮抑蛋白酶肽；
v)移除所述的硫酸铵；
vi)过滤步骤v)的混合物；和
vii)使用离子交换分离所述的胶原酶I和胶原酶II；
d)以大约1：1的比例混合从步骤(c)中纯化得到的胶原酶I以及胶原酶II。
6.根据权利要求5所述的药物产品，其中胶原酶I和胶原酶II均通过反相高效液相色谱确定具有至少96％面积的纯度。
7.根据权利要求5所述的药物产品，其中所述药物产品的制备进一步包括在植物蛋白胨或者蔬菜蛋白胨的存在下进行主细胞库的制备的步骤。
8.根据权利要求5所述的药物产品，其中所述的发酵步骤包括下述步骤：
(i)在第一阶段将溶组织梭状芽孢杆菌接种至培养基中，并且对得到的混合液进行搅拌；
(ii)对来自于步骤(i)的混合液进行培养，从而获得一个等份溶液；
(iii)在第二阶段将来自于步骤(ii)中的等份溶液接种至培养基中，并且对得到的混合液进行搅拌；
(iv)对来自于步骤(iii)中的混合液进行培养；
(v)在第三阶段将来自于步骤(iv)中的等份溶液接种至培养基中，并且进行搅拌；
(vi)对来自于步骤(v)中的混合液进行培养；
(vii)在第四阶段将来自于步骤(vi)中的等份溶液接种至培养基中，并且进行搅拌；以及
(viii)对来自于步骤(g)中的混合液进行培养。
9.根据权利要求5所述的药物产品，其中所述的药物产品在大约-70℃的温度下保存。
10.一种药物制剂，其包括药物可接受性赋形剂和药物产品，所述药物产品包括作为唯一活性成分分离和纯化的胶原酶I以及胶原酶II，所述的胶原酶I和胶原酶II分别具有溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I以及胶原酶II的序列，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且所述胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述的药物产品是无菌冻干粉末并储存于大约5℃温度下。
12.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述的制剂是使用蔗糖、Tris配制而成的冻干可注射形式的制剂，且具有大约8.0的pH水平。
13.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射形式的制剂，其包括大约0.9毫克所述的药物产品，大约18.5毫克的蔗糖以及大约1.1毫克的Tris，并且其中每一小瓶的目标填充体积为大约0.9毫升。
14.根据权利要求12所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射形式的制剂，其包括大约0.58毫克所述的药物产品，大约12.0毫克的蔗糖以及大约0.7毫克的Tris。
15.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述药物产品的制备包括如下步骤：
a)对溶组织梭状芽孢杆菌进行发酵；
b)收集包括胶原酶I以及胶原酶II的粗发酵液；
c)通过过滤以及柱层析从所述的粗收集物中纯化所述的胶原酶I以及胶原酶II，其包括如下步骤：
i)通过阴离子交换过滤器对所述粗收集物进行过滤；
ii)加入硫酸铵；
iii)使所述粗收集物经过HIC柱；
iv)向所述滤液中加入亮抑蛋白酶肽；
v)移除所述的硫酸铵；
vi)过滤步骤v)的混合物；和
vii)使用离子交换分离所述胶原酶I和胶原酶II；和
d)以大约1：1的比例混合从步骤(c)中纯化得到的胶原酶I以及胶原酶II。
16.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述制剂为无菌冻干粉末。
17.根据权利要求16所述的药物制剂，其中所述制剂是使用蔗糖、Tris配制而成的冻干可注射组合物制剂，且具有大约8.0的pH水平。
18.根据权利要求17所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射形式的制剂，其包括大约0.9毫克所述的药物产品，大约18.5毫克的蔗糖以及大约1.1毫克的Tris，并且其中每一小瓶的目标填充体积为大约0.9毫升。
19.根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射组合物，其包括大约0.58毫克所述的药物产品，大约12.0毫克的蔗糖以及大约0.7毫克的Tris。
20.根据权利要求10所述的药物制剂，其中胶原酶I和胶原酶II均通过反相高效液相色谱确定具有至少96％面积的纯度。
21.根据权利要求20所述的药物制剂，其中所述制剂为无菌冻干粉末并储存于大约5℃温度下。
22.根据权利要求21所述的药物制剂，其中所述制剂是使用蔗糖、Tris配制而成的冻干可注射制剂，且具有大约8.0的pH水平。
23.根据权利要求22所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射形式的制剂，其包括大约0.9毫克所述的药物产品，大约18.5毫克的蔗糖以及大约1.1毫克的Tris，并且其中每一小瓶的目标填充体积为大约0.9毫升。
24.根据权利要求22所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射组合物，其包括大约0.58毫克所述的药物产品，大约12.0毫克的蔗糖以及大约0.7毫克的Tris。
25.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述药物产品的制备包括以下步骤：
a)对溶组织梭状芽孢杆菌进行发酵；
b)收集包括胶原酶I以及胶原酶II的粗发酵液；
c)通过过滤以及柱层析从所述的粗收集物中纯化所述的胶原酶I以及胶原酶II，其包括如下步骤：
i)通过阴离子交换过滤器对所述粗收集物进行过滤；
ii)加入硫酸铵；
iii)使所述粗收集物经过HIC柱；
iv)向所述滤液中加入亮抑蛋白酶肽；
v)移除所述的硫酸铵；
vi)过滤步骤v)的混合物；和
vii)使用离子交换分离所述的胶原酶I和胶原酶II；
d)以大约1：1的比例混合从步骤(c)中纯化得到的胶原酶I以及胶原酶II。
26.根据权利要求25所述的药物制剂，其中所述制剂为无菌冻干粉末。
27.根据权利要求25所述的药物制剂，其中所述制剂是使用蔗糖、Tris配制而成的冻干可注射形式的制剂，且具有大约8.0的pH水平。
28.根据权利要求27所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射组合物，其包括大约0.9毫克所述的药物产品，大约18.5毫克的蔗糖以及大约1.1毫克的Tris，并且其中每一小瓶的目标填充体积为大约0.9毫升。
29.根据权利要求27所述的药物制剂，其中所述的制剂是冻干可注射形式的制剂，其包括大约0.58毫克所述的药物产品，大约12.0毫克的蔗糖以及大约0.7毫克的Tris。
30.一种用于骨胶原介导的疾病的药物产品，其包括作为唯一活性成分的溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I和胶原酶II，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且所述胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
31.一种用于骨胶原介导的疾病的药物产品，其包括溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I和胶原酶II，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且所述胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述的胶原酶I具有大约13,000至大约23,000fSRC单位/毫克的药效，以及其中所述药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
32.一种用于骨胶原介导的疾病的药物产品，其包括溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I和胶原酶II，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且所述胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述的胶原酶II具有大约230,000至大约430,000fGPA单位/毫克的药效，以及其中所述药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
33.一种用于骨胶原介导的疾病的药物产品，其包括溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I和胶原酶II，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且所述胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述胶原酶II具有大约200,000至大约380,000fGPA单位/毫克的药效，其中所述药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
34.一种用于骨胶原介导的疾病的药物产品，其包括溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I和胶原酶II，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且所述胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述的药物产品的胶原酶I具有大约13,000至大约23,000fSRC单位/毫克的药效，而胶原酶II具有大约230,000至大约430,000fGPA单位/毫克的药效，以及其中所述药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
35.一种用于骨胶原介导的疾病的药物产品，其包括溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶I和胶原酶II，其中所述胶原酶I和胶原酶II以质量比约为1：1的比例混合，且所述胶原酶I和胶原酶II的两种通过反相高效液相色谱确定具有至少95％面积的纯度，其中所述的药物产品的胶原酶I具有大约13,000至大约23,000fSRC单位/毫克的药效，而胶原酶II具有大约200,000至大约380,000fGPA单位/毫克的药效，以及其中所述药物产品含有小于10ppm的残留宿主蛋白、小于10EU/毫升的内毒素、小于或等于10匹克/剂量的残留宿主细胞DNA、小于或等于1％面积的利用反相液相色谱测定的梭菌蛋白酶、小于或等于1％面积的利用阴离子交换色谱测定的明胶酶和小于或等于1微克/毫克(重量/重量)的利用反向色谱测定的亮抑蛋白酶肽。
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| WO1996000283A1 (en) * | 1994-06-24 | 1996-01-04 | Boehringer Mannheim Corporation | A purified mixture of collagenases and two other proteases obtained from clostridium histolyticum |
| US6475764B1 (en) * | 1996-11-19 | 2002-11-05 | Roche Diagnostics Gmbh | Recombinant collagenase type I from clostridium histolyticum and its use for isolating cells and groups of cells |
| WO1998024889A1 (en) * | 1996-12-06 | 1998-06-11 | Boehringer Mannheim Corporation | Enzyme composition for tissue dissociation |
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Legal Events
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