CN105963678A - 一种环孢素a微乳巴布膏眼贴及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种环孢素A微乳巴布膏眼贴及其制备方法，所述环孢素A微乳巴布膏眼贴包括环孢素A巴布剂胶体、无纺布以及流延聚丙烯膜，所述环孢素A巴布剂胶体涂布在无纺布上，并覆盖上流延聚丙烯膜；所述环孢素A巴布剂胶体中各原料组分如下：聚丙烯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、高岭土、钛白粉、氢氧化铝、酒石酸、EDTA‑2Na、尼泊金甲酯、尼泊金丙脂、吐温‑80、甘油、纯化水以及环孢素A微乳。本发明巴布膏眼贴安全性高，药效性质稳定，在透皮性能、粘附性能以及皮肤舒适的方面表现良好，另外其药力药效持久，对皮肤刺激性小、无毒性反应。

Description

一种环孢素A微乳巴布膏眼贴及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及一种环孢素A微乳巴布膏眼贴及其制备方法。
【背景技术】
正常机体免疫系统存在自身耐受机制，对自身抗原不发生免疫反应。在一些情况下机体免疫系统可以对自身成分发生免疫应答称为自身免疫(Autoimmunity)，这种自身免疫应答通常是适度的，不产生组织损伤，而且有利于清除衰老或损伤的自身细胞起免疫稳定作用。然而过度持久的自身免疫反应，造成组织损伤，引起病变和出现临床症状即称为自身免疫病(Autoimmunity diseases)。
眼部也可以发生一系列的免疫病理过程，引起眼部的各种免疫性疾病，我们把它们统称为免疫性眼病。目前已知眼的自身免疫性疾病共几十种，诸如，甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)又称Graves眼病，是一种同时累及甲状腺与眼眶等器官的特异性自身免疫性疾病，是最常见的眼眶病，占成人眼眶病发病率的20％，常见于女性，但在年龄大于50岁的男性中亦常见。约有25-50％的Graves甲亢患者会合并出现眼部症状，如果进行眼部的MRI或CT检查，这一比例可高达90％。除此之外，在桥本氏甲状腺炎，甲状腺功能低下的患者中也可出现。其它免疫性眼病还包括内因性葡萄膜炎、交感性眼炎等等。故免疫性眼病的发病率高，目前临床上采用的方法包括单独的肾上腺皮质激素或肾上腺皮质激素与免疫抑制剂的联合，对重症患者亦采用放射治疗，甚至手术治疗。但疗效欠佳，病情反复，致肓率高，严重影响患者的生活。设计本课题的目的，即是对免疫性眼病的一种治疗探讨，以寻找一种简单易行、行之有效的治疗免疫性眼病的方法。
环孢素A(cyclosporin A,CsA)系由11个氨基酸组成的亲脂性环状多肽,为第三代高效免疫抑制剂，环孢素A是治疗自身免疫性眼病常用的免疫抑 制药物之一，主要有滴眼液、注射液及口服药三种制剂。本品是真菌Tolypocladiuminflatum培养液中分离的中性环状多肽混合物，为一免疫抑制作用很强、对骨髓毒性很小的新药。环孢素A有较广泛的免疫抑制作用，主要作用在免疫反应的诱导期，即抗原识别和增殖克隆阶段，主要降低胸腺细胞总数，阻断胸腺内淋巴细胞分化成熟及淋巴因子合成。本品干扰抗原或致裂原触发的T细胞激活过程，可抑制细胞介导的反应发生，因而对细胞和体液免疫过程兼有抑制效用。在细胞水平，环孢素抑制包括白细胞介素2、T细胞生长因子(TCGF)在内的淋巴因子的生成和释放。本品能特异而可逆地作用于淋巴细胞，而不影响造血及吞噬细胞的功能，故对中性粒细胞的影响较小，继发感染的发生率较低。抑制体内T淋巴细胞在抗原或分裂原刺激下的分化、增殖和分泌淋巴因子。主要作用于T辅助细胞，降低其功能，减少白细胞介素2(IL-2)的产生。在某些条件下还抑制T细胞对IL-2的反应性，并使T杀伤细胞的发展受阻，抑制T细胞及NK细胞的细胞毒杀伤活力，降低Th/Ts比值，但却有利于T抑制细胞的生成。本品口服吸收不规则且不完全，个体差异大，生物利用度20％-50％，血药浓度达峰时间3.5小时，与血浆蛋白结合率90％。主要在肝脏中代谢，由胆汁排出，可通过胎盘及乳汁，半衰期为10-72小时。近年来其在眼科多种疾病的预防和治疗如干眼症、角膜移植免疫排斥反应、葡萄膜炎等方面已有应用并取得较好疗效！环孢素A的免疫抑制效果很好，但它全身应用的副作用亦是不容小觑，主要有肾毒性、肝毒性，发生感染的也很常见，而且有可能是致命的，还可能因为其免疫抑制作用，发生淋巴细胞瘤。因此在上述药物副作用的前提下，曾有学者报道普通的环孢素经过微乳化改造后可有效透皮，故课题采用环孢素微乳即“新山地明”的工业用料进行研究，探讨可否通过眼周局部给药的方式，实现药物有效通过血眼生理屏障，通过环孢素A微乳对局部淋巴的免疫抑制作用，达到治疗免疫性眼病的目的；再者，局部给药不同于口服、静脉注射等全身给药方式，药物在局部发挥作用，相关的肝肾毒性等不良反应相应减少，给药方便，增加患者对治疗的依从性。课题中，我们就如何实现眼周局部给药进行了相应探讨。
为减少药物全身给药后的不良反应的发生，随着科学技术的不断发展，新的给药途径不断出现，例如经皮给药途径、靶向给药途径、植入给药途径等。经皮给药系统是指经皮肤敷贴方式给药,药物由皮肤吸收进入全身血液循环并达到有效血药浓度,实验疾病预防或治疗的一类制剂。广义的经皮给药系统可以包括贴片、软膏、凝胶剂、气雾剂和涂剂。这种给药系统拥有其他给药系统所不具备的优势，可以避免肝脏的首过效应和胃肠道的破坏,直接进入血液循环,维持较长的作用时间,减少给药次数,延长给药时间,维持恒定的有效血药浓度,降低药物的毒性和副作用,提高疗效。巴布贴剂又称巴布剂，是以水溶性高分子聚合物为基质骨架材料的外用贴剂，是从古代泥罨剂发展起来的，常用于中药制剂的体外透皮给药。自20世纪70年代日本进行工业化生产以来，巴布剂在日本有了较快的发展，并于80年代成功地打入了欧美市场，同期引入我国。巴布膏属于透皮给药系统或经皮吸收制剂的一种。是经皮肤贴敷方式用药，药物由皮肤吸收进入全身血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防的一类制剂。巴布贴剂的好处：(1)可避免肝脏的首过效应和药物在胃肠道的灭活，药物的吸收不受胃肠道因素的影响.减少用药的个体差异。(2)维持恒定有效血药浓度或生理效应，避免口服给药引起的血药浓度峰谷现象，降低毒副反应。(3)减少给药次数，提高治疗效能，延长作用时间，避免多剂量给药，使大多数病人易于接受。(4)使用方便，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药。(5)靶向性强，可直接作用与病患处，最大发挥药物疗效。(6)保湿透气耐老化，载药量大、无刺激性过敏性，是中药外用贴剂的适宜剂型。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种环孢素A微乳巴布膏眼贴，其安全性高，药效性质稳定，在透皮性能、粘附性能以及皮肤舒适的方面表现良好，另外其药力药效持久，对皮肤刺激性小、无毒性反应。
本发明是这样实现上述技术问题之一的：
一种环孢素A微乳巴布膏眼贴，所述环孢素A微乳巴布膏眼贴包括环 孢素A巴布剂胶体、无纺布以及流延聚丙烯膜，所述环孢素A巴布剂胶体涂布在无纺布上，并覆盖上流延聚丙烯膜；所述环孢素A巴布剂胶体中各原料组分如下：聚丙烯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、高岭土、钛白粉、氢氧化铝、酒石酸、EDTA-2Na、尼泊金甲酯、尼泊金丙脂、吐温-80、甘油、纯化水以及环孢素A微乳。
进一步地，所述环孢素A巴布剂胶体中各原料组分的含量如下：聚丙烯酸钠：聚乙烯吡咯烷酮：明胶：高岭土：钛白粉：氢氧化铝：酒石酸：EDTA-2Na：尼泊金甲酯：尼泊金丙脂：吐温-80：甘油：纯化水：环孢素A微乳为30：10：7.5：10：2.5：0.75：1.0：0.25：0.125：0.125：1.5：75：500：0.1-1.0。
进一步地，所述环孢素A微乳巴布膏眼贴中环孢素A含量为10mg/片，浓度为0.2-2mg/ml，其规格为7*10cm，重量8g/片。
本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种环孢素A微乳巴布膏眼贴的制备方法，其制备的产品安全性高，药效性质稳定，在透皮性能、粘附性能以及皮肤舒适的方面表现良好，另外其药力药效持久，对皮肤刺激性小、无毒性反应。
本发明是这样实现上述技术问题之二的：
一种环孢素A微乳巴布膏眼贴的制备方法，所述制备方法步骤如下：
步骤10、称取甘油，加入环孢素A微乳、尼泊金甲酯、尼泊金丙脂、氢氧化铝、钛白粉、高岭土，搅拌至初步混合；
步骤20、采用均质机搅拌，得到细腻白色的混合液；
步骤30、往上述白色混合液中加入聚丙烯酸钠，分散机上分散搅拌，得到环孢素A微乳甘油相，备用；
步骤40、用纯化水分别溶解EDTA-2Na、酒石酸、明胶、吐温-80，备用；
步骤50、纯化水加热至90℃保温，然后加入聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮进行搅拌溶解至透明，冷却至室温备用；
步骤60、行星混合机当中加入上述聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮混合溶液、EDTA-2Na溶液进行搅拌；
步骤70、把环孢素A微乳甘油相加入到其中，真空条件下搅拌；然后加入酒石酸、明胶、吐温-80溶液，继续真空搅拌，得到环孢素A巴布剂胶体；
步骤80、将环孢素A巴布剂胶体涂布在无纺布上，再覆盖上流延聚丙烯膜，经冲切机切割后，既得环孢素A微乳巴布膏眼贴。
进一步地，所述环孢素A微乳巴布膏眼贴中各原料组分的含量如下：所述聚丙烯酸钠：聚乙烯吡咯烷酮：明胶：高岭土：钛白粉：氢氧化铝：酒石酸：EDTA-2Na：尼泊金甲酯：尼泊金丙脂：吐温-80：甘油：纯化水：环孢素A微乳为30：10：7.5：10：2.5：0.75：1.0：0.25：0.125：0.125：1.5：75：500：0.1-1.0。
进一步地，所述环孢素A微乳巴布膏眼贴中环孢素A含量为10mg/片，浓度为0.2-2mg/ml。
进一步地，所述制备方法步骤具体如下：
步骤10、称取甘油75g，加入环孢素A微乳500mg、尼泊金甲酯0.125g、尼泊金丙脂0.125g、氢氧化铝0.75g、钛白粉2.5g、高岭土10g，手工搅拌至初步混合；
步骤20、采用均质机3000转/分搅拌5min，得到细腻白色的混合液；
步骤30、上述白色混合液中加入聚丙烯酸钠30g，分散机上1000转/分，分散搅拌10min，得到环孢素A微乳甘油相，备用；
步骤40、纯化水25mg用于溶解EDTA-2Na 0.25g，备用。纯化水25mg进行溶解酒石酸1.0g，备用；纯化水25mg用于溶解明胶7.5g，备用。纯化水25mg用于溶解吐温-80 1.5g，备用；
步骤50、纯化水400mg加热至90℃保温，一次性加入聚乙烯醇10g和聚乙烯吡咯烷酮10g进行搅拌溶解至透明，冷却至室温备用；
步骤60、行星混合机当中加入聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮混合溶液、EDTA-2Na溶液进行10转/分2min搅拌；
步骤70、把环孢素A微乳甘油相加入到其中，真空条件下30转/分，搅拌5min。加入酒石酸、明胶、吐温-80溶液，继续真空搅拌30转/分，搅拌10min，得到环孢素巴布剂胶体；
步骤80、将环孢素A巴布剂胶体涂布在EW9100无纺布，覆盖CPP膜，冲切机切成7*10cm规格，重量8g/片，既得环孢素A微乳巴布膏眼贴。
本发明具有如下优点：
本发明环孢素A微乳巴布膏眼贴膏体中含有近50％～60％的水分，接近人体皮肤含水状况，这样的环境中，药物可以在其中沿着浓度梯度自由移动。再者，贴敷于人体表皮的膏体层中的药物被吸收一部分后，远端药物分子可以自动向浓度低的皮肤表层转移，由此造成膏体内药物最大限度地渗透人体皮肤进入局部组织，且给药方便，药力药效持久。
本发明环孢素A微乳巴布膏眼贴中环孢素A的浓度为0.15％，相比0.5％环孢素滴眼液，其浓度更低，从理论上讲，安全性也相对优于环孢素滴眼液；再者，本身环孢素A微乳的纳米粒径大于4-5nm，可通过淋巴管吸收，而淋巴管回流速度仅为血液回流速度的1/200，故药物与淋巴细胞的接触时间更长，可达48小时之久。除此之外，环孢素A微乳巴布膏眼贴面积7×10cm，可有效覆盖眼眶周转淋巴引流区域，24小时的累计透皮浓度0.4881mg/ml,在巴布膏的促透皮作用下，其透皮性能高于单纯的环孢素A微乳，为后续研究环孢素A微乳巴布膏眼贴在治疗免疫性眼病的疗效观察中有重要价值。
通过对环孢素A微乳巴布膏单次给药和连续给药对豚鼠完整皮肤及破损皮肤的影响试验，结果表明本发明环孢素A微乳巴布膏对皮肤刺激性小、无毒性反应。对豚鼠皮肤过敏性试验中,未见豚鼠红斑、水肿等皮肤过敏反应。所以环孢素A微乳巴布膏具有临床应用价值和深入开发的可行性。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例中20ul稀释后的环孢素A标准品的透皮图谱。
图2为本发明实施例中12ul稀释后的环孢素A标准品的透皮图谱。
图3为本发明实施例中8ul稀释后的环孢素A标准品的透皮图谱。
图4为本发明实施例中4ul稀释后的环孢素A标准品的透皮图谱。
图5为本发明实施例中2ul稀释后的环孢素A标准品的透皮图谱。
图6为本发明实施例中环孢素A标准曲线图。
图7本发明实施例中环孢素A微乳巴布膏眼贴透皮试验时间-浓度曲线。
【具体实施方式】
请参阅图1～7所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
一、环孢素A微乳巴布膏眼贴成型工艺
1.1、制备方法
环孢素A微乳巴布膏眼贴的制备方法步骤具体如下：
步骤10、称取甘油75g，加入环孢素A微乳500mg、尼泊金甲酯0.125g、尼泊金丙脂0.125g、氢氧化铝0.75g、钛白粉2.5g、高岭土10g，手工搅拌至初步混合；
步骤20、采用均质机3000转/分搅拌5min，得到细腻白色的混合液；
步骤30、上述白色混合液中加入聚丙烯酸钠30g，分散机上1000转/分，分散搅拌10min，得到环孢素A微乳甘油相，备用；
步骤40、纯化水25mg用于溶解EDTA-2Na 0.25g，备用。纯化水25mg进行溶解酒石酸1.0g，备用；纯化水25mg用于溶解明胶7.5g，备用。纯化水25mg用于溶解吐温-80 1.5g，备用；
步骤50、纯化水400mg加热至90℃保温，一次性加入聚乙烯醇10g和聚乙烯吡咯烷酮10g进行搅拌溶解至透明，冷却至室温备用；
步骤60、行星混合机当中加入聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮混合溶液、EDTA-2Na溶液进行10转/分2min搅拌；
步骤70、把环孢素A微乳甘油相加入到其中，真空条件下30转/分，搅拌5min。加入酒石酸、明胶、吐温-80溶液，继续真空搅拌30转/分，搅拌10min，得到环孢素巴布剂胶体；
步骤80、将环孢素A巴布剂胶体涂布在EW9100无纺布，覆盖CPP膜， 冲切机切成7*10cm规格，重量8g/片，既得环孢素A微乳巴布膏眼贴。
1.2环孢素A微乳巴布膏的质量控制
按2005年版本的《中国药典》一部附录Ⅱ贴膏剂的要求对环孢素A微乳巴布膏眼贴进行检查，以进一步验证成型工艺的合理性。
1.2.1粘附性试验
取环孢素A微乳巴布膏眼贴3片，在室温下，除去盖衬，置于长30cm、与水平面成15“的斜面，滚球放在中央，膏面向上，斜面上部10cm及下部15cm用0.025mm厚的涤纶薄膜覆盖，中间留出5cm膏面，将各该品种项下规定的小球，自斜面顶端自由滚下。3片环孢素A微乳巴布膏眼贴中应有2片或2片以上能在测试段上粘住钢球，如有1片不能粘住，再用较小1号的钢球试验，应能粘住。如只有1片能粘住钢球，2片只能粘住较小l号的钢球，则应另取3片复试，3片均应能粘住钢球为合格。由于巴布膏眼贴将来要敷贴于眼部，且多为睡眠时使用，故不需要太大的粘性，所以测定结果为环孢素A微乳巴布膏眼贴能粘住的最大球号为3号钢球。
1.2.2含膏量测定
取巴布膏眼贴1片,除去盖衬,精密称量后置于烧杯中,加适量水,加热煮沸至纱布与膏药完全分离后将布取出,用水洗涤至布面无残留膏体,晾干后在105℃烘箱中干燥30min,移至干燥器中,冷却30min。再次精密称量,减失重量即为膏重。按标示面积换算成每100cm2含膏量。结果,环孢素A微乳巴布膏眼贴含膏量为6.83克。
1.2.3其他：符合2005年版《中国药典》(一部)贴膏剂有关巴布膏剂项下的规定。
二、环孢素A微乳巴布膏眼贴体外透皮实验
1.试验材料
仪器与试剂：
环孢素A微乳巴布膏眼贴5片(自制)；
高效液相色谱仪(岛津公司)
改良式Franz扩散池(德阳科瑞仪器设备厂)；
接受液：30％乙醇溶液(上海金锦乐实业有限公司)；
BS-10S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
动物：ICR小鼠(长沙市天勤生物技术有限公司)15只，18-20克/只。
2.试验方法与结果
2.1鼠皮的制备
ICR小鼠断颈处死，通过脚掌充气至皮肤鼓起，用医用剪刀去除腹部皮肤，剃净腹部毛发，无菌棉签粘除皮下残留组织，迅速放入生理盐水保存，必要时置入冰箱6℃保存。
2.2体外透皮试验方法
2.2.1扩散池与接受液的选择：
漏槽条件是指药物所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，生理学解释为药物在体内被迅速吸收，制剂的体外包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的，满足药物溶解-吸收的过程，漏槽条件起到了修正作用，一般释放介质的体积为药物饱和溶液所需介质体积的3～5倍。结合环孢素A的漏槽条件，查阅相关文献后，确定本研究中采用改良Franz扩散池(图3)进行环孢素A微乳巴布膏眼贴的体外透皮吸收实验，并确定本试验所用的接受液是30％乙醇生理盐水混合液。
2.2.2改良Franz扩散池操作流程
根据改良Franz扩散池的瓶口大小剪取环孢素A微乳巴布膏眼贴样品，取出事先准备好的离体ICR小鼠鼠皮，生理盐水洗净，用滤纸吸干表面水分，将同等面积的供试环孢素A微乳巴布膏眼贴样品贴于皮肤角质层面，贴在瓶口，夹好上口漏槽和夹板(贴药面朝向供应室，皮肤面朝向接受室)，接受室内加入30％乙醇生理盐水混合液，操作中避免气泡产生。模拟眼表皮肤温度，循环水温度控制在33℃，搅拌速度控制在50转/分进行试验。分别在实验的2小时、5小时、8小时、12小时、24小时取2ml样品，取完补足等量的接受液。所得样品经过滤膜过滤，留取1ml待行液相色谱分析。
2.3环孢素A微乳经皮浓度的测定
2.3.1色谱条件
参照2010年版药典二部附录ⅤD,采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测样品环孢素A浓度。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱前连接的不锈钢管)；以乙腈－水－叔丁基甲醚－磷酸(430：520：50：1)为流动相；检测波长为210nm；不锈钢管和柱温70℃。
2.3.2环孢素A浓度-峰面积标准曲线绘制
标准溶液配制及测定：称取环孢菌素A标准品0.0234g，溶于2ml甲醇(浓度为0.0117g/ml，即11.7mg/ml)，从中取0.1ml加0.9ml甲醇稀释(浓度为1.17mg/ml)，再从中取0.1ml加0.9ml甲醇稀释(浓度为0.117mg/ml)，并分别取20ul、12ul、8ul、4ul、2ul采用HPLC上机检测环孢素A标准品峰面积，如图1～5所示，得到环孢素A各标准品的峰面积值，如表1所示。根据标准品浓度绘制标准曲线，如图6所示。
表1环孢素A标准品峰面积值
标样编号 实际浓度(mg) 峰面积
1 0.000234 747731
2 0.000468 12815102
3 0.009360 24391912
4 0.001404 36295223
5 0.002340 60399946
以横作标X代表浓度，纵作标Y代表峰面积，列出线性方程式Y＝1.134×105+2.522×109×X，浓度X＝(Y-1.134×105)/2.522×109，如下表2所示，线性相关系数R＝0.99987。
表2线性方程式
Linear Regression:Y＝A+B*X
2.3.3环孢素A微乳巴布膏眼贴样品体外透皮试验浓度测定
2.3.3.1.样品溶液配制及测定
取环孢素A微乳巴布膏眼贴接受液待测样品0.2ml加1ml甲醇稀释，并取20ul测HPLC，平行测定3次，求取平均峰面积，代入线性方程式计得计算浓度，由于计算浓度＝实际浓度×0.2ml×(20/1200)，所以样品实际浓度＝计算浓度×300。根据标准品透皮图谱，环孢素A透皮峰面积计算起始时间10.53±0.188min,达峰时间12.78±0.104min,计算结束时间15.57±0.172min，计算机自动生成峰面积数值(表3)，透皮时间与峰面积为正相关关系。
表3环孢素A微乳巴布膏眼贴透皮接受液样品浓度
2.3.3.2.环孢素A微乳巴布膏眼贴透皮试验时间-浓度曲线
以横作标代表时间，纵作标代表样品透过浓度作图，如图7所示，说明环孢素A微乳巴布膏眼贴有良好的透皮能力。
三、皮肤刺激性及过敏性试验
环孢素A微乳巴布膏眼贴含有环孢素A微乳及其它材料，本试验观测动物局部给药后对皮肤的刺激性及过敏反应。
1试验动物及材料
健康豚鼠(长沙市天勤生物技术有限公司)，环孢素A微乳巴布膏(自制)及基质(自制)，脱毛剂8％硫化钠(青岛雅各化学试剂有限公司)。
2皮肤刺激性试验
2.1单次给药对豚鼠完整皮肤及破损皮肤的影响。
2.1.1试验方法
取豚鼠10只，给药前24小时将豚鼠背部脊柱两侧用8％硫化钠脱毛，面积约9cm2，其中5只用细砂纸在脱毛部位造成局部擦伤。分脊柱左右两个区，左侧为给药区，右侧为对照区。在脱毛给药区贴相应面积的环孢素A微乳巴布膏，右侧贴相同面积的基质，药物与皮肤接触24h后用清水轻轻洗去药膏及基质，于去除受试物后l、12、24、48、72h观察其皮肤刺激反应，看有无红斑、水肿、隆起、焦痴形成等，并对每只动物的皮肤反应强度进行评分，观察药物对皮肤刺激情况。
2.1.2评分标准
表4皮肤反应评分标准
表5皮肤刺激强度评价
反应平均值＝(红斑形成总分十水肿形成总分)/合计动物数。
2.1.3试验结果
环孢素A微乳巴布膏对完整皮肤无刺激性，去除受试药物后l、12、24、48、72h后均无红斑及水肿(结果见表5)，且动物精神状态、外观、摄食量、体重、呼吸、大小便、肤色、外观等未见明显异常，破损皮肤给药后也 未见明显的皮肤刺激性，其他也未见明显异常(结果见表6和表7)。
表6环孢素A微乳巴布膏一次给药对完整皮肤刺激性试验结果
表7环孢素A微乳巴布膏一次给药对破损皮肤刺激性试验结果
结论：环孢素A微乳巴布膏对豚鼠完整皮肤及破损皮肤单次给药试验未出现皮肤刺激反应，破损皮肤给药仅有一只见轻度的发红、水肿。
2.2多次给药对豚鼠完整皮肤及破损皮肤的影响
2.2.1试验方法
取豚鼠10只，给药前24小时将豚鼠背部脊柱两侧用8％硫化钠脱毛，面积约9cm cm2，其中5只用细砂纸在脱毛部位造成局部擦伤。分脊柱左右两个区，左侧为给药区，右侧为对照区。在脱毛给药区贴相应面积的环孢素A微乳巴布膏，右侧贴相同面积的基质，每天1次，连续7天。每日密切观察皮肤反应情况。观察其皮肤刺激反应，看有无红斑、水肿、隆起、焦痴形成等，并对每只动物的皮肤反应强度进行评分，观察药物对皮肤刺激情况。
2.2.2评分标准
评分标准见表3、4。
2.2.3试验结果及结论
动物完整皮肤区在给药7天后观察，未见明显的红斑、水肿反应。破损皮肤区从用药即刻到给药前3天均无明显异常，第4天皮肤开始出现轻度红斑、水肿反应，逐渐明显。(结果见表8)。所有动物精神状态、外观、摄食量、体重、呼吸、大小便、肤色、外观等未见明显异常。
表8环孢素A微乳巴布膏连续给药对豚鼠皮肤刺激性试验结果
结论:环孢素A微乳巴布膏对豚鼠完整皮肤连续给药无刺激性；而破损皮肤其保护屏障受到破坏，连续给药时有轻度刺激性。豚鼠完整皮肤及破损皮肤经连续给药均未出现毒性反应。
3皮肤过敏试验
3.1实验方法
取豚鼠20只,随机分为基质组、给药组2组,给药前24小时将豚鼠背部脊柱两侧用8％硫化钠脱毛，面积约9cm2，将环孢素A微乳巴布膏和基质各涂于豚鼠左侧脱毛区,6h后除去受试物。第7天、第14天以同样方法重复致敏接触1次。在最后一次给受试物致敏后14天,将环孢素A微乳巴布膏和基质各涂于豚鼠右侧脱毛区,6h后除去受试物,即刻观察,然后于24、48、72h再次观察皮肤过敏反应情况。
3.2评分标准
3.2.1皮肤过敏反应评分标准(见表9)。
表9皮肤过敏反应评分标准
3.2.2皮肤致敏性评价标准(见表10)
表10皮肤致敏性评价标准
致敏发生率＝发生过敏动物例数(不论过敏程度轻重)/受试动物总数。
3.3实验结果
涂用化环孢素A微乳巴布膏及基质后,未发现受试豚鼠局部皮肤出现红斑、水肿等过敏反应,皮肤致敏评价为无致敏性。结果见表11。
表11过敏实验结果
结论:环孢素A微乳巴布膏对豚鼠皮肤过敏性试验中，未见豚鼠红斑、水肿等皮肤过敏反应。
综上，巴布剂具有众多的优点，例如贴敷舒适、载药量大、生产无“三废”、适宜的粘附性等。本发明环孢素A微乳巴布膏眼贴膏体基质具有以下优点：(1)对主药稳定性没有影响，无副作用；(2)有适当的弹性和薪性；(3)不在皮肤上残存；(4)能保持巴布剂的形状；(5)不因汗水作用而软化；(6)在规定的时间内稳定和保湿性。
本发明环孢素A微乳巴布膏眼贴膏体中含有近50％～60％的水分，接近人体皮肤含水状况，这样的环境中，药物可以在其中沿着浓度梯度自由移动。再者，贴敷于人体表皮的膏体层中的药物被吸收一部分后，远端药物分子可以自动向浓度低的皮肤表层转移，由此造成膏体内药物最大限度地渗透人体皮肤进入局部组织，且给药方便，药力药效持久。
本发明环孢素A微乳巴布膏眼贴中环孢素A的浓度为0.15％，相比0.5％环孢素滴眼液，其浓度更低，从理论上讲，安全性也相对优于环孢素滴眼液；再者，本身环孢素A微乳的纳米粒径大于4-5nm，可通过淋巴管吸收，而淋巴管回流速度仅为血液回流速度的1/200，故药物与淋巴细胞的接触时间更长，可达48小时之久。除此之外，环孢素A微乳巴布膏眼贴面积7×10cm，可有效覆盖眼眶周转淋巴引流区域，24小时的累计透皮浓度0.4881mg/ml,在巴布膏的促透皮作用下，其透皮性能高于单纯的环孢素A微乳，为后续研究环孢素A微乳巴布膏眼贴在治疗免疫性眼病的疗效观察中有重要价值。
通过对环孢素A微乳巴布膏单次给药和连续给药对豚鼠完整皮肤及破损皮肤的影响试验，结果表明本发明环孢素A微乳巴布膏对皮肤刺激性小、无毒性反应。对豚鼠皮肤过敏性试验中,未见豚鼠红斑、水肿等皮肤过敏反应。所以环孢素A微乳巴布膏具有临床应用价值和深入开发的可行性。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发 明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (7)

1.一种环孢素A微乳巴布膏眼贴，其特征在于：所述环孢素A微乳巴布膏眼贴包括环孢素A巴布剂胶体、无纺布以及流延聚丙烯膜，所述环孢素A巴布剂胶体涂布在无纺布上，并覆盖上流延聚丙烯膜；所述环孢素A巴布剂胶体中各原料组分如下：聚丙烯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、高岭土、钛白粉、氢氧化铝、酒石酸、EDTA-2Na、尼泊金甲酯、尼泊金丙脂、吐温-80、甘油、纯化水以及环孢素A微乳。
2.根据权利要求1所述的一种环孢素A微乳巴布膏眼贴，其特征在于：所述环孢素A巴布剂胶体中各原料组分的含量如下：聚丙烯酸钠：聚乙烯吡咯烷酮：明胶：高岭土：钛白粉：氢氧化铝：酒石酸：EDTA-2Na：尼泊金甲酯：尼泊金丙脂：吐温-80：甘油：纯化水：环孢素A微乳为30：10：7.5：10：2.5：0.75：1.0：0.25：0.125：0.125：1.5：75：500：0.1-1.0。
3.根据权利要求2所述的一种环孢素A微乳巴布膏眼贴，其特征在于：所述环孢素A微乳巴布膏眼贴中环孢素A含量为10mg/片，浓度为0.2-2mg/ml，其规格为7*10cm，重量8g/片。
4.一种环孢素A微乳巴布膏眼贴的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤如下：
步骤10、称取甘油，加入环孢素A微乳、尼泊金甲酯、尼泊金丙脂、氢氧化铝、钛白粉、高岭土，搅拌至初步混合；
步骤20、采用均质机搅拌，得到细腻白色的混合液；
步骤30、往上述白色混合液中加入聚丙烯酸钠，分散机上分散搅拌，得到环孢素A微乳甘油相，备用；
步骤40、用纯化水分别溶解EDTA-2Na、酒石酸、明胶、吐温-80，备用；
步骤50、纯化水加热至90℃保温，然后加入聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮进行搅拌溶解至透明，冷却至室温备用；
步骤60、行星混合机当中加入上述聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮混合溶液、EDTA-2Na溶液进行搅拌；
步骤70、把环孢素A微乳甘油相加入到其中，真空条件下搅拌；然后加入酒石酸、明胶、吐温-80溶液，继续真空搅拌，得到环孢素A巴布剂胶体；
步骤80、将环孢素A巴布剂胶体涂布在无纺布上，再覆盖上流延聚丙烯膜，经冲切机切割后，既得环孢素A微乳巴布膏眼贴。
5.根据权利要求4所述的一种环孢素A微乳巴布膏眼贴的制备方法，其特征在于：所述环孢素A微乳巴布膏眼贴中各原料组分的含量如下：所述聚丙烯酸钠：聚乙烯吡咯烷酮：明胶：高岭土：钛白粉：氢氧化铝：酒石酸：EDTA-2Na：尼泊金甲酯：尼泊金丙脂：吐温-80：甘油：纯化水：环孢素A微乳为30：10：7.5：10：2.5：0.75：1.0：0.25：0.125：0.125：1.5：75：500：0.1-1.0。
6.根据权利要求5所述的一种环孢素A微乳巴布膏眼贴的制备方法，其特征在于：所述环孢素A微乳巴布膏眼贴中环孢素A含量为10mg/片，浓度为0.2-2mg/ml。
7.根据权利要求5所述的一种环孢素A微乳巴布膏眼贴的制备方法，其特征在于：所述制备方法步骤具体如下：
步骤10、称取甘油75g，加入环孢素A微乳500mg、尼泊金甲酯0.125g、尼泊金丙脂0.125g、氢氧化铝0.75g、钛白粉2.5g、高岭土10g，手工搅拌至初步混合；
步骤20、采用均质机3000转/分搅拌5min，得到细腻白色的混合液；
步骤30、上述白色混合液中加入聚丙烯酸钠30g，分散机上1000转/分，分散搅拌10min，得到环孢素A微乳甘油相，备用；
步骤40、纯化水25mg用于溶解EDTA-2Na 0.25g，备用；纯化水25mg进行溶解酒石酸1.0g，备用；纯化水25mg用于溶解明胶7.5g，备用；纯化水25mg用于溶解吐温-80 1.5g，备用；
步骤50、纯化水400mg加热至90℃保温，一次性加入聚乙烯醇10g和聚乙烯吡咯烷酮10g进行搅拌溶解至透明，冷却至室温备用；
步骤60、行星混合机当中加入聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮混合溶液、EDTA-2Na溶液进行10转/分2min搅拌；
步骤70、把环孢素A微乳甘油相加入到其中，真空条件下30转/分，搅拌5min；加入酒石酸、明胶、吐温-80溶液，继续真空搅拌30转/分，搅拌10min，得到环孢素巴布剂胶体；
步骤80、将环孢素A巴布剂胶体涂布在EW9100无纺布，覆盖CPP膜，冲切机切成7*10cm规格，重量8g/片，既得环孢素A微乳巴布膏眼贴。
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