KR20110046537A - 콜라겐매개된 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24007—Interstitial collagenase (3.4.24.7), i.e. matrix metalloprotease 1 or MMP1
Abstract
본 발명은 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터 고도로 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 조합물을 포함하는 약품에 관한 것이다. 상기 약품은 적어도 95%를 초과하는 순도를 지니며, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 약 1:1의 비로 포함한다. 본 발명은 추가로 상기 약품을 제조하기 위한 개선된 발효 및 정제 방법을 기술한다.
Description
콜라겐은 포유동물 유기체의 주된 구조 성분이고 동물체의 피부 및 다른 부분의 총 단백질 함량의 큰 부분을 구성한다. 사람에서, 이것은 상처 치료 과정 및 자연 노화 과정에서 특히 중요하다. 화상, 수술, 감염 및 사고와 같은 다양한 피부 외상은 종종 콜라겐에 풍부한 섬유질의 불규칙적인 축적 및 증가된 프로테오글리칸 함량을 지니는 것을 특징으로 한다. 손상되거나 파괴된 정상 조직의 교체에 더하여, 신규한 조직의 과도하고 모양이 망가진 침착이 종종 치료 과정 중에 형성된다. 과도한 콜라겐 침착은 콜라겐 합성과 콜라겐 분해간 균형이 방해되었기 때문이다.
다수의 질병 및 질환이 과도한 콜라겐 침착 및 콜라겐에 풍부한 섬유질 조직의 불규칙적인 축적과 연관된다. 이러한 질병 및 질환을 총괄하여 "콜라겐-매개된 질병"이라 언급한다. 콜라게나제는 다양한 콜라겐-매개된 질병을 치료하기 위해 이용되어 왔다. 콜라게나제는 콜라겐을 소화시키는 특정 능력을 지니는 효소이다.
치료에 이용되는 콜라게나제는 포유동물(예컨대, 사람), 갑각류(예컨대, 게, 새우), 균류, 및 세균(예컨대, 클로스트리디움, 스트렙토마이세스, 슈도모나스 또는 비브리오의 발효로부터)을 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 콜라게나제는 유전적으로 공학처리된 바도 있다. 미정제 콜라게나제의 한 일반적인 공급원은 세균 발효 공정, 구체적으로 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 발효로부터 수득된다. C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)으로부터 수득된 미정제 콜라게나제를 다수의 크로마토그래피 기술을 이용하여 정제시킬 수 있다.
C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)으로부터의 발효 공정의 한 가지 단점은 이것이 콜라겐 매개된 질환을 치료하기 위한 치료용 조성물에 종종 이용되는, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II와 같은 다양한 콜라게나제를 일정치 않은 비율로 산출한다는 것이다. 추가로, 배양이 대대로 고기 생성물의 사용을 요구해 왔다. 이러한 고기 배양은 원래 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 H4 균주[Dr. I. Mandl's laboratory in Columbia University in 1956]로부터 유래되었고 ATCC에 수탁되어 있다. 냉동건조된 바이알이 조작된 고기 배양물을 이용해 만들어졌으며 ABC 클로스트리디움 히스톨리티쿰 마스터 세포 뱅크로서 명명된다.
치료용 콜라게나제 제조물 중 콜라게나제 II에 대한 콜라게나제 I의 다양한 비율이 상이한 생물학적 효과를 지닌다. 따라서, 우수하고 일관된 효소 활성 및 치료 효과를 수득하기 위해 제조물 중 콜라게나제 II에 대한 콜라게나제 I의 비율이 용이하고 효과적으로 결정되고 조절될 수 있는 치료용 콜라게나제 제조물이 바람직할 것이다.
발명의 개요
본 발명의 고도로 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 조합물을 포함하는 콜라게나제 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II가 약 1:1의 질량 비로 존재한다. 콜라겐-매개된 질병을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서 이용되는 경우, 본 발명의 조성물은 부작용의 가능성을 낮추면서 개선되고 일관된 치료 효과를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 콜라게나제 조성물을 제조하는 방법, 본 발명의 조성물을 포함하는 약제학적 제형 및 본 발명의 콜라게나제 조성물을 이용하여 콜라겐-매개된 질병에 걸린 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 상기 및 그 밖의 목적, 특징 및 이점이 첨부된 도면에 도시된 대로, 하기 본 발명의 바람직한 구체예의 보다 상세한 설명으로부터 자명할 것이며, 첨부된 도면에서 같은 도면 부호는 여러 도면에 걸쳐서 동일한 부분을 나타낸다. 도면이 반드시 일정한 비례인 것은 아니며, 대신 본 발명의 원리 설명시에 강조된다.
도 1은 5L의 DCFT24a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(OD 대 시간)을 도시한다.
도 2는 5L의 DCFT24a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 순(net) 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다.
도 3은 두 번째 발효로부터의 8% 트리스-글리신 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - 0.27㎍
레인 3: 콜라게나제 II - 0.29㎍
레인 4: 2Oh (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 5: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 11: 11.6h - 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 12: 10.5h (6.12㎕의 샘플);
도 4는 첫 번째 발효로부터의 8% 트리스-글리신 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - 0.27㎍
레인 3: 콜라게나제 II - 0.29㎍
레인 4: 2Oh (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 5: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 11: 11.4h (6.12㎕의 샘플)
레인 12: 10.4h (6.12㎕의 샘플);
도 5는 두 번째 발효, 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
레인 3: 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
레인 4: 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
레인 5: 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
레인 6: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 7: 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 8: O.135㎍ 콜라게나제 I
레인 9: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 10: O.193㎍ 콜라게나제 II
레인 11 : 0.145㎍ 콜라게나제 II;
도 6은 DCFT26a 및 DCFT26b에 사용된 발효 방법을 나타낸다;
도 7은 5L DCFT26a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(OD 대 시간)을 도시한다; 도 8은 5L DCFT26a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 순 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 9는 DCFT26aDP 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 3: 콜라게나제 II - 0.72㎍
레인 4: 2Oh (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 5: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 11: 11h (6.12㎕의 샘플);
도 10은 DCFT26b에 대한 SDS-PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 20h (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 3: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 4: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 5: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 11h (6.12㎕의 샘플)
레인 11 : 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 12: 콜라게나제 II - 0.72㎍;
도 11은 DCFT26a, 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I
레인 5: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 0.193㎍ 콜라게나제 II
레인 7: 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 8: 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
레인 9: 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
레인 10: 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
레인 11: 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석);
도 12는 DCFT26b, 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 3 : 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I
레인 5: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 0.193㎍ 콜라게나제 II
레인 7: 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 8: 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
레인 9: 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
레인 10: 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
레인 11: 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석);
도 13은 암모늄 설페이트 투석 후 침전된 (100g/L 및 150 g/L) 샘플, DCFT26a, 수확점 샘플에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.67㎍ 콜라게나제 I 및 0.72㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 4: SC11로부터의 6.12㎕의 상청액 샘플
레인 5: 투석 후 샘플 - 100g/L AS (Neat)
레인 6: 투석 후 샘플 - 100g/L AS (1/5)
레인 7: 투석 후 샘플 - 100g/L AS (1/10)
레인 8: 투석 후 샘플 - 150g/L AS (Neat)
레인 9: 투석 후 샘플 - 150g/L AS (1/5)
레인 10: 투석 후 샘플 - 150g/L AS (1/10);
도 14는 암모늄 설페이트 투석 후 침전된 (200g/L 및 250 g/L) 샘플, DCFT26a, 수확점에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.67㎍ 콜라게나제 I 및 0.72㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 4: SC11로부터의 6.12㎕의 상청액 샘플
레인 5: 투석 후 샘플 - 200g/L AS (Neat)
레인 6: 투석 후 샘플 - 200g/L AS (1/5)
레인 7: 투석 후 샘플 - 200g/L AS (1/10)
레인 8: 투석 후 샘플 - 250g/L AS (Neat)
레인 9: 투석 후 샘플 - 250g/L AS (1/5)
레인 10: 투석 후 샘플 - 250g/L AS (1/10);
도 15는 암모늄 설페이트 투석 후 침전된 (300g/L 및 400 g/L) 샘플, DCFT26a, 수확점에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.67㎍ 콜라게나제 I 및 0.72㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 4: SC11로부터의 6.12㎕의 상청액 샘플
레인 5: 투석 후 샘플 - 300g/L AS (Neat 샘플)
레인 6: 투석 후 샘플 - 300g/L AS (1/5 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 300g/L AS (1/10 희석)
레인 8: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (Neat)
레인 9: 투석 후 샘플 - 4000g/L AS (1/5 희석)
레인 10: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/10 희석);
도 16은 PBFT57 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(OD 대 시간 및 순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 17은 반-정량적 SDS PAGE 겔, 수확점 샘플이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I
레인 5: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 0.193㎍ 콜라게나제 II
레인 7: 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 8: 2.04㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/3 희석)
레인 9: 1.53㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/4 희석)
레인 10: 1.22㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/5 희석)
레인 11: 0.87㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/7 희석);
도 18a는 발효 PBFT57, 수확점 샘플로부터의 투석 후 500 mL 샘플에 대한 정량적인 SDS PAGE이다. 400g/L의 암모늄 설페이트가 첨가된다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.272㎍ 콜라게나제 I 및 0.286㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.181㎍ 콜라게나제 I 및 0.190㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.136㎍ 콜라게나제 I 및 0.142㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.109㎍ 콜라게나제 I 및 0.114㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/15 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/20 희석)
레인 8: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/25 희석)
레인 9: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/30 희석)
레인 10: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/35 희석)
레인 11: 고분자량 마커;
도 18b는 암모늄 설페이트 침전된 샘플의 원심분리 후 상청액의 SDS PAGE이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ Col I 및 0.29 ㎍ Col II
레인 3: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 4: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L 빠른 첨가)의 상청액 (neat)
레인 5: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(440g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 6: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(480g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 7: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(520g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 8: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L, pH 6)의 상청액 (neat)
레인 9: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L, 산소첨가됨)의 상청액 (neat);
도 19는 수확점 상청액으로부터 희석된 샘플 및 암모늄 설페이트 투석 후 (400g/L - 빠른 첨가) 침전된 샘플을 도시하는 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 발효 샘플 - 수확 (neat)
레인 3: 발효 샘플 - 수확 (1/1 희석)
레인 4: 발효 샘플 - 수확 (1/2 희석)
레인 5: 발효 샘플 - 수확 (1/3 희석)
레인 6: 발효 샘플 - 수확 (1/4 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 수확 (1/17.54 희석) 레인 1에 해당
레인 8: 투석 후 샘플 - 수확 (1/35.08 희석) 레인 2에 해당
레인 9: 투석 후 샘플 - 수확 (1/52.62 희석) 레인 3에 해당
레인 10: 투석 후 샘플 - 수확 (1/70.16 희석) 레인 4에 해당
레인 11 : 투석 후 샘플 - 수확 (1/87.70 희석) 레인 5에 해당;
도 20은 수확점 상청액으로부터 희석된 샘플 및 암모늄 설페이트 투석 후 (520g/L) 침전된 샘플을 도시하는 PBFT57에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 발효 샘플 - 수확 (neat)
레인 3: 발효 샘플 - 수확 (1/1 희석)
레인 4: 발효 샘플 - 수확 (1/2 희석)
레인 5: 발효 샘플 - 수확 (1/3 희석)
레인 6: 발효 샘플 - 수확 (1/4 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 수확 (1/15.63) 레인 1에 해당
레인 8: 투석 후 샘플 - 수확 (1/31.26) 레인 2에 해당
레인 9: 투석 후 샘플 - 수확 (1/46.89) 레인 3에 해당
레인 10: 투석 후 샘플 - 수확 (1/62.52) 레인 4에 해당
레인 11 : 투석 후 샘플 - 수확 (1/78.15) 레인 5에 해당;
도 21은 PBFT58c,d 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum) 균주 004 및 013의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다:
도 22는 PBFT58c (균주 004)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - l.OO㎍
레인 3: 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 4: 콜라게나제 II - 1.08㎍
레인 5: 콜라게나제 II - 0.72㎍
레인 6: 16.25h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 20.5h (6.12㎕의 샘플);
도 23은 PBFT58d (균주 013)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - l.OO㎍
레인 3: 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 4: 콜라게나제 II - 1.08㎍
레인 5: 콜라게나제 II - 0.72㎍
레인 6: 16.25h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 20.5h (6.12㎕의 샘플);
도 24는 PBFT58c (균주 004), 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 6.12㎕의 샘플
레인 7: 3.06㎕의 샘플
레인 8: 2.04㎕의 샘플
레인 9: 1.53㎕의 샘플
레인 10: 1.22㎕의 샘플;
도 25는 PBFT58d (균주 013), 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 6.12㎕의 샘플
레인 7: 3.06㎕의 샘플
레인 8: 2.04㎕의 샘플
레인 9: 1.53㎕의 샘플
레인 10: 1.22㎕의 샘플;
도 26은 PBFT58c 발효 (균주 004)의 투석 후 수확점 샘플 (520g/L 암모늄 설설페이트)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5 : 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 투석 후 수확점 샘플 - Neat
레인 7: 투석 후 수확점 샘플 - (1/5 희석)
레인 8: 투석 후 수확점 샘플 - (1/10 희석)
레인 9: 투석 후 수확점 샘플 - (1/15 희석)
레인 10: 투석 후 수확점 샘플 - (1/20 희석);
도 27은 PBFT58d 발효 (균주 013)의 투석 후 수확점 샘플 (400g/L 암모늄 설설페이트)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 투석 후 수확점 샘플 - Neat
레인 7: 투석 후 수확점 샘플 - (1/5 희석)
레인 8: 투석 후 수확점 샘플 - (1/10 희석)
레인 9: 투석 후 수확점 샘플 - (1/15 희석)
레인 10: 투석 후 수확점 샘플 - (1/20 희석);
도 28은 대안적인 식물성 펩톤을 스크리닝하는데 이용된 실험적인 절차의 흐름도를 도시한다.
도 29는 DCFT27a,b 발효에 대한 유가식(fed)-회분 방법을 설명한다.
도 30은 5L DCFT27a 및 DCFT27b 유가식-회분 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 31은 5L PBFT59a,b,c 회분 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 32는 5L DCFT27d 유가식-회분 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 33a는 DCFT27d (아미노산이 보충된 피톤)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 3: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 4: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 5: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 11.3h (6.12 ㎕의 샘플)
레인 8: 0.27 ㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II;
도 33b는 접종 절차의 개략도를 나타낸다;
도 33c는 대략 200 L의 유가식-회분 접종 과정의 흐름도를 나타낸다;
도 34는 히드록시아파타티트 크로마토그래피 후의 크로마토그램을 도시한다;
도 35는 프랙토겔 TMAE 음이온 교환 후의 크로마토그램을 도시한다;
도 36은 5L 규모 공정으로부터 HA 전, HA 후 및 TMAE 후 재료의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 고분자량 마커 20
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 20
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 20
4 HA 전 - 1㎍ 20
5 HA 후 -1㎍ 20
6 TMAE 후 - 1㎍ 20
도 37은 프랙토겔 TMAE 음이온 교환 후의 크로마토그램을 도시한다;
도 38은 류펩틴의 존재하에 진행된 TMAE 후 재료의 Q 세파로스 IEX 크로마토그래피의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 고분자량 마커 20
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 20
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 20
4 TMAE 후/투석 후 - 1㎍ 20
5 분획 D6 - neat 20
6 분획 E6 - neat 20
7 분획 F7 - 1㎍ 20
8 분획 F6 - 1㎍ 20
9 분획 F5 - 1㎍ 20
10 분획 F4 - neat 20
도 39는 류펩틴의 존재하에 진행된 TMAE 후 재료의 Q 세파로스 IEX 크로마토그래피의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다. 겔 2 - 피크 2(ABCI):
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 고분자량 마커 20
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 20
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 20
4 분획 B2 - neat 20
5 분획 C1 - 1㎍ 20
6 분획 C2 - 1㎍ 20
7 분획 C3 - 1㎍ 20
8 분획 C4 - 1㎍ 20
9 분획 C5 - neat 20
10 분획 C6 - neat 20
도 40은 개질된 구배로 Q 세파로스 HP 음이온 교환 후 크로마토그램을 도시한다;
도 41은 ABCII의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피 후 크로마토그램을 도시한다;
도 42는 아르기닌의 존재하에 진행된 농축된 ABC II의 슈퍼덱스 75 GPC의 12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 마커 10
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 15
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 15
4 GPC 로딩 1㎍ 15
5 분획 D4 15
6 분획 D3 15
7 분획 D2 15
8 분획 D1 Neat 15
9 분획 E1 15
10 분획 E2 15
11 분획 E3 15
12 분획 E4 15
도 43은 ABCI의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피 후 크로마토그램을 도시한다;
도 44는 아르기닌의 존재하에 진행된 농축된 ABC의 슈퍼덱스 75 GPC의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다;
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 마커 10
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 15
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 15
4 GPC 로딩 1㎍ 15
5 분획 D4 15
6 분획 D3 15
7 분획 D2 15
8 분획 D1 15
9 분획 E1 15
10 분획 E2 15
11 분획 E3 15
12 분획 E4 15
도 45는 한 제안된 제조 공정의 흐름도를 나타낸다;
도 46은 공정 3에 대한 발효 절차의 흐름도를 나타낸다;
도 47은 공정 3에 대한 정제 절차의 흐름도를 나타낸다;
도 48은 중간체 AUXI 및 AUXII에 대해 코마시 염색된 SDS-PAGE(환원됨)이다:
레인
1. 고분자량 마커
2. 0.132mg/ml ABC-I 참조
3. 0.0265mg/ml ABC-I 참조
4. 0.132mg/ml AUX-I 중간체
5. 0.0265mg/ml AUX-I 중간체
6. 0.132mg/ml ABC-II 참조
7. 0.0265mg/ml ABC-II 참조
8. 0.132mg/ml AUX-II 중간체
9. 0.0265mg/ml AUX-II 중간체;
도 49는 약물에 대해 코마시 염색된 SDS-PAGE(환원됨)이다:
레인
1. 고분자량 마커
2. 0.132mg/ml 혼합된 BTC 참조
3. 0.0265mg/ml 혼합된 BTC 참조
4. 0.132mg/ml 약물
5. 0.0265mg/ml 약물;
도 50은 은 염색된 약물의 SDS-PAGE(환원됨)이다:
레인
1. HMW 마커
2. 혼합된 BTC 참조 1.3㎍
3. 블랭크
4. 약물 1.3 ㎍
5. 약물 0.27㎍
6. 약물 0.13 ㎍.
도 51은 유가식-회분 배양 동안 피톤 펩톤을 이용하는 현존하는 발효 공정에 대해, 회분 발효에서 프로테오스 펩톤 #3 상에서 성장된 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)을 비교하여 도시한다;
도 52는 5L 프로테오스 펩톤 #3 회분 발효(GCFT03b)(8% 트리스-글리신)의 수확점에서(20h) 콜라게나제 생성물의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 0.27㎍ AUXI
3 0.18㎍ AUXI
4 0.135㎍ AUXI
5 0.29㎍ AUXII
6 0.193㎍ AUXII
7 0.145㎍ AUXII
8 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
9 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
10 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
11 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
추정값
AUXI ~ 176mg/L
AUXII ~ 190mg/L
도 53은 5L 피톤 유가식-회분 발효(GCFT03d)(8% 트리스-글리신)의 수확점에서(20h) 콜라게나제 생성물의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 0.27㎍ AUXI
3 0.18㎍ AUXI
4 0.135㎍ AUXI
5 0.29㎍ AUXII
6 0.193㎍ AUXII
7 0.145㎍ AUXII
8 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
9 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
10 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
11 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
추정값
AUXI ~ 88mg/L
AUXII ~ 142mg/L
도 54는 재현가능한 성장 프로필을 입증하는 50g/L PP3에서 성장된 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 3개 발효를 도시한다:
도 55는 GCFT05d(프로테오스 펩톤 #3으로 회분 발효), (8% 트리스-글리신 겔, 콜로이드 염색됨)의 시간 추이를 나타내는 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, AUXI 및 AUXII
3 3시간
4 4시간
5 5시간
6 6시간
7 7시간
8 8시간
9 9시간
10 10시간
11 11시간
도 56은 GCFT05d(프로테오스 펩톤 #3으로 회분 발효), (8% 트리스-글리신 겔, 은 염색됨)의 시간 추이를 나타내는 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, AUXI 및 AUXII
3 3시간
4 4시간
5 5시간
6 6시간
7 7시간
8 8시간
9 9시간
10 10시간
11 11시간
도 57은 DCFT24b(피톤 펩톤을 이용한 유가식-회분 발효), (8% 트리스-글리신 겔, 콜로이드 염색됨)의 시간 추이를 나타내는 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 AUXI - 0.27㎍
3 AUXII - 0.29㎍
4 20시간 - 수확점
5 19시간
6 17시간
7 16시간
8 15시간
9 14시간
10 13시간
11 11.6시간
12 10.5시간
도 58은 상이한 로트의 PP3을 이용한 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum) 발효로부터의 성장 곡선을 비교하는 것을 도시한다:
도 59는 3개 로트의 PP3의 소규모 비교 및 100g/L PP3의 평가를 도시한다:
도 60은 PP3을 100g/L로 이용한 두 5L 발효의 성장 프로필을 도시한다:
도 61은 PBFT70c, 100g/L PP3 (로트 # 5354796) 발효 (8% 트리스-글리신)의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, 0.4㎍ AUXI 및 AUXII
3 3.1시간
4 4.4시간
5 5.5시간
6 6.6시간
7 8.0시간
8 9.1시간
9 10.1시간
10 11.4시간
11 12.0시간
도 62는 PBFT70d, 100g/L PP3 (로트 # 5325635) 발효 (8% 트리스-글리신)의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, 0.4㎍ AUXI 및 AUXII
3 3.1시간
4 4.3시간
5 5.5시간
6 6.6시간
7 7.8시간
8 9.1시간
9 10.1시간
10 11.3시간
11 12.0시간
도 63은 5L 발효 PBFT70c로부터의 생성물 형성에 대해 세포 성장을 비교하기 위한 SDS-PAGE의 밀도계 분석을 나타낸다:
도 64는 5L 및 200L 규모의 100g/L PP3 공정의 비교를 설명한다:
도 65는 200L 발효의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다(8% 트리스-글리신):
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 AUXI 및 AUXII 혼합된 참조(1.2㎍)
3 4시간
4 6시간
5 8시간
6 9.4시간
7 12시간
8 14시간
도 66은 200L 발효로부터의 생성물 형성에 대해 세포 성장을 비교하기 위한 SDS-PAGE의 밀도계 분석을 나타낸다:
도 67은 200L 발효의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다(12% 비스-트리스):
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 AUXI 및 AUXII 혼합된 참조(1.2㎍)
3 4시간
4 6시간
5 8시간
6 9.4시간
7 12시간
8 14시간
도 68은 콜라게나제 농도의 밀도측정 정량을 위한 표준 곡선을 도시한다.
도 69는 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 발효 및 수확의 도식적인 설명을 나타낸다.
도 70(a) 및 (b)는 페닐 세파로스 FF(로우 서브)를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터 생성된 크로마토그램이다: (a)는 실물 크기의 크로마토그램이고 (b)는 분획 수집을 나타내는 확대된 크로마토그램이다.
도 71은 무스탕 Q 단계에서 TFF1 단계까지의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 오염물질 밴드를 나타내기 위해 겔을 콜로이드 블루로 염색하고 오버로딩시켰다(2.5㎍의 총 단백질/레인):
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 12
2 무스탕 Q 후 여액 15
3 HIC 전 백 1 15
4 HIC 전 백 2 15
5 HIC 통과흐름 백 1 15
6 HIC 통과흐름 백 2 15
7 HIC 피크 1(0.3M AS 세척) 15
8 HIC 후 푸울(피크 2) 15
9 TFF 전(HIC 후 푸울 + 2일 유지) 15
10 TFF 후 15
11 Q-AEX 전(TFF 후 + 밤새 유지) 15
도 72은 1OmM 트리스, 20OμM 류펩틴 pH 8으로의 농축 및 정용여과 후 HIC 후 재료의 이온 교환 크로마토그램(Q 세파로스 HP)이다.
도 73은 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 1(AUXII)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 1: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 74 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 1(AUXII)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 2: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 75는 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 2(AUXI)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 3: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 76은 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 2(AUXI)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 4: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 77은 최종 생성물에 대한 음이온 교환 컬럼 동안 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔은 콜로이드 블루로 염색된다. 겔 1: 1㎍/레인 로딩:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 10
2 ABC I 참조 15
3 ABC II 참조 15
4 IEX 후 AUX I 푸울 15
5 IEX 후AUX II 푸울 15
6 AUX I 중간체(DOM: 12MAYO6) 15
7 AUX II 중간체(DOM: 10MAYO6) 15
8 AUX I 중간체(혼합 전) 15
9 AUX II 중간체(혼합 전) 15
10 약물(DOM: 15MAY06) 15
도 78은 최종 생성물에 대한 음이온 교환 컬럼 동안 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔은 콜로이드 블루로 염색된다. 겔 2: 2.5㎍/레인 로딩:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 10
2 ABC I 참조 15
3 ABC II 참조 15
4 IEX 후 AUX I 푸울 15
5 IEX 후 AUX II 푸울 15
6 AUX I 중간체(DOM: 12MAYO6) 15
7 AUX II 중간체(DOM: 10MAYO6) 15
8 AUX I 중간체(혼합 전) 15
9 AUX II 중간체(혼합 전) 15
10 약물(DOM: 15MAY06) 15
도 79는 8% 트리스 글리신을 이용한 SDS-PAGE이다 (NB Ref AS/1640/020):
1. 고분자량 마커
2. 블랭크 레인
3. 1㎍ 발효 여액 4일
4. 1㎍ 발효 여액 5일
5. 1㎍ 무스탕 Q 후 4일
6. l㎍ HIC 후 3일
7. 1㎍ HIC 후 6일
8. 1㎍ TFF 후 2일
9. 1㎍ TFF 후 4일
도 80은 8% 트리스 글리신을 이용한 SDS-PAGE이다:
1. 고분자량 마커
2. 1㎍ AUX-I 참조
3. 1㎍ AUX-II 참조
4. 1㎍ IEX 후 AUX-I 5일
5. 1㎍ IEX 후 AUX-I 12일
6. 1㎍ IEX 후 AUX-II 5일
7. 1㎍ IEX 후 AUX-II 12일
도 81은 SDS-PAGE 겔이다:
1. 고분자량 마커
2. 1㎍ AUX-I 참조
3. 1㎍ AUX-II 참조
4. 1㎍ AUX-I 중간체 5일
5. 1㎍ AUX-I 중간체 12일
6. 1㎍ AUX-II 중간체 5일
7. 1㎍ AUX-II 중간체 12일
도 82는 분석적 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 83은 UV에 의한 단백질 농도 결정을 나타낸다.
도 84는 제조 시점에 수득되고 -20℃에서 저장된 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다. 1㎍ 로딩:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 12
2 무스탕 Q 후 여액 15
3 HIC 전 백 1 15
4 HIC 전 백 2 15
5 HIC 통과흐름 백 1 15
6 HIC 통과흐름 백 2 15
7 HIC 피크 1(0.3M AS 세척) 15
8 HIC 후 푸울 15
9 TFF 전(HIC 후 푸울 + 주말 유지) 15
10 TFF 후 15
11 Q-AEX 전(TFF 후 + 밤새 유지) 15
도 85는 실온에서 22시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 86은 37℃에서 22시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 87은 실온에서 94시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 88은 37℃에서 94시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 89는 선택된 IEX 후 AUX I 및 IEX 후 AUX II 분획의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다. 분획들은 요구되는 오염물질 단백질이 부화된 20L 시범 진행으로부터 선택되었다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 90은 선택된 IEX 후 AUX I 및 IEX 후 AUX II 분획의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다. 분획들은 발효 20L PP3으로부터 생성되고 ~90kDa 오염물질 단백질이 부화된 정제된 재료로부터 선택되었다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 1은 5L의 DCFT24a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(OD 대 시간)을 도시한다.
도 2는 5L의 DCFT24a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 순(net) 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다.
도 3은 두 번째 발효로부터의 8% 트리스-글리신 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - 0.27㎍
레인 3: 콜라게나제 II - 0.29㎍
레인 4: 2Oh (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 5: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 11: 11.6h - 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 12: 10.5h (6.12㎕의 샘플);
도 4는 첫 번째 발효로부터의 8% 트리스-글리신 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - 0.27㎍
레인 3: 콜라게나제 II - 0.29㎍
레인 4: 2Oh (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 5: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 11: 11.4h (6.12㎕의 샘플)
레인 12: 10.4h (6.12㎕의 샘플);
도 5는 두 번째 발효, 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
레인 3: 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
레인 4: 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
레인 5: 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
레인 6: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 7: 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 8: O.135㎍ 콜라게나제 I
레인 9: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 10: O.193㎍ 콜라게나제 II
레인 11 : 0.145㎍ 콜라게나제 II;
도 6은 DCFT26a 및 DCFT26b에 사용된 발효 방법을 나타낸다;
도 7은 5L DCFT26a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(OD 대 시간)을 도시한다; 도 8은 5L DCFT26a,b 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 순 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 9는 DCFT26aDP 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 3: 콜라게나제 II - 0.72㎍
레인 4: 2Oh (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 5: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 11: 11h (6.12㎕의 샘플);
도 10은 DCFT26b에 대한 SDS-PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 20h (6.12㎕의 샘플) - 수확점
레인 3: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 4: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 5: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 16h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 11h (6.12㎕의 샘플)
레인 11 : 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 12: 콜라게나제 II - 0.72㎍;
도 11은 DCFT26a, 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I
레인 5: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 0.193㎍ 콜라게나제 II
레인 7: 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 8: 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
레인 9: 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
레인 10: 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
레인 11: 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석);
도 12는 DCFT26b, 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 3 : 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I
레인 5: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 0.193㎍ 콜라게나제 II
레인 7: 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 8: 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
레인 9: 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
레인 10: 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
레인 11: 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석);
도 13은 암모늄 설페이트 투석 후 침전된 (100g/L 및 150 g/L) 샘플, DCFT26a, 수확점 샘플에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.67㎍ 콜라게나제 I 및 0.72㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 4: SC11로부터의 6.12㎕의 상청액 샘플
레인 5: 투석 후 샘플 - 100g/L AS (Neat)
레인 6: 투석 후 샘플 - 100g/L AS (1/5)
레인 7: 투석 후 샘플 - 100g/L AS (1/10)
레인 8: 투석 후 샘플 - 150g/L AS (Neat)
레인 9: 투석 후 샘플 - 150g/L AS (1/5)
레인 10: 투석 후 샘플 - 150g/L AS (1/10);
도 14는 암모늄 설페이트 투석 후 침전된 (200g/L 및 250 g/L) 샘플, DCFT26a, 수확점에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.67㎍ 콜라게나제 I 및 0.72㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 4: SC11로부터의 6.12㎕의 상청액 샘플
레인 5: 투석 후 샘플 - 200g/L AS (Neat)
레인 6: 투석 후 샘플 - 200g/L AS (1/5)
레인 7: 투석 후 샘플 - 200g/L AS (1/10)
레인 8: 투석 후 샘플 - 250g/L AS (Neat)
레인 9: 투석 후 샘플 - 250g/L AS (1/5)
레인 10: 투석 후 샘플 - 250g/L AS (1/10);
도 15는 암모늄 설페이트 투석 후 침전된 (300g/L 및 400 g/L) 샘플, DCFT26a, 수확점에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.67㎍ 콜라게나제 I 및 0.72㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 4: SC11로부터의 6.12㎕의 상청액 샘플
레인 5: 투석 후 샘플 - 300g/L AS (Neat 샘플)
레인 6: 투석 후 샘플 - 300g/L AS (1/5 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 300g/L AS (1/10 희석)
레인 8: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (Neat)
레인 9: 투석 후 샘플 - 4000g/L AS (1/5 희석)
레인 10: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/10 희석);
도 16은 PBFT57 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(OD 대 시간 및 순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 17은 반-정량적 SDS PAGE 겔, 수확점 샘플이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I
레인 5: 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 0.193㎍ 콜라게나제 II
레인 7: 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 8: 2.04㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/3 희석)
레인 9: 1.53㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/4 희석)
레인 10: 1.22㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/5 희석)
레인 11: 0.87㎕의 샘플 (발효 수확 샘플의 1/7 희석);
도 18a는 발효 PBFT57, 수확점 샘플로부터의 투석 후 500 mL 샘플에 대한 정량적인 SDS PAGE이다. 400g/L의 암모늄 설페이트가 첨가된다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.272㎍ 콜라게나제 I 및 0.286㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.181㎍ 콜라게나제 I 및 0.190㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.136㎍ 콜라게나제 I 및 0.142㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.109㎍ 콜라게나제 I 및 0.114㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/15 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/20 희석)
레인 8: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/25 희석)
레인 9: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/30 희석)
레인 10: 투석 후 샘플 - 400g/L AS (1/35 희석)
레인 11: 고분자량 마커;
도 18b는 암모늄 설페이트 침전된 샘플의 원심분리 후 상청액의 SDS PAGE이다:
레인 1 : 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ Col I 및 0.29 ㎍ Col II
레인 3: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 4: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L 빠른 첨가)의 상청액 (neat)
레인 5: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(440g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 6: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(480g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 7: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(520g/L 느린 첨가)의 상청액 (neat)
레인 8: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L, pH 6)의 상청액 (neat)
레인 9: 암모늄 설페이트 침전 후 샘플(400g/L, 산소첨가됨)의 상청액 (neat);
도 19는 수확점 상청액으로부터 희석된 샘플 및 암모늄 설페이트 투석 후 (400g/L - 빠른 첨가) 침전된 샘플을 도시하는 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 발효 샘플 - 수확 (neat)
레인 3: 발효 샘플 - 수확 (1/1 희석)
레인 4: 발효 샘플 - 수확 (1/2 희석)
레인 5: 발효 샘플 - 수확 (1/3 희석)
레인 6: 발효 샘플 - 수확 (1/4 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 수확 (1/17.54 희석) 레인 1에 해당
레인 8: 투석 후 샘플 - 수확 (1/35.08 희석) 레인 2에 해당
레인 9: 투석 후 샘플 - 수확 (1/52.62 희석) 레인 3에 해당
레인 10: 투석 후 샘플 - 수확 (1/70.16 희석) 레인 4에 해당
레인 11 : 투석 후 샘플 - 수확 (1/87.70 희석) 레인 5에 해당;
도 20은 수확점 상청액으로부터 희석된 샘플 및 암모늄 설페이트 투석 후 (520g/L) 침전된 샘플을 도시하는 PBFT57에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 발효 샘플 - 수확 (neat)
레인 3: 발효 샘플 - 수확 (1/1 희석)
레인 4: 발효 샘플 - 수확 (1/2 희석)
레인 5: 발효 샘플 - 수확 (1/3 희석)
레인 6: 발효 샘플 - 수확 (1/4 희석)
레인 7: 투석 후 샘플 - 수확 (1/15.63) 레인 1에 해당
레인 8: 투석 후 샘플 - 수확 (1/31.26) 레인 2에 해당
레인 9: 투석 후 샘플 - 수확 (1/46.89) 레인 3에 해당
레인 10: 투석 후 샘플 - 수확 (1/62.52) 레인 4에 해당
레인 11 : 투석 후 샘플 - 수확 (1/78.15) 레인 5에 해당;
도 21은 PBFT58c,d 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum) 균주 004 및 013의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다:
도 22는 PBFT58c (균주 004)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - l.OO㎍
레인 3: 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 4: 콜라게나제 II - 1.08㎍
레인 5: 콜라게나제 II - 0.72㎍
레인 6: 16.25h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 20.5h (6.12㎕의 샘플);
도 23은 PBFT58d (균주 013)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 콜라게나제 I - l.OO㎍
레인 3: 콜라게나제 I - 0.67㎍
레인 4: 콜라게나제 II - 1.08㎍
레인 5: 콜라게나제 II - 0.72㎍
레인 6: 16.25h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 8: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 9: 19h (6.12㎕의 샘플)
레인 10: 20.5h (6.12㎕의 샘플);
도 24는 PBFT58c (균주 004), 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 6.12㎕의 샘플
레인 7: 3.06㎕의 샘플
레인 8: 2.04㎕의 샘플
레인 9: 1.53㎕의 샘플
레인 10: 1.22㎕의 샘플;
도 25는 PBFT58d (균주 013), 수확점 샘플에 대한 반-정량적 SDS PAGE이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 6.12㎕의 샘플
레인 7: 3.06㎕의 샘플
레인 8: 2.04㎕의 샘플
레인 9: 1.53㎕의 샘플
레인 10: 1.22㎕의 샘플;
도 26은 PBFT58c 발효 (균주 004)의 투석 후 수확점 샘플 (520g/L 암모늄 설설페이트)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5 : 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 투석 후 수확점 샘플 - Neat
레인 7: 투석 후 수확점 샘플 - (1/5 희석)
레인 8: 투석 후 수확점 샘플 - (1/10 희석)
레인 9: 투석 후 수확점 샘플 - (1/15 희석)
레인 10: 투석 후 수확점 샘플 - (1/20 희석);
도 27은 PBFT58d 발효 (균주 013)의 투석 후 수확점 샘플 (400g/L 암모늄 설설페이트)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 0.27㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II
레인 3: 0.18㎍ 콜라게나제 I 및 0.19㎍ 콜라게나제 II
레인 4: 0.135㎍ 콜라게나제 I 및 0.145㎍ 콜라게나제 II
레인 5: 0.108㎍ 콜라게나제 I 및 0.116㎍ 콜라게나제 II
레인 6: 투석 후 수확점 샘플 - Neat
레인 7: 투석 후 수확점 샘플 - (1/5 희석)
레인 8: 투석 후 수확점 샘플 - (1/10 희석)
레인 9: 투석 후 수확점 샘플 - (1/15 희석)
레인 10: 투석 후 수확점 샘플 - (1/20 희석);
도 28은 대안적인 식물성 펩톤을 스크리닝하는데 이용된 실험적인 절차의 흐름도를 도시한다.
도 29는 DCFT27a,b 발효에 대한 유가식(fed)-회분 방법을 설명한다.
도 30은 5L DCFT27a 및 DCFT27b 유가식-회분 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 31은 5L PBFT59a,b,c 회분 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 32는 5L DCFT27d 유가식-회분 발효에서 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장 곡선(순 OD 대 시간)을 도시한다;
도 33a는 DCFT27d (아미노산이 보충된 피톤)에 대한 SDS PAGE 겔이다:
레인 1: 고분자량 마커
레인 2: 18h (6.12㎕의 샘플)
레인 3: 17h (6.12㎕의 샘플)
레인 4: 15h (6.12㎕의 샘플)
레인 5: 14h (6.12㎕의 샘플)
레인 6: 13h (6.12㎕의 샘플)
레인 7: 11.3h (6.12 ㎕의 샘플)
레인 8: 0.27 ㎍ 콜라게나제 I 및 0.29㎍ 콜라게나제 II;
도 33b는 접종 절차의 개략도를 나타낸다;
도 33c는 대략 200 L의 유가식-회분 접종 과정의 흐름도를 나타낸다;
도 34는 히드록시아파타티트 크로마토그래피 후의 크로마토그램을 도시한다;
도 35는 프랙토겔 TMAE 음이온 교환 후의 크로마토그램을 도시한다;
도 36은 5L 규모 공정으로부터 HA 전, HA 후 및 TMAE 후 재료의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 고분자량 마커 20
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 20
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 20
4 HA 전 - 1㎍ 20
5 HA 후 -1㎍ 20
6 TMAE 후 - 1㎍ 20
도 37은 프랙토겔 TMAE 음이온 교환 후의 크로마토그램을 도시한다;
도 38은 류펩틴의 존재하에 진행된 TMAE 후 재료의 Q 세파로스 IEX 크로마토그래피의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 고분자량 마커 20
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 20
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 20
4 TMAE 후/투석 후 - 1㎍ 20
5 분획 D6 - neat 20
6 분획 E6 - neat 20
7 분획 F7 - 1㎍ 20
8 분획 F6 - 1㎍ 20
9 분획 F5 - 1㎍ 20
10 분획 F4 - neat 20
도 39는 류펩틴의 존재하에 진행된 TMAE 후 재료의 Q 세파로스 IEX 크로마토그래피의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다. 겔 2 - 피크 2(ABCI):
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 고분자량 마커 20
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 20
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 20
4 분획 B2 - neat 20
5 분획 C1 - 1㎍ 20
6 분획 C2 - 1㎍ 20
7 분획 C3 - 1㎍ 20
8 분획 C4 - 1㎍ 20
9 분획 C5 - neat 20
10 분획 C6 - neat 20
도 40은 개질된 구배로 Q 세파로스 HP 음이온 교환 후 크로마토그램을 도시한다;
도 41은 ABCII의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피 후 크로마토그램을 도시한다;
도 42는 아르기닌의 존재하에 진행된 농축된 ABC II의 슈퍼덱스 75 GPC의 12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 마커 10
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 15
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 15
4 GPC 로딩 1㎍ 15
5 분획 D4 15
6 분획 D3 15
7 분획 D2 15
8 분획 D1 Neat 15
9 분획 E1 15
10 분획 E2 15
11 분획 E3 15
12 분획 E4 15
도 43은 ABCI의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피 후 크로마토그램을 도시한다;
도 44는 아르기닌의 존재하에 진행된 농축된 ABC의 슈퍼덱스 75 GPC의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다;
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 마커 10
2 콜라게나제 ABC I 참조 1㎍ 15
3 콜라게나제 ABC II 참조 1㎍ 15
4 GPC 로딩 1㎍ 15
5 분획 D4 15
6 분획 D3 15
7 분획 D2 15
8 분획 D1 15
9 분획 E1 15
10 분획 E2 15
11 분획 E3 15
12 분획 E4 15
도 45는 한 제안된 제조 공정의 흐름도를 나타낸다;
도 46은 공정 3에 대한 발효 절차의 흐름도를 나타낸다;
도 47은 공정 3에 대한 정제 절차의 흐름도를 나타낸다;
도 48은 중간체 AUXI 및 AUXII에 대해 코마시 염색된 SDS-PAGE(환원됨)이다:
레인
1. 고분자량 마커
2. 0.132mg/ml ABC-I 참조
3. 0.0265mg/ml ABC-I 참조
4. 0.132mg/ml AUX-I 중간체
5. 0.0265mg/ml AUX-I 중간체
6. 0.132mg/ml ABC-II 참조
7. 0.0265mg/ml ABC-II 참조
8. 0.132mg/ml AUX-II 중간체
9. 0.0265mg/ml AUX-II 중간체;
도 49는 약물에 대해 코마시 염색된 SDS-PAGE(환원됨)이다:
레인
1. 고분자량 마커
2. 0.132mg/ml 혼합된 BTC 참조
3. 0.0265mg/ml 혼합된 BTC 참조
4. 0.132mg/ml 약물
5. 0.0265mg/ml 약물;
도 50은 은 염색된 약물의 SDS-PAGE(환원됨)이다:
레인
1. HMW 마커
2. 혼합된 BTC 참조 1.3㎍
3. 블랭크
4. 약물 1.3 ㎍
5. 약물 0.27㎍
6. 약물 0.13 ㎍.
도 51은 유가식-회분 배양 동안 피톤 펩톤을 이용하는 현존하는 발효 공정에 대해, 회분 발효에서 프로테오스 펩톤 #3 상에서 성장된 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)을 비교하여 도시한다;
도 52는 5L 프로테오스 펩톤 #3 회분 발효(GCFT03b)(8% 트리스-글리신)의 수확점에서(20h) 콜라게나제 생성물의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 0.27㎍ AUXI
3 0.18㎍ AUXI
4 0.135㎍ AUXI
5 0.29㎍ AUXII
6 0.193㎍ AUXII
7 0.145㎍ AUXII
8 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
9 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
10 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
11 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
추정값
AUXI ~ 176mg/L
AUXII ~ 190mg/L
도 53은 5L 피톤 유가식-회분 발효(GCFT03d)(8% 트리스-글리신)의 수확점에서(20h) 콜라게나제 생성물의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 0.27㎍ AUXI
3 0.18㎍ AUXI
4 0.135㎍ AUXI
5 0.29㎍ AUXII
6 0.193㎍ AUXII
7 0.145㎍ AUXII
8 0.87㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/7 희석)
9 1.22㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/5 희석)
10 1.53㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/4 희석)
11 2.04㎕의 샘플 (발효 샘플의 1/3 희석)
추정값
AUXI ~ 88mg/L
AUXII ~ 142mg/L
도 54는 재현가능한 성장 프로필을 입증하는 50g/L PP3에서 성장된 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 3개 발효를 도시한다:
도 55는 GCFT05d(프로테오스 펩톤 #3으로 회분 발효), (8% 트리스-글리신 겔, 콜로이드 염색됨)의 시간 추이를 나타내는 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, AUXI 및 AUXII
3 3시간
4 4시간
5 5시간
6 6시간
7 7시간
8 8시간
9 9시간
10 10시간
11 11시간
도 56은 GCFT05d(프로테오스 펩톤 #3으로 회분 발효), (8% 트리스-글리신 겔, 은 염색됨)의 시간 추이를 나타내는 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, AUXI 및 AUXII
3 3시간
4 4시간
5 5시간
6 6시간
7 7시간
8 8시간
9 9시간
10 10시간
11 11시간
도 57은 DCFT24b(피톤 펩톤을 이용한 유가식-회분 발효), (8% 트리스-글리신 겔, 콜로이드 염색됨)의 시간 추이를 나타내는 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 AUXI - 0.27㎍
3 AUXII - 0.29㎍
4 20시간 - 수확점
5 19시간
6 17시간
7 16시간
8 15시간
9 14시간
10 13시간
11 11.6시간
12 10.5시간
도 58은 상이한 로트의 PP3을 이용한 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum) 발효로부터의 성장 곡선을 비교하는 것을 도시한다:
도 59는 3개 로트의 PP3의 소규모 비교 및 100g/L PP3의 평가를 도시한다:
도 60은 PP3을 100g/L로 이용한 두 5L 발효의 성장 프로필을 도시한다:
도 61은 PBFT70c, 100g/L PP3 (로트 # 5354796) 발효 (8% 트리스-글리신)의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, 0.4㎍ AUXI 및 AUXII
3 3.1시간
4 4.4시간
5 5.5시간
6 6.6시간
7 8.0시간
8 9.1시간
9 10.1시간
10 11.4시간
11 12.0시간
도 62는 PBFT70d, 100g/L PP3 (로트 # 5325635) 발효 (8% 트리스-글리신)의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다:
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 참조, 0.4㎍ AUXI 및 AUXII
3 3.1시간
4 4.3시간
5 5.5시간
6 6.6시간
7 7.8시간
8 9.1시간
9 10.1시간
10 11.3시간
11 12.0시간
도 63은 5L 발효 PBFT70c로부터의 생성물 형성에 대해 세포 성장을 비교하기 위한 SDS-PAGE의 밀도계 분석을 나타낸다:
도 64는 5L 및 200L 규모의 100g/L PP3 공정의 비교를 설명한다:
도 65는 200L 발효의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다(8% 트리스-글리신):
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 AUXI 및 AUXII 혼합된 참조(1.2㎍)
3 4시간
4 6시간
5 8시간
6 9.4시간
7 12시간
8 14시간
도 66은 200L 발효로부터의 생성물 형성에 대해 세포 성장을 비교하기 위한 SDS-PAGE의 밀도계 분석을 나타낸다:
도 67은 200L 발효의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석이다(12% 비스-트리스):
레인 샘플
1 고분자량 마커
2 AUXI 및 AUXII 혼합된 참조(1.2㎍)
3 4시간
4 6시간
5 8시간
6 9.4시간
7 12시간
8 14시간
도 68은 콜라게나제 농도의 밀도측정 정량을 위한 표준 곡선을 도시한다.
도 69는 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 발효 및 수확의 도식적인 설명을 나타낸다.
도 70(a) 및 (b)는 페닐 세파로스 FF(로우 서브)를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터 생성된 크로마토그램이다: (a)는 실물 크기의 크로마토그램이고 (b)는 분획 수집을 나타내는 확대된 크로마토그램이다.
도 71은 무스탕 Q 단계에서 TFF1 단계까지의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 오염물질 밴드를 나타내기 위해 겔을 콜로이드 블루로 염색하고 오버로딩시켰다(2.5㎍의 총 단백질/레인):
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 12
2 무스탕 Q 후 여액 15
3 HIC 전 백 1 15
4 HIC 전 백 2 15
5 HIC 통과흐름 백 1 15
6 HIC 통과흐름 백 2 15
7 HIC 피크 1(0.3M AS 세척) 15
8 HIC 후 푸울(피크 2) 15
9 TFF 전(HIC 후 푸울 + 2일 유지) 15
10 TFF 후 15
11 Q-AEX 전(TFF 후 + 밤새 유지) 15
도 72은 1OmM 트리스, 20OμM 류펩틴 pH 8으로의 농축 및 정용여과 후 HIC 후 재료의 이온 교환 크로마토그램(Q 세파로스 HP)이다.
도 73은 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 1(AUXII)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 1: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 74 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 1(AUXII)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 2: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 75는 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 2(AUXI)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 3: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 76은 이온 교환 컬럼 동안 용리된 피크 2(AUXI)로부터의 분획의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔 4: 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 77은 최종 생성물에 대한 음이온 교환 컬럼 동안 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔은 콜로이드 블루로 염색된다. 겔 1: 1㎍/레인 로딩:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 10
2 ABC I 참조 15
3 ABC II 참조 15
4 IEX 후 AUX I 푸울 15
5 IEX 후AUX II 푸울 15
6 AUX I 중간체(DOM: 12MAYO6) 15
7 AUX II 중간체(DOM: 10MAYO6) 15
8 AUX I 중간체(혼합 전) 15
9 AUX II 중간체(혼합 전) 15
10 약물(DOM: 15MAY06) 15
도 78은 최종 생성물에 대한 음이온 교환 컬럼 동안 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스 트리스 SDS-PAGE 분석이다(도 5). 겔은 콜로이드 블루로 염색된다. 겔 2: 2.5㎍/레인 로딩:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 10
2 ABC I 참조 15
3 ABC II 참조 15
4 IEX 후 AUX I 푸울 15
5 IEX 후 AUX II 푸울 15
6 AUX I 중간체(DOM: 12MAYO6) 15
7 AUX II 중간체(DOM: 10MAYO6) 15
8 AUX I 중간체(혼합 전) 15
9 AUX II 중간체(혼합 전) 15
10 약물(DOM: 15MAY06) 15
도 79는 8% 트리스 글리신을 이용한 SDS-PAGE이다 (NB Ref AS/1640/020):
1. 고분자량 마커
2. 블랭크 레인
3. 1㎍ 발효 여액 4일
4. 1㎍ 발효 여액 5일
5. 1㎍ 무스탕 Q 후 4일
6. l㎍ HIC 후 3일
7. 1㎍ HIC 후 6일
8. 1㎍ TFF 후 2일
9. 1㎍ TFF 후 4일
도 80은 8% 트리스 글리신을 이용한 SDS-PAGE이다:
1. 고분자량 마커
2. 1㎍ AUX-I 참조
3. 1㎍ AUX-II 참조
4. 1㎍ IEX 후 AUX-I 5일
5. 1㎍ IEX 후 AUX-I 12일
6. 1㎍ IEX 후 AUX-II 5일
7. 1㎍ IEX 후 AUX-II 12일
도 81은 SDS-PAGE 겔이다:
1. 고분자량 마커
2. 1㎍ AUX-I 참조
3. 1㎍ AUX-II 참조
4. 1㎍ AUX-I 중간체 5일
5. 1㎍ AUX-I 중간체 12일
6. 1㎍ AUX-II 중간체 5일
7. 1㎍ AUX-II 중간체 12일
도 82는 분석적 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 83은 UV에 의한 단백질 농도 결정을 나타낸다.
도 84는 제조 시점에 수득되고 -20℃에서 저장된 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다. 1㎍ 로딩:
레인 샘플 로딩 부피, ㎕
1 마크 12 분자량 마커 12
2 무스탕 Q 후 여액 15
3 HIC 전 백 1 15
4 HIC 전 백 2 15
5 HIC 통과흐름 백 1 15
6 HIC 통과흐름 백 2 15
7 HIC 피크 1(0.3M AS 세척) 15
8 HIC 후 푸울 15
9 TFF 전(HIC 후 푸울 + 주말 유지) 15
10 TFF 후 15
11 Q-AEX 전(TFF 후 + 밤새 유지) 15
도 85는 실온에서 22시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 86은 37℃에서 22시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 87은 실온에서 94시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 88은 37℃에서 94시간 후 20L 시범 예행 시도로부터의 인-프로세스 샘플의 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 분석이다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 89는 선택된 IEX 후 AUX I 및 IEX 후 AUX II 분획의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다. 분획들은 요구되는 오염물질 단백질이 부화된 20L 시범 진행으로부터 선택되었다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
도 90은 선택된 IEX 후 AUX I 및 IEX 후 AUX II 분획의 8% 트리스-글리신 SDS-PAGE 분석이다. 분획들은 발효 20L PP3으로부터 생성되고 ~90kDa 오염물질 단백질이 부화된 정제된 재료로부터 선택되었다. 겔은 콜로이드 블루로 염색된다:
발명의 상세한 설명
본 발명은 고도로 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 약 1:1의 질량 비로 포함하는 신규한 콜라게나제 약물을 제공한다. 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 혼합물을 1:1의 인위적 질량 비로 포함하는 조성물은 부작용의 가능성을 낮추면서 고도로 재현가능하며 최적의 효소 활성을 제공하고 우수한 치료 효과를 나타내는 것이 발견되었다. "약물", "약품" 또는 "콜라게나제 조성물"은 상호교환적으로 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
일 구체예에서, 본 발명은 95 면적% 이상의 순도, 및 바람직하게는 98 면적% 이상의 순도를 지니며 질량 비가 약 1:1인, 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 서열을 각각 지니는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로 구성된 약물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 표 A로부터 선택된 하나 이상의 명세를 지니는 약물을 제공한다:
표 A
일 측면에서, 본 발명은 95 면적% 이상의 순도를 지니며 질량 비가 약 1:1인, 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 서열을 각각 지니는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로 구성된 약물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)을 발효시키고;
b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미정제 생성물을 수확하고;
c) 미정제 수확물로부터 여과 및 컬럼 크로마토그래피에 의해 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하고;
d) 단계 (c)로부터의 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 약 1:1의 비로 조합한다.
바람직한 일 구체예에서, 발효 단계는 돼지 유래된 피톤 펩톤 또는 식물성 펩톤 배지의 존재하에 수행된다. 보다 바람직하게는, 돼지 유래된 배지가 프로테오스 펩톤 #3이다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 발효 절차를 제공한다:
a) 제1 단계에서 배지에 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)을 접종하고 혼합물을 교반시키는 단계;
b) 단계 a)로부터의 혼합물을 인큐베이션시켜 분취량을 수득하는 단계;
c) 제2 단계에서 배지를 단계 b)에서 수득된 분취량으로 접종하고 혼합물을 교반시키는 단계;
d) 단계 c)로부터의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계;
e) 제3 단계에서 배지를 단계 d)에서 수득된 분취량으로 접종하고 교반시키는 단계;
f) 단계 e)의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계;
g) 제4 단계에서 배지를 단계 f)에서 수득된 분취량으로 접종하고 교반시키는 단계;
h) 단계 g)의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계; 및
i) 단계 h)에서 수득된 배양물을 여과에 의해 수확하는 단계.
바람직한 구체예에서, 발효 절차는 하기 단계들을 포함한다:
a) 3 x 25mL의 PP3 (프로테오스 펩톤) 배지에 3 x 250㎕의 WCB (3 x 125mL의 진탕 플라스크 중의 25mL 배양액, 혐기성 가스 병에 함유됨)를 37℃의 설정 온도에서 접종하고, 혼합물을 125rpm에서 교반하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 혼합물을 12시간 동안 인큐베이션하는 단계;
c) 4 x 20OmL의 PP3 배지에 상기 25mL 배양액 (4 x 500mL의 진탕 플라스크 중의 200mL 배양액, 혐기성 가스 병에 함유됨) 중 1로부터의 4 x 5mL 분취량을 37℃의 설정 온도에서 접종하고, 혼합물을 125rpm에서 교반하는 단계;
d) 단계 c)로부터의 혼합물을 12시간 동안 인큐베이션하는 단계;
e) 14.4L의 PP3 배지에 3 x 20OmL 배양액 (20L 발효기 중 15L 배양액)을 37℃의 설정 온도 및 7.00의 설정 pH에서 접종하고, 혼합물을 125rpm에서 교반하는 단계;
f) 단계 e)로부터의 혼합물을 12시간 동안 인큐베이션하는 단계;
g) 192L의 PP3 배지에 15L 배양액 (270L 발효기 중 200L 배양액) 중 8L를 37℃의 설정 온도 및 7.00의 설정 pH에서 접종하고, 혼합물을 125rpm에서 교반하는 단계;
h) 단계 g)로부터의 혼합물을 14시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및
i) 200L 배양액을 여과에 의해(0.2㎛까지 이어지는 깊이) 필리포어 밀리스택 4m2 및 0.2㎛ 필터 (2 x 밀리포어 익스프레스 XL 10 필터)를 통해 200L/h의 유속으로 수확하는 단계.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 정제 절차를 제공한다:
a) 미정제 수확물을 무스탕 Q 음이온-교환 캡슐 필터를 통해 여과하는 단계;
b) 암모늄 설페이트를 바람직하게는 1M의 최종 농도까지 첨가하는 단계;
c) 미정제 수확물을 바람직하게는 0.45㎛ 필터를 통해 여과하는 단계;
d) 여액을 HIC 컬럼, 바람직하게는 페닐 세파로스 6FF (low sub)를 통해 처리하는 단계;
e) 류펩틴을 여액에, 바람직하게는 HIC 용리된 후의 생성물에 0.2mM의 최종 농도로 첨가시키는 단계;
f) 암모늄 설페이트를 제거하고 TFF에 의한 완충액 교환에 의해, 바람직하게는 TFF에 의한 완충액 교환에 의해 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 정확한 결합을 위해 류펩틴을 유지하는 단계;
g) 단계 f)의 혼합물을 바람직하게는 0.45㎛ 필터를 통해 여과시키는 단계;
h) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 Q-세파로스 HP를 이용하여 분리하는 단계;
i) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대한 TFF 농축물 및 제형을 따로따로 제조하는 단계; 여기서 TFF는 10 및/또는 30K MWCO (분자량 컷오프) PES 또는 RC-폴리에테르설폰 또는 재생된 셀룰로오스 필터 막을 이용한 접점 흐름 여과이다. 선택된 단백질을 보유하고 농축하며 단백질을 한 완충액으로부터 다른 완충액으로 교환시키는 수단이 제공되며;
j) 0.2㎛ 여과 시스템을 통해 여과시키는 단계.
본 발명의 약물은 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 모두를 포함한다. 미정제 콜라게나제의 바람직한 공급원은 세균 발효 공정, 구체적으로 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 발효로부터 온 것이다. 본 발명의 일 구체예에 발효 공정이 기술되어 있다. C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)으로부터 수득된 미정제 콜라게나제를, 염료 리간드 친화력 크로마토그래피, 헤파린 친화력 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 및 금속 킬레이션 크로마토그래피를 포함하는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 정제할 수 있다. 미정제 및 부분적으로 정제된 콜라게나제는 어드밴스 바이오팩쳐스 코프.(Lynbrook, New York)를 포함하는 다수의 공급처로부터 시판된다.
콜라게나제 I 및 콜라게나제 II 둘 모두는 메탈로프로테아제이며 이들의 활성을 위해서는 단단하게 결합된 아연 및 느슨하게 결합된 칼슘을 필요로 한다(Eddie L. Angleton and H. E. Van Wart, Biochemistry 1988, 27, 7406-7412). 두 콜라게나제는 모든 유형의 콜라겐에 대해 넓은 특이성을 지닌다(Steinbrink, D; Bond, M and Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771-2776). 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II는 생리적 조건하에 콜라겐의 삼중-나선 영역을 가수분해시킴에 의해 콜라겐을 소화시킨다(Steinbrink, D; Bond, M and Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771 - 2776). 비록 각 콜라게나제가 서로 상이한 특이성(예컨대, 각각은 절단에 바람직한 상이한 아미노산 서열을 지닌다)을 지니나, 이들은 함께 콜라겐에 대해 상승적인 활성을 지닌다[Mandl, I., (1964), Biochemistry, 3: p.1737-1741; Vos-Scheperkeuter, GH, (1997), Cell Transplantation, 6: p.403-412]. 콜라게나제 II는 문헌에서 클래스 II 및 클래스 I 콜라게나제에 대해 보고된 대로 콜라게나제 I 보다 모든 종류의 합성 펩티드 기질에 대해 더 높은 활성을 지닌다[Bond, M.D. (1984), Biochemistry, 23: p.3085-3091. Hesse, F, (1995), Transplantation Proceedings, 27: p.3287-3289].
본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 콜라겐 매개된-질병의 예로는 두푸이트렌병(Dupuytren's disease); 페이로니병(Peyronie's disease); 동결견(유착 관절낭염), 켈로이드; 비대 흉터; 염증성 여드름으로부터 초래된 것들과 같은 함몰 흉터; 수술 후 유착; 보통 여드름; 지방종, 및 주름, 셀룰라이트 형성 및 신생 섬유증과 같은 모양이 망가진 상태가 있으나 이로 제한되지 않는다. 본원에 참조로서 포함된 미국특허 6,086,872호 및 5,589,171호는 두푸이트렌병의 치료에서 콜라게나제 제조물의 이용을 기술한다. 본원에 참조로서 포함된 미국특허 6,022,539호는 페이로니병의 치료에서 콜라게나제 제조물의 이용을 기술한다.
콜라겐-매개된 질병을 치료하는데 있어서의 이의 용도에 추가하여, 본 발명의 조성물은 개개 세포 및 세포 클러스터로 조직을 해리(dissociation)시키는데에도 유용하며, 이것은 매우 다양한 실험실, 진단적 및 치료적 적용에서 유용하다. 이러한 적용들은 소 직경 합성 혈관 이식 시딩을 위한 미세혈관 내피 세포, 유전자 치료용 간세포, 약물 독성학 스크리닝 및 체외 간 보조 장치, 연골 재생용 연골세포, 및 인슐린-의존성 당뇨병을 치료하기 위한 랑게르한스 섬을 포함하는, 다양한 용도를 위한 수많은 유형의 세포의 단리를 수반한다. 효소 처리는 세포외 매트릭스 단백질 및 세포-대-세포 접촉을 유지하는 단백질의 단편에 대한 조작이다. 콜라겐이 조직 초미세 구조의 주요한 단백질 성분이기 때문에, 효소 콜라게나제는 요망되는 조직 분해를 달성하기 위해 빈번하게 사용되어 왔다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은, 세포의 제거 또는 세포외 매트릭스의 개질이 요망되는 임의의 적용에 유용하다.
본 발명의 콜라게나제 조성물은, 특정 수의 활성 유닛 또는 특정 질량의 바람직하게 정제된 효소를 혼합시킴에 의해 제조될 수 있다. 콜라게나제 활성은 합성 펩티드 또는 콜라겐 기질을 가수분해시키는 효소의 능력에 의해 결정될 수 있다. 당업자는 본원에 개시된 것들 이외의 효소 검정이 기능적으로 등가인 효소 조성물을 규정하고 제조하기 위해 이용될 수도 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 조성물에서 콜라게나제 I 대 콜라게나제 II의 1:1 질량 비를 재현가능하게 최적화시키는 것이다. 콜라게나제 II에 대한 콜라게나제 I의 비율의 재현성은 이미 여러 요인으로 인해 난제로 남아 있다. 먼저, 클로스트리디움의 대량생산 발효는 일반적으로 1:2 비의 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 초래한다. 둘째로, 정제 공정이 이 비율을 현저하게 변화시켜 일관되지 않은 비율의 정제된 생성물을 초래하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 조성물의 최적화된 고정 질량 비가 두 상이한 콜라게나제에 의해 제공되는 상승 효과를 최대화하므로 우수한 치료적 이익을 초래한다.
본 발명은 본 발명의 조성물의 약제학적 제형도 제공한다. 본 발명의 약제학적 제형은 함께 제형화된 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 콜라게나제 조성물을 포함한다.
본원에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제"라는 용어는 무독성, 불활성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화재료 또는 임의 유형의 제형 보조제를 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 기능할 수 있는 재료의 몇몇 예로는 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오스 및 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 이의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탤크; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 아가; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산' 무-발열원 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알코올 및 포스페이트 완충액, 및 나트륨 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 다른 무독성 양립성(compatiable) 윤활제가 있으며, 착색제, 방출제, 코팅제, 방향제, 보존제 및 항산화제도 제조자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구, 국소 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 비경구라는 용어는 피하, 피내, 정맥내, 근내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 경막내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 모양이 망가진 조직에 주사된다. 페이로니병 또는 두푸이트렌병 또는 유착 관절낭염의 경우, 조성물은 코드 또는 플라크에 주사된다. "국소 투여"라는 용어는 본원에서 이러한 직접 주사를 포괄하도록 정의된다.
추가로, 투여 후에 주사 부위를 고정시킴에 의해 특히 양호한 결과를 얻을 수 있다. 예를 들어, 투여 부위는 4시간 이상 동안 고정될 수 있다.
주사가능한 제조물, 예를 들어 살균 주사액 또는 유성 현탁액을 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 살균 주사 제조물은 살균 주사액, 비경구적으로 허용되는 무독성 희석액 또는 용매 중의 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수도 있다. 적용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, U.S.P 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 살균고정된 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 이용된다. 이를 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드(bland) 고정오일이 이용될 수 있다. 추가로, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제조물에 이용된다.
주사가능한 제형은, 예를 들어 세균-보류성 필터를 통해 여과되거나, 사용 전에 살균수 또는 주사가능한 다른 살균 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 살균 고체 조성물의 형태로 살균제를 혼입시킴에 의해 살균될 수 있다. 살균 용액은 이후 사용을 위해 냉동건조될 수도 있다.
본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여용 용량 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함한다. 활성 성분은 살균 조건하에 약제학적으로 허용되는 담체 및 요구될 수 있는 임의의 필요한 보존제 또는 완충액과 혼합된다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 본 발명의 활성 화합물에 추가하여, 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탤크 및 산화아연과 같은 부형제, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 본 발명의 화합물에 추가하여, 락토오스, 탤크, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말과 같은 부형제, 또는 상기 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 클로로플루오로히드로카본과 같은 통상의 추진제를 추가로 함유할 수 있다.
경피 패치는 신체로 화합물의 제어된 전달을 제공하는 부가의 이점을 지닌다. 이러한 용량 형태는, 화합물을 적절한 매질에 용해시키거나 분산시킴에 의해 제조될 수 있다. 흡수 개선제를 사용하여 피부를 가로지르는 화합물의 흐름을 증가시킬 수도 있다. 상기 속도는 속도 제어 막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 화합물을 분산시킴에 의해 조절될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 약물은 락토오스와 제형화된 주사가능한 냉동건조된 조성물이다. 일 구체예에서, 각 밀리그램의 주사가능한 콜라게나제가 1.9mg의 락토오스와 제형화된다. 또 다른 구체예에서, 각 밀리그램의 주사가능한 콜라게나제가 합성 기질, pzGPGGPA를 이용한 효능 검정으로 측정시 약 2800 SRC 유닛 및 51000 유닛을 지니는 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 콜라게나제 조성물은 수크로오스, 트리스와 약 8.0의 pH 수준에서 제형화된 냉동건조된 주사가능한 조성물이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 1.0mg의 약물을 60mM의 수크로오스, 10mM 트리스에서 약 8.0의 pH에서 제형화한다(이것은 제형화 완충액에서 20.5mg/mL의 수크로오스 및 1.21mg/mL의 트리스와 같다). 제형 중 일부의 예는, 0.58의 약물 용량에 대하여 18.5mg의 수크로오스 및 1.1mg의 트리스를 각 바이알에 첨가하고, 표적으로 하는 바이알 충전 부피가 0.9mL인 것; 및 0.58mg의 약물 용량에 대하여 12.0mg의 수크로오스(multicompendial) 및 0.7mg의 트리스(multicompendial)를 첨가하는 것을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 치료적 유효량의 조성물, 또는 본 발명의 치료적 유효량의 약제학적 제형을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 콜라겐-매개된 질병을 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 화합물의 "치료적 유효량"이란 치료되는 피검체에 대해 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 타당한 이익/위험 비로 치료 효과를 제공하는 화합물의 양을 의미한다.
치료 효과는 객관적(즉, 얼마의 시험 또는 마커에 의해 측정될 수 있음)이거나 주관적(즉, 피검체가 효과를 나타내거나 효과를 느낀다)일 수 있다. 효과적인 용량은 투여 경로 및 다른 작용제와의 공동-사용 가능성에 따라 변화될 것이다. 그러나, 본 발명의 조성물의 총 매일 용법은 확실한 의학적 판단의 범위내에서 의사에 의해 결정될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료적 유효량은 치료하려는 질병 및 질병의 중증도; 적용된 특정 화합물의 활성; 적용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이; 적용된 특정 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; 치료 지속기간; 적용된 특정 화합물과 조합하여 또는 동시에 사용된 약물; 및 의학계에 널리 공지된 유사 인자들을 포함하는 다양한 인자에 의존적일 것이다.
주사가능한 콜라게나제의 약물은 콜라게나제 AUX I 및 콜라게나제 ABC I 및 콜라게나제 AUX II 및 콜라게나제 ABC II로 언급되는 두 미생물 콜라게나제로 구성된다. "콜라게나제 I", "ABC I", "AUX I" "콜라게나제 AUX I" 및 "콜라게나제 ABC I"은 동일하며 상호교환적으로 이용될 수 있다. 유사하게, "콜라게나제 II", "ABC II", "AUX II" "콜라게나제 AUX II" 및 "콜라게나제 ABC II"은 동일한 효소를 언급하며 또한 상호교환적으로 이용될 수 있다. 이러한 콜라게나제는 세균 세포에 의해 분비된다. 이들은 크로마토그래피 방법에 의해 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 배양 상청액으로부터 단리되고 정제된다. 두 콜라게나제는 특수한 프로테아제이며 동일한 EC 수(E.C 3.4.24.3)를 공유한다.
콜라게나제 AUX I은 분자량이 115kDa인 대략 1000개의 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩티드 사슬을 지닌다. 콜라게나제 AUX II도 분자량이 110kDa인 대략 1000개의 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩티드 사슬이다.
비록 문헌에 콜라게나제 AUX I 및 AUX II의 영역에 상동인 서열이 존재한다고 개시되어 있으나, 두 폴리펩티드는 웨스턴 블롯 분석에 의해 지적되는 대로 면역적으로 교차 반응성인 것으로 보이지 않는다.
약물(콜라게나제 농축물)은 콜라게나제 AUX I 및 AUX II에 대해 약 1:1의 질량 비를 지닌다. 콜라게나제 농축물은 1.528의 소멸 계수를 갖는다.
본원에 인용된 모든 참조문헌들은 인쇄물, 전자식, 컴퓨터로 읽을 수 있는 저장 매체 또는 다른 형태이든 간에, 비제한적으로 요약, 논문, 저널, 공개물, 텍스트, 보고서, 인터넷 웹 사이트, 데이타베이스, 특허 및 특허 공개를 포함하는 이들의 전체로서 명백히 참조로서 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법은 하기 실시예와 관련하여 보다 잘 이해될 것이며, 이는 단지 예시하고자 하는 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 개시된 구체예에 대한 다양한 변화 및 개질이 당업자에게 명백할 것이며 비제한적으로 본 발명의 공정, 제형 및/또는 방법과 관련된 것들을 포함하는 그러한 변화 및 개질이 본 발명의 정신 및 첨부된 청구범위의 범위를 벗어나지 않으며 이루어질 수 있다.
공정 2:
발효 공정
본 작업은 무-동물 성분 성장 배지에서 5L 발효 규모 공정으로부터 총 콜라게나제 ABC I & II의 250mg/L의 표적 수율을 운반하는 것을 목적으로 하는 발효 공정을 개발하기 위해 설정되었다. 다양한 가능한 대안적인 질소 공급원을, 이들이 성장 배지에 현재 이용되는 피톤 성분 이상으로 콜라게나제 발현에 임의의 효과를 지니는지를 알기 위해 스크리닝하였다. C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum) 004 및 013의 두 균주로부터의 생산성을 비교하는 실험으로 성장 동역학, 콜라게나제 생산성 및 동물 유래 배지에서 성장된 오염성 프로테아제의 생성에 관하여 두 균주간의 차이를 결정하였다. 상기 비교는 무-동물 성장 배지에 반해 동물 유래 배지에서 성장된 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum) 균주 간에 현저한 차이를 나타낸다.
이전의 결과는, 피톤 및 효모 추출물의 증가된 농도가 더 높은 생체질량 농도를 뒷받침하므로 더 높은 수준의 총 콜라게나제 발현을 지지하는 것으로 보인다고 기술하였다. 생체질량 농도 및 최적화된 회분 발효 배지의 총 콜라게나제 생산성을 추가로 높이려는 시도에서, 유가식-회분 발효 방법이 고안되었다. 2개의 5L 발효를 수행하였고, 하나는 회분상에 높은 농도의 배지를 이용하고 이어서 낮은 농도의 공급상이 이어지며, 두 번째는 회분상에 낮은 농도의 배지를 이용하고 이어서 높은 농도의 공급상이 이어진다. 두 발효 모두는 높은 생체질량 농도를 제공하였으나, 높은 농도의 회분상이 비교적 낮은 수준의 콜라게나제 발현을 나타내었다. 저 농도 회분 발효는 매우 높은 수준의 콜라게나제 발현(~280mg/L)을 나타내었으나 상기 배양은 현저한 양의 오염성 프로테아제인 클로스트리파인도 생성하였다.
비록 저 농도 회분 발효가 콜라게나제 발현과 관련하여 매우 양호한 결과를 제공하였으나, 고도로 농축된 피톤 및 효모 추출물 공급액은 제조하기가 매우 어렵다. 추가의 두 발효를 수행하였는데, 첫 번째는 이전의 성공적인 유가식-회분 발효의 반복이었고 두 번째는 보다 농축된 공급액을 이용한 다소 더 높은 농도의 회분상 배지 조성물을 지녔다. 두 발효 모두는 유사한 생체질량 농도를 달성하였고 콜라게나제 및 클로스트리파인의 동일한 발현 프로필을 나타내었다. 생성된 콜라게나제 양은 두 발효 모두에서 또한 약 280mg/L인 것으로 산정되었다. 그러나, 이러한 발효들은 현저한 양의 오염성 프로테아제인 클로스트리파인을 생성하였다.
대안적인 질소 공급원을 선택하여 유가식-회분 발효 방법에 사용된 피톤 펩톤을 대체하는 이들의 능력을 측정하였다. C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)을 4 내지 5 유닛의 광학 밀도(600nm)에 도달하도록 식물성 펩톤 상에서 매우 잘 성장시켰다. 그러나, 상기 발효들의 SDS-PAGE 분석은 콜라게나제 또는 클로스트리파인의 어떠한 발현도 나타내지 않았다. 이러한 펩톤 상에서 관찰된 풍부한 세포 성장으로 인해, 복잡한 질소 공급원의 농도가 매우 높아서 프로테아제 발현의 억제를 초래한 것으로 여겨진다. 따라서 두 번째 세트의 발효는 대용 펩톤을 회분 방법에서 50g/L로 이용하여 수행하였다. SDS-PAGE에 의해 발효를 분석하였을 때, 역시 콜라게나제 또는 클로스트리파인의 발현은 관찰되지 않았다. 피톤 펩톤을 이용한 유가식-회분 발효에 글루타민, 트립토판 및 아스파라긴의 세 아미노산을 보충하였다. 이러한 아미노산은 비-동물 배지에 소량으로 존재하는 것이 확인되었다. 발효의 성장 프로필은 아미노산이 보충되지 않은 유가식-회분 발효의 것과 매우 유사하였다. SDS-PAGE 분석은, 콜라게나제의 수율은 유사하나 클로스트리파인의 수준이 다소 낮음을 나타내었다. 클로스트리파인 검정은, 대조군 유가식-회분 발효와 비교하여 아미노 보충시 감소된 활성을 나타내었다. 클로트리파인 활성은 감소된 반면 여전히 현저하였으며 이것은 동물 및 비-동물 배지간에 차이가 크지 않았다. 암모늄 설페이트 침전을 이용한 콜라게나제의 일차 회수 단계의 측정을 미정제 발효 상청액의 0.2㎛ 여액에 대해 수행하였다. 이는 콜라게나제 수율을 증가시키고 공정 동안 운반되는 클로스트리파인의 양을 이상적으로 감소시키는 것을 돕기 위한 것이다. 먼저 100-400g/L의 암모늄 설페이트 농도를 평가하였다. 400g/L의 암모늄 설페이트는 콜라게나제의 현저한 회수를 초래하였다. 더 높은 범위의 암모늄 설페이트(400-520g/L)를 이용한 추가 연구를 수행하였다. 또한, pH를 6.0으로 감소시키는 효과 및 침전 전에 배지에 산소를 첨가시키는 효과도 조사하였다. 이러한 임의의 조건하에 상청액으로부터 회수되는 콜라게나제 또는 클로스트리파인의 양에는 아무런 차이가 관찰되지 않았다. 400g/L 암모늄 설페이트로부터 생성된 펠렛은 재현탁되기가 가장 쉬웠다.
C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 두 균주(004 및 013)를 비교하기 위한 연구는, 동물 유래 배지로부터의 콜라게나제의 생산성이 최적 비-동물 유래 배지 보다 낮았음을 나타내었다. 클로스트리파인 활성에 대한 효소 검정에 의해 뒷받침되는 SDS-PAGE 분석은, 동물 유래 배지로부터 생성된 재료 중의 클로스트리파인이 비-동물 배지에 비해 상당한 낮은 양이었음을 강조하였다. 이는, 비-동물 유래 배지 발효로부터 생성된 원액이 동물 유래 배지를 이용한 발효로부터의 원액 재료와, 오염성 프로테아제의 생성에 있어서, 현저히 상이하다는 사실을 강조한다.
제1 세트의 유가식-회분 발효 -DCFT24
공정 진행 작업으로부터의 결과는, 부화된 배지(100g/L 피톤 펩톤 및 50g/L 효모 추출물)의 사용이 원래 배지(50g/L 피톤 펩톤 및 8.5g/L 효모 추출물)에 비해 높은 양의 콜라게나제 발현을 초래하였음을 나타내었다. 또한, 이것은 초기에 생성된 클로스트리파인의 양을 감소시키는 것으로 보였다.
이후 두 5L 발효를 수행하였다. 첫 번째 방법은 긴 회분상/짧은 유가식-회분상으로 구성된 한편, 두 번째는 짧은 회분상/긴 유가식-회분상으로 구성되었다. 두 방법 모두에서, 발효 종료시에(20h 후) 피톤 펩톤 및 효모 추출물의 농도는 회분 발효의 경우와 같이 각각 100g/L 및 50g/L였다. 표 1 및 2는 사용된 배지 레시피 및 방법을 상세히 설명한다.
표 1 배지 레시피 및 유가식-회분 방법
표 2 배지 레시피 및 유가식-회분 방법
도 1은 두 발효로부터의 성장 곡선(OD600nm 대 시간)을 나타내는 한편, 도 2는 순(net) 성장 곡선(순 OD600nm 대 시간)을 나타낸다. 첫 번째 발효로부터의 세포가 매우 빠르게 성장하여 약 10시간 후 이들의 최대 OD에 도달한 것이 관찰되었다. 이것은, 회분상의 배지가 매우 풍부하기 때문이다. 유가식-회분상 동안, 세포는 성장하지 않는 것처럼 보였다. OD 값은 다소 감소되었고, 이것은 부분적으로, 세포의 사멸과 발효기로의 공급물의 희석 효과 때문일 수 있다.
두 번째 발효의 경우, 유가식-회분상을 6시간 후에 시작하였다. 이 시점에서 OD 값은 도 1의 성장 곡선에 의해 제시된 대로 낮을 것이다. 세포는 대략 18시간까지 천천히 지속하여 성장하였다.
도 2의 순 성장 곡선이, DCFT24b 발효의 세포 농도가 DCFT24a 발효 보다 높음을 시사하는 것이 주목된다. 접종 전 배지의 OD600nm은 약 1.7인 반면, DCFT24b에서 이것은 약 0.4였다. 이러한 차이는, 발효기를 오토클레이빙할 때 침전물이 형성되기 때문이다. DCFT24a의 경우, DCFT24b 보다 더 많은 양이 형성되었다.
SDS PAGE 겔:
상청액 샘플의 SDS PAGE 분석 (8% 트리스-글리신 겔)을 두 발효 각각에 대해 수행하였다. 겔은 도 3 및 4에 도시된다. 두 번째 발효의 수확점 샘플에 대해 반-정량적 SDS-PAGE 겔도 생성되었다.
도 4의 SDS PAGE 겔 분석은, 매우 소량의 콜라게나제가 발현되었음을 나타내었다. 이것은, 세포가 회분상 동안 매우 빠르게 성장하여 그 결과 약 10시간 후에 최대 세포 농도에 도달하였기 때문일 수 있다. 대조적으로, 두 번째 발효에서는 매우 높은 수준의 콜라게나제 발현이 관찰되었는데, 이것은 아마도 세포가 짧은 회분상 동안 보다 느리게 성장하고 유가식-회분상 동안 지속하여 성장하였기 때문이다. 따라서, 본 발명은 세포 성장이 짧은 회분상 동안 느리게 조절되고 유가식-회분상 동안 지속하여 성장하는 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)에 대한 개선된 발효 방법에 관한 것이다. 느린 성장은, 짧은 회분상 동안의 성장 속도가 유가식-회분상 이전에, 예컨대 발효 공정을 개시한 지 약 10시간 이내에 최대 세포 농도를 초래하지 않음을 의미하는 것으로 정의된다. 바람직한 구체예에서, 성장 속도는 대략 본원에 개시된 두 번째 발효 사이클로부터 초래된 속도이다.
두 번째 발효 사이클(도 5)의 수확점에서 반-정량적 SDS PAGE 겔로부터 추정되는 콜라게나제 생산성은 콜라게나제 ABC I에 대해 132mg/L이고 콜라게나제 ABC II에 대해 158mg/L이다. 이러한 값을 이전에 수득된 것들과 비교해 보면, 유가식-회분 방법을 이용한 발현 수준에서 약 3-배가 증가된 것이다.
다음 단계에서 다소 개질된 유가식-회분 방법 및 배지를 이용하여 추가 세트의 유가식-회분 발효를 수행하였다. 발효 공정의 확장성(scalability) 및 견고성(robustness)을 개선시키는 것이 목적이다. 본 발효의 배지 레시피는 상기와 동일하며, 다만 회분상의 피톤 펩톤 및 효모 추출물이 오토클레이빙 대신 여과살균되었다는 것이 예외이다. 이것은 배지 중 단백질의 가열 및 변성으로 인해 효모 추출물 및 피톤 조성물에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 오토클레이빙을 피하기 위해 수행되었다. DCFT26b 발효의 경우, 효모 추출물 및 피톤 펩톤의 양을 증가시켰다. 이것은, 공급물 중의 효모 추출물 및 펩톤의 농도가 DCFT26a에서 보디 적어지게 하여 구성 및 여과살균이 용이하도록 하기 위해 수행되었다. 두 발효 모두에서 수행된 방법은 동일하였고, 6h의 회분상 이후에 14h의 유가식-회분상이 이어졌다. 표 3 및 4는 배지 레시피를 나타내고 도 6은 두 발효에 사용된 방법이다.
표 3 DCFT26a에 대한 배지 레시피 및 유가식-회분 방법
표 4 DCFT26b에 대한 배지 레시피 및 유가식-회분 방법
도 7은 두 발효로부터의 성장 곡선(OD600nm 대 시간)을 나타내는 한편, 도 8은 순 성장 곡선(순 OD600nm 대 시간)을 나타낸다.
DCFT26a 및 DCFT26b에 대한 성장 곡선은 도 2에 도시된 DCFT24b와 매우 유사하였다. 세포는 유가식-회분상 동안 천천히 성장하여 약 3.5의 최종 순 OD600nm에 도달하였다.
발효 샘플의 SDS PAGE 겔:
상청액 샘플의 SDS PAGE 분석 (8% 트리스-글리신 겔)을 두 발효 각각에 대해 수행하였다(도 9 및 도 10). 또한, 콜라게나제의 양을 보다 양호하게 산정하기 위하여, DCFT26a(도 11) 및 DCFT26b(도 12)의 수확점 샘플에 대해 반-정량적 SDS-PAGE 겔을 수행하였다.
두 발효 모두에서, 콜라게나제의 수준은 DCFT24b(도 3)와 매우 유사하였다. 반-정량적 SDS PAGE 겔은, DCFT24와 매우 유사한 수준이(280mg/L 내지 300mg/L의 총 콜라게나제) DCFT26a 및 DCFT26b 둘 모두에 대해 수득되었음을 나타낸다. DCFT26a 발효 사이클(도 11)의 수확점은 콜라게나제 I에 대해 ~142mg/L이고 콜라게나제 II에 대해 ~132mg/L였다. DCFT26b 발효 사이클(도 12)의 수확점은 콜라게나제 I에 대해 ~147mg/L이고 콜라게나제 II에 대해 ~158mg/L였다. 클로스트리파인의 수준은 DCFT24b의 경우에서와 같이, 여전히 높았다.
암모늄 설페이트 침전 단계의 연구:
이러한 발효로부터의 결과는, 비록 콜라게나제의 수준이 유가식-회분 방법을 이용할 때 높았지만, 클로스트리파인의 수준도 여전히 현저히 높았음을 나타내었다. 따라서, 소규모 실험 연구를 설정하여 여과된 발효 상청액으로부터 침전된 펠렛에서 회수되는 클로스트리파인 및 콜라게나제의 양에 대한 암모늄 설페이트 농도의 효과를 조사한다.
암모늄 설페이트 침전 단계의 효능을 평가하기 위해, 6 x 100mL의 상청액 샘플을 DCFT26a 발효로부터 수확하였다. 상기 샘플을 하기 표에 상세된 대로 6개의 상이한 암모늄 설페이트 농도에서 침전시켰다. 펠렛을 3.3mL의 WFI에 재현탁시키고 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석하였다.
표 5 DCFT26a로부터의 100mL 상청액 샘플을 침전시키기 위해 사용된 암모늄 설페이트 농도
이후 투석 후 샘플을 SDS PAGE 분석에 의해 분석하였다.
도 13: 15% 및 22.5%로 침전된 투석 후 수확점 샘플
도 14: 30% 및 37.5%로 침전된 투석 후 수확점 샘플
도 15: 45% 및 60%로 침전된 투석 후 수확점 샘플
겔은, 사용된 암모늄 설페이트가 15% 내지 45% 포화된 경우, 투석 후 샘플 중 콜라게나제 수준이 매우 낮았음을 도시한다. 이러한 경우에서의 회수는 5% 미만인 것처럼 보였다.
60% 포화의 암모늄 설페이트를 이용한 경우(400g/L), 투석 후 샘플 중 콜라게나제의 수준은 매우 높았다(도 15). 밴드의 강도를 비교해 보면(샘플 대 참조), 콜라게나제 각각에 대해 약 70mg/L가 투석 후 샘플에 존재한다고 추정될 수 있다. 이것은, DCFT26a에 대한 반-정량적 겔(도 11)에 따라, 수확점 샘플에 약 130mg/L의 각 콜라게나제가 존재하였기 때문에, 약 50 내지 60%의 회수를 시사한다.
따라서, 본 발명은 DCFT26b에 상기 설명된 배지 레시피(물론, 여기에 개시된 양과 비슷함)의 이용 및 콜라게나제를 침전시키기 위한 암모늄 설페이트의 이용에 관한 것이고, 여기서 약 400g/L의 암모늄 설페이트가 콜라게나제-함유 배지에 첨가된다.
제3 세트의 유가식 회분-발효
여기에서의 주요한 목적은 개발된 유가식-회분 방법의 재현성을 평가하는 것이다. DCFT26b의 모사 발효인 유가식-회분 발효를 수행하였다. 또한, 암모늄 설페이트/침전 단계를 이전의 소규모 연구에 비해 보다 상세하게 조사하였다. 보다 구체적으로, 이의 목적은 침전/투석 후 샘플 중 콜라게나제 및 클로스트리파인의 회수에 대한 60%(400g/L) 내지 80%(530g/L)의 다양한 암모늄 설페이트 농도의 효과를 조사하는 것이었다. 추가로, 수확된 상청액 샘플을 처리하는 두 가지 방법, 즉 pH 변화 및 배지 산소화도 평가하였다.
성장 곡선:
사용된 배지 및 유가식-회분 방법은 DCFT26b와 정확히 동일하였다. 도 16은 발효로부터의 성장 곡선(OD600nm 대 시간) 및 순 성장 곡선(순 OD600nm 대 시간)을 도시한다. 성장 곡선은 DCFT26b와 매우 유사하였고, 이는 공정의 양호한 재현성을 나타낸다.
발효를 통해 얻어진 상청액 샘플의 SDS PAGE 분석(8% 트리스-글리신 겔)은, 콜라게나제 및 클로스트리파인의 수준이 DCFT26b와 매우 유사함을(SDS PAGE 겔은 도시하지 않음) 나타내었다. 수확점 샘플에 대해 반-정량적 SDS PAGE 겔(8% 트리스-글리신 겔)을 수행하였다(도 17). 상기 겔은, DCFT26b에서 관찰된 수준과 유사한, 120mg/L를 초과하는 각 콜라게나제가 존재하였음을 나타낸다.
발효 수확 샘플의 암모늄 설페이트 침전:
암모늄 설페이트 침전 단계의 효율을 평가하기 위하여, 7 x 500mL의 상청액 샘플을 수확하였다. 하기 6개 방법을 이용하여 이들을 침전시켰다.
모든 경우에 펠렛을 16.5mL의 WFI에 재현탁시키고 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석시켰으며, 방법 4는 예외로 펠렛을 16.5mL의 100mM의 K2HPO4(pH 6)에 재현탁시키고 동일한 완충액에 대해 투석시켰다. 이후 SDS PAGE를 수행하여 투석 후 샘플 중 콜라게나제의 양을 산정하고 침전/투석 단계의 회수를 평가하였다.
수행된 침전/투석 방법은 다음과 같다:
1 400g/L의 암모늄 설페이트를 한번에 모두 상청액 샘플에 첨가시켜 침전. 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석.
2 400g/L의 암모늄 설페이트를 천천히(약 30분) 상청액 샘플에 첨가시켜 침전. 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석.
3 400g/L의 암모늄 설페이트를 천천히(약 30분) 미리-산소화된 상청액 샘플에 첨가시켜 침전. 이것은 발효기로부터 수확된 500mL의 세포 배양액을 약 10분 동안 산소화시킴에 의해 수행되었다. 이후 배양액을 여과살균시켰다. 암모늄 설페이트 침전 후 형성된 펠렛을 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석시켰다.
4 400g/L의 암모늄 설페이트를 천천히(약 30분) 상청액 샘플에 첨가하여 침전시키고, 5N HCl을 첨가시켜 이의 pH를 pH 6으로 변경. 이후 형성된 펠렛을 100mM의 K2HPO4(pH 6)에 대해 투석.
5 440g/L의 암모늄 설페이트를 천천히(약 30분) 상청액 샘플에 첨가시켜 침전. 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석.
6 480g/L의 암모늄 설페이트를 천천히(약 30분) 상청액 샘플에 첨가시켜 침전. 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석.
7 520g/L의 암모늄 설페이트를 천천히(약 30분) 상청액 샘플에 첨가시켜 침전. 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석.
암모늄 설페이트가 상청액 샘플에 480g/L 및 520g/L로 첨가된 경우 완전히 용해되지 않았으나, 400g/L 및 440g/L로 첨가된 경우 완전히 용해되었다.
SDS PAGE로부터의 결과는, 침전 단계에 사용된 상이한 수준의 암모늄 설페이트(400g/L, 440g/L, 480g/L, 520g/L) 또는 사용된 다른 방법(산소화, pH 변화)이 투석 후 샘플에 존재하는 콜라게나제의 양에 대해 명백한 효과를 지니지 않는 것처럼 보였음을 나타내었다. 모든 경우에, 투석 후 샘플 중 콜라게나제 각각의 농도는 50mg/L 내지 60mg/L였다. 도 18a는 대표적인 SDS PAGE 겔을 도시하며, 예컨대, 400g/L의 암모늄 설페이트로 침전된 투석 후 샘플의 겔이다. 모든 겔이 매우 유사하였기 때문에, 다른 SDS PAGE 겔은 여기에 제시하지 않는다.
수확점 샘플(도 17) 및 투석 후 샘플 중 산정된 콜라게나제의 농도를 고려할 때, 침전/투석 단계 후 콜라게나제의 회수는 약 50%였다. SDS 겔에 의한 콜라게나제 농도 산정의 오차가 일반적으로 높기 때문에 50%의 회수 값이 정확한지를 알기 위해 하기 SDS PAGE 겔을 수행하였다.
· 암모늄 설페이트 침전된 샘플의 원심분리 후 모든 상청액의 SDS PAGE 겔(도 18a). 이의 목적은 임의 양의 콜라게나제가 상청액으로 손실되는지를 평가하기 위한 것이다.
· 수확점 상청액 샘플 및 암모늄 설페이트(400g/L) 투석 후 침전된 샘플을 같은 양의 콜라게나제를 함유하도록 적절하게 희석하여 동일한 겔에 로딩시킨 SDS PAGE 겔(도 19).
· 수확점 상청액 샘플 및 암모늄 설페이트 투석 후 샘플(520g/L)을 같은 양의 콜라게나제를 함유하도록 적절하게 희석하여 동일한 겔에 로딩시킨 SDS PAGE 겔(도 20).
암모늄 설페이트 침전된 샘플의 원심분리 후 상청액에 존재하는 콜라게나제의 양이 매우 낮았음을 도 18b로부터 알 수 있다. 도 19 및 도 20에서, 침전/투석 단계 후 콜라게나제의 양은 상청액 수확 샘플과 매우 유사하게 나타났다. 따라서, 상청액 및 투석 후 샘플의 반-정량적 SDS PAGE 겔을 비교하여 유도된 회수 값은 실제로 더 높을 듯 하였다.
동물 유래 TSB/프로테오스를 이용한 벤치마킹 발효 실험:
동물 유래된 성분을 함유하는 배지에서 C. 히스콜리티쿰(C. histolyticum) 013 및 004 균주의 발효를 수행하였다. 이는 균주 013을 균주 004와 비교하고 세포 성장, 콜라게나제 발현 및 오염물질의 수준에 대한 동물 성분의 효과를 평가하기 위한 것이다.
C. 히스콜리티쿰(C. histolyticum) 013:
냉동건조된 균주를 PBS에서 재구성하고 TSB/프로테오스 아가 플레이트(30g/L TSB, 10g/L 프로테오스 펩톤, 12g/L 아가) 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 혐기성 가스 팩의 존재하에 혐기성 병에서 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 취하여 5mL의 TSB/프로테오스 배지에 접종하는데 이용하였다. 37℃에서 15시간의 인큐베이션 후, 배양액의 OD600nm는 약 1.0 유닛이었다. 5mL의 배양액을 이후 1mL의 무균과 혼합시키고 -70℃ 미만으로 저장하였다.
PBFT58 발효
성장 곡선:
PBFT58c(균주 004) 및 PBFT58d(균주 013), 2개의 5L 회분 발효를 수행하였다. 표 6은 사용된 TSB/프로테오스 배지의 레시피를 제시한다. 도 21은 수득된 성장 곡선(순 OD600nm 대 시간)을 도시한다.
표 6 TSB/프로테오스 배지에 대한 레시피
균주 013이 균주 004 보다 더 높은 OD로 성장하였음을 도 21로부터 볼 수 있다. 그러나 두 경우 모두에서, 최종 OD600nm는 2.5 보다 높았으며, 이는 동물 유래 배지가 두 균주 모두에 대한 양호한 성장을 뒷받침하였음을 나타낸다.
균주 013이 수확점(20시간)까지 계속 천천히 성장한 반면, 균주 004는 약 2.7의 순 OD600nm까지 성장한 다음 성장을 멈추었다는 것이 주목된다. 비-동물 유래 배지를 이용한, 앞서 제시된 유가식-회분 발효와 바교하여, 동물 유래 TSB/프로테오스 배지를 이용하여 수득된 최종 OD가 더 낮았다.
SDS PAGE 분석:
발효를 통해 수득된 상청액 샘플의 SDS PAGE 겔(8% 트리스-글리신 겔)을 도 22 및 도 23에 도시한다.
발효 상청액, 특히 균주 013의 경우에 임의의 클로스트리파인이 존재하지 않는 것처럼 보였다. 이것은 매우 중요한 발견인데, 원조가 콜라게나제의 정제 동안 자손을 갖지 않거나 감소된 자손을 가질 수 있다는 사실을 설명할 수 있었기 때문이다. 대조적으로, 콜라게나제의 분해와 관련된 중요한 문제가 정제 공정 동안 이미 경험된 바 있다. 이것은 발효 중 클로스트리파인의 존재가 일부 원인일 수 있었다.
발효 중에 존재하는 콜라게나제의 양에 대한 더 양호한 평가를 수득하기 위해, 반-정량적 SDS PAGE 겔을 수화점 샘플에 대해 수행하였다(도 24 및 도 25). 상기 겔은, 더 적은 양의 콜라게나제가 식물성 배지를 이용한 유가식-회분 발효(PBFT57)에 비해 TSB/프로테오스 배지를 이용한 회분 발효(PBFT58c)에서 생성되었음을 나타낸다. 이것은 후자의 경우에 더 높은 세포 밀도(OD600nm ~ 4 내지 OD600nm ~2.7)가 수득되었다는 사실에 기인할 수 있었다. 표 7은 반-정량적 겔로부터의 결과를 요약한다.
표 7 PBFT57 및 PBFT58c,d에 대한 반-정량적 SDS PAGE 겔로부터의 결과
발효 수확 샘플의 암모늄 설페이트 침전:
각 발효에 대하여, 2 x 500mL의 수확점 샘플을 400g/L(60%) 및 520g/L(80%)의 암모늄 설페이트로 침전시켰다. 펠렛을 16.5mL의 WFI에 재현탁시키고 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 투석하였다. 투석 후 샘플의 SDS PAGE 분석(8% 트리스-글리신 겔)을 수행하였다(도 26 및 도 27).
상기 겔로부터의 결과는, 심지어 매우 농축된 투석 후 샘플(도 26 및 27의 레인 6 및 7)에서도, 클로스트리파인의 수준은 극히 낮았음을 나타낸다. 이것은 균주 004 보다 균주 013의 경우에 더욱 분명하다.
따라서, 본 발명은 본원에 개시된 발효 공정에 의해 생성된 것들과 같은, 클로스트리파인이 없는 콜라게나제 조성물에 관한 것이다.
클로스트리파인 활성의 측정:
클로스트리파인의 역할을 추가로 조사하기 위해, 투석 후 샘플의 클로스트리파인 활성을 측정하기 위해 효소 검정을 구성하였다. 하기 방법을 이용하였다:
클로스트리파인의 효소 검정:
BAEE + H2O 
N-a-벤조일-L-아르기닌 + 에탄올
BAEE = N-a-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르
조건: T = 25℃, pH = 7.6, A253nm, 빛의 경로 = 1 cm
방법: 연속적인 분광광도 속도 측정
유닛 정의: 1 유닛은 pH 7.6에서 2.5mM의 DTT 존재하에 25℃에서 분 당 1.0μmol의 BAEE를 가수분해시킬 것이다.
클로스트리파인 활성에 대해 투석 후 샘플의 분석:
TSB/프로테오스(PBFT58)를 이용한 발효 및 식물성 기재 유가식-회분 발효(PBFT57)로부터의 투석 후 샘플을 분석하기 위해 클로스트리파인 활성 검정을 이용하였다. 표 8은 결과를 요약한다.
이 결과는, TSB/프로테오스 발효의 경우에 매우 낮은 클로스트리파인 활성이 존재하였음을 입증한다. 대조적으로 유가식-회분 PBFT58의 경우 클로스트리파인 활성은 매우 높았다.
표 8 투석 후 샘플의 효소 활성
* 클로스트리파인 활성은 침전/투석 후 샘플에서 결정되었다
대용 펩톤의 조사
진탕 플라스크에서의 스크리닝 실험:
본 연구에서 피톤 펩톤의 대용물로서 다양한 식물성 펩톤을 이용하였다. 이는 콜라게나제 및 클로스트리파인의 발현 수준에 대한 이들의 효과를 평가하는 것을 목적으로 한다. 시험된 모든 펩톤은 식물성 공급원으로부터 유도되었고 시그마에서 판매된다.
사용된 실험 절차를 도 28에 설명한다. 배지 레시피를 표 9에 상세하게 기술하는 한편, 사용된 펩톤 리스트를 표 10에 도시한다. 피톤 펩톤을 함유하는 대조 진탕 플라스크도 사용되었다. 모든 경우에, 50g/L의 효모 추출물 및 100g/L의 각 펩톤을, 전개되는 유가식-회분 발효의 수확점에서의 상기 성분들의 농도를 모방하기 위해 사용하였다(표 4 참조).
표 9 진탕 플라스크 실험에 사용된 배지의 조성. 모든 배지는 여과살균됨
진탕 플라스크를 18시간 동안 인큐베이션하였다. 배양액을 OD600nm 및 생육할 수 있는 세포 총수에 대해 분석하였다. 배양액을 여과하고 상청액을 SDS PAGE에 의해 분석하였다. OD600nm 측정 및 생육할 수 있는 세포 총수로부터의 결과를 표 10에 요악한다.
식물성 펩톤의 대부분은 피톤 펩톤에 비해 높은 순 OD 값을 나타내었다. 그러나 OD 값은 생육할 수 있는 세포 총수에 비례하지 않았다. 이것은 부분적으로 생육할 수 있는 세포 계수 방법의 가변성 또는 세포가 미리 선택된 수확점(18시간) 이전에 이미 용해되기 시작했다는 사실 때문일 수 있었다.
흥미롭게도, SDS-PAGE 겔은 대조군(피톤 펩톤)을 포함하는 모든 플라스크에서 콜라게나제가 발현되지 않았음을 나타내었다(겔은 도시되지 않음). 이렇게 된 가능한 이유로는, 사용된 피톤 펩톤 및 효모 추출물의 농도가 매우 높아서 이들이 콜라게나제의 발현을 억제하였다는 사실을 들 수 있었다.
표 10 제1 스크리닝 실험으로부터의 결과
대용 펩톤을 이용한 유가식-회분 발효 - DCFT27a,b:
콜라게나제 발현이 관찰되지 않았다는 이전 진탕 플라스크 실험의 정보에 기초하여, 전개된 유가식-회분 방법을 이용하여 대용 펩톤을 평가하는 것으로 결정되었다.
DCFT27a(식물성 추출물 2) 및 DCFT27b(식물성 가수분해물 2)의 두 유가식-회분 발효를 수행하였다. 두 발효 모두에서, 피톤 펩톤을 함유하는 배지에 대해 전개된 유가식-회분 방법을 이용하였다. 표 11은 배지 레시피를 나타내고, 도 29는 사용된 방법을 설명한다.
도 11 유가식-회분 발효 DCFT27a 및 DCFT27b에 대한 배지 레시피
성장 곡선:
DCFT27a 및 DCFT27b에 대한 성장 곡선(순 OD600nm 대 시간)을 도 30에 도시한다. 두 발효 모두에서, 세포는 피톤 펩톤을 함유하는 배지에 비해(발효 PBFT57, 도 16) 다소 높은 OD600nm로 성장하였다. 이것은 생육할 수 있는 세포 총수에 따른 것이다(PBFT57의 1.5 x 109 CFU/mL에 비해 DCFT27a,b의 약 2 x 109 CFU/mL).
SDS PAGE 겔:
진탕 플라스크 실험과 같이 SDS PAGE 분석은 DCFT27a 및 DCFT27b 둘 모두에서 콜라게나제가 발현되지 않았음을 나타내었다(겔은 도시되지 않음). 이것은, 높은 양의 펩톤으로 구성된 배지가 피톤 펩톤이 사용된 콜라게나제의 발현을 지원하나, 대용 펩톤이 사용될 때 지나치게 풍부하여 콜라게나제 및 클로스트리파인을 포함하는 임의의 대사산물의 발현을 억제하였기 때문일 수 있었다. 대용 펩톤을 함유하는 배지에서 세포가 호사스러운 성장 조건을 경험하고 임의의 프로테아제를 생성할 것을 요구하지 않는 것으로 보인다.
대용 펩톤을 이용한 회분 발효 - PBFT59a,b:
DCFT27a 및 DCFT27b 유가식-회분 발효로부터의 결과는 이전에 사용된 것 보다 낮은 농도를 이용하는 3개의 추가적인 대용 펩톤을 조사하는 추가의 작업을 이끌었다.
PBFT59a(식물성 트립톤), PBFT59b(식물성 추출물) 및 PBFT59c(식물성 추출물 1번)의 3개의 5L 회분 발효를 수행하였다. 발효는 18시간 후에 수확되었다.
동물 배지의 프로테오스 펩톤의 농도(프로테오스/펩톤) 및 이전에 사용된 피톤 펩톤의 농도를 모방하기 위해 모든 펩톤을 50g/L의 농도로 이용하였다. 배지 레시피를 표 12에 도시한다.
표 12 5L 발효 PBFT59a,b,c에 대한 배지 레시피 및 발효 방법
성장 곡선:
PBFT59a,b,c 발효로부터 수득된 성장 곡선을 도 31에 도시한다. 모든 경우에 세포는 DCFT27 유가식-회분 발효에 비해 낮은 OD600nm(1.8 내지 2.8)까지 성장하였다. 이것은 또한 생육할 수 있는 세포 총수(DCFT27a,b의 2 x 109 CFU/mL에 비해 PBFT59a,b,c의 0.7 x 109 CFU/mL 내지 1.2 x 109 CFU/mL)에 따른 것이다. 트립톤을 함유하는 배지에서 세포의 가장 느린 성장 속도가 입증되었고 18시간 후 가장 낮은 세포 밀도를 달성하였다.
SDS PAGE 겔:
진탕 플라스크 실험 및 DCFT27a,b 유가식-회분 발효와 같이 SDS PAGE 겔에서 콜라게나제 발현은 나타나지 않았다(겔은 도시되지 않음).
이러한 결과는, 대용 펩톤이 세포 성장은 지원하나 콜라게나제의 발현은 허용하지 않음을 나타낸다. 앞서 제시된 대로, 이것은 이러한 펩톤이 유리 아미노산, 소형 펩티드와 같은 영양소에 매우 풍부하였기 때문일 수 있다.
제4 세트의 유가식-회분 발효 - DCFT27d
대용 식물성 펩톤을 이용한 실험 결과가 성공적이지 못했기 때문에, 본 작업의 다음 목적은 피톤 펩톤 배지를 이용하여 전개된 유가식-회분 발효에서 클로스트리파인의 수준을 감소시킬 가능성을 조사하는 것이었다. 앞서 기술된 대로, 클로스트리파인은 정제 공정 동안 대개는 콜라게나제의 분해를 야기한다.
유가식-회분 발효를 3개의 아미노산, 즉 글루타민, 트립토판 및 아스파라긴이 보충된 표준 피톤 펩톤 배지를 이용하여 수행하였다. 상기 발효는, 이러한 특정 아미노산의 농도를 제조자에 의해 제공된 상기 성분들의 아미노산 조성에 기초하여, 동물 TSB/프로테오스 배지에 비해 피톤 펩톤 중에서 낮게 하여 수행되었다.
이는, 상기 아미노산의 첨가가 클로스트리파인의 발현에 기여하는 인자일 수 있는 임의의 영양소 제한을 감소시킬 수 있는지를 조사하기 위한 것이다. 배지 레시피를 표 13에 도시한다. 사용된 발효 방법은 DCFT26 및 PBFT57 발효에 사용된 표준 유가식-회분 방법이었다(도 6 참조).
표 13 유가식-회분 발효 DCFT27d에 대한 배지 레시피
성장 곡선:
DCFT27d 발효로부터 수득된 성장 곡선을 도 32에 도시한다. 수득된 성장 프로필은 상기 도시된 아미노산의 부재하에서 표준 유가식-회분 발효(DCFT26b 및 PBFT57)에 대해 수득된 것과 매우 유사하였다.
SDS PAGE 겔:
도 33a는 발효를 통해 수득된 상청액 샘플의 SDS PAGE 겔을 도시한다. 콜라게나제의 수준은 표준 유가식-회분 발효(DCFT26b으로부터의 SDS PAGE 겔에 대한 도 10 참조)에 대해 보여지는 것과 유사하다. 클로스트리파인이 여전히 발효 중에 준재하지만, 이의 수준은 DCFT26b 보다 낮은 것처럼 보였다.
추가로 연구하기 위해, 투석 후 수확점 샘플의 클로스트리파인 활성을 클로스트리파인 활성 검정을 이용하여 산정하였다. 또한, 20L 냉동건조 회분으로부터 수득된 투석 후 수확점 샘플의 클로스트리파인 활성도 산정하였다. 상기 특정 회분이 현저한 콜라게나제 분해를 나타내지 않으면 정제되었기 때문에, 클로스트리파인 활성에 대한 이의 정보는 유익할 것이다. 표 14는 투석 후 샘플의 효소 활성을 요약한다. 이것은 표 8에 제시된 표준 유가식-회분 발효 PBFT57 및 동물 TSB/프로테오스 펩톤에 대한 효소 활성도 비교 목적으로 포함한다.
표 14 투석 후 샘플의 효소 활성
DCFT27d로부터의 결과는, 아미노산의 첨가가 균주에 의해 생성된 클로스트리파인의 활성을 감소시켰음을 나타낸다. 클로스트리파인 대 콜라게나제의 비율은 대조 유가식-회분 발효에 비해 아미노산 보충된 발효에서 약 4배 낮았다. 동물-유래된 발효에서 클로스트리파인 대 콜라게나제의 비율은 아미노산 보충된 유가식-회분 발효에서 10배 낮았다. 클로스트리파인 활성의 감소는 정제 동안 콜라게나제의 분해에 대해 현저한 감소를 초래할 수 있다.
일련의 5L 발효를 수행하여 여러 가지 유가식-회분 발효 방법을 평가하였다. 이 방법들은 이들의 콜라게나제 수율, 오염물의 양 및 확장성에 기초하여 평가되었다. 상기 결과에 기초하여, 약 280mg/L의 총 콜라게나제 생산성을 초래한 최적의 유가식-회분 방법을 규명하였다. 발효 방법은, 회분 배지 농도를 다소 증가시키고 유가식-회분 배지 농도를 감소시킴에 의해 개질되어 이의 확장성을 개선시킨다. 발효 방법에 대한 이러한 변경은 생산성 또는 오염물질의 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다.
두 번째 목적은 콜라게나제의 근본적인 회수 단계를 최적화시키는 것이었다. 상기 단계의 최적화는 공정 단계의 수율 개선 또는 회수되는 오염물의 양 감소 또는 확장성에 있어서의 증가를 수반하였다. 100 내지 520g/L의 암모늄 설페이트 농도 범위를 평가하였다. pH를 6.0으로 낮추고 배지를 산소화시키는 효과도 평가하였다. 400g/L 미만의 모든 암모늄 설페이트 농도가 콜라게나제의 매우 낮은 회수를 나타내었다. 콜라게나제 또는 클로스트리파인의 회수는 400 내지 520g/L의 암모늄 설페이트 농도 중 임의의 농도에서 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 400g/L 침전물로부터의 펠렛은 재현탁이 가장 용이하며 따라서 이 농도가 최적 수준으로 정의되었다.
C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum) 균주 013 및 004를 이용한 동물-유래된 배지에서 콜라게나제 및 클로스트리파인의 성장 및 생성을 결정하고 비교하기 위해 벤치마킹 실험을 수행하였다. 동물-유래 배지 레시피를 TSB 및 프로테오스 펩톤을 이용한 공정 1 발효 배지로부터 얻었다. 이 실험은 동물 및 비-동물 배지에서 성장된 균주 004의 비교도 가능하게 하였다. SDS-PAGE 분석으로부터의 결과는, 동물-유래된 배지에서 성장된 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)으로부터 훨씬 적은 양의 클로스트리파인이 수득되었음을 나타내었다. 이러한 결과는 클로스트리파인 활성에 대한 효소 검정을 이용하여 확인되었다. 이 검정은 동물-유래된 배지를 이용한 발효에서 클로스트리파인 활성에 있어서의 현저한 감소를 입증하였다. 두 균주를 비교해 보면, 004가 013 보다 높은 클로스트리파인 활성을 나타내었다.
유가식-회분 발효 방법에서 피톤 펩톤을 대신하는 능력에 대해 대용 질소 공급원의 선택을 평가하였다. 이러한 펩톤은 식물성 추출물 2번(Sigma, 49869) 및 식물성 가수분해물 2번(Sigma, 07436)이었다. C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)을 식물성 펩톤 상에서 4 내지 5 유닛의 광학 밀도(600nm)에 도달하도록 매우 잘 성장시켰다. 이러한 발효의 SDS-PAGE 분석은 콜라게나제 또는 클로스트리파인의 어떠한 발현도 나타내지 않았다. 이러한 펩톤에서 관찰된 풍부한 세포 성장으로 인해, 복합 질소 공급원의 농도가 매우 높아서 프로테아제 발현의 억제를 초래한 것으로 여겨진다. 두 번째 세트의 발효는 따라서 50g/L의 대용 펩톤을 이용하여 회분 방법으로 수행하였다. 식물성 트립톤(Sigma, 16922) 식물성 추출물(Sigma, 05138) 및 식물성 추출물 1번(Sigma, 04316)을 상기 실험에서 대용 펩톤으로서 이용하였다. 발효를 SDS-PAGE에 의해 분석했을 때, 콜라게나제 또는 클로스트리파인의 발현은 관찰되지 않았다. 피톤 펩톤을 이용한 유가식-회분 발효에 글루타민, 트립토판 및 아스파라긴의 3개 아미노산을 보충하였다. 이러한 아미노산은 비-동물 배지에 소량으로 존재하는 것이 확인되었다. 발효의 성장 프로필은 아미노산이 보충되지 않은 유가식-회분 발효와 매우 유사하였다. SDS-PAGE 분석은 유사한 수율의 콜라게나제와 다소 낮은 수준의 클로스트리파인을 나타내었다. 클로스트리파인 검정은 대조 유가식-회분 발효에 비해 아미노 보충시 감소된 활성을 나타내었다. 여전히 현저한 활성이긴 하나 클로스트리파인 활성에서의 이러한 감소는 동물 및 비-동물 배지간에 차이가 크지 않았다.
재료 및 방법:
식물성 배지를 이용한 발효용 접종 배지
본 개발 작업 동안 접종 배지용으로 하기 레시피를 이용하였다.
접종 배지 - 식물성
배지는 여과살균되었다.
접종 절차
내부 세포 뱅크로부터의 바이알을 해동시키고 0.025mL를 30mL의 유니버셜(universal) 중의 5mL 접종 배지를 접종하는데 이용하였다. 5mL의 배양액을 혐기성 병에서 혐기성 가스 발생기의 존재하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 약 13 내지 15시간의 인큐베이션 후에, 4mL의 배양액을 이용하여 500mL 플라스크에서 200mL의 접종 배지를 접종하는데 이용하였다. 앞에서와 같이 플라스크를 혐기성 가스 발생기의 존재하에 혐기성 병에 정위시켰다. 37℃ 및 75rpm에서 약 13 내지 15시간의 인큐베이션 후에, 플라스크의 모든 내용물은 발효기를 접종하는데 이용하였다.
발효기의 pH 및 온도를 각각 7.0 및 37℃로 조절하였다. 질소 유속을 1L/분(~ 0.2vvm)으로 설정하였고 교반기 속도는 100rpm이었다. OD600nm 측정 및 바이알 세포 계수를 위해 발효기를 규칙적인 시간 간격으로 샘플링하였다. 샘플을 0.22㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 여액을 -20℃에서 저장하고 SDS PAGE 분석을 위해 -20℃에서 동결시켰다. 도 33b는 접종 절차의 개략적인 도식이다.
유가식-회분 발효에 대한 바람직한 레시피를 하기 개시한다.
콜라게나제 생성물의 질 또는 수율을 손상시키지 않으며 발효 공정을 추가로 확대시키는 것도 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 도 33c의 흐름도에 기술된 약 200L 유가식-회분 공정에 관한 것이다.
생육할 수 있는 세포 계수 방법
진탕 플라스크로부터 수득된 샘플을 10-4 내지 10-7의 인자로 희석시키고 TB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 약 48시간 동안 젠박스(Genbox) 병에서 인큐베이션하였다. 혐기성 가스 발생기 팩을 이용하여 병 내에 혐기성 조건을 제공하였다. 이후 콜로니의 수를 계수하였다.
암모늄 설페이트 침전:
재료: 소르발 이볼루션(Sorvall Evolution) 원심분리
화학제품: 암모늄 설페이트, GPR 등급(BDH)
상청액 샘플(100mL 내지 500mL)을 0.22㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 실험에 따라 다양한 양의 암모늄 설페이트를 첨가하였다(15% 내지 80% 포화). 이 용액을 모든 암모늄 설페이트가 용해될 때까지 자기 교반기에서 약 15분 동안 천천히 혼합하였다. 이후 혼합시키지 않고 ~3.5시간 동안 +2-8℃에서 유지하였다. 유지 단계 후에, 상당량의 침전물이 형성되었다. 이후 용액을 7,200 x g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 기울여 따르고 펠렛을 -20℃에서 저장하였다.
투석
재료: 10kDa MWCO 스네이크스킨(SnakeSkin) 투석 튜빙(68100, Pierce)
자기 교반기
화학제품: 칼륨 디히드로겐 오르토포스페이트 AnalaR(BDH)
주사용 물(WFI)
100mL 암모늄 설페이트 샘플로부터 수득된 펠렛을 3.3mL의 WFI에 재현탁시켰다. 재구성된 펠렛을 미리 습윤된 10kDa MWCO 스네이크스킨 투석 튜빙으로 옮기고 100mM의 K2HPO4(pH 6.7)에 대해 ~12 내지 16시간 동안 2-8℃에서 투석시켰다. 이후 WFI를 변경하고 2-4시간 동안 계속 투석시켰다. 투석된 재료를 회수하고 부피를 측정하였다. 투석 후 샘플을 -20℃에서 저장하였다.
SDS-PAGE 분석(8% 트리스-글리신 겔)
재료: Xcell SureLock Mini-Cell
화학제품:
SDS-PAGE 스탠다즈 하이 모레큘러 웨이트(161-0303, Bio Rad)
노벡스(Novex) 8% 트리스-글리신 겔, 1.5mm, 10 웰(EC6018BOX, Invitrogen)
노벡스 8% 트리스-글리신 겔, 1.5mm, 15 웰(EC60185BOX, Invitrogen)
노벡스 트리스-글리신 SDS 진행 완충액(10x)(LC2675, Invitrogen)
노벡스 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액(2x)(LC2676, Invitrogen)
NuPAGE 샘플 환원제(10x)(NP0009, Invitrogen)
콜로이드 블루 염색 키트(LC6025, Invitrogen)
에틸렌디아민테트라-아세트산 이나트륨 염 Analar R(BDH)
10㎕의 샘플을 10㎕의 샘플 완충액(2x), 2.5㎕의 환원제(10x) 및 2㎕의 0.1M EDTA에 첨가시켜 환원성 SDS-PAGE를 위한 샘플을 제조하였다(10mM의 최종 농도를 달성함). 10㎕의 농축된 스톡을 80㎕의 환원제(10x), 310㎕의 WFI 및 400㎕의 샘플 완충액(2x)에 첨가시켜 고분자량(HMW) 마커를 제조하였다. 희석된 HMW 표준을 95℃에서 5분 동안 가열하고 등분하고 이어지는 겔에서의 사용을 위해 -20℃에서 저장하였다. 콜라게나제를 함유하는 샘플(15㎕)을 트리스-글리신 진행 완충액을 이용하여 130V에서 ~1시간 50분 동안 8% 트리스-글리신 겔 상에서 직접 진행시켰다(즉, 사전 가열 처리 없음). 전기영동 후, 겔을 제조자의 지시에 따라서 콜로이드 블루 염색제로 염색하였다.
정제 공정
5L 정제 공정의 방법 개요:
단계 1. 배양 배지 상청액의 암모늄 설페이트 침전(분비 단백질).
재구성 및 0.1M 인산칼륨, 0.1M 아르기닌(pH 6.7)으로 투석.
단계 2. 히드록시아파타이트 크로마토그래피(200μM 류펩틴 존재)
0-100% 구배의 0.264M 인산칼륨(pH 6.7)으로 4CV에 걸쳐 용리.
A280>A260인 푸울 2 후기(late)-용리 피크, TMAE 위로 로딩 스트레이트
단계 3. 프랙토겔 TMAE 이온 교환(200μM 류펩틴 존재)
핵산 제거(팔 무스탕(Pall Nustang) Q 필터도 사용될 수 있음)
비결합된 통과흐름을 수집 및 푸울링.
단계 4. 10mM 트리스 pH 8.0으로 투석
단계 5. Q 세파로스 HP 이온 교환(200μM 류펩틴 존재)
AUXII로부터 AUXI 분리
0-40% 구배의 10mM 트리스, 3mM CaCl2, 360mM NaCl pH 8.0로 20CV에 걸쳐서 용리
2개 피크 수집됨: 피크 1 = AUXII
피크 2 = AUXI
아르기닌은 AUXI 및 AUXII 함유 분획에 0.1M로 첨가
단계 6. 가압 교반된-세포에 의해 농축된 AUXI 및 AUXII 푸울
단계 7. 슈퍼덱스 75 겔 여과
AUXI 및 AUXII로부터 클로스트리파인 및 젤라티나제 제거
AUXI 및 AUXII를 개별 컬럼상에 단독으로 진행시킴
샘플을 5% CV로 로딩
` 완충액: 10mM 트리스, 3mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.1M 아르기닌 pH8
단계 8. AUXI 및 AUXII를 푸울링하고 개별적으로 농축시키고, 물로 정용여과한 후 푸울링시켜 최종 약물을 형성.
컬럼 상세:
표 15 5L 공정에 대한 컬럼 명세
컬럼 패킹
· 컬럼을 가능한 제조자의 지시에 따라서 패킹하였다.
· TMAE 컬럼 - 어떠한 문제도 없었다.
· Q 세파로스 및 슈퍼덱스 75 - 컬럼의 크기로 인해 압력을 바로잡는데 패킹에 어려움이 있었다. 그러나, 컬럼은 추천된 압력에서 진행될 수 있었다.
· HA - 50% 슬러리로서 패킹하였고 10mL/분으로 진행시켰다.
수율/5L 공정으로부터의 회수
표 16 AS ppt로부터 Q-세파로스 IEX로 정제. 크로마토그래피 단계 수율은 굵 게 표시한다.
표 17: Q-세파로스 IEX로부터 슈퍼덱스 75 GPC 후로의 정제
5L 공정으로부터의 수율은 ABCI 및 ABCII 각각의 약 60-75mg이다.
확대의 경우, 발효에 따라서, 20L에 대해 250-300mg의 수율 및 200L에 대해 2500-3000mg의 수율이 예상될 수 있었다.
5L 규모 공정의 개별적인 크로마토그래피 단계:
히드록시아파타이트 크로마토그래피
컬럼 크기: XK50/30 중 2 x 200mL (각 15cm 베드 높이)
완충액 A: 0.1M 인산칼륨, 200μM 류펩틴, pH 6.7
완충액 B: 0.264M 인산칼륨, 200μM 류펩틴, pH 6.7
샘플: ~350mL(0.1M 인산칼륨, 0.1M 아르기닌(pH 6.7) 중)가 <1.0mg/mL 배지*에서 로딩됨
유속: 9.8mL/분
용리: 4CV에 걸쳐 0-100% B
도 34는 히드록시아파타이트를 1L의 배지 당 1.0mg으로 로딩시킨 후의 크로마토그램을 도시하며, 여기서 분해능 및 표적 분해의 상당한 손실이 발생한다.
프랙토겔 TMAE 음이온 교환
컬럼 크기: XK26/20 중 58mL (10cm 베드 높이)
완충액 A: 10mM 인산칼륨, 0.2M NaCl, 200μM 류펩틴, pH 6.7
완충액 B: 10mM 인산칼륨, 2M NaCl, pH 6.7
샘플: ~650mL @ 0.5mg/mL(인산칼륨(pH 6.7) 중, HA 컬럼으로부터 스트레이트)가 ~5.5mg/mL 배지 * 에서 로딩됨
유속: 8.8mL/분
용리: (핵산을 용리시키는 100% B)
도 35는 프랙토겔 TMAE 음이온 교환 후 크로마토그램을 설명한다. 결합되지 않은 분획을 푸울링시켜 0.5mg/mL의 ~650mL를 제공하였다. 10mM 트리스(pH 8)로 투석.
도 36은 5L 규모 공정의 HA 전, HA 후 및 TMAE 후 재료의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 겔을 콜로이드 블루로 염색한다.
최초의 용리 구배를 이용한 Q 세파로스 HP 음이온 교환
컬럼 크기: XK50/20 중 100mL (5.0cm 베드 높이)
완충액 A: 10mM 트리스, 3mM CaCl2, 200μM 류펩틴, pH 8.0
완충액 B: 10mM 트리스, 3mM CaCl2, 360mM NaCl, 200μM 류펩틴, pH 8.0
샘플: ~650mL @ 0.5mg/mL(10mM 트리스(pH 8.0) + 200μM 류펩틴 중)가 ~3.0mg/mL 배지 * 에서 로딩됨
유속: 18.0mL/분
용리: 20CV에 걸쳐 0-40% B
도 37은 최초의 용리 구배를 이용한 Q 세파로스 HP 음이온 교환 후 크로마토그램을 설명한다. 아르기닌을 ABCI 및 ABCII 함유 분획에 0.1M으로 첨가한다. 피크 1 분획(ABCII)을 푸울링시켜 0.55mg/mL의 ~220mL를 제공하고 교반된-세포에 의해 농축시켜 2.8mg/mL의 ~45mL를 제공하였다. 피크 2 분획(ABCI, 젤리티나제 숄더 제외)을 푸울링시켜 0.45mg/mL의 ~190mL를 제공하고 교반된-세포에 의해 농축시켜 2mg/mL의 ~42mL를 제공하였다.
도 38은 피크 1(ABCII)에 대해 류펩틴의 존재하에 진행된 TMAE 후 재료의 Q 세파로스 IEX 크로마토그래피의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 겔을 콜로이드 블루로 염색하였다.
도 39는 피크 2(ABCI)에 대해 류펩틴의 존재하에 진행된 TMAE 후 재료의 Q 세파로스 IEX 크로마토그래피의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 겔을 콜로이드 블루로 염색하였다.
개질된 구배를 이용한 Q 세파로스 HP 음이온 교환
완충액 A에 NaCl을 첨가하고 더 가파르고/빠른 구배를 이용한 소규모 시험. 샘플은 TMAE 후 동결(-20℃) 전에 1/3 5L 공정으로부터 수득되었다.
컬럼 크기: 1mL
완충액 A: 10mM 트리스, 30mM NaCl, 3mM CaCl2, 200μM 류펩틴, pH 8.0
완충액 B: 10mM 트리스, 3mM CaCl2, 360mM NaCl, 200μM 류펩틴, pH 8.0
샘플: TMAE 후 3mg, 투석 후에 3mg/mL 배지로 10mM 트리스, 30mM NaCl, 200μM 류펩틴, pH 8.0으로 로딩시킴.
구배: 2CV에 걸쳐서 0-25% B, 2CV 동안 25% B, 7.5CV에 걸쳐서 25-40% B.
도 40은 개질된 용리 구배를 이용한 Q 세파로스 HP 음이온 교환 후 크로마토그램을 도시한다. ABCI 및 ABCII의 양호한 분리가 관찰된다. 두 번째 부분의 구배를 더 가파르게 하여 ABCI 피크를 날카롭게 할 수 있다. 피크의 개선은 3 및 10mg/mL의 배지로 로딩된 5mL의 CV를 이용하여 이루어질 수도 있다.
ABCII(IEX로부터의 피크 1)의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피
컬럼 크기: XK50/60 중 880mL (54cm 베드 높이)
완충액: 10mM 트리스, 3mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.1M 아르기닌, pH 8.0
샘플: 2.5mg/mL로 ~44mL(5% CV)(10mM 트리스, 3mM CaCl2, ~60mM NaCl, 0.1M 아르기닌, pH 8.0 중)
유속: 8.8mL/분
도 41은 ABCII(IEX로부터의 피크 1)의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피 후 크로마토그램을 도시한다. 피크를 푸울링시켜 1.2mg/mL으로 ~60mL의 ABCII를 제공하였다.
도 42는 아르기닌의 존재하에 진행된 농축된 ABCII의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 겔을 콜로이드 블루로 염색한다.
ABCI(IEX로부터의 피크 2)의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피:
컬럼 크기: XK50/60 중 880mL (54cm 베드 높이)
완충액: 10mM 트리스, 3mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.1M 아르기닌, pH 8.0
샘플: 2.0mg/mL로 ~42mL(5% CV)(10mM 트리스, 3mM CaCl2, ~60mM NaCl, 0.1M 아르기닌, pH 8.0 중)
유속: 8.8mL/분
도 43은 ABCI(IEX로부터의 피크 2)의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피 후 크로마토그램을 도시한다. 피크를 푸울링시켜 1.1mg/mL으로 ~60mL의 ABCI를 제공하였다.
도 44는 아르기닌의 존재하에 진행된 농축된 ABCI의 슈퍼덱스 75 겔 침투 크로마토그래피의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 겔을 콜로이드 블루로 염색한다.
확대 컬럼 사이징
표 18
*컬럼 유형 및 생성되는 베드 높이가 추가로 최적화된다. 배지 부피를 5L 규모로부터 선형 확대시킨다.
도 44b는 5L 정제 공정 흐름도를 설명한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 개시된 정제 공정의 투석 단계는 투석을 이용한 초여과/정용여과(UF/DF) 작업으로 대신될 수 있고 교반된 세포는 TFF(접점 흐름 여과)로 교체될 것이다. 상기 논의된 TMAE 단계는 임의적인 것이다.
본 발명은 상기 정제 공정에 의해 생성된(또는 생성될 수 있는) 콜라게나제 생성물을 포함한다. 이러한 콜라게나제 생성물은 뛰어난 고순도를 소유하고 효소 활성을 보유한다. 예를 들어, 조성물에는 클로스트리파인이 없다(예컨대, 무시할 정도나 검출될 수 없는 수준의 클로스트리파인 포함).
제조 공정의 최적화:
임상 연구를 뒷받침하고 상업-규모 공정을 제공하기 위해, 앞서 전개된 제조 공정의 최적화를 완료하였다. 공정 변화는 하기 간단하게 개시되며, 표 19에 요약된다.
표 19 BTC(공정 1) 및 옥실리엄 양식(공정 2 및 3)간의 공정 변화 개요
발효 최적화
최초 세포 뱅크 및 발효 공정으로부터 소-유래 원료의 제거를 실시하였다. 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 균주 004를 마스터 세포 뱅크로서 이용하기 위해 확대에 요구되는 계대 생육성에 기초하여 번식시켰다. 마스터 세포 뱅크에 대한 명세 및 분석 결과는 표 20에 개시한다. 콜라게나제의 생체질량 및 생성을 증가시키기 위해, 유가식-회분 발효 방법을 무-동물 원료를 이용하여 성장 배지에서 20L의 발효 규모로 전개하였다. 200L로의 추가의 발효 확대는 일관된 세포 성장, 콜라게나제 발현 및 개선된 불순물 프로필을 보장하기 위해 돼지-유래 배지 성분(즉, 프로테오스 펩톤 #3, 후술됨)의 이용을 요구하는 것이 관찰되었다. 다운스트림 공정에 대한 콜라게나제의 수율 및 순도를 개선시키기 위해 후속적인 변경이 이루어졌다. 이러한 변경에는 신규한 분리 및 여과 방법의 부가 및 200L 회분 발효 규모를 지원하기 위한 생산 장비의 확대가 있다. 도 45는 공정 3에 대한 발효의 흐름도를 도시한다.
표 20 마스터 세포 뱅크에 대한 분석 명세 및 시험 결과
일차 회수 및 정제 최적화
일차 회수 및 다운스트림 정제 공정을 최적화하기 위한 추가 개발에 착수한다. 콜라게나제를 포획하기 위해 페닐 세파로스 빠른 흐름의 저 서브 컬럼 크로마토그래피를 이용한 암모늄 설페이트 침전의 치환은 수율을 개선하고, 벌크 암모늄 설페이트의 이용을 배제하고 무균 가공을 개선시키기 위해 실행되어 왔다.
정제와 관련하여, 팔 무스탕 Q 필터를 잔류 DNA 및 불순물 제거에 이용하여 수율을 추가로 개선하고 생산 공정 트레인 및 유효 요건들은 단순화하였다. 4차 아민 세파로스 고성능(Q HP) 작업 파라미터를 최적화하여 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 단계를 배제시켰다. 상기 인용된 공정 변화에 추가하여, 약물 제형을 개질시켜 10mM 트리스, 60mM 수크로오스, pH 8.0를 포함하도록 함으로써 생성물 용해성 및 약물 및 약품 안정성 둘 모두를 개선시켰다.
최적화 공정은 두 단계로 일어났다. 개시 공정(공정 2)은 20L 규모에서 수행된 유가식-회분 발효에서 모든 세포 뱅킹(banking) 및 발효 단계에 무-동물 배지를 이용한다. 다운스트림 공정은 공정 1로부터 개작하여 잔류하는 DNA 제거를 위한 무스탕 Q 여과 및 추가의 숙주 세포 오염물질 제거를 위한 슈퍼덱스 75 GPC를 포함하도록 하였다. 류펩틴도 크로마토그래피 완충액 시스템에 첨가되어 단백질분해를 억제한다. 공정 2 재료는 공정 1 재료(표 21A)와 분석적으로 중개되어 있으며, 본원에 개요된 임상 연구 전에 동시에 시험되었다. 공정 2 재료는 3상 임상 프로그램의 초기 단계에 이용이 제안되었다. 공정 2 중간체 및 약물에 대한 명세는 각각 표 22 및 23에 상세된다. 추가의 공정, 제형화 및 냉동건조 전개가 최적화된 제조 공정(공정 3)을 제공하였다. 이러한 변화에는 신규한 분리 및 여과 방법의 부가 및 표 19에 개요된 대로 200L 회분 발효 규모를 지원하는 생산 장비의 확대가 있다. 표 46은 공정 3에 대한 정제의 흐름도를 도시한다.
용량 발표: 초기 시험관내 효능 검정은 소 콜라게나제 검정이었고 콜라게나제 유형 I 및 II를 구별하지 않았다. 이 검정은 오픈 라벨, DUPY101 및 DUPY202 임상 연구에만 이용된 물질에 대해 이용되었고, 0.58mg의 용량이 통상적으로 10,000 유닛의 효능을 야기하였다. 유형 I 콜라게나제 및 유형 II 콜라게나제에 대한 현행의 분리된 시험관내 효능 검정을 이용한 공정 1 재료의 분석은 통상적으로 유형 I 콜라게나제에 대해 1,700 내지 3,500 유닛/용량(0.58mg 용량) 및 유형 II 콜라게나제에 대해 43,000 내지 69,000 유닛/용량(0.58mg)을 초래하였다. 현행 시험관내 효능 검정을 이용한 공정 2 재료의 분석으로부터, 공정 1 재료에 비해 유사한 상대 효능 값이 통상적으로 달성됨을 확인하였다.
공정 1 및 공정 2간의 분석적 비교가능성의 입증: 공정 1 및 공정 2간의 변화를 뒷받침하기 위하여, 비교가능성 데이터를 방출 시험 및 분석적 특징의 형태로 제공하였다. 이러한 데이터를 표 21에 제공한다.
중간체의 비교가 AUX-1 및 AUX-11로서 개시된 중간체, 및 이전 공정(공정 1; 참조)과 본 발명의 공정(공정 2)으로부터의 약물 비교. 이러한 분석적 비교는, 공정 2에서 제조된 재료가 공정 1에서 제조된 재료에 필적함을 나타낸다(표 21). 구체적으로, 이러한 물질들간의 주체성, 효능 및 순도가 비교가능하다.
공정 2 중간체의 순도 수준이 환원된 SDS-PAGE 코마시 염색된 겔인 도 47에 도시된다. 이 겔은 다른 소 밴드의 흔적 없이 각 중간체에 대한 단일 밴드를 나타낸다. AUX-I는 참조(ABC I)와 비교하여 115kDa의 겉보기 MW를 지니는 반면, AUX-II는 참조(ABC II)와 비교하여 110kDa의 겉보기 MW를 지닌다. 도 48은 약물을 도시하는 환원된 SDS-PAGE 코마시 염색된 겔을 나타낸다. 중간체와 같이, 공정 2에 의해 제조된 약물을 참조(공정 1)와 비교한다. 은 염색된 SDS-PAGE 겔이 고순도의 공정 2 약물을 추가로 입증하고 있는 도 49에 도시된다. 요약해 보면, 공정 2를 이용하여 제조된 중간체(AUX-I 및 AUX-II) 및 약물에 대한 방출 시험 및 분석적 특징으로부터 공정 1(참조) 물질과의 비교가능성이 명확히 입증된다. 또한, 추가의 방출 시험을 공정 2 재료에 대해 수행하였고 표 21B에 열거한다. 결론적으로, 공정 1 및 공정 2 재료간의 직접적인 분석적 비교(표 21), 및 추가로 중간체 및 방출 시험(표 22)은 공정 2 재료가 사람에 대한 연구에 사용하기 적합함을 나타낸다. 표 23 및 표 24는 공정 2 제조 공정으로부터 수득된 분석적 명세를 추가로 나열한다.
표 21 (공정 1) 및 옥실리엄(공정 2) 중간체 및 약물간의 분석적 비교가능성
*공정 1 예빙 명세는 본원에 포함되지 않음
**본 시험에 이용될 수 없는 약물, 입수가 제한된 공급
***AUX-I(참조와 동일함)에 대해 N-말단 서열화가 완료되었으나, N-말단으로서 AUX-II에 요구되는 추가의 전개는 차단된 것으로 보임.
표 22 공정 2 중간체 및 약물에 대한 분석 결과
*결과는 이전의 잔류하는 DNA 방법의 LOQ로부터이다.
표 23 공정 2 AUX-I 및 AUX-II 중간체에 대한 분석 결과
표 24 공정 2 약물에 대한 분석적 명세
*추가 제조를 위한 약물의 일시적인 방출에 요구되는 시험
공정 3에 대한 상세한 실험:
공정 3 발효:
공정 2 동안 적용된 피톤 펩톤을 이용한 발효 공정은 DSP 전개 및 GMP 제조를 위한 두 공급 동안 현저한 가변성을 나타내었다.
이전의 작업 동안, 동물 유래된 프로테오스 펩톤은 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 성장을 매우 잘 지원하는 것으로 나타났다. 동물 유래 프로테오스 펩톤 배양은 공정 2 동안 관찰된 것 보다 클로스트리파인을 현저하게 덜 생성하였고 AUXI 및 AUXII을 1:1의 비로 발현시켰다. 결과적으로, 벡톤 디킨슨(PP3)으로부터의 프로테오스 펩톤 #3인 규정된 허용가능한 동물 유래된 펩톤을 5L 발효기에서 평가하였다. 공정(공정 2)에 기초한 현존하는 피톤에 대한 초기 비교는, PP3을 50g/L로 이용시 기하급수적인 빠른 성장 속도로 높은 생체질량 농도가 생성되었음을 나타내었다. 발효는 공정 2로부터의 ~230mg/L에 반해 >350mg/L의 총 콜라게나제의 높은 생성 수율을 야기시켰다(반 정량적 SDS-PAGE 분석에 의해). PP3을 이용한 추가의 발효는, 동물 유래된 발효 배지 이용시 클로스트리파인이 상당히 덜 생성되었음을 입증하였다. 처음 3개의 발효(PP3의 한 회분 이용)는 매우 일관된 성장 프로필을 입증하였다. 생성물을 SDS-PAGE로 분석했을 때, 콜라게나제의 수율 및 순도는 3개의 발효간에 매우 재현성이 있는 것이 발견되었다.
공정을 전개하기 위한 재료를 DSP에 공급하기 위해, PP3을 이용한 수 개의 발효를 수행하였다. 이러한 공급 재료에 대해 PP3의 세 상이한 회분을 이용하였다. 이들 회분 중 2개 이용시, 배양의 성장 프로필은 이전의 PP3 발효와 일치하지 않았고 성장 프로필에 있어서 발효간에 가변성이 입증되었음을 주목해야 한다. PP3에 있어서의 회분 대 회분의 가변성이 이러한 변화를 야기하였음이 소규모 연구에 의해 밝혀졌다. 소규모 연구는, PP3 농도를 100g/L로 증가시키는 것이 이러한 변화를 억제할 것이라는 것도 입증하였다.
두 회분의 펩톤을 이용하여 100g/L의 PP3을 지니는 두 5L 발효를 수행하였으며, 하나는 통상적인 성장 프로필을 나타낸 반면 하나는 그렇지 않았다(소규모 실험 동안 입증됨). 상기 실험은, 농도의 증가가 상이한 회분의 PP3을 이용한 두 발효가 재현될 수 있음을 보장한다는 것을 증명하였다. 성장 프로필은 매우 유사하였고 생성물은 유사한 수율 및 순도로 발현되었다.
100g/L의 PP3을 이용한 최적화된 발효 공정은 최종적으로 200L로 확대되었다. 200L 성장 프로필은 5L 규모에서 보여진 것과 매우 유사하였다. 발효 여액의 SDS-PAGE 분석은 ~320mg/L의 총 콜라게나제에 이르는 200L 발효로부터 고 수율을 나타내었다(정량적 밀도계 분석). 콜라게나제 생성물(발효 후)의 순도는 5L 및 200L 규모 둘 모두에서 유사하였다. 200L 발효 여액 중 20L를 DSP기에 의해 가공하였고 이는 다운스트림 공정에 대한 부분적인 확대를 나타낸다(후술됨).
프로테오스 펩톤 #3 발효 공정(공정 3)은 현존하는 피톤 공정 보다 높은 수율의 콜라게나제 및 적은 양의 클로스트리파인을 생성하였다. PP3는 100g/L에서 다양한 회분의 PP3를 이용했음에도 불구하고 재현될 수 있는 성장 곡선을 지니는 C. 히스콜리티쿰(C. histolyticum) 배양을 초래함을 나타내었다. 콜라게나제의 수율 및 순도 둘 모두는 다양한 로트의 PP3 이용시에도 재현될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
C. 히스콜리티쿰( C. histolyticum )으로부터 콜라게나제를 생성하기 위한 원료로서 프로테오스 펩톤 #3의 평가
복합 질소 공급원으로서 피톤 펩톤을 이용한 발효에서 관찰된 가변성으로 인해, 프로테오스 펩톤 #3(벡톤 디킨슨, 212230)(PP3)의 적합성을 5L 발효에서 평가하였다. 50g/L의 PP3을 이용한 단순 회분 방법을 이용하였다. 정확한 배지 조성은 재료 및 방법 섹션에서 찾아볼 수 있다.
도 51은 50g/L PP3(공정 2의 피톤 농도 보다 낮은 농도)의 성장 곡선을 피톤 유가식-회분 배양과 비교한다. PP3 배양은 접종한 지 약 8시간 후 정지기에 들어가기 전에 대수증식기 동안 매우 빠른 비(specific) 성장 속도를 나타낸다. PP3 발효는 4.7 유닛의 최대 광학 밀도(600nm)에 도달하였다. 배양액을 정지기에 추가로 12시간 동안 방치하고 생성물 형성/분해를 모니터링하였다.
도 52는 PP3 배양의 20시간 포인트로부터 콜라게나제 생성물의 농도의 SDS-PAGE 반-정량적 분석을 도시한다. 도 53은 피톤 유가식-회분 공정에 대한 동일한 분석을 도시한다. PP3 발효가 피톤 기재 공정 보다 더 많은 생성물을 제공하였음이 관찰될 수 있다(도 52 및 53의 반-정량적 분석에 기초하여, 230mg/L로부터 360mg/L로 총 콜라게나제의 증가). PP3 배양은 AUXI 및 AUXII을 1:1 비로 발현시킨 한편, 공정 2는 두 단백질을 1:1.6 비로 생성하였다.
프로테오스 펩톤 #3 회분 발효의 재현성
로트 #5354796의 프로테오스 펩톤 #3을 이용하여 PP3 회분 공정의 재현성을 추가로 조사하였다. 도 54에 도시된 3개의 진행 모두는 8시간 후에 수득된 약 4.5의 최대 광학 밀도(600nm)를 지니는 일관된 성장 프로필을 입증한다.
발효 수확점의 반-정량적 SDS-PAGE 분석은 총 콜라게나제 수율이 ~350-400mg/L인 것으로 나타내었다.
발효의 수확점도 본 연구 동안 평가되었다. 발효를 8, 11 및 20시간에 수확하였다. 도 55 및 56은 PP3 발효 GCFT05d의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석을 도시한다(11시간에 수확됨). 도 55에 도시된 겔을 콜로이드 블루로 염색하고 도 56의 겔을 은 염색하였다. 세 번째 고분자량 밴드가 도 55 및 56의 겔 상에서 두 콜라게나제 밴드 위에서 관찰될 수 있다. 이 밴드는 문헌에서 보고된 AUXI 전구체 단백질에 상응하는 것으로 여겨진다. 전구체 밴드는 대수증식기 동안 존재한다. 대수증식기의 끝에서 전구체 밴드의 강도는 감소되며 11시간 후에는 존재하지 않는다(GCFT05d에서). 메인 저분자량 오염물질이 약 90, 60, 55, 45 및 40kDa에서 은 염색된 겔 상에 나타날 수 있다. 이러한 오염물질이 낮은 수준으로 존재하며 은 염색된 겔 상에서만 명확히 검출되는 것에 주목해야 한다. 발효에 대한 최적의 수확점은 전개의 본 단계에서 ~11시간인 것으로 결정되었다. 도 57은 표준 피톤 유가식-회분 발효의 시간 추이로부터 샘플의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 40kDa의 오염물질이 도 57의 겔 상에서 관찰될 수 있다. 피톤 유가식-회분 공정으로부터의 40kDa 오염물질 밴드는 프로테아제 클로스트리파인인 것으로 동정되었다. 도 55 및 57의 겔을 비교함에 의해, PP3 발효 공정을 이용하여 생성된 클로스트리파인의 양이 피톤 기재 발효에 비해 현저히 낮음을 확정할 수 있다.
다운스트림 공정 전개를 위한 공급 재료의 생성
다운스트림 공정(DSP) 전개를 뒷받침하기 위해, 50g/L의 PP3을 이용한 여러 발효를 수행하였다. 이러한 발효 동안 두 상이한 로트의 PP3을 이용하였다(5332398 및 5325635). 도 58은 로트 #5354796(GCFT05d)를 이용한 발효(스퀘어로 표시됨)와 비교하여 이러한 발효(다이아몬드로 표시됨)의 성장 곡선을 도시한다. 새로운 회분의 PP3을 이용한 발효는 매우 다양한 성장 프로필을 나타낸다. 배양의 초기 성장 속도가 모두 매우 유사하지만, 이들이 정지기에 들어가 최대 생체질량 농도가 되는 시점은 매우 다르다. 접종 배양액의 광학 밀도(600nm)는 PP3 로트 #5354796을 이용한 이전의 접종으로부터 매우 근소한 변화(5mL 단계의 OD600; 2.9-3.6 유닛, 200mL 단계의 OD600; 4.5-5.9 유닛)가 있고 감소되지 않은 것으로 나타났다. 변화 및 감소된 광학 밀도(600nm)만이 배양의 최종(발효) 단계에서 스스로 나타났다. 이것은, 변화의 원인이 PP3에서의 영양소 제한 및 PP3의 회분간에 변화된 제한적인 영양소의 양 때문이었음을 시사한다.
비록 이러한 발효가 생성된 콜라게나제의 양에 있어서 대단한 변화가 존재하지 않았음을 보여주는 DSP 전개 및 SDS-PAGE 분석에 성공적으로 이용되었으나(반-정량적 SDS-PAGE 분석에 기초하여 350-400mg/L의 총 콜라게나제, 데이터는 도시되지 않음), 변화의 원인을 조사하는 것이 여전히 중요한 것임이 결정되었다. 성장 프로필의 변화는 발효의 수확점을 예측하기가 매우 어렵게 만들 것이다. 영양소 제한이 피톤 유가식-회분 공정에서 보여진 다른 프로테아제의 발현, 특히 프로테아제 클로스트리파인의 발현을 유도할 수 있다는 것도 관심사였다.
프로테오스 펩톤 #3의 회분간에 변화에 대한 조사
PP3를 이용한 초기 작업은 보다 높은 생성물 수율 및 더 낮은 수준의 프로테아제 클로스트리파인을 지니는 매우 견고한 공정을 입증하였다. 새로운 회분의 PP3을 적용하는 경우, 공정 견고성은 매우 가변적인 성장 프로필을 지니며 현저히 감소되는 것이 관찰되었다. 진탕 플라스크 실험을 수행하여 지금까지 사용된 3개의 PP3 회분(로트 5354796, 5325635 및 5332398)을 직접 비교하였다. 실험은 5L 공정으로부터의 2단계 접종 공정을 되풀이하였으나, 최종 발효상을 또 다른 200mL 배양액으로 교체하였다. 이 세 번째 단계가 중요하기 때문에, 이전 실험에서의 공정의 최종 발효 단계에서만 변화가 관찰되었다. 배양액의 광학 밀도(600nm)를 각 이동 단계에서 측정하였고, 배양액을 다음 단계를 접종하는데 이용하였다. 3개 회분의 50g/L의 PP3를 이용하여 배지를 제조하였다. 5L 실험 동안 낮은 생체질량 농도의 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)을 생성시킨 2개의 회분 중 하나(로트# 5332398)도 100g/L로 제조하였다.
도 59는 소규모 실험으로부터의 결과를 도시한다. 로트 5325635 및 5332398이 세 번째 단계에서 약 2.5 유닛의 감소된 광학 밀도(600nm)를 나타내었음을 관찰할 수 있고, 이것은 PP3의 "불충분한" 회분으로 간주되었다. 로트 5354796은 배양의 세 번째 단계에서 5 유닛의 광학 밀도(600nm)를 유지하며, 이것은 PP3의 "양호한" 회분으로 간주되었다. 흥미롭게도 PP3의 "불충분한" 회분(5332398)의 농도를 100g/L로 증가시켰을 때, 배양의 두 번째 및 세 번째 단계에서 동일한 광학 밀도(600nm)가 달성되었다. 이러한 데이터는, 성장 프로필에서의 편차가 PP3의 회분간에 제한적인 영양소의 양 변화에 의해 야기된 것이라는 이론을 뒷받침한다. PP3 회분의 분석 시험에 의해 이러한 영양소를 규명하는 것은 불가능했다.
5L 발효에서 100g/L의 프로테오스 펩톤 #3의 평가
PP3의 농도를 50에서 100g/L로 증가시켜 회분 대 회분 가변성의 문제가 제거됨이 소규모 연구 결과로부터 입증되었다. 이러한 공정 변화는 PP3 가변성에 대한 소규모 조사 동안 측정된 PP3의 "양호" 및 "불충분"한 회분을 이용하여 5L 규모로 시험되었다(각각 로트 5354796 및 5325635). 도 60은 두 발효의 성장 프로필을 도시한다. 두 배양액은 대수증식기 동안 동일한 비 성장 속도를 나타낸다. 발효가 정지기에 들어가 약 6.5 유닛의 매우 유사한 최대 광학 밀도(600nm)에 도달한다. 이러한 데이터는, PP3의 농도를 증가시키는 것이 PP3의 회분 대 회분 가변성의 문제를 경감시킴을 입증한다. 달성된 더 높은 생체질량 농도 및 발효에서의 더 긴 대수증식기로 인해, 수확점은 12시간까지 연장되었다.
도 61 및 62는 100g/L의 PP3을 이용한 두 발효의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 겔은 두 발효에서 콜라게나제의 일관된 발현을 입증한다. 두 발효로부터의 샘플은 도 56에 개시된 유사한 수준의 오염물질을 함유하는 것으로 보이나, PBFT70d는 다소 더 많은 40kDa 밴드(클로스트리파인)를 함유하는 것처럼 보인다. 이러한 작은 차이는 염색 또는 로딩 차이일 수 있다. PP3 공정을 이용하여 생성된 클로스트리파인의 양 역시 피톤 공정에 비해 현저히 적었다. 전구체 밴드는 발효의 시간 추이에 비해 더 길게 존속하는 것으로 보인다. 앞으로의 100g/L에서의 발효는 14시간의 수확까지 연장될 것이 추천되었다.
전구체 밴드의 존재는 수확점 정의 및 공정이 유효한 동안 이의 조건(qualification)의 중요성을 강조한다.
도 63은 도 61의 겔의 밀도계 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 챠트는 생성물 및 전구체 형성(밀도계 피크 면적)과 세포 성장(OD600)을 비교한다. 생성물 형성은 세포 성장과 일치하는 것처럼 보이며 생성 속도는 배양이 정지기로 들어가면서 감소된다. 전구체 밴드는 대수증식기 끝에 강도가 감소하나 발효의 수확점에 여전히 존재한다.
200L로 100g/L 프로테오스 펩톤 #3 발효의 확대
PP3 농도가 100g/L로 증가됨에 따라서, 공정은 200L로 확대되었다. 200L 용기용으로 요구되는 접종량을 생성하기 위해, 세 번째 접종 단계를 15L의 작업 부피 발효기를 이용하여 도입하였다. 3 x 200mL 배양액을 이용하여 15L 발효기를 접종하고 이어서 12시간 성장시키고 15L 중 8L를 200L 용기에 접종하였다. 도 64는 200L 발효의 성장 곡선을 100g/L의 PP3을 이용한 두 5L 발효와 비교한다. 추천된 대로 성장 프로필을 14시간까지 연장하여 전구체 밴드가 가공이 시작되기 전에 완전히 사라지도록 하였다. 200L 발효의 성장 프로필은 5L 규모의 발효와 매우 유사하였고, 이것은 배양의 성공적인 확대를 입증한다.
도 65는 200L 발효의 시간 추이의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 겔은 발효 진행 동안 생성물 형성을 도시한다. 14시간 수확점에서의 재료는 검출될 수 있는 전구체를 함유하지 않고 매우 낮은 수준을 오염물질을 지녔다. 200L 발효로부터 생성된 생성물은 5L 공정으로부터 생성된 것과 매우 유사한 것처럼 보이는데, 이것은 200L 공정이라는 증가된 생성 숫자가 유해한 효과를 지니지 않음을 나타낸다. 도 66은 도 64의 겔의 밀도게 분석으로부터의 데이터를 나타낸다. 챠트는 생성물 및 전구체 형성(밀도계 피크 면적)을 세포 성장(OD600nm)과 비교한다. 생성물 형성은 세포 성장과 일치하는 것으로 보이며 생산 속도는 대수증식기의 끝에서 강도가 감소된다. 전구체 밴드는 5L 배양, PBFT70c(도 63) 보다 200L 발효에서 보다 급속하게 강도가 감소된다. 도 67은 200L 발효 시간 추이에 따른 4-12% 비스-트리스 겔을 이용한 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 검출된 오염물질의 추정되는 분자량을 겔 상에 기입한다.
공정 2에 대해 전개된 수확 공정(여과에 의한 정화)을 200L 확대 발효 동안 평가하였다. 세포 배양액을 필터 트레인의 방해물이 없는 현존하는 공정을 이용하여 성공적으로 정화시켰다. 수확 공정은 재료 및 방법 섹션에 개시된다. 200L 발효로부터의 20L 여액을 DSP에 의해 가공시켜 다운스트림 공정 3의 부분적인 확대를 입증하였다(후술함).
밀도계 분석에 의한 생성물 수율의 정량
업스트림 공정 단계 동안의 생성물 농도를 결정하는데 반-정량적 SDS-PAGE 분석(도 62 및 63) 보다 더 정확하고 정량적인 방법이 요구되었다. 발효 여액은 UV 및 브래드포드 검정과 같은 표준 단백질 정량 기술을 사용할 수 없게 만드는 성장 배지로부터의 높은 양의 안료 및 펩티드를 지녔다. 코마시 염색된 겔의 밀도계 분석을 수행함에 의해 이전에 수행된 반-정량적 분석을 개질하고 업데이트하였다. 이 방법은 소정 범위량(0.2-1.2㎍/레인)의 혼합된 AUXI 및 AUXII 참조 물질을 로딩시키는 것과 트리스 글리신 겔 상으로 정량된 샘플의 희석을 수반하였다. 이후 스캐닝된 이미지를 분석하고 표준 및 샘플에 대해 피크 면적을 산정하였다. 표준 곡선을 그리고(총 콜라게나제) 샘플 희석액 중 총 콜라게나제의 양을 정량하는데 이용하였다. 도 68은 콜라게나제 표준 곡선의 예를 도시하며 샘플의 예상된 범위내에서 정량 방법의 선형성을 강조한다. 트리스 글리신 겔이 AUXI 및 AUXII을 완전히 용해시키지 않았으므로, 두 단백질을 별개로 정량하지 않고 총 콜라게나제를 정량하였다.
콜라게나제의 양을 PBFT70c, PBFT70d 및 200L 확대 발효에 대해 분석하였다. 양은 3개 모두의 발효에 대해 ~280-350mg/L의 총 콜라게나제인 것으로 밝혀졌다.
재료 및 방법
배지 제조:
1L 배지 제조
접종 제조물(표 25)용 포스페이트를 1L 보틀에서 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하였다. 벌크 배지(표 26)를 먼저 마이크로웨이브에서 60℃로 가열시켜 성분들을 완전히 용해시키고 1L 보틀에서 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하였다. PSA1(표 27)을 0.2㎛ 사르토포어(Sartopore) 2 150cm2 필터를 통해 250mL의 살균 보틀로 여과하였다. 300mL의 오토클레이빙된 포스페이트, 600mL의 오토클레이빙된 벌크 배지 및 100mL의 살균여과된 PSA 1을 푸울링하고 30mL의 감마 조사된 유니버셜(8 x 5mL) 및 500mL의 에를렌마이어 플라스크(4 x 200mL)로 분취시켰다.
표 25 접종 제조물에 대한 포스페이트 조성
표 26 접종 제조물에 대한 벌크 배지 조성
표 27 접종 제조물에 대한 PSA 1 마그네슘/글루코오스 조성
표 28 접종 제조물에 대한 비타민 용액
5L 배지 제조물
5L 규모(표 29)용 포스페이트를 1L 보틀에서 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하였다. 벌크 배지(표 30)를 5L 용기에 직접 첨가하고 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하였다. PSA 1(표 31)을 0.2㎛ 사르토포어 2 150cm2 필터를 통해 500mL의 살균 보틀로 여과하였다. 용기의 오토클레이빙 및 냉각 완료시에 250mL의 포스페이트 용액 및 200mL의 PSA 1을 5L 용기로 따로따로 펌핑하였다.
표 29 5L 발효에 대한 포스페이트 조성
표 30 5L 발효에 대한 벌크 배지 조성
표 31 5L 발효에 대한 PSA 1 마그네슘/글루코오스 조성
표 32 5L 발효에 대한 비타민 용액
15L 배지 제조물
포스페이트 용액(표 33)을 0.2㎛ 사르토포어 2 300cm2 필터를 통해 2L의 살균 보틀로 여과하였다. 벌크 배지(표 34)를 20L 용기에 직접 첨가하고 용기를 스팀-인-플레이스(SIP) 살균하였다. PSA 1(표 35)을 0.2㎛ 사르토포어 2 300cm2 필터를 통해 1L의 살균 보틀로 여과하였다. 용기의 SIP 및 냉각 완료시에 750mL의 포스페이트 및 600mL의 PSA 1을 20L 용기로 따로따로 펌핑하였다.
표 33 15L 발효에 대한 포스페이트 조성
표 34 15L 발효에 대한 벌크 배지 조성
표 35 15L 발효에 대한 PSA 1 마그네슘/글루코오스 조성
표 36 15L 발효에 대한 비타민 용액
200L 배지 제조물
포스페이트 용액(표 37)을 0.2㎛ 사르토포어 2 300cm2 필터를 통해 감마사르트(Gammasart) 바이오시스템 SA10 10L 백으로 여과하였다. 벌크 배지(표 38)를 200L 용기에 직접 첨가하고 용기를 SIP 살균하였다. PSA 1 용액(표 39)을 0.2㎛ 300cm2 필터를 통해 감마사르트 바이오시스템 SA10 10L 백으로 여과하였다. 용기의 SIP 및 냉각 완료시에 10L의 포스페이트 및 8L의 PSA 1을 200L 용기로 따로따로 펌핑하였다.
표 37 200L 발효에 대한 포스페이트 조성
표 38 200L 발효에 대한 벌크 배지 조성
표 39 200L 발효에 대한 PSA 1 마그네슘/글루코오스 조성
표 40 200L 발효에 대한 비타민 용액
발효
도 69는 5 및 200L 규모의 피톤 및 PP3 발효 공정에 대한 공정 흐름의 개관을 설명한다.
5L 규모의 발효
WCB의 바이알(2005#1019D)을 해동시키고 50㎕의 분취량을 이용하여 30mL의 감마 조사된 유니버셜 중의 8x5mL의 접종 배지에 접종시켰다. 5mL 배양액을 37℃에서 혐기성 병에서 3개의 혐기성 가스 팩의 존재하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 지 약 12시간 후(OD600 3.0-4.0) 2x5mL 배양액을 선택하고 500mL의 에를렌마이어 플라스크 중 2x200mL의 접종 배지를 접종하는데 이용하였다. 2개의 플라스크를 3개의 가스 팩을 지니는 혐기성 병에 함께 두고 37℃에서 진탕 인큐베이터(70rpm)에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 접종한 지 12시간 후(OD600 6.0-7.0) 각 200mL의 접종물을 이용하여 5L 용기를 접종하였다.
5/7L 용기 FT 아플리콘(Applikon) 용기의 작업 부피는 5L였고 이의 4%(v/v)는 200mL 단계로부터의 접종물이었다. 교반 속도는 100rpm으로 설정되었다. pH, dO2 및 온도를 각각 7.00 유닛, 0% 포화 및 37℃로 조절하였다. HCl(5M) 또는 NaOH(5M)를 첨가하여 pH를 조절하였다. dO2 농도는 질소의 지속적인 살포에 의해 0%로 유지되었고 질소의 유속은 1L/분이었다. 발효 동안 샘플을 취하고 0.2㎛ 필터를 통해 여과시킨 후 분석을 목적으로 -20℃에서 저장하였다. 발효는 6.0-7.0의 OD600에서 정지기로 들어가지 시작했다. 12시간 후, 발효기를 10-20℃로 냉각하고 나서 수확 회수를 시작하였다.
200L 규모의 발효
WCB의 바이알(2005#1019D)을 해동시키고 50㎕의 분취량을 이용하여 30mL의 감마 조사된 유니버셜 중의 8x5mL의 접종 배지를 접종시켰다. 5mL 배양액을 37℃에서 혐기성 병에서 3개의 혐기성 가스 팩의 존재하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 지 약 12시간 후(OD600 3.0-4.0) 4x5mL 배양액을 선택하고 500mL의 에를렌마이어 플라스크 중 4x200mL의 접종 배지를 접종하는데 이용하였다. 2개의 플라스크를 3개의 가스 팩을 지니는 혐기성 병에 함께 두고 37℃에서 진탕 인큐베이터(70rpm)에서 12시간 동안 인큐베이션되도록 두었다. 인큐베이션한 지 12시간 후(OD600 6.0-7.0) 4개의 플라스크 중 3개를 함께 푸울링하고 20L 용기를 접종하는데 이용하였다.
20L 용기의 작업 부피는 15L였고 이의 4%(v/v)는 200mL 단계로부터의 접종물이었다. 교반 속도는 100rpm으로 설정되었다. pH, dO2 및 온도를 각각 7.00 유닛, 0% 포화 및 37℃로 조절하였다. HCl(5M) 또는 NaOH(5M)를 첨가하여 pH를 조절하였다. dO2 농도는 질소의 지속적인 공간부분 살포에 의해 0%로 유지되었고 질소의 유속은 20L/분이었다.
20L 용기에서 성장시킨 지 12시간 후(OD600 6.0-7.0) 8L의 배양액을 이용하여 200L 용기를 접종하였다. 진행 조건은 20L 규모와 동일하였다. 수확시 최종 광학 밀도(600nm)는 6.0-7.0이었다. 14시간 후 발효기를 10-20℃까지 냉각하고 나서 수확 회수를 개시하였다.
수확
5L 수확
5L 배양액을 밀리스택+10" 옵티캡 깊이 필터(Millipore, KC0HC10FF1) 및 0.2㎛ 사르토포어 2 300cm2 필터를 통해 5L/h의 유속으로 250mL의 살균 바이오-컨테이너로 펌핑하였다. 가공된 재료를 DSP로 가공하기 전에 -20℃에서 저장하거나 4℃에서 밤새 저장하였다.
200L 수확
여과 수확 트레인을 이용하여 200L 수확을 수행하였다. 배양액을 4x1m2의 여과 면적을 지니는 밀리스택+(MC0HC10FS1) 일회용 깊이 필터에 이어서 2개의 0.2㎛ 익스프레스 옵티캡 XL 10 필터, 2x0.49m2(Millipore, KHGES10TT1)를 통해 200L/h의 유속으로 펌핑하였다. 일차 정화의 공정 시간은 1시간이었다. 필터에 걸린 잔류하는 생성물을 회수하기 위해 수확의 끝에 추가 10분을 허용하였다. 정화된 상청액을 여액 중량을 기록하면서 200L 스테딤 팔레탱크(Stedim Palletank)에 수집하였다. 20L 여액을 무스탕 Q 고 친화력 DNA 컬럼을 통해 ~6L/분의 유속으로 통과시키고 2개의 살균된 20L 스테딤 백에 수집하고 나서 4℃에서 밤새 저장하였다.
분석
광학 밀도 측정
분광광도계를 600nm의 파장에서 PBS를 이용하여 블랭킹하였다. 발효 샘플을 PBS를 이용하여 10, 20 또는 100(세포 밀도에 따라서)의 인자로 희석시켰다.
1mL의 각 희석된 샘플을 1mL 큐벳으로 옮겼다; 상부를 밀봉하고 5회 뒤집은 다음 600nm의 파장에서의 광학 밀도 판독치를 3회 기록하였다.
트리스-글리신 겔
발효 샘플을 SDS-PAGE 분석을 위해 준비하기 전에 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 10㎕의 여과된 샘플을 10㎕의 샘플 완충액(2x), 2.5㎕의 환원제(10x) 및 2㎕의 0.1M EDTA에 첨가하였다(10mM의 최종 농도 달성). 10㎕의 농축된 스톡을 80㎕의 환원제(10x), 310㎕의 WFI 및 400㎕의 샘플 완충액(2x)에 첨가시켜 고분자량(HMW) 마커를 제조하였다. 희석된 HMW 표준을 95℃까지 5분 동안 가열하고 분취시키고 후속의 겔에 이용하기 위해 -20℃에서 저장하였다. 15㎕의 발효 샘플 및 10㎕의 HMW 마커를 미리-냉각된(4℃) 트리스-글리신 진행 완충액을 이용하여 130V, 400mA 및 100W에서 ~1시간 50분 동안 8% 트리스-글리신 겔 상에서 진행시켰다. 전기영동 후, 겔을 100mL의 콜로이드 블루 염색시약에 가라앉히고(55mL WFI, 20mL 메탄올, 5mL 염색제 A, 20mL 염색제 B) 5시간 동안 60rpm의 오비탈 진탕기 상에 염색되게 두었다. 200mL의 WFI로 겔에서 염색제를 제거하였다. 과량의 염색이 제거될 겔을 WFI에 15-20시간 동안 두고, 이후 제조자의 지시에 따라 겔을 스캐닝하고 건조시켰다.
비스-트리스 겔
10㎕의 0.2㎛ 여과된 샘플을 4㎕의 샘플 완충액(4x), 1.5㎕의 환원제(10x) 및 1.7㎕의 0.1M EDTA에 첨가시킴에 의해 SDS-PAGE 분석을 위한 발효 샘플을 제조하였다(10mM의 최종 농도 달성). 15㎕의 발효 샘플 및 10㎕의 마크 12 마커를 4-12% 비스-트리스 겔 상에서 진행시키고 MES 진행 완충액을 이용하여 200V, 400mA 및 100W에서 ~40분 동안 진행시켰다. 전기영동 후, 겔을 100mL의 고정 용액(40mL dH2O, 50mL 메탄올, 10mL 아세트산)에 10분 동안 가라앉힌 후 추가 10분 동안 95mL의 염색 용액(55mL dH2O, 20mL 메탄올, 20mL 염색제 A)로 교체하였다. 5mL의 염색제 B를 염색 용액에 첨가하고 겔을 60rpm의 오비탈 진탕기 상에서 5시간 동안 염색되게 방치한 후 200mL의 WFI를 이용하여 염색제를 제거하였다. 과량의 염색이 제거될 때까지 겔을 WFI에 15-20시간 동안 두고, 이후 제조자의 지시에 따라 겔을 스캐닝하고 건조시켰다.
공정 3 정제:
공정 2로부터 개질된, 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터 콜라게나제를 정제하기 위해 새롭게 개발된 공정(공정 3)의 20L 규모 예행 시도를 먼저 20L 규모로 GMP 상에서 수행하였다. 확대에 더욱 적합하고 더욱 수정이 가능한 정제 및 후속적인 유효한 공정을 만들기 위해 공정 3에 상당한 공정상의 변화가 도입되었다. 이러한 공정 변화를 촉진하는 하나의 중요한 인자는 발효 성분의 선택에 있었다. 공정 2는 피톤 기재 발효 배지를 유지하기 위한 요건에 기초한 반면 공정 3에서는 프로테오스 펩톤 3번을 이용하였다. 공정 예행 시도를 다운스트림 정제 및 콜라게나제 AUXI 및 AUXII의 중요한 단계들로 나눈다. 여기에는 무스탕 Q 캡슐, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 접점 흐름 여과 단계 1(TFF1로 표시됨), 음이온 교환 크로마토그래피 및 접점 흐름 여과 단계 2(TFF2로 표시됨)을 이용한 발효 여액의 처리가 포함된다. AUXI 및 AUXII는 정제의 초기 단계에 함께 정제되고 음이온 교환 크로마토그래피 단계 중에만 분리된다(Q-세파로스 HP 배지를 이용하여 수행됨). 이후 AUXI 및 AUXII를 분리하여 가공하고 제형화한다. 중간체를 1:1 비(UV에 의해 측정된 단백질 함량에 기초함)로 혼합하고 여과시켜 약물을 형성한다. 공정 3을 전개함에 있어서, 공정 2와 관련된 중요한 단계들은 제거되었다. 그 중에서도 특히, 암모늄 설페이트 침전 단계, 2개 크로마토그래피 단계(히드록시아파타이트 및 겔 침투 크로마토그래피) 및 모든 -20℃ 유지 단계들이 제거되었다. 교반된 세포 및 투석과 같은 확대될 수 없는 단계들의 이용도 제거되었으며 접점 흐름 여과(TFF)로 교체되었다. 공정 2(TFF의 이용이 제외되었음)에서 명백했던 생성물 불안정성의 문제가 공정 3의 20L 규모 진행에서는 뚜렷하지 않았다. 그러나 공정 3과 연관된 오염물질 프로필은 클로스트리파인 및 콜라게나제가 주요 성분이었던 공정 2와 상이하였다. 가장 명백하게는 40kDa, 55kDa 및 2개의 90kDa 오염물질(하나는 AUXI와 함께 정제되고 다른 하나는 AUXII와 함께 정제됨)이 SDS-PAGE에 의해 검출되었다. 이러한 새로운 오염물질들의 결과로서, QC 검정의 일부(예컨대 RPHPLC 및 SEC-HPLC)의 사용이 제한되었는데, 그 이유는 이들이 모든 공정 3 불순물을 용해시키지 않기 때문이다. 인-프로세스 순도 결정을 위해 확립된 QC 검정을 이용할 수 없음은, Q 세파로스 컬럼으로부터의 재료가 추가의 정제에 적합함을 입증하기 위한 방법을 규정하도록 하였다. 이것은, 오염물질이 Q 세파로스 컬럼 상에서 AUXI 및 AUXII 생성물로부터 분명히 용해되지 않고 따라서 소급하여(retrospectively) 분석될 수 있었던, 별개의 분획에서 용리된 재료를 수집할 필요가 있기 때문에 요구되었다. SDS PAGE에 의해 분석을 수행하였고 20L 예행 시도에 대한 푸울링 결정은 표준화된 1㎍ 로딩을 이용하여 생성물에 대한 불순물의 상태 염색 강도의 경험에 기초하였다.
SDS-PAGE의 후방(retrospective) 밀도계 분석은 푸울링 기준이 생성물의 상대 순도%에 기초하여 기술될 수 있도록 하였다. 200L 시범 진행으로부터의 재료를 이용한 추가의 밀도계 분석은 표준화된 방법은 물론이고 검정 변화의 추정도 가능하게 하였다. 이것은 최초 GMP 캠페인에 도움이 되는 인-프로세스 분획의 푸울링을 위한 동의된 절차를 이끌었다.
공정 설명에 추가하여, 완충 안정성 및 인-프로세스 샘플 안정성 연구를 기술하는 예비 작업이 공정 3과 관련된 불순물 중 일부의 초기 특성화와 함께 제시된다.
공정 3은 3가지 주요 면에서 공정 2와 다르다. 먼저, 암모늄 설페이트 침전 단계 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계가 없고; 둘째로, 겔 침투 크로마토그래피(GPC) 단계가 없으며; 세째로, 모든 완충액 교환 단계가 접점 흐름 여과에 의해 수행된다. 침전 단계는 의뢰인의 추천으로 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)의 이용으로 대체되었다. 상기 단계를 전개시켜 (i) 생성물 포획(이에 의해 농축 단계로서 기능함) 및 (ii) 일부 단백질 및 안료 오염물질 제거에 대한 HIC의 성공적인 이행을 초래하였다. HIC 단계는 후속하여 dsDNA의 수준을 낮추는 것으로 나타났다. 공정 개발 프로그램의 결과로서, HIC의 도입 및 무스탕 Q 단계의 포함이 암모늄 설페이트 침전 단계 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계 둘 모두에 대한 요구를 제거하였다. 전체적인 효과는 생성물의 중요한 포획을 단순화하고 공정 2와 관련된 잠재적인 유지 단계를 제거하였다는 것이다. 후자는, 침전 단계로부터 생성된 펠렛이 가공 이전에 -20℃에서 유지될 수 있었기 때문에 다운스트림 정제 이전에 발효가 미리 평가될 수 있었다는데 의의가 있다.
HIC 단계에 이어서, 생성물을 접점 흐름 여과(TFF)를 이용하여 완충 교환시켰다. 이것은 30kDa의 분자량 컷오프(MWCO) 막을 이용하여 수행되었고 공정 2에서 사용된 투석 절차를 대신하였다. 존재하는 경우 AUXII-유래로서 검출되었던 응집 오염이 음이온 교환 크로마토그래피 단계(IEX) 동안 제거된 것으로 나타났다. 결과적으로, AUXI 및 AUXII 중간체 둘 모두가 IEX 뒤에 응집물에 대한 명세내에 있기 때문에 응집 GPC 단계가 제거되었다. 마지막으로, AUXI 및 AUXII 중간체의 최종 농축 및 제형화를 교반된 세포를 이용하는 이전의 방법 대신에 TFF를 이용하여 수행하였다.
전체적으로, 공정 3은 확대를 위해 더욱 보완될 수 있고 공정 2 보다 유효한 보다 단순한 공정을 제공하였다. 또한, 히드록시아파타이트 및 겔 침투 배지에 대한 요구 제거 및 류펩틴을 요구하는 단계의 수 감소에 의해 소비 비용의 감소가 명백하다. 공정 3에 대한 정제도의 개관은 도 46에 제공된다.
20L 규모로 진행된 비-GMP 시범
공정 3을 공정 전개 실험실에서 20L 규모로 수행하여 적합한 품질의 재료가 이렇게 개질된 공정을 이용하여 20L 규모에서 생성될 수 있는지를 입증하였다. 가공을 위한 중요 요건은, 가능하다면 냉장된 단계를 수행하고 공정의 중요한 단계에서 시스테인 프로테아제 억제제 류펩틴을 포함시켜 잠재적인 프로테아제 활성을 제한하는 능력이었다. 원액이 200L 발효 PP3으로부터 생성되었기 때문에 충분한 20L의 발효 여액을 가공하였다. 발효 및 후속하는 수확 및 여과의 상세한 설명은 다른 보고서에 문서화되어 있다.
발효 여액의 무스탕 Q 처리
0.2㎛ 여과 이후에, 약 22L의 발효 상청액을 앞서 개시된 무스탕 Q 크로마토그래피 캡슐 상에 로딩하였다. 일부 가시적인 안료 오염(그린/브라운)이 처음 10L의 여과 동안 무스탕 Q 캡슐에 의해 제거된 것으로 나타났는데, 이는 처음 10L 스테딤 백의 내용물이 두 번째 보다 가시적으로 덜 안료화된 것으로 나타났기 때문이다. dsDNA를 제거하는 무스탕 Q 캡슐의 능력을 무스탕 Q 전후 샘플의 피코 그린(pico green) 분석에 의해 본 단계에 걸쳐 모니터링하였다(표 41). 공정 분석에서, 소규모에서 생성된 이전 데이터와 달리, 벌크 핵산 제거가 무스탕 Q 단계에서 명백하지 않은 것으로 나타났다. 따라서 본 단계의 견고성 및 적용은 추가의 조사를 요구한다.
표 41
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
HIC의 이용은 정제에서 3가지 기능을 만족시킨다. 먼저, 콜라게나제가 수지에 결합되는 조건이 확인되었기 때문에 생성물의 부피가 감소되었다. 둘째로, 일부 안료 및 단백질 오염물질이 이 단계에서 제거되었고, 셋째로 이러한 진행으로부터의 피코 그린 분석은 dsDNA의 감소를 나타내었다. HIC 단계는 발효로부터 직접 가공된 상청액을 이용하여 수행되었고(무스탕 Q 처리 후), 그 결과 유지 단계(공정 2에서 암모늄 설페이트 펠렛으로서 분명함)가 공정 3에는 더 이상 존재하지 않았다.
콜라게나제가 HIC 컬럼에 결합하는 조건을 제공하기 위해, 무스탕 Q 단계로부터의 생성물(20L)을 3M-암모늄 설페이트 용액으로 최종 농도 1M까지 희석시켰다. 여과 후, 생성물을 컬럼 상에 로딩하고 2-단계 등용매 용리를 이용하여 용리시켰다.
HIC 로딩 재료의 단백질 농도는 정확하게 결정하기가 어려우며 두 가지 방식으로 추정되었다. 먼저, 브래드포드 검정을 암모늄 설페이트 첨가 전에 재료에 대해 수행하였다. 이것은, 검정을 방해하는 것으로 공지되어 있는, 발효 배지에 존재하는 안료로부터의 영향을 표준화하기 위해 희석되지 않은 재료를 이용하여 수행되었다. 둘째로, 상기 추정은 컬럼 수지 1mL 당 로딩된 발효 배지의 부피에 기초하였다. 컬럼 로딩은 브래드포드 검정에 의해 1mL의 수지 당 5.9mg의 총 단백질이거나 대안적으로 1mL의 수지에 대해 ~13mL의 발효 배지인 것으로 추정되었다. 컬럼으로부터 용리된 표적 단백질의 총 양의 산정은 UV를 이용하여 3.4g으로 측정되었다(표 42 참조). HIC 로딩에 존재하는 총 단백질이 9g(브래드포드 검정)임을 고려할 때, 이것은 38% 회수에 해당된다. 상기 값은, 그러나, 발효 배지 성분을 함유하는 샘플에 대한 검정의 부정확성으로 인해 비교상의 값으로서만 고려되었다.
HIC 로딩 농도를 산정하는 대안적인 방법으로 밀도계를 이용한 결정이 있으나, 이러한 산정이 총 단백질(발효 간에 다양할 수 있음)을 산정한다기보다 콜라게나제 함량을 제공할 것임이 인식되었다. 이러한 접근법을 이용하여, 총 콜라게나제가 360mg/L로서 산정되었고 AUXI 대 AUXII의 대략적인 비는 40:60인 것으로 산정되었다. 이 데이터를 이용하여, HIC 로딩에서 예상되는 총 콜라게나제는 7.2g일 것이고 47%의 단계 수율을 제공한다.
HIC 단계로부터 생성된 크로마토그램이 도 70에 도시된다. 가시적인 안료가 통과흐름에 명백할 뿐 아니라 컬럼에 결합된다. 컬럼을 평형 완충액으로 세척하여 통과흐름 오염물을 세척한 후, 중간체 농축 암모늄 설페이트 용액(0.3M)을 이용하여 피크 1을 용리시켰다.
상기 피크는, 일부 AUXII도 본 단계에서 용리되었으나, 단백질 오염물질을 함유하는 것으로 나타났다(도 71). 생성물에서의 이러한 손실은 예상되었고 이전에 언급된 바 있다. 순도를 손상시키지 않으며 생성물 손실량을 최소화하기 위해, 피크 1 제거를 위한 용리 부피를 5 컬럼 부피로 설정하였다. 대부분의 생성물을 함유하는 피크 2를 이후 암모늄 설페이트가 없는 완충액을 이용하여 용리시켰다. 피크 2를 프로그래밍된 크로마토그래피 방법으로 단일 푸울로서 수집함으로써 용리 완충액의 컬럼 부피의 3/4이 컬럼에 적용된 후에 수집을 개시하였다. 총 4 컬럼 부피가 수집된 후 수집을 종료하였다. 공정의 본 단계에서 생성물에서의 잠재적인 단백질분해를 최소화하기 위해, 류펩틴을 HIC 후 용리액에 첨가시키고 재료를 2-8℃에서 유지하였다. HIC 후 용리액에 대한 유지 시간은 지속기간이 2일이었다.
접점 흐름 여과 1(TFF1)
30kDa 막을 이용한 TFF에 이어서 HIC를 도입시켜 생성물의 부피를 줄이고(5배) 완충액을 음이온 교환 컬럼과의 결합에 적합한 조건으로 교환하였다. 특히 중요한 것은 암모늄 설페이트를 충분히 감소시켜 IEX 로딩 샘플의 전도성이 <1.8mS가 되게 하는 것이었다. 정용여과 완충액을 냉장시키고 사용 전에 류펩틴을 첨가하여 단백질분해의 가능성을 감소시켰다. 본 단계를 진행하는 동안 어떠한 단백질 손실도 판단되지 않았으나(>100% 회수), 이것은 TFF1전 재료 중 안료의 존재로 인해 공정의 본 단계에서 단백질 농도 산정이 부정확하다는 것을 반영하는 것일 수 있다. 약 97.5%의 총 단백질(3325mg)을 보유액에서 회수하고 제1 막 세정(후술함)에서 추가로 204.8mg을 회수하였다. 보유액 및 세정액을 조합하여 수득된 총 단백질의 여과를 TFF 단계의 끝에 수행한 다음 재료를 밤새 2-8℃에서 유지하였다. TFF 단계의 전과 후에 SDS-PAGE 분석에서 어떠한 유의성도 검출되지 않았다(도 71).
Q-세파로스 크로마토그래피
Q-세파로스 컬럼에 수지 1mL에 대하여 5mg의 최대 수용량으로 총 단백질을 로딩시켰다. 그 결과, TFF 단계로부터 이용가능한 모든 재료가 본 단계에서 사용된 것은 아니다(표 421 참조). Q-세파로스 컬럼은 예상한 대로 AUXI 및 AUXII 콜라게나제를 용해시켰다(도 72). AUXII 용리의 개시는 약 13.6% B에서 시작되었고(여기서, 완충액 A = 10mM 트리스, 0.2mM 류펩틴 pH 8 및 완충액 B = 완충액 A + 360mM NaCl) 이것은 5.7mS의 컬럼 후 전도성과 같다. 흡광도 값이 피크 높이의 25%까지 떨어질 때까지(550mAU) 분획(100mL)을 AUXII의 용리를 통하여 수집하였다. 소 피크가 AUXII 용리 이후에 약 8mS(20.3% B)에서 용리되었다. 이전 소규모 실험으로부터의 상기 피크의 인-프로세스 분석은, 이것이 AUXII 유래된 응집 재료임을 나타내었다. AUXI 용리의 개시는 약 27% B에서였다(10.4mS와 같음). 예전처럼, 100mL의 분획을, 흡광도가 요구되는 25% 값(190mAU)으로 떨어질 때까지 수집하였다.
수집된 AUXI 및 AUXII 분획 각각을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 밀도측정하였다(도 73-76). 밀도측정은 소급하여 수행되므로, 분획 푸울링에 대한 결정은 콜로이드 블루 염색에 의해 가시적인 오염물질의 수준의 경험에 기초하였다. 옥실리엄의 자문으로, 분획 6-12를 AUXII 생성물에 대해 푸울링하고 분획 19-26을 AUXI에 대해 푸울링하였다. Q-세파로스 진행으로부터 푸울링된 재료에 존재하는 단계 수율 및 단백질 농도는 표 42에 포함되어 있다.
20L 시범 진행으로부터의 IEX 후 AUXI 및 AUXII 생성물의 SDS-PAGE 분석은(도 77 및 78), SDS-PAGE에 의해 가시적인 극히 소수의 오염물질을 나타내었다. 또한, 검출된 오염물질은 이전의 소규모 실험과 일치하였으나 오염물질의 용해에 있어서 차이가 있었고, 이것은 소규모 모델에서 더욱 명확한 것으로 나타났다(즉, 분리된 피크 또는 숄더). 이러한 오염물질은 클로스트리파인 및 젤라티나제가 주요 성분들이었던 공정 2에서 동정된 것들과도 상이하였다. 결과적으로, 공정 2에 대해 개발된 QC 프로토콜은 공정 3과 관련된 새로운 오염물질의 검출에 최대한으로 활용되지 않았다.
푸울링된 재료의 후방 밀도측정은 순도를 AUXI에 대해 95.1% 및 AUXII에 대해 99.4%로 산정하였다. 그러나 일반적으로 ≥97%의 순도 명세가 RP-HPLC에 의해 구현되며 밀도계를 이용해서는 어떠한 최종 생성물 명세도 확립되지 않았다.
AUXI 및 AUXII의 농축 및 완충액 교환
Q 세파로스 컬럼으로부터 분리된 AUXI 및 AUXII 생성물을 30kDa 막을 이용하여 TFF에 의해 따로 따로 가공하였다. 이 단계는 (i) 최종 생성물에서의 류펩틴을 제거/감소하고 (ii) 중간체를 정확한 완충액(10mM 트리스, 60mM 수크로오스 pH 8)으로 제형화하며 (iii) 0.9-1.1mg/mL의 요구되는 표적 단백질 농도를 달성하기 위해 요구된다. 799mg(1.17mg/mL에서 ~683mL)의 AUXII 및 860mg(1.08mg/mL에서 796mL)의 AUXI의 총양을 1.75mg/mL의 표적 농도로 농축시켰다. 이러한 이론적인 농도는 농축 단계 동안 생성물의 손실이 없는 것으로 가정하여 계산된 요구되는 부피의 감소에 기초하였다. 이후 정용여과를 요구되는 제형화 완충액으로 수행하고, 막을 최소 부피의 TFF 시스템(~250mL)으로 세척하고 충분한 양을 농축물과 조합시켜 0.9-1.1mg/mL의 요구되는 표적 농도를 달성하였다. 819.5mg의 AUXII(1.03mg/mL) 및797.0mg의 AUXI(1.09mg/mL)의 총양이 여과 후에 이용가능하였다. 두 경우 모두에, 생성물의 대부분이 보유액에서 회수되었고 AUXII에 대해 95.4%(762mg) 및 AUXI에 대해 83.1%(715mg)으로 산정되었다. 막 세정에 의해 추가로 제공된 재료는 AUXII 및 AUXI 각각에 대해 153mg 및 89.6mg이었다.
약물로 중간체의 혼합
약 200mg의 각 중간체를 조합하여 400mg의 약물을 제공하였다. 이후 이것을 여과시켜 약 26mg이 시험을 위해 QC에 제공되었다. AUXI, AUXII 중간체 및 약물에 대한 QC 결과가 표 43에 제공된다. 약물 및 AUXII 중간체에 대한 모든 시험이 요구되는 명세를 통과하였다. 그러나, 중간체 AUXI의 효능에 대한 시험이 명세된 범위를 벗어났으나 다른 시험들은 모두 통과하였다. AUXI 효능 결과를 제외한 이러한 데이터는, 공정 3이 20L 규모로 정제될 때 요구되는 명세의 재료를 생성할 수 있음을 나타내었다.
20L 시범 진행으로부터의 재료는 QC 시험 뿐 아니라 KBI BioPharma, Inc.에서 방법 허가에 이용되었다. 의뢰인의 요구대로, 200mg의 약물을 약물 및 약품 방법 허가를 위해 드라이 아이스 상에서 KBI로 운반하였다. KBI에서 약물의 냉동건조 후 후자의 시험을 수행하였다. 또한, 25mg의 각 중간체를 분석적 방법의 허가를 위해 KBI에 공급하였다.
20L 시범 진행에서의 개별적인 단계 수율이 표 42에 제공된다. 모든 이용가능한 재료가 Q-세파로스 컬럼 상에 로딩된 데이터의 연장으로서, 상기 예행 공정으로부터의 이용가능한 약물의 최대 총양은 1.6g인 것으로 나타났다(보유에 의한 재료의 손실은 없는 것으로 가정). 이것은 HIC 컬럼에 로딩하기 위해 이용될 수 있는 총 단백질의 양이 9g(브래드포드 검정 이용)으로 초기 산정된 것에 기초하여 17.8%의 대략적인 전체 공정 수율과 같은 것으로 판단된다. Q-세파로스 컬럼의 경우 로딩에 제한이 있으므로, 모든 이용가능한 중간체를 혼합하여 약물을 형성한다면, 최대 1.4g의 약물이 현행의 예행 시도로부터 이용될 수 있다.
표 42
표 43
샘플 안정성 연구
20L 시범 진행 동안, 샘플을 중요한 공정 포인트로서 선택하였다. 시범 진행이 연속 공정(유지 단계 없음)으로 수행되었기 때문에, GMP 회분에 예상되는 유지 시간 동안 인-프로세스 재료의 안정성을 평가해 보려고 시도하였다. GMP에 예상되는 연장된 진행 지속시간은 공정 단계간 장치 세척 데이터를 수득하기 위한 요건 때문인 것으로 이해되었다. 인-프로세스 재료를 2-8℃에서 GMP 제조에 예상되는 대략의 지속기간 동안 유지하였다. 또한, 샘플을 GMP 캠페인에 예상되는 것의 2배를 나타내는 연장된 시간 동안 유지하였다. 각각의 유지 시간에 따라 선택된 샘플의 설명이 표 44에 제공된다. 20L 시범 진행의 가공 시간은 표 45에 표시된다. 모든 샘플은 SDS-PAGE, RP-HPLC, SEC-HPLC 및 UV 분석을 위해 QC에 제공된다(도 79-83).
전체적으로, 상기 결과는 순도(RP-HPLC에 의해 측정됨), 분해(8% 트리스-글리신 SDS-PAGE에 의해 검출됨) 및 응집(SECHPLC에 의해 측정됨)과 관련하여 첫 번째 유지 포인트 동안에 생성물에 어떠한 검출가능한 열화도 나타내지 않았다. 그러나 검정 중 일부는 제한적인 것이 인식되었는데, 그 이유는 저분자 질량 성분이 8% SDS-PAGE에 의해 검출되지 않을 것이고 RPHPLC 검정이 공정 3과 관련된 40kDa, 55kDa 및 90kDa 오염물질을 검출하도록 전개되지 않았기 때문이다. 발효 샘플에서 UV 및 SEC-HPLC의 이용과 같은 일부 검정도 미정제 샘플에 대해 덜 적절하였다. 이러한 한계에도 불구하고, 생성물 프로필에서 검출된 변화가 단지 Q-세파로스 컬럼으로부터 선택된 AUXII 인-프로세스 샘플에 대하여 두 번째 유지 포인트(12일) 동안 규명되었다. 이것은 5일 내지 12일 사이에 응집물 수준의 증가를 나타냈으나 그 증가는 단지 0 내지 0.62%였다.
두 번째 안정성 연구를, 20L 시범 진행 동안의 제조 포인트에서 수득되고 -20℃에 저장된 인-프로세스 보유액에 대하여 수행하였다. 상기 연구에서, 샘플을 해동시키고 실온에서 인큐베이션하고 37℃에서 4-12% SDS-PAGE 분석에 의해 모니터링하여 오염물질의 전체 분자 질량 범위를 구하였다(도 84-88). 이러한 데이터로, Q-세파로스 음이온 교환 이전의 샘플이 분해에 약하다는 것이 입증되었다. 콜라게나제 AUXI 및 AUXII의 분리(Q-세파로스 컬럼에 의해) 이후에, 샘플은 비교적 안정한 것으로 나타났고 SDS-PAGE에 의해 0시간 샘플에 필적함을 확인하였다.
포괄하여 보면, 두 연구 모두는 온도가 2-8℃로 유지된다는 것을 조건으로, 인-프로세스 재료가 연구된 유지 시간 동안 가공 중에 열화되지 않을 것이라고 예상하였다. 이것은 류펩틴의 이용 및 온도 조절이 GMP에 예상되는 지속기간에 걸쳐 가공 중에 생성물 분해 수준을 제한하기에 충분하다는 확신을 제공한다.
표 44
표 45
완충액 안정성 연구
표 46에 나열된 완충액 샘플을 20L 시범으로부터 미리 확보하여 2-8℃에서의 저장 후 재시험하였다. 완충액의 pH, 전도성, 온도 및 외관을 저장 완료시와 저장 12-13일 후에 관찰하였다. 본 연구 결과를 표 47에 제공한다. pH 및 전도성 값에 있어서 약간의 차이를 관찰하였으나, 이것은 원래 완충액과 시험과 보유액간에 온도 차이 때문일 수 있다. 특히, HIC 완충액은 전도성 및 온도에 있어서 가장 큰 변화를 나타내었다. 결과적으로, 완충액 안정성에 대한 앞으로의 연구는 기록된 모든 파라미터에 대해 허용된 온도 범위의 구현을 포함하여야 한다. 모든 경우에, 완충 보유액은 0시와 요구되는 유지 시간 후에 투명한 외관이었다.
표 46
표 47
N-말단 서열화에 의한 오염물질 동정
3개의 주요 불순물을 공정 3에서 SDS-PAGE에 의해 검출하였다. 이들은 AUXI 및 AUXII 콜라게나제와 함께 용리된 것으로 보이며 Q-세파로스 컬럼으로부터 용리된 피크의 분획화에 의해서만 분석되었다.
오염물질은 40kDa, 55kDa 및 90kDa 오염물질로서 SDS-PAGE 상에 이들의 겉보기 분자 질량에 의해 할당되었다. 증가된 수준의 특정 오염물질을 지니는 분획이 SDS-PAGE로부터의 밴드의 삭제 후 N-말단 서열화를 위해 제공되었다.
서열 분석은 20L 시범 진행으로부터 단리된 55kDa 및 40kDa 오염물질 둘 모두에 대해 성공적이었다. AUXI와 관련된 55kDa 오염물질 밴드의 N-말단(레인 1-5; 도 89)은 콜라게나제 AUXI에 대한 Col G 서열 영역과 매칭되는 한편 AUXII로부터의 40kDa 오염물질 밴드(레인 6-10; 도 89)는 콜라게나제 AUXII에 대한 Col H 서열 영역과 동일한 것으로 나타났다. AUXI 및 AUXII 생성물 둘 모두와 관련된 90kDa 밴드를 서열화하기 위한 사전 시도가 이루어졌다(도 90). AUXI 생성물과 관련된 90kDa 오염물질의 서열화는, 동일성이 AUXI 서열의 N-말단과 상관된다는 점에서 성공적이었다. 대조적으로, AUXII와 관련된 90kDa 오염물질에 대해서는 완전한 서열을 수득할 수 없었는데, 이것은 두 90kDa 오염물질이 상이한 생성물이었음을 시사한다.
공정 3과 관련된 메인 오염물질들은 관련 생성물인 것으로 나타났으며 AUXI(55kDa) 및 AUXII(40kDa)의 N-말단으로 절단된 생성물이거나 AUXI(90kDa)의 C-말단으로 절단된 생성물인 것으로 동정되었다. 이러한 오염물질이 공정 2에서 동정된 것들과 상이하기 때문에, 검정 전개가 공정 2 주위에서 시발됨에 따라 중간체 및 약물의 구현을 위해 사용된 QC 검정이 신규한 오염물질을 분석할 수 없었다. 특히, 40kDa 및 55kDa 오염물질의 수준을 검출하기 위해 표준 순도 검정(RP-HPLC)을 이용할 수 없었다.
밀도측정 분석
20L 시범 진행
공정 3과 관련된 40kDa, 55kDa 및 90kDa 오염물질을 동정하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 이러한 오염물질들은 Q-세파로스 컬럼으로부터 용리된 분획에서 뚜렷하게 검출되었고 피크 프로필의 선행 및 후행 에지에서 용리되는 것으로 나타났다(도 72-76 참조). 추가의 정제를 위해 포함되거나 배제된 분획의 삭제는 콜로이드 블루 염색된 겔 상에서 오염물질 및 생성물에 대한 염색의 상대적인 강도에 대한 경험에 기초하였다. 이러한 판단이 덜 주관적이 되도록, 밀도계를 이용하여 Q-세파로스 단계 이후 분획에 대한 특정 푸울링 기준을 결정하였다. 상기 검정이 공정 3과 관련된 신규한 오염물질을 분석할 수 없었기 때문에, 순도에 대한 현행 QC 검정(RP-HPLC)에 우선하여 밀도계를 이용하였다.
20L 시범으로부터 Q 분획화 후 밀도측정 데이터
IEX-후 분획에 대한 분리된 2회 분석으로부터의 밀도측정 값을 평균 내고 표 48에 도시한다. 분획 1-12 및 피크 1의 마지막 25%(테일)는 AUXII와 40, 75 및 90kDa의 관련된 오염성 단백질을 함유한다. 분획 13-27 및 피크 2의 마지막 25%(테일)는 AUXI과 55 및 90kDa의 관련된 오염물질을 함유한다. 밀도측정 분석 없이 SDS-PAGE에 기초하여, 선택된 분획의 푸울을 강조한다.
표 48
200L 시범 진행으로부터 Q 분획화 후 밀도측정 요약 자료
밀도계 분석의 개요
200L 공학처리 진행으로부터의 IEX 후 분획을 여러 회 분석하여 GMP 캠페인에 대한 IEX BMR으로 문서화될 수 있는 푸울링 기준을 확립하였다. 이러한 푸울링 기준은 (i) 공학처리 진행으로부터 생성된 재료의 품질이 GMP 재료에 대해 적합하며 (ii) 밀도측정 방법의 접근이 허용될 수 있다는 가정에 기초한다. 목적이 GMP 캠페인에서 고 품질의 재료를 생성하기 위한 것이라면 푸울링 기준에 대한 명세를 개정할 필요가 있을 것이다.
IEX로부터 푸울링을 위한 명세
모두, 200L 공학처리 진행으로부터의 샘플을 6회(2명의 오퍼레이터 및 각 겔의 3회 반복) 분석하고 평균 데이터를 표 49에 제시한다. 공학처리 진행을 위해 푸울링된 분획을 붉은 색으로 강조한다. 상기 분석으로부터, 다음과 같은 푸울링 기준이 확립될 수 있다:
(i) 순도가 88.5%이거나 이보다 큰 임의의 분획을 푸울링할 수 있다:
(ii) 단일 불순물이 10%이거나 이보다 큰 임의의 분획을 푸울링할 수 없다
(iii) 푸울링되는 분획은 연속하는 분획으로부터 온 것이어야 한다.
(iv) 푸울의 계산된 이론적 순도는 다음과 같아야 한다:
AUXI의 경우 이론적 순도는 93%이거나 이보다 커야 하고
AUXII의 경우 이론적 순도는 96%이거나 이보다 커야 한다.
마지막 포인트는 200L 공학처리 진행으로부터의 평가에 기초한 것이고, 여기서 이용가능한 분획 중 총 단백질이 산정되었다(AUXI에 대한 UV 분석을 위해 모든 분획이 제공된 것은 아니라는 한 가지 제한이 있음). 상기 분석으로부터의 데이터를 표 50에 제시한다.
**주: 이러한 기준으로부터, AUXII 피크에 대한 분획 7은 여기서 배제될 것이다.
검정 변화
200L 공학처리 진행으로부터의 IEX 후 분획의 데이터에서, 다음 수준의 정확성이 예측되었다:
(i) 생성물(AUXI 및 AUXII)에 대하여 %CV는 2.1%(AUXI) 및 2.3%(AUXII)로 산출되었다. 따라서, 푸울링에 대한 88.6%의 순도 명세는 86.3-90.9% 범위일 수 있었다.
(ii) 불순물의 경우, %CV는 훨씬 컸고 범위는 불순물에 따라서 18.5%-33.7%인 것으로 예측되었다. 결과적으로, 10% 이하의 단일 불순물을 지니는 분획을 제외한 순도 명세는 6.63-13.37%의 실제 불순물 범위를 지니는 분획에 대한 것일 수 있었다. 따라서, 생성물(및 불순물 아님)의 순도 값은 푸울링 명세에서 가장 신뢰할 수 있는 값이다.
밀도계에 의해 산정된 최종 재료의 순도
200L 공학처리 진행에 대한 최종 재료(DS 및 중간체)의 밀도측정 분석도 밀도계에 의해 결정될 수 있으며 하기와 같다:
AUXI = 96.0% (3.1%의 90kDa 오염물질)
AUXII = 98.7% (1.2%의 90kDa 오염물질)
DS = 97.6% (2.1%의 90kDa 오염물질)
(주: 이것은 3명의 다른 오퍼레이터에 의해 3회 분석된 단일 SDS-PAGE의 경우에 결정된 범위이다)
방법의 표준화
반복 분석을 진행하는 동안, 오퍼레이터간의 에러와 겔 간의 편차를 최소화하기 위해 밀도측정 방법을 표준화하였으며 SOP에서 문서화될 것이다. 가장 주목할만 한 것은 다음과 같다:
(i) 겔의 각 레인에서 총 단백질의 표준 로딩은 1㎍일 것이다.
(ii) 최대 16개의 분획을 각 생성물 피크(AUXI 및 AUXII)로부터 분석을 위해 선택할 것이다. 이것은 밀도측정 분석을 위한 겔의 수를 4로 제한할 것이다.
(iii) 선택된 16개 분획은 마지막 분획에서 시작하여 각 피크에 대해 수집되고 연속하여 전방으로 처리될 것이다. 이것은 평균 순도에 대해 산출된 도면에서 정확성을 보장하기 위한 것이다(푸울링된 모든 분획이 포함될 것 같기 때문이다).
표 49: 밀도측정 분석에 의해 결정된, 200L 공학처리 진행으로부터의 IEX 후 분획에서 생성물 및 불순물의 평균 상대량. 푸울링된 분획을 붉은 색으로 강조한다.
표 50: 밀도측정 분석에 의해 결정된, 200L 공학처리 진행으로부터의 IEX 후 푸울에서 생성물 및 불순물의 이론적인 상대량. 푸울링된 분획을 붉은 색으로 강조한다. 이론적인 평균 생성물 순도는 AUXI 및 AUXII 중간체에 대해 각각 92.3% 및 95.8%인 것으로 계산된다.
Q-세파로스 후 분획에 대한 GMP 푸울링 기준
이온 교환 BMR에서 구현되는 세목
A. 하기 푸울링 기준은 밀도계에 의해 분석된 AUXI 및 AUXII 피크 둘 모두로부터의 분획에 구현되기 위한 것이다:
(i) 최대 16개의 분획을 각 생성물 피크(AUXI 및 AUXII)로부터 분석을 위해 선택할 것이다. 이것은 밀도측정 분석을 위한 겔의 수를 4로 제한할 것이다.
(ii) 순도가 90.00%(소수점 2자리로 보고됨)이거나 이보다 큰 임의의 분획을 푸울링할 수 있다.
(iii) 단일 불순물이 9.00%(소수점 2자리로 보고됨)이거나 이보다 큰 임의의 분획을 푸울링할 수 없다.
(iv) 푸울링되는 분획은 연속하는 분획으로부터 온 것이어야 한다.
B. 하기 푸울링 기준은 SEC-HPLC에 의해 분석된 AUXII 피크로부터의 분획에 구현되기 위한 것이다:
(i) SEC-HPLC에 제공되는 샘플의 최대 수는 10개이며 이 피크로부터 수집된 마지막 분획 및 연속하는 전방의 분획들로부터 온 것이어야 한다.
(ii) 응집물이 2.00%(소수점 2자리로 보고됨)이거나 이보다 큰 임의의 분획을 푸울링할 수 없다.
정보로서만 기록된 세목
A. 푸울의 산정된 이론적 순도는 정보로서만 산출되어야 하며 하기와 같이 예상된다:
AUXI의 경우 이론적 순도는 93.00%이거나 이보다 크고
AUXII의 경우 이론적 순도는 97.00%이거나 이보다 크다.
B. 단백질 양이 0.5g 미만인 분획을 제외시키는 기준이 앞으로도 이용될 수 있는지를 확정하기 위해 각 푸울 중 단백질의 최소 양이 기입되어야 한다.
*C. AUXI 피크에 대한 분획을 RP-HPLC용으로 제공하나 소급에 의해 정보로서만 분석될 것이다. 이러한 데이터가 푸울링 기준의 일부로서 고려되지 않을 것이다.
푸울링에 대해 예상되는 영향
표 51에 제시된 평균 데이터 세트로부터 하기를 산출하여 새로운 푸울링 기준에 따른 수율 및 분획 선택에 대한 효과를 숙고하였다:
표 51
표 52: 밀도측정 분석에 의해 결정된, 200L 공학처리 진행으로부터의 IEX 후 분획에서 생성물 및 불순물의 평균 상대량
표 53: 밀도측정 분석에 의해 결정된, 200L 공학처리 진행으로부터의 IEX 후 푸울에서 생성물 및 불순물의 이론적인 상대량. 푸울링된 분획을 붉은 색으로 강조한다. 이론적인 평균 생성물 순도는 AUXI 및 AUXII 중간체에 대해 각각 92.3% 및 95.8%인 것으로 계산된다.
2개의 데이터 세트의 비교(즉, 다른 겔 상에서 상이한 오퍼레이터에 의해 진행된 동일한 인-프로세스 샘플)는, 하나의 추가 분획(AUXI로부터의 분획 27)이 20L 진행에서 실제로 푸울링된 것들로부터 포함될 것이나, 하기 후방 푸울링 기준이 평균 데이터 세트로서 주목될 수 있게 한다:
· AUXI
순도가 ≥87%이나 ≥10%의 단일 불순물을 지니지 않는 모든 분획 푸울링.
· AUXII
순도가 ≥94%이나 ≥4%의 단일 불순물을 지니지 않는 모든 분획 푸울링.
20L 시범 진행으로부터의 최종 재료의 분석에서 수득된 QC 데이터는, AUXII 중간체가 99.4% 순수하고, AUXI 중간체가 99.1% 순수하며 약물이 RP-HPLC에 의해 99.9% 콜라게나제임을 나타내었다. 따라서, 푸울링 공정에 대해 구현된 기준은 최종 재료에 대한 방출 명세를 통과하는 재료를 생성하는 것으로 예상될 것이다.
200L 시범 진행
앞서 언급된 20L 시범 진행에 대해 확립된 기준은 200L 공학처리 진행을 위해 숙고된 것과 상이하였다. 이 경우에, 푸울링은 순도가 ≥86.5%이고 ≥10%의 단일 불순물 오염물질을 지니지 않은 분획으로서 AUXI 및 AUXII 생성물 둘 모두에 대해 구현되었다. SEC-HPLC에 의해 검출된 불순물 수준이 ≥2%인 AUXII 샘플도 제외되었다. 생성된 AUXI/AUXII 중간체 및 약물도 표준화된 방법을 이용하여 밀도계에 의해 분석되었으며, 3회의 단일 겔 분석에 기초하여 하기와 같이 산정된 순도를 지니는 것으로 나타났다(3명의 다른 오퍼레이터): AUXI = 96.0% (3.1%의 90kDa 오염물질); AUXII = 98.7% (1.2%의 90kDa 오염물질); DS = 97.6% (2.1%의 90kDa 오염물질).
추가로, QC 결정된 중간체 및 약물의 순도는 RP-HPLC 검정에 의한 명세를 통과하는 것으로 나타났다 (AUXI = 98.2%; AUXII = 98.1%; 약물 = 99.4%). 결과적으로, 200L 공학처리 진행에 대해 수행된 푸울링 기준은 현행의 분석 방법에 기초하여 적합한 순도의 생성물을 운반하는데 성공적이었다.
재료 및 방법
무스탕 Q 크로마토그래피 (20L 규모 진행)
장비:
무스탕 Q 크로마토그래피 캡슐, 60mL (CL3MSTGQP1, Pall)
전도성 및 pH 미터 4330 (Jenway)
화학제품:
염화나트륨 (USP 등급, Merck)
수산화나트륨 용액 (부피 4M) (AnalaR, BDH)
트리스(히드록시메틸)메틸아민 (USP 등급, Merck)
암모늄 설페이트 (엑스트라 퓨어, Merck)
주사용 하이클론 수 -퀄리티 워터 (WFI-QW)
6OmL의 베드 부피 무스탕 Q 크로마토그래피 캡슐을 1M NaOH를 이용하여 30mL/분의 유속으로 30분 동안 소독하였다. 이후 캡슐을 동일한 시간 및 1M NaCl을 이용한 동일한 유속으로 사전처리하였다. 캡슐을 60mL/분의 유속에서, 2L의 무스탕 Q 평형 완충액(1OmM 트리스, 1M 암모늄 설페이트, pH 8)과 평형을 이루게 하였다. 출구 흐름을 검사하여 pH가 ≤8인 것을 확인하였다. 200L 발효 PP3(0.2㎛ 여과됨)로부터의 상청액(22L)을 캡슐 상에 540mL/분의 유속으로 로딩하였다(약 40분의 지속기간). 캡슐에 대해 추천된 최대 작업 유속은 600mL/분이었다. 여과된 재료를 2 x 1OL의 스테딤 백에 2-8℃에서 밤새 저장하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (20L 규모 진행)
장비:
유니콘 V 5.01 소프트웨어가 설치된 AKTA 파일롯(GE Healthcare)
밴티지(Vantage) S130 컬럼 (단면적 125cm2, Millipore)
전도성 및 pH 미터 4330 (Jenway)
사르토포어 2 0.8+0.45㎛ 필터 캡슐 (Sartorius)
메디컬 리프리저레이션 유닛 MPl 50 (Electrolux)
화학제품:
페닐 세파로스 6 FF 로우 서브 (GE Healthcare)
수산화나트륨 용액 (부피 4M) (AnalaR, BDH)
염화나트륨 (USP 등급, Merck)
트리스(히드록시메틸)메틸아민 (USP 등급, Merck)
암모늄 설페이트 (엑스트라 퓨어, Merck)
류펩틴 (MP Biomedicals, Inc)
주사용 하이클론 수 - 퀄리티 워터 (WFI -QW)
HIC 컬럼 패킹
240OmL의 페닐 세파로스 6 FF 로우 서브 (로트# 312089) 슬러리를 3시간 동안 침전시키고 에탄올을 제거하고 180OmL의 WFI로 교체하였다. 배지를 재슬러리화하고(50%), 침전시키고, 세척 간에 밤새 침전시키면서, WFI로 1회 및 180OmL의 20OmM NaCl로 2회 세척하였다. 배지를 180OmL의 20OmM NaCl을 이용하여 재슬리러화하고, 컬럼에 붓고, 1시간 동안 침전되게 하였다. 어댑터가 수지 베드 위 ~1cm 까지 낮아지게 하고(모든 공기 방울 제거) 배지를 200nM NaCl에 400mL/분(192cm/hr)의 유속으로 10분 동안 패킹하였다. 이러한 패킹 유속은 GMP에서 이용될 수 있는 K-프라임 시스템에 대한 최대 작업 유속과 동등하게 사용된 것이다. 어댑터가 베드의 상단까지 내려오게 하고 컬럼을 192cm/hr에서 10분 동안 패킹한 후 어댑터를 수지의 상단으로 스큐류잉(screwing)하고 192cm/hr에서 추가 10분 동안 패킹하였으며, 그 동안 수지의 압착은 관찰되지 않았다. AKTA 파일롯 방법을 이용하여 팩 시험을 수행하였다: HIC 150OmL 팩 시험. 이를 위해, 컬럼을 WFI 중의 1 컬럼 부피(CV)의 20OmM NaCl와 평형을 이루게 하고 WFI 중 15mL (1% CV)의 1M NaCl을 이용하여 313mL/분 (150cm/hr)의 유속으로 팩 시험하였다. 컬럼을 2CV의 WFI로 플러싱하고 2CV의 1OmM NaOH와 함께 저장하였다. 패킹된 컬럼은 1.2의 비대칭, 2659 플레이트/미터의 플레이트 수, 1525mL의 CV 및 12.2cm의 베드 높이를 지녔다.
컬럼 소독 및 평형상태 유지
페닐 세파로스 6 FF (로우 서브) 컬럼을 0.5M NaOH로 60분 동안 소독하고, 2 컬럼 부피(CV)의 WFI로 세척하고 5CV 1OmM 트리스, pH 8 (HIC 완충액 B)에 이어서 5CV 1OmM 트리스, 1.OM 암모늄 설페이트, pH 8 (HIC 완충액 A)와 평형을 이루게 하였다.
HIC 로딩의 제조
13.48kg (11.05L)의 3.0M 암모늄 설페이트, 1OmM 트리스, pH 8를 무스탕 Q 처리 후(섹션 3.1) 22.1kg의 발효 여액에 첨가하였다. 여액을 5분 동안 혼합하고 0.05m2 필터 캡슐 (0.8+0.45㎛)을 통해 여과하였다. 여과된 재료(HIC 로딩 재료로서 표시됨)를 사용시까지 얼음 위에 저장하였다(지속기간 약 30분).
HIC 컬럼 진행
150cm/시간의 일정한 선형 유속에서 2-8℃에서 유지된 냉장된 완충액을 이용하여 HIC 진행을 수행하였다. 30L 원액 (2OL의 무스탕 Q-후 여액에 상당함)을 2CV의 10mM 트리스, 1.0M 암모늄 설페이트, pH 8 (HIC 완충액 A)로 이미 평형을 이룬 1525mL의 페닐 세파로스 6 FF (로우 서브) 컬럼 위로 로딩시켰다. 결합되지 않은 재료를 lOCV의 HIC 완충액 A를 이용하여 컬럼에서 씻어 냈다. 이후 컬럼을 5CV 1OmM 트리스, 0.3M 암모늄 설페이트, pH 8 (HIC 완충액 A2)로 세척하고 결합된 단백질을 lOCV 1OmM 트리스, pH 8 (HIC 완충액 B)을 이용하여 용리시켰다. 용리 완충액의 최초 0.67 CV (1L)를 폐기하고 4CV의 HIC-후 푸울을 수집하였다. 류펩틴(126.4mL)을 10mM 류펩틴, 10mM 트리스, pH 8의 원액으로부터 200μM의 최종 농도까지 HIC-후 푸울(6191.3g)에 첨가하였다. 혼합된 용액(6.3kg)을 2-8℃에서 2일 동안 저장한 후 접점 흐름 여과에 의해 추가로 가공하였다.
접점 흐름 여과 단계 1 (TFFl 2OL 규모 진행)
장비:
프로플럭스(ProFlux) Ml2 TFF 시스템system (Millipore)
전도성 및 pH 미터 4330 (Jenways)
사르토포어 2 0.8+0.45㎛ 필터 캡슐 (Sartorius)
펠리콘(Pellicon) 2 "미니" 필터 0.1 m2 3OkDa MWCO PES 막 (Millipore)
메디컬 리프리저레이션 유닛 MP 150 (Electrolux)
재료/화학제품:
수산화나트륨 용액 (부피 4M) (AnalaR, BDH)
트리스(히드록시메틸)메틸아민 (USP 등급, Merck)
류펩틴 (MP Biomedicals, Inc)
주사용 하이클론 수 퀄리티 워터 (WFI-QW)
시스템 구성
제조자의 지시에 따라 2개의 펠리콘 2 "미니" 필터 3OkDa MWCO PES 막을 이용하여 프로플럭스 Ml2 TFF 시스템을 구성하고, 0.5M NaOH로 60분 동안 소독하고, 사용시까지 0.1 M NaOH에 저장하였다. 시스템을 배수시키고, 14L의 WFI로 플러싱하고, 보통의 물 침투성(NWP)을 25℃에서 15psig의 트랜스-막 압력(TMP)에서 (입구 압력 20psig 및 출구 압력 10 psig) 23L/m2/hr/psi로서 측정하였다. 시스템을 0.5L 1OmM 트리스, pH 8 (정용여과 완충액)로 플러싱하고 1L의 동일한 완충액으로 10분 동안 평형을 이루게 하였다. 침투물의 전도성 및 pH를 측정하고 정용여과 완충액에 대해 조사하여 막이 사용 전에 평형을 이루었음을 확인하였다.
농축 및 정용여과
200μM의 류펩틴을 함유하는 냉장된 정용여과 완충액(10mM 트리스, pH 8)을 이용하여 농축 및 정용여과 단계를 수행하였다. TFF 시스템을 사용 직전에 1L의 냉장된 완충액으로 플러싱하였다. 2L의 HIC-후 재료 (총 부피 6.3L)를 TFF 시스템 저장소로 펌핑하고 막의 조건을 조절하기 위해 백(back)-압력 없이 10분 동안 재순환시켰다. 저장소 상의 레벨 센서를 1.2L로 설정하고 HIC-후 재료를 15psig의 TMP에서 (입구 압력 20psig 및 출구 압력 lOpsig) 모든 재료가 시스템으로 들어갈 때까지 농축하였다. 침투물을 수집하고 분석을 위해 2-8℃에서 저장하였다. 입구 튜빙을 정용여과 완충액에 연결하고 재료의 정용여과를 15psig의 TMP에서 (입구 압력 20psig 및 출구 압력 lOpsig) 약 8.5의 턴오버 부피(TOV) 동안, 저장소내 재료의 부피를 1.2L로 유지하면서 수행하였다. 침투물의 전도성 및 pH를 5, 7 및 8.5 TOV 후에 측정하고 정용여과 완충액에 대해 이들을 조사하였다. 보유액을 시스템으로부터 배수시키고 2-8℃에서 저장하였다. 25OmL의 정용여과 완충액을 저장소로 펌핑하고, 시스템 주위로 20분 동안 백압력(backpressure) 없이 재순환시켜 시스템을 세정하고, 배수시키고, 세정을 반복하고, 두 세정액 모두를 따로따로 2-8℃에서 저장하였다. 보유액 및 세정액의 단백질 농도를 측정하고(UV에 의해) 처음 세정액(204.8g 중량)을 보유액 (1231.4g 중량)에 첨가하였다. 이러한 TFFl 후 재료(1.4kg)를 사르토포어 2 0.8+0.45㎛ 필터 캡슐을 통해 여과하고 Q 세파로스 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 가공할 때까지 2-8℃에서 밤새 저장하였다.
이온 교환 크로마토그래피 (20L 규모 진행)
장비:
유니콘 5.01 소프트웨어가 설치된 AKTA 파일롯 (GE Healthcare)
전도성 및 pH 미터 4330 (Jenway)
밴티지 S90 컬럼 (단면적 62cm2, Millipore)
메디컬 리프리저레이션 유닛 MPl 50 (Electrolux)
화학제품:
수산화나트륨 용액 (부피 4M) (AnalaR, BDH)
염화나트륨 (USP 등급, Merck)
트리스(히드록시메틸)메틸아민 (USP 등급, Merck)
염화칼슘 2-수화물 (USP 등급, Merck)
류펩틴 (MP Biomedicals, Inc.)
Q 세파로스 HP (GE Healthcare)
주사용 하이클론 수 - 퀄리티 워터 (WFI-QW)
컬럼 패킹 및 제조
WFI 중 Q 세파로스 HP 배지를 지니는 AKTA 파일롯 크로마토그래피 시스템을 이용하여 밴티지 S90 컬럼을 패킹함으로써 베드 높이가 10cm인 패킹된 컬럼을 제공하였고, 이에 따른 컬럼 부피(CV)는 62OmL이었다. 제조자의 지시에 따랐으나 패킹 유속이 210cm/hr이고 압력 제한이 0.28MPa라고 표시된 강제된 밴티지 컬럼의 압력 제한을 두면서(0.3MPa) 패킹을 수행하였다. 패킹 후, 컬럼을 2CV의 0.2M NaCl과 평형을 이루게 하고 1% CV (6.2mL)의 1M NaCl을 이용하여 lOOcm/hr (103mL/분)의 유속으로 팩 시험하였다. 패킹된 컬럼은 1.6의 비대칭 및 12605 플레이트/미터의 플레이트 수를 지녔으며, 이것은 배지에 대한 명세내에 있는 것이다(0.8 내지 1.8의 비대칭, 플레이트 수>10,000). 컬럼을 필요할 때까지 10mM의 NaOH에 저장하였다.
사용 전에, Q 세파로스 컬럼을 1.5 컬럼 부피(CV)의 WFI로 세척하여 저장 완충액을 제거하고, 0.5M NaOH를 이용하여 60분 동안 40cm/hr으로 소독한 후 1.5CV의 WFI로 다시 플러싱하였다. 이후 컬럼을 제조자의 지시에 따라 2CV 1OmM 트리스, 3mM 염화칼슘, pH 8에 이어서 2CV 1OmM 트리스, 3mM CaCl2, 36OmM NaCl, pH 8 및 마지막으로 5CV 1OmM 트리스, 3mM CaCl2, pH 8로 충전하고 평형을 이루게 하였다.
컬럼 진행
샘플을 컬럼에 로딩하기 직전에, 컬럼이 냉장된 1OmM 트리스, 3mM CaCl2, 200μM leupeptin pH 8(IEX 완충액 A)과 다시 평형을 이루게 하였다. 1216mL의 냉장된 TFF 1 후 재료를 2.55mg/mL의 농도에서 (UV에 의해 결정됨) 컬럼 위로 lOOcm/hr (103mL/분)의 유속으로 로딩하였다. 이것은 1mL의 배지에 대하여 5mg의 총 단백질이 컬럼에 로딩된 것과 같은 것이다. 생성물을 로딩한 다음, 컬럼을 3 컬럼 부피(CV)의 IEX 완충액 A로 세척하고 단백질을 1OmM 트리스, 3mM CaCl2, 36OmM NaCl, 200μM 류펩틴, pH 8 (IEX 완충액 B)을 이용하여 0-40%의 용리 완충액 구배로 (A에서 B), 20CV에 걸쳐 70.2ml/분 (68cm/hr)의 유속으로 용리시켰다. 용리를 280nm 및 260nm에서 모니터링하고 10OmL의 본획을 AUXII 및 AUXI을 함유하는 2개의 생성물 피크의 전역에서 수집하였다. 분획 수집은 피크의 돌파점(breakthrough)에서 시작되었고 후행 에지 상에서 피크 높이의 25%까지 계속되었다. 총 12개의 분획을 AUX II 피크에 걸쳐 수집하였고 15개의 분획을 AUX I 피크에 걸쳐 수집하였다. Q 세파로스 HP 크로마토그래피를 18-23℃의 표준 실험실 온도에서 수행하였으나, 사용된 완충액은 미리-냉장되었다. SDSPAGE 분석으로부터 결과가 수득될 때까지 분획을 2-8℃에서 저장하였다. 분획 6 내지 12(피크 1)을 683g으로 결정된 부피를 지니는 AUX II 콜라게나제로서 푸울링하고(샘플링 후) UV 분석에 의해 농도를 1.17mg/mL으로 측정하였다. 분획 19 내지 26(피크 2)을 796g으로 결정된 부피를 지니는 AUX I 콜라게나제로서 푸울링하고(샘플링 후) UV에 의해 농도를 1.08mg/mL으로 측정하였다.
접점 흐름 여과 단계 2 (TFF2 2OL 규모 진행)
장비:
프로플럭스 M12 TFF 시스템 (Millipore)
전도성 및 pH 미터 4330 (Jenways)
펠리콘 2 "미니" 필터 0.1m2 30kDa MWCO PES 막 (Millipore)
90mm 여과 유닛 (IL)
0.2㎛ PES 막 (Nalgene)
메디컬 리프리저레이션 유닛 MP150 (Electrolux)
재료/화학제품:
수산화나트륨 용액 (부피 4M) (AnalaR, BDH)
트리스(히드록시메틸)메틸아민 (USP 등급, Merck)
수크로오스 (BP 등급, Merck)
류펩틴 (MP Biomedicals, Inc.)
주사용 하이클론 수 - 퀄리티 워터 (WFI-QW)
주사용 프렌시어스 카비 수(Frensius Kabi Water) (WFI)
시스템 구성
제조자의 지시에 따라 1개의 펠리콘 2 "미니" 필터 3OkDa MWCO PES 막을 이용하여 프로플럭스 Ml2 TFF 시스템을 구성하고, 0.5M NaOH로 60분 동안 소독하고, 사용시까지 0.1 M NaOH에 저장하였다. 시스템을 배수시키고, 14L의 WFI로 플러싱하고, 보통의 물 침투성(NWP)을 25℃에서 15psig의 트랜스-막 압력(TMP)에서 (입구 압력 20psig 및 출구 압력 10 psig) AUXI용으로 사용된 막에 대해 19.5L/m2/hr/psi로서 측정하고 AUXII용으로 사용된 막에 대해 14.5L/m2/hr/psi로서 측정하였다. 시스템을 0.5L 1OmM 트리스, 60mM 수크로오스, pH 8 (제형화 완충액)로 플러싱하고 1L의 동일한 완충액으로 10분 동안 평형을 이루게 하였다. 침투물의 전도성 및 pH를 측정하고 제형화 완충액의 전도성 및 pH를 조사하였다.
농축 및 제형화
AUXI 및 AUXII의 IEX 후 푸울 각각에 대하여 농축 정용여과 단계를 따로따로 수행하였다. 모든 단계는 2-8℃에서 유지된 냉장된 제형화 완충액(10mM 트리스, 60mM 수크로오스, pH 8)을 이용하여 수행되었다. TFF 시스템을 사용 직전에 1L의 냉장된 완충액으로 플러싱하였다. IEX-후 푸울(683g(중량)의 AUXII 및 796g(중량)의 AUXII)을 TFF 시스템 저장소로 펌핑하고 막의 조건을 조절하기 위해 백압력 없이 10% 펌프 스피드에서 10분 동안 재순환시켰다. 저장소 상의 레벨 센서를 약 400mL로 설정하고 AUXI 및 AUXII 푸울을 15psig의 TMP에서 (입구 압력 20psig 및 출구 압력 lOpsig) 저장소의 부피가 약 360-390mL로 감소될 때까지(이것은 시스템이 100mL의 부피를 나타내는 것으로 가정한다) 농축시켰다. 표적 부피 감소는 농축 작업 동안 단백질이 손실되지 않는다는 가정하에 생성물에 대해 1.75mg/mL의 이론적 농도를 달성하는 것을 기초로 하였다. 침투물을 수집하고 분석을 위해 2-8℃에서 저장하였다. 정용여과 작업을 위해, 입구 튜빙을 제형화 완충액에 연결하고 정용여과를 15psig의 TMP에서 (입구 압력 20psig 및 출구 압력 lOpsig) 수행하였다. 저장소내 재료의 부피를 ~400mL로 유지하면서, AUXII에 대해 약 12의 턴오버 부피(TOV)를 수행하였고 AUXI에 대해 8.5의 턴오버 부피를 수행하였다. 침투물의 전도성 및 pH를 AUXII에 대해 12 TOV 후에 측정하고 AUXI에 대해 6, 7 및 8.5 TOV 후에 측정하였으며, 제형화 완충액에 대해 이들을 조사하였다. 보유액을 시스템으로부터 배수시키고 2-8℃에서 저장하였다.
25OmL의 제형화 완충액을 이용하여 시스템 주위로 10분 동안 (백압력 없이) 재순환시켜 막으로부터 잔류하는 생성물을 세척하였다. 세정액을 배수시킨 후, 두 번째 세척을 수행하고, 세정액 1 및 세정액 2 둘 모두를 2-8℃에서 저장하였다. UV 후, 보유액 및 세정액의 단백질 함량을 측정하고, 첫 번째 세정액을 보유액에 첨가하고, 혼합시키고, 혼합물의 UV 단백질 농도를 측정하였다. AUXII에 대하여, 122g의 두 번째 세정액도 세정액 1에 더하여 보유액에 첨가하여 1.1mg/mL의 이론적인 AUXII 농도를 수득하였다. AUXI에 대하여, 94g의 두 번째 세정액을 재료에 첨가하여 1.1mg/mL의 이론적인 AUXI 농도를 수득하였다. AUXI 및 AUXII 재료 둘 모두를 클래스 II 후드에서 1L Nalgene 0.2㎛ 필터 유닛을 통해 여과하고 여과 후 단백질 농도를 측정하였다. AUXI 및 AUXII 중간체를 2-8℃에서 저장하였다.
단백질 농도 측정
흡광도
장비:
DU800 분광광도계 (Beckman)
공정 중에, 220 내지 330nm에서 샘플의 UV 스캔을 수행함에 의해 샘플을 UV 분광광도계에 의해 분석하였다. 적합한 완충액을 블랭크로서 이용하였고 완충액 블랭크의 스캔을 샘플을 스캐닝하기 전에 수행하였다. 필요한 경우, 샘플을 동일한 완충액으로 희석하여 A280 < 1.0 AU를 보장하였다. 단백질 농도(mg/mL)를 비어-람베르트(Beer-Lambert) 법에 따라 결정하였다, c = A/b.ε, 여기서 A는 흡광도(A280-A330)이고, b는 경로길이(1.0cm)이며, ε은 단백질의 소멸 계수이다. AUXI에 대해 1.48mg-lcm-1mL, AUXII에 대해 1.576mg-1cm-1mL 및 AUXI/AUXII 혼합물에 대해 1.428mg-1cm-1mL의 소멸 계수가 이용되었다.
브래드포드 검정
재료:
냉동건조된 BSA (1.4mg/mL로 수화됨)
화학제품:
단백질 검정 염료 시약 농축물 (500-0006, Bio-Rad)
BSA를 공지된 농도로 물에 희석시킴에 의해 BSA 표준 곡선을 제조하였다. Bio-Rad 단백질 검정 염료 시약을, 1부의 농축물을 4부의 물로 희석시킴에 의해 제조하였다. 물에 희석시켜 시험 샘플을 제조하였다. 순수하거나 희석된 50㎕의 시험 샘플을 큐벳에 첨가하고 2.5mL의 희석된 시약을 첨가하였다. 샘플을 이중으로 제조하였다. 샘플을 OD를 판독하기 전에 10분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 농도에 대한 OD595nm의 표준 곡선을 공지된 농도의 BSA 용액의 OD595nm를 측정함에 의해 수득하였다. 이후 시험 샘플을 검정하고 표준 단백질 검정 곡선으로부터 단백질 농도를 결정하였다. 무스탕 Q 단계 후 샘플을 항상 희석하지 않고 분석하였는데, 이는 안료로부터의 영향을 표준화하기 위함이다. 이 경우, 50㎕의 희석되지 않은 무스탕 Q 후 재료를 검정에 이용하였다.
SDS-PAGE 분석
장비:
Xcell SureLock Mini-Cell 전기영동 시스템 (Invitrogen)
전기영동 전력 공급 EPS 601, (Amersham Pharmacia Biotech)
록키 쉐이커 플랫폼(Rocky shaker platform) (Scientific Laboratory Supplies)
화학제품:
SDS-PAGE 스탠다즈 하이 모레큘러 웨이트(161-0303, Bio Rad)
마크 12 비염색된 표준(LC5677, Invitrogen)
노벡스(Novex) 8% 트리스-글리신 겔, 1.5mm, 10 웰(EC6018BOX, Invitrogen)
NuPAGE 노벡스 4-12% 비스-트리스 겔, 1.0mm, 12 웰(NP0322BOX, Invitrogen)
노벡스 트리스-글리신 SDS 진행 완충액(10x)(LC2675, Invitrogen)
NuPAGE MES SDS 진행 완충액(20x)(NP0002, Invitrogen)
노벡스 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액(2x)(LC2676, Invitrogen)
NuPAGE LDS 샘플 완충액(4x)(NP0007, Invitrogen)
NuPAGE 샘플 환원제(10x)(NP0009, Invitrogen)
콜로이드 블루 염색 키트(LC6025, Invitrogen)
에틸렌디아민테트라-아세트산 이나트륨 염 Analar R(BDH)
트리스-글리신 겔
12㎕의 샘플을 20㎕의 샘플 완충액(2x), 4㎕의 환원제(1Ox) 및 4㎕의 0.1M EDTA에 첨가시켜 환원성 SDS-PAGE용의 샘플을 제조하였다(1OmM의 최종 농도 달성). 고분자량(HMW) 마커를, 10㎕의 농축된 스톡을 80㎕의 환원제(1Ox), 310㎕의 WFI 및 400㎕의 샘플 완충액(2x)에 첨가시킴에 의해 제조하였다. 희석된 HMW 표준을 95℃에서 5분 동안 가열시킨 후 분취시키고 후속하는 겔에서의 사용을 위해 -20℃에서 저장하였다. 콜라게나제를 함유하는 샘플(20㎕ 로딩 부피)을 8% 트리스-글리신 겔 상에서 트리스-글리신 진행 완충액을 이용하여 130V에서 ~2시간 동안 직접 진행시켰다(즉, 사전 가열 처리 없음). 전기영동 후, 겔을 제조자의 지시에 따라 콜로이드 블루 염색 시약으로 염색하였다.
비스-트리스 겔
16.5㎕의 샘플을 7.5㎕의 샘플 완충액(4x), 3㎕의 환원제(1Ox) 및 3㎕의 0.1M EDTA에 첨가함에 의해 환원성 SDS-PAGE용의 샘플을 제조하였다(1OmM의 최종 농도 달성). 마크 12 마커를 순수하게 로딩시켰다(10㎕). 콜라게나제를 함유하는 샘플(15㎕ 로딩 부피)을 4-12% 비스-트리스 겔 상에 MES 진행 완충액을 이용하여 200V에서 ~40분 동안 직접 진행시켰다(즉, 사전 가열 처리 없음). 전기영동 후, 겔을 제조자의 지시에 따라 콜로이드 블루 염색 시약으로 염색하거나 표준 공정을 이용하여 은 염색하였다(GE Healthcare).
IEX-후 분획의 밀도측정 분석
장비:
Xcell SureLock Mini-Cell 전기영동 시스템 (Invitrogen)
전기영동 전력 공급 EPS 601 (Amersham Pharmacia Biotech)
록키 쉐이커 플랫폼 (Scientific Laboratory Supplies) 플랫베드(Flatbed) 스캐너 (Hewlett Packard)
재료/화학제품:
NuPAGE 노벡스 4-12% 비스-트리스 겔, 1.0mm, 12 웰 (NP0322BOX, Invitrogen)
NuPAGE MES SDS 진행 완충액(2Ox) (NP0002, Invitrogen)
NuPAGE LDS 샘플 완충액(4x) (NP0007, Invitrogen)
NuPAGE 샘플 환원제(1Ox) (NP0009, Invitrogen)
마크 12 비염색된 표준 (LC5677, Invitrogen)
콜로이드 블루 염색 키트 (LC6025, Invitrogen)
에틸렌디아민테트라-아세트산 이나트륨 염(EDTA) (AnalaR, BDH)
정제수
환원성 SDS-PAGE
IEX-후 샘플을 4-12% 비스-트리스 겔 상에서 MES 진행 완충액을 이용하여 1㎍/레인의 로딩으로 진행시켰다. 20㎕의 희석된 IEX-후 재료를 8㎕의 샘플 완충액(4x), 3㎕의 환원제(1Ox) 및 3.4㎕의 0.1M EDTA에 첨가시켜 샘플을 제조하였다. 15㎕의 각 샘플을 혼합 후 웰에 직접 로딩하고(즉, 사전 가열 처리 없음) 200V에서 40분 동안 진행시켰다. 전기영동 후, 겔을 제조자의 지시에 따라 콜로이드 블루 염색 시약으로 염색하였으나 염색 편차를 줄이기 위해 고정된 염색 지속기간을 이용하였다(10분 고정, 5시간 염색, 15-20시간 정제수로 염색제 제거).
겔 스캐닝 및 밀도측정
모든 공기 방울을 확실히 제거하면서 겔을 아세테이트의 2개 시트 사이에 두고, 편평한-베드 스캐너상에서 600dpi 해상도로 스캔하고, 이미지를 잘라내어 크기를 다시 맞추고, HP 이미지 존 소프트웨어로 컬러를 수정하였다. 알파 EasePC 소프트웨어를 이용하여 이미지를 8-비트 그레이스캐일(greyscale) TIFF 이미지로 전환하고, 단백질 밴드를 퀀티티원(QuantityOne) 겔 도큐먼테이션 소프트웨어(BioRad)를 이용하여 분석하였다. 배경 치환후, 선택된 밴드의 강도 피크 면적을 각 레인의 생성물(AUXI 또는 AUXII) 및 불순물(들)의 상대 백분율 값으로 전환하였다.
완충액 안정성
장비:
연동식 펌프 (Watson Marlow)
125ml PETG 바이오테이너 (Cellon)
연동식 펌프용 왓슨 말로우(Watson Marlow) 튜빙
전도성 및 pH 미터 4330 (Jenway)
사르토포어 2 300 (0.45/0.2㎛) 필터 캡슐 (Sartorius)
20L 시범 진행용 완충액을 0.45/0.2㎛ 필터 캡슐을 통해 제조한 후 10 또는 2OL 스테딤 백으로 여과시키고 사용 전에 2-8℃에서 저장하였다.
완충액의 대부분이 여과되었을 때, 약 75ml의 남아 있는 완충액을 미리-표지된 125ml의 PETG 바이오테이너에 수집하고 2-8℃에서 저장하였다. 완충 제조물의 pH, 전도성, 온도 및 날짜를 기록하였다. 20L 시범 진행 완료시에, 완충액 샘플을 냉장 저장으로부터 회수하여 pH, 전도성 및 외관을 재시험하였다. 시험시에 완충액의 온도도 기록하였다.
N-말단 서열화 분석을 위한 샘플의 제조
장비:
전기영동 전력 공급 EPS 601 (Amersham Pharmacia Biotech)
Xcell SureLock Mini-Cell 전기영동 시스템 (Invitrogen)
록키 쉐이커 플랫폼 (Scientific Laboratory Supplies)
화학제품:
노벡스 8% 트리스-글리신, 1.5mm, 10 웰, (Invitrogen)
고분자량 마커 (BioRad)
NuPAGE 샘플 환원제(1Ox) (Invitrogen)
노벡스 트리스-글리신 SDS 진행 완충액(1Ox), (Invitrogen)
노벡스 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액(2x), (Invitrogen)
콜로이드 블루 염색 키트 (Invitrogen)
에틸렌디아민테트라-아세트산 이나트륨 염(EDTA) (AnalaR, BDH)
메탄올, AnalaR (BDH)
아세트산, AnalaR (BDH)
주사용 물 (WFI)
정제수
상기 개요된 대로 N-말단 서열화를 위한 샘플을 8% 트리스-글리신 겔 상에서 제조하고 분리하였다. 4OkDa 오염물질(IEX 후 AUXII 피크로부터의 분획 2, CTL2006#0610H;) 및 55kDa 오염물질(IEX 후 AUXI 피크로부터의 분획 16, CTL2006#0611H)이 풍부한 것으로 동정된 샘플을 각각 겔의 5개 레인에 로딩하여 서열화를 위한 충분한 재료를 제공하였다(도 89). AUXI (분획 B7 R2, CTL2006#0581P) 및 AUXII (분획 Dl, CTL2006#0582P) 둘 모두와 관련된 9OkDa 오염물질이 풍부한, 이전의 20L 발효로부터의 IEX 후 분획(20L PP3)도 다수의 레인에 로딩하였다(도 90). 전기영동 후, 겔을 제조자의 지시에 따라 콜로이드 블루 염색 시약으로 염색하고 오염물질 밴드를 삭제하고 N-말단 서열화를 위해 알타 바이오사이언스(Alta Bioscience)(Birmingham University, UK)에 제공하였다. 20L 시범 진행으로부터의 90kDa AUXI 관련 오염물질(CTL2006#0612H)도 서열화를 위해 제공되었으나 데이터는 수득되지 않았다.
공정 3의 제조 개요
발효
클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터 콜라게나제를 생산하기 위한 피톤 유가식-회분 발효 공정(공정 2)은 피톤 펩톤의 회분-대-회분 가변성으로 인해 매우 변하기 쉬운 것으로 나타났다. 이러한 이유로, 프로테오스 펩톤 #3(PP3)을 5L 발효에서 평가하였다. 상기 발효는, PP3의 한 특정 회분을 50g/L로 사용할 때, 발효 공정이 견고하고 재현될 수 있었음을 입증하였다. 그러나, PP3의 다른 회분들이 50g/L로 적용될 때, 배양의 성장 프로필에 있어서 큰 변화가 확인되었다. 다양한 회분의 PP3가 지원할 최대 생체질량 농도를 소규모 평가로 측정하였다. 이러한 회분들은 C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)의 높은 또는 낮은 생체질량 농도를 각각 지원하는 이들의 능력에 따라 "양호"하거나 "불충분"한 것으로 고려되었다. "불충분"하고 "양호"한 회분의 PP3를 100g/L로 이용한 두 발효를 5L 규모로 수행하였을 때, 둘 모두는 매우 유사한 성장 프로필 및 생성물 수율을 나타내었다. 상기 실험은, PP3의 농도를 100g/L로 증가시키는 것이 펩톤의 회분 대 회분간 가변성과 관련된 문제를 경감시켰음을 나타낸다.
확대 발효를 200L에서 수행하였다. 발효는 PP3의 최적 농도(100g/L)를 이용하였다. 발효는 성공적이었고 5L 규모에서 관찰된 성장 프로필 및 생성물 수율/품질 둘 모두를 재현하였다. 공정 2에서 전개된 수확 공정(여과에 의한 정화)을 200L 확대 발효 동안 평가하였다. 세포 배양액은 현존하는 공정을 이용하여 여과 트레인의 막힘 없이 성공적으로 정화되었다.
미정제 발효 샘플 중 콜라게나제 농도의 정량화가 코마시 염색된 트리스 글리신 겔의 밀도측정 분석을 이용하여 개선되었다. 혼합된 AUXI 및 AUXII의 표준 곡선이 발효 샘플을 희석시켜 로딩되었다. 콜라게나제의 농도와 밀도측정 피크 면적간의 관계는 샘플 희석액의 범위내에서 선형인 것으로 나타났다. 샘플 중 콜라게나제의 농도를 이들의 피크 면적 및 표준 곡선을 이용하여 추정하였다. 상기 방법은 5L 및 200L 규모에서 100g/L PP3 공정으로부터의 콜라게나제의 수율을 280 - 350mg/L로 산정하였다.
최적화된 PP3 발효 공정은 피톤 유가식-회분 공정에 비해, 더 높은 생체질량 농도(OD600 7 유닛)와 증가된 생성물 수율(280 - 350mg/L의 총 콜라게나제, 정량적 밀도측정에 의해)을 발생시켰다. 발효 여액은 피톤 공정 보다 현저히 적은 양의 클로스트리파인을 함유하였다. AUXI: AUXII의 비율은 공정 2의 평가 동안 관찰된 것과 비교하여 1에 더 가까워졌다. 요약해 보면, PP3은 생성물 수율, 순도(발효 후) 및 발효의 재현성을 증가시켰다.
정제
Cobra에서 이미 개발된 공정(공정 2)을 개선하기 위해 가속된 시간 프레임으로 공정 3을 개발하고 GMP에서 20L 규모로 진행시켰다. 공정의 주요 개선은 정제 공정을 단순화하고 견고성을 조장할 뿐 아니라 공정을 200L로의 확대를 위해 더욱 개작가능하게 만들기 위해 이루어졌다. 이러한 개선점들은 공정 허가를 돕는데에도 중요한 것으로 여겨진다.
클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 200L 발효로부터의 재료를 이용하여 공정 3을 수행하였고 여기서 충분한 20L의 발효액이 정제되었다. 재료를 발효액으로부터 직접 가공하였고 유지 단계는 고려되지 않았다. 여과 후에, 생성물을 무스탕 Q를 통해 통과시켰는데, 이는 소규모 실험이 이 공정을 이용한 dsDNA의 감소(피코 그린 분석에 의해 검출됨)를 입증하였기 때문이다. 그러나 20L 시범 진행으로부터의 인-프로세스 샘플의 분석은 dsDNA가 감소되지 않았음을 나타내었는데, 이는 본 단계의 견고성 및 적용이 추가의 조사를 요구함을 시사한다. 20L 예행 시도 및 사전의 소규모 실험에서 이용된 파라미터의 비교는, 캡슐이 1000배(제조자에 의해 개시된 15-25mg DNA/mL 캡슐의 DNA 결합 가능성에 기초하여) 만큼 오버사이징되었을 때 dsDNA의 제거를 입증하였다. 비교해 보면, 20L 예행 시도에 사용된 캡슐은 약 177-296배 만큼 오버사이징되었다. 무스탕 Q 캡슐로부터의 재료를 2-8℃에서 밤새 유지하였다. 공정의 본 단계에서 수득된 샘플 재료에 대한 오프-라인 안정성 연구는, 낮은 온도를 유지하는 것이 공정의 이 시점에서 생성물 안정성에 중요하였음을 나타내었으며, 그 이유는 RT 및 37℃로 인큐베이션된 샘플이 SDS-PAGE 분석에 의해 지적된 대로 분해에 민감하였기 때문이다.
암모늄 설페이트 용액(3M)을 첨가하고 혼합시켜 1M의 최종 농도를 달성함에 의해 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 위한 무스탕 Q 캡슐로부터의 생성물을 제조하였다. 이것은 콜라게나제가 페닐 세파로스 FF(로우 서브) 배지에 결합하기 적합한 조건을 제공하였다. 단백질 오염물질 및 안료 부분을 HIC 컬럼으로부터 0.3M 암모늄 설페이트의 단계 용리를 이용하여 용리시킨 후 콜라게나제 단백질을 암모늄 설페이트를 함유하지 않는 용액을 이용하여 용리시켰다. 생성물 피크의 수집에 대한 기준을 4 컬럼 부피의 고정된 부피로서 확립하였다(이것은 이후에 200L 규모 시범 진행에 대해 5 컬럼 부피로 확대되었다). 이후, 류펩틴을 첨가한 직후 용리시키고 재료를 2일의 기간 동안 2-8℃에서 유지하였다. 본 단계로부터의 수율은 원액의 복잡한 성질로 인해 정확히 측정하기가 어려웠다. 공정 단계 수율은 (i) 로딩의 브래드포드 검정 및 용리된 재료의 UV에 기초하여 38% 또는 (ii) 밀도측정에 의해 산정된 로딩 중의 콜라게나제 함량 및 용리된 재료의 UV에 기초하여 47%로서 산정되었다. 대안적으로, 적용된 발효 여액 매 1L의 등가물에 대해 0.17g의 총 단백질을 HIC 컬럼으로부터 용리시켰다.
HIC 후 푸울을 농축(5배) 및 2 x 0.1m2 3OkDa 막을 이용한 접점 흐름 여과(TFF1)를 이용한 완충액 교환에 의해 Q-세파로스 정제를 위해 제조하였다. 이 단계에서 어떠한 손실도 검출되지 않았고 회수된 단백질의 증가가 보고된 것은 공정의 이 시점에서 UV의 부정확성을 반영할 수 있다. 부정확성은 안료 오염 또는 콜라게나제에 대한 소멸 계수의 사용 때문일 수 있었고, 소멸 계수는 복잡한 단백질이 존재할 것 같을 때 정제에서 더 이른 재료의 경우에 덜 정확할 것이다. 생성물 여과 단계에 의해 TFF 단계를 완료하고 재료를 2-8℃에서 밤새 유지하였다.
공정 2와 같이, Q-세파로스 컬럼은 공정 3에서 중요한 정제 단계이며 AUXI 및 AUXII 콜라게나제의 분리를 초래하였다. 그러나, 공정 3과 관련된 오염물질은 공정 2의 것들과 다르며 AUXI 및 AXUII 생성물과 밀접하게 함께-정제되는 것으로 나타났다. 그러나, 오염물질이 두 피크 모두의 선행 또는 후행 에지에서 용리되는 것으로 나타났기 때문에 생성물 피크의 분획화에 의해 오염물질을 생성물로부터 제거할 수 있다. 오염물질은 환원성 SDS-PAGE 상에서 이들의 상대 분자 질량에 의해 표시되었다. AUXII 생성물(Q-세파로스 컬럼으로부터 용리된 첫 번째 피크)과 관련된 것들은 (i) 4OkDa (피크의 선행 에지와 관련됨) 및 (ii) 75kDa 및 9OkDa (피크의 후행 에지와 관련됨)인 것으로 동정되었다. N-말단 아미노산 서열화는, 40kDa가 AUXII와 관련되는데, 이는 서열이 Col H 서열의 영역과 동일성 매칭되기 때문이라고 지적한다. 비교해 보면, 90kDa 오염물질에 대해서는 낮은 시그널의 문제로 인해 동일성이 확인되지 않았다. AUXI 생성물(Q-세파로스 컬럼으로부터 용리된 두 번째 피크)과 관련된 오염물질은 (i) 55kDa (피크의 선행 에지와 관련됨) 및 (ii) 9OkDa (피크의 후행 에지와 관련됨)이었다. N-말단 서열화는, 55kDa 및 9OkDa 오염물질 둘 모두가 AUXI-관련된 것으로 동정하였으며, 여기서 55kDa 오염물질은 Col G 서열의 중간 영역과 서열 동일성을 나타내었고 9OkDa는 AUXI와 동일한 N-말단 매칭을 나타내었다. 결과적으로, 공정의 본 단계에서 동정된 주요 불순물들은 모두 생성물과 관련이 있었고, AUXI (55kDa) 및 AUXII (4OkDa)의 내부 절단 생성물 또는 AUXI (90kDa)의 C-말단으로 절단된 생성물인 것으로 동정되었다.
Q-세파로스 컬럼 이후에, 중요한 공정 단계는 분획이 추가의 정제를 위해 제시되어야 하는 지와 관련된 결정에 있다. 20L 시범 진행의 경우, 이 기준은, 4-12% SDS-PAGE에 의해 분석되고 콜로이드 블루 염색으로 염색될 때 생성물에 대한 오염물질의 상대 염색 강도에 기초하였다. 이러한 결정은 주관적이며 공정 개발 그룹의 총체적인 경험 및 의뢰인으로부터의 요구에 기초하였다. 푸울링 공정에 개시되는 규정된 기준을 확립하기 위해, SDSPAGE 상에서 밀도측정을 수행하였다. 이로부터, AUXI에 대해 ≥87% 순수하고(단일 불순물이 ≥10%이 아님) AUXII에 대하여 ≥94% 순수한(단일 불순물이 ≥4%이 아님) 분획을 함유하는 것으로서 푸울링을 개시하였다. 이것은 AUXI 및 AUXII에 대해 각각 27.7% 및 25.8%의 UV 산정에 기초한 단계 수율을 초래하였다. 200L 규모의 시범 진행으로부터 얻은 데이터로부터 밀도측정 방법의 추가의 정교화 및 표준화를 달성하였고, 이것은 후속하는 GMP 진행에 대한 개질된 기준을 정의하게 하였다.
Q-세파로스 컬럼으로부터의 AUXI 또는 AUXII 생성물을 함유하는 분획을 TFF에 의해(TFF2로서 표시됨) 각 콜라게나제에 대해 1 x 0.1m2 3OkDa 막을 이용하여 따로따로 제형화하였다. 1OmM 트리스, 6OmM 수크로오스 pH 8의 제형화 완충액을 KBI BioPharma Inc로부터 입수하였다. TFF2 단계에 따라서 생성물을 여과하였고 TFF 및 여과에 대한 전체적인 단계 수율은 AUXI에 대해 97.5% 및 AUXII에 대해 92.2%인 것으로 산정되었다. 본 단계에서, 샘플은 중간체로서 언급되었고 약물과 혼합시키기 전에 QC 분석을 위해 2-8℃에서 보유되었다. 후방 안정성 연구는, 중간체가 SDS-PAGE, UV, RP-HPLC 및 SEC-HPLC 분석에 의해 측정된 대로 2-8℃에서 5일 이상의 기간에 걸쳐 안정하였음을 나타내었다. 중간체에서 검출되는 열화는 12일 후 AUXII 중간체에서만 동정되었고 여기서 응집물 수준이 0에서 0.62%로 증가되었다.
AUXI 및 AUXII 중간체를 같은 비(UV에 의해 측정됨)로 혼합시켜 약물을 생성하고 최종 생성물 여과를 수행하였다. 400mg의 약물이 제조되었고 이 중 200mg만이 25mg의 각 중간체와 함께 KBI BioPharma Inc.로 보내졌다. 전체 공정 수율은 20L 시범 진행에서 산정되었고, 여기서 20L의 발효 원액으로부터 이용가능한 모든 재료가 가공되었으며 모든 재료가 약물로서 혼합된 것으로 가정되었다. 이것은 20L 규모 정제에 대해 1.6g의 예상되는 약물 수율을 제공하였다. 이것은 HIC 컬럼 위로 로딩되는 이용가능한 총 단백질의 양에 대한 9g의 초기 산정이(브래드포드 검정 이용) 정확하였다는 가정에 기초하여 17.8%의 공정 회수와 같은 것이다. 대안적으로, 이용가능한 총 단백질이 HIC 로딩 중의 콜라게나제 함량과 관련되는 경우(밀도측정에 의해 산정됨), 전체적인 공정 수율은 22%로서 계산되었다.
공정 예행 시도에 추가하여, 몇몇 예비 연구가 공정으로부터 수득된 샘플 및 완충 보유액에 대하여 안정성을 평가하기 위해 수행되었다. 이러한 데이터는, 생성물의 경우, 낮은 온도가 분해를 조절하는 중요한 인자이며 정제 초기에 얻어진 샘플(Q-세파로스 컬럼 이전)이 단백질분해에 더욱 민감하였음을 지적하였다. 그러나, 생성물 유지 연구는, 류펩틴 및 온도 조절(2-8℃)의 조합이 GMP 공정에 예상되는 시간 추이 동안 생성물의 품질을 유지하는데 성공적이었음을 나타내었다.
표 54 및 55는 공정 3의 AUX-I 및 AUX-II 중간체 및 또한 약물에 대한 분석적 명세를 상세하게 개시한다.
표 54: 공정 3 AUX-I 및 AUX-II 중간체에 대한 분석적 명세
*추가 제조를 위한 중간체의 일시적인 방출에 요구되는 시험
표 55: 공정 3 약물에 대한 분석적 명세
*추가 제조를 위한 약물의 일시적인 방출에 요구되는 시험
본원에 언급된 특허 및 과학 문헌은 당업자가 이용가능한 지식을 제공한다. 본원에 이용된 모든 미국특허 및 공개되거나 비공개된 미국특허 출원이 참조로서 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원이 참조로서 여기에 포함된다. 본원에 인용된 모든 다른 공개된 참조문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌이 여기에 참조로서 포함된다.
본 발명은 바람직한 구체예를 참조로 하여 제시되고 기술되었으나, 형태 및 설명에 있어서의 다양한 개질이 첨부된 청구범위에 포함된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 본원에서 이루어질 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다.
Claims (47)
- 95 면적% 이상의 순도 지니며 질량 비가 약 1:1인, 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 서열을 각각 지니는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로 구성된 약물.
- 제 1항에 있어서, 약품이 약 8의 pH에서 10mM의 트리스 완충액 및 60mM의 수크로오스 중에 있을 때, 콜라게나제 I에 대해 약 13,000 내지 약 23,000 fSRC 유닛/mg의 SRC 검정 활성, 및 콜라게나제 II에 대해 약 200,000 내지 약 380,000 fGPA 유닛/mg의 GPA 검정 활성을 지니는 약품.
- 제 1항에 있어서, 약품이 약 2 면적% 미만의 응집된 단백질을 함유하는 약품.
- 제 3항에 있어서, 약품이 약 1 면적% 미만의 클로스트리파인을 함유하는 약품.
- 제 4항에 있어서, 약품이 약 1 면적% 미만의 젤라티나제를 함유하는 약품.
- 제 5항에 있어서, 약품이 약 1% ㎍/mg(w/w) 미만의 류펩틴을 함유하는 약품.
- 제 6항에 있어서, 1 cfu/ml 미만의 바이오버든(bioburden)을 지니며 살균된 약품.
- 제 7항에 있어서, 10 EU/ml 미만의 내독소를 함유하는 약품.
- 제 7항에 있어서, 5 EU/ml 미만의 내독소를 함유하는 약품.
- 제 1항에 있어서, 콜라게나제 I 및 II가 최소 약 97 면적%의 순도를 지니는 약품.
- 제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 약품.
- 제 1항에 있어서, 약품이 살균 냉동건조된 분말이고 약 5℃의 온도에서 저장되는 약품.
- 제 11항에 있어서, 약품이 수크로오스, 트리스로 약 8.0의 pH 수준을 지니도록 제형화된 냉동건조된 주사가능한 조성물인 약품.
- 제 13항에 있어서, 약품이 약 0.9mg의 상기 약품, 약 18.5mg의 수크로오스 및 약 1.1mg의 트리스를 포함하는 냉동건조된 주사가능한 조성물 제형이고, 목표로 하는 바이알 충전 부피가 약 0.9mL인 약품.
- 제 13항에 있어서, 약품이 약 0.58mg의 상기 약품, 약 12.0mg의 수크로오스 및 약 0.7mg의 트리스를 포함하는 냉동건조된 주사가능한 조성물 제형인 약품.
- 제 11항에 따른 약품을 제공하기 위한 바이알 및 상기 약품을 장치를 이용하여 전달하는 방법을 설명하는 설명서를 포함하는 키트.
- 제 1항에 있어서, 약품이 콜라겐-매개된 질병에 걸린 피검체를 치료하기 위해 이용되는 약품.
- 95 면적% 이상의 순도를 지니며 질량 비가 약 1:1인, 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 서열을 각각 지니는 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II로 구성된 약품으로서, 상기 약품의 제조방법이
a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)을 발효시키고;
b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미정제 생성물을 수확하고;
c) 미정제 수확물로부터 여과 및 컬럼 크로마토그래피를 통해 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하고;
d) 단계 (c)로부터의 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 약 1:1의 비로 조합시키는 단계를 포함하는 약품. - 제 18항에 있어서, 약품이 콜라게나제 I에 대해 약 13,000 내지 약 23,000 fSRC 유닛/mg의 SRC 검정 활성, 및 콜라게나제 II에 대해 약 200,000 내지 약 380,000 fGPA 유닛/mg의 GPA 검정 활성을 지니는 약품.
- 제 18항에 있어서, 순도가 97 면적% 이상인 약품.
- 제 18항에 있어서, 순도가 98 면적% 이상인 약품.
- 제 18항에 있어서, 세포 뱅크 제조가 피톤 펩톤 또는 식물성 펩톤의 존재하에 수행되는 약품.
- 제 18항에 있어서, 발효 단계가 하기 단계를 포함하는 약품:
a) 제1 단계에서 배지에 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)을 접종하고 혼합물을 교반시키는 단계;
b) 단계 a)로부터의 혼합물을 인큐베이션시켜 분취량을 수득하는 단계;
c) 제2 단계에서 배지를 단계 b)에서 수득된 분취량으로 접종하고 혼합물을 교반시키는 단계;
d) 단계 c)로부터의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계;
e) 제3 단계에서 배지를 단계 d)에서 수득된 분취량으로 접종하고 교반시키는 단계;
f) 단계 e)의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계;
g) 제4 단계에서 배지를 단계 f)에서 수득된 분취량으로 접종하고 교반시키는 단계;
h) 단계 g)의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계; 및
i) 단계 h)에서 수득된 배양물을 여과에 의해 수확하는 단계. - 제 18항에 있어서, 정제 단계가 하기 단계를 포함하는 약품:
a) 미정제 수확물을 무스탕 Q 컬럼를 통해 여과하는 단계;
b) 암모늄 설페이트를 첨가하는 단계;
c) 미정제 수확물을 여과하는 단계;
d) 여액을 HIC 컬럼을 통해 처리하는 단계;
e) 류펩틴을 여액에 첨가시키는 단계;
f) 암모늄 설페이트를 제거하고 TFF에 의한 완충액 교환으로 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 정확한 결합을 위해 류펩틴을 유지하는 단계;
g) 단계 f)의 혼합물을 여과시키는 단계;
h) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 Q-세파로스 HP를 이용하여 분리하는 단계;
i) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대한 TFF 농축물 및 제형을 따로따로 제조하는 단계; 및
j) 0.2㎛ 여과 시스템을 통해 여과하는 단계. - 제 18항에 있어서, 약품이 약 -70℃의 온도에서 저장되는 약품.
- 제 18항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 약품.
- 제 18항에 있어서, 약품이 살균 냉동건조된 분말이고 약 5℃의 온도에서 저장되는 약품.
- 제 26항에 있어서, 약품이 수크로오스, 트리스로 약 8.0의 pH 수준을 지니도록 제형화된 냉동건조된 주사가능한 조성물인 약품.
- 제 28항에 있어서, 약품이 약 0.9mg의 상기 약품, 약 18.5mg의 수크로오스 및 약 1.1mg의 트리스를 포함하는 냉동건조된 주사가능한 조성물 제형이고, 목표로 하는 바이알 충전 부피가 약 0.9mL인 약품.
- 제 28항에 있어서, 약품이 약 0.58mg의 상기 약품, 약 12.0mg의 수크로오스 및 약 0.7mg의 트리스를 포함하는 냉동건조된 주사가능한 조성물 제형인 약품.
- 제 26항에 따른 약품을 제공하기 위한 바이알 및 상기 약품을 장치를 이용하여 전달하는 방법을 설명하는 설명서를 포함하는 키트.
- 제 18항에 있어서, 약품이 콜라겐-매개된 질병에 걸린 피검체를 치료하기 위해 이용되는 약품.
- a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)을 발효시키고;
b) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 포함하는 미정제 생성물을 수확하고;
c) 미정제 수확물로부터 여과 및 컬럼 크로마토그래피를 통해 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 정제하고;
d) 단계 (c)로부터의 정제된 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 약 1:1의 비로 조합시키는 단계를 포함하여, 제 1항에 따른 약품을 제조하는 방법. - 제 33항에 있어서, 약품이 콜라게나제 I에 대해 약 13,000 내지 약 23,000 fSRC 유닛/mg의 SRC 검정 활성, 및 콜라게나제 II에 대해 약 200,000 내지 약 380,000 fGPA 유닛/mg의 GPA 검정 활성을 지니는 방법.
- 제 33항에 있어서, 약품이 97 면적% 이상의 순도를 지니는 약품.
- 제 33항에 있어서, 약품이 98 면적% 이상의 순도를 지니는 약품.
- 제 33항에 있어서, 세포 뱅크 제조가 피톤 펩톤 또는 식물성 펩톤의 존재하에 수행되는 방법.
- 제 33항에 있어서, 발효 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 제1 단계에서 배지에 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)을 접종하고 혼합물을 교반시키는 단계;
b) 단계 a)로부터의 혼합물을 인큐베이션시켜 분취량을 수득하는 단계;
c) 제2 단계에서 배지를 단계 b)에서 수득된 분취량으로 접종하고 혼합물을 교반시키는 단계;
d) 단계 c)로부터의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계;
e) 제3 단계에서 배지를 단계 d)에서 수득된 분취량으로 접종하고 교반시키는 단계;
f) 단계 e)의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계;
g) 제4 단계에서 배지를 단계 f)에서 수득된 분취량으로 접종하고 교반시키는 단계;
h) 단계 g)의 혼합물을 인큐베이션시키는 단계; 및
i) 단계 h)에서 수득된 배양물을 여과에 의해 수확하는 단계. - 제 33항에 있어서, 정제 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 미정제 수확물을 무스탕 Q 컬럼를 통해 여과하는 단계;
b) 암모늄 설페이트를 첨가하는 단계;
c) 미정제 수확물을 여과하는 단계;
d) 여액을 HIC 컬럼을 통해 처리하는 단계;
e) 류펩틴을 여액에 첨가시키는 단계;
f) 암모늄 설페이트를 제거하고 TFF에 의한 완충액 교환으로 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II의 정확한 결합을 위해 류펩틴을 유지하는 단계;
g) 단계 f)의 혼합물을 여과시키는 단계;
h) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II를 Q-세파로스 HP를 이용하여 분리하는 단계;
i) 콜라게나제 I 및 콜라게나제 II에 대한 TFF 농축물 및 제형을 따로따로 제조하는 단계; 및
j) 0.2㎛ 여과 시스템을 통해 여과하는 단계. - 제 33항에 있어서, 약품이 약 -70℃의 온도에서 저장되는 방법.
- 제 33항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 약품.
- 제 33항에 있어서, 약품이 살균 냉동건조된 분말이고 약 5℃의 온도에서 저장되는 약품.
- 제 33항에 있어서, 약품이 수크로오스, 트리스로 약 8.0의 pH 수준을 지니도록 제형화된 냉동건조된 주사가능한 조성물인 약품.
- 제 43항에 있어서, 약품이 약 0.9mg의 상기 약품, 약 18.5mg의 수크로오스 및 약 1.1mg의 트리스를 포함하는 냉동건조된 주사가능한 조성물 제형이고, 목표로 하는 바이알 충전 부피가 약 0.9mL인 약품.
- 제 43항에 있어서, 약품이 약 0.58mg의 상기 약품, 약 12.0mg의 수크로오스 및 약 0.7mg의 트리스를 포함하는 냉동건조된 주사가능한 조성물 제형인 약품.
- 제 41항에 따른 약품을 제공하기 위한 바이알 및 상기 약품을 장치를 이용하여 전달하는 방법을 설명하는 설명서를 포함하는 키트.
- 제 33항에 있어서, 약품이 콜라겐-매개된 질병에 걸린 피검체를 치료하기 위해 이용되는 방법.
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