CN105820233A - 一种胰岛素衍生物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明针对现有胰岛素衍生物制备过程中使用等电沉淀法所存在的产率不高的问题，提供了一种胰岛素衍生物的制备方法，该方法在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应完成后，在反应液中加入二价或三价金属离子，从而能将胰岛素衍生物或胰岛素衍生物前体的粗产物从反应液中彻底沉淀出来，残留在上清液中的产物损失量可以降低至对照例（未加金属离子）的7%以下，有些甚至可以降至1%以下或者检测不到，大幅度提高产品收率。

Description

一种胰岛素衍生物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种胰岛素衍生物的制备方法。

背景技术

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来全世界糖尿病的患病率都在增长，在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病的患病率更有迅猛增长的趋势，目前中国糖尿病人数患者已超过1.14亿，给个人、家庭和社会都带来沉重的负担。

糖尿病患者一般都存在相对或绝对的胰岛素分泌不足，故胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世纪70年代，人们通过基因工程技术开发出了重组人胰岛素。后来，为了获得速效或长效等不同作用时间曲线的药物，人们又相继开发出了一系列的胰岛素类似物和衍生物。其中胰岛素类似物是指增加、删除或改变胰岛素序列中的一个或多个氨基酸后所得到的胰岛素类产品，胰岛素衍生物是指在胰岛素或胰岛素类似物的一个或多个位置上引入例如长链脂肪酸、聚乙二醇、烷基链等修饰基团后所得到的胰岛素类产品。胰岛素衍生物相较于普通人胰岛素具有更长的作用时间，药动学曲线也更为平稳，更接近生理条件下基础胰岛素的分泌模式。目前已知的胰岛素衍生物有例如诺和诺德公司开发的地特胰岛素、德谷胰岛素，礼来公司开发的酰化胰岛素、聚乙二醇化胰岛素等。

在制备方法上，胰岛素类似物由于只涉及胰岛素氨基酸序列上的变化，一般通过设计核酸序列就可直接通过基因工程获得。但是，胰岛素衍生物需要在胰岛素序列外连接其他修饰基团，而这部分修饰基团如果不是蛋白质或多肽，通常不能与胰岛素部分一起通过基因工程获得。因此，现有的胰岛素衍生物的制备方法通常是通过以下步骤来实现：先分别获得胰岛素部分和修饰基团部分，然后将修饰基团部分与胰岛素部分通过相应的化学反应进行偶联，得到胰岛素衍生物粗品或胰岛素衍生物前体的粗品。由于该偶联反应的溶液体积一般较大，反应产物浓度相对较低，因此在偶联反应结束后，通常需要先将反应产物从反应溶液中沉淀分离出来，甚至干燥后，才能再进行后续的制备步骤，例如进行进一步的纯化，或是先脱除掉胰岛素和/或修饰基团上的保护基团，再进行纯化等等。

上述制备方法中所述的沉淀分离步骤，在现有技术中通常是利用胰岛素等电沉淀的原理进行，即，将溶液的pH值调节到胰岛素衍生物的等电点附近，使其沉淀，然后离心收集沉淀。但是，这种等电沉淀的方法并不能使反应产物沉淀完全，仍会有相当多的胰岛素衍生物或胰岛素衍生物前体没有沉淀下来而留在上清液中，致使在该步骤中损失很多反应产物，直接影响最终的产品收率。例如，在专利200480021733.8的实施例4中，其胰岛素衍生物的终产率只有12%。

发明内容

针对现有技术在制备胰岛素衍生物方法中存在的问题，本发明提供了一种胰岛素衍生物的制备方法，该方法在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应（以下简称“偶联反应”）完成后，能够将胰岛素衍生物或胰岛素衍生物前体的粗品从反应液中彻底沉淀出来，大幅度提高产品收率。

具体的说，本发明提供一种胰岛素衍生物的制备方法，该制备方法包括在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应完成后，在反应液中加入二价或三价金属离子的步骤。

进一步的，本发明提供一种胰岛素衍生物的制备方法，包括：

1.分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分；

2.将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应；

3.在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近；

4.在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子；

5.收集步骤4获得的沉淀。

不同的胰岛素衍生物由于其胰岛素氨基酸序列的不同或是修饰基团种类的不同，其合成策略也会有所差别。有些胰岛素衍生物，在偶联反应完成后即可得到胰岛素衍生物的粗品；而有些胰岛素衍生物，需要在偶联反应之前将胰岛素部分和/或修饰基团部分中干扰偶联反应的一些基团保护起来，在偶联反应后先得到胰岛素衍生物前体的粗品，然后再将保护基团脱除掉，得到胰岛素衍生物的粗品。针对这两种不同的合成策略，本发明提供的胰岛素衍生物的制备方法如下（具体流程图参见图1）。

一方面，本发明提供一种胰岛素衍生物的制备方法，包括：

1.分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分；

2.将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应；

3.在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近；

4.在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子；

5.收集步骤4获得的沉淀，得到胰岛素衍生物粗品。

另一方面，本发明提供一种胰岛素衍生物的制备方法，包括：

1.分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分，其中所述胰岛素部分和/或修饰基团部分带有一个或多个保护基团；

2.将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应；

3.在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近；

4.在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子；

5.收集步骤4获得的沉淀；

6.对步骤5获得的沉淀进行脱保护反应，得到胰岛素衍生物粗品。

优选的，本发明的制备方法进一步包括在得到胰岛素衍生物粗品后，对胰岛素衍生物粗品进行后处理，得到胰岛素衍生物纯品的步骤。

本发明所述“胰岛素衍生物”，是指在胰岛素或胰岛素类似物主链的一个或多个位置上引入修饰基团所形成的胰岛素类产品。

本发明所述“胰岛素部分”，是指胰岛素衍生物结构中的胰岛素或胰岛素类似物部分，其序列可为全部或部分人胰岛素的序列，或是其中氨基酸有增加、删除或改变的全部或部分胰岛素类似物序列。本发明的胰岛素部分可以通过商购获得，也可以采用任何一种本领域公知的肽/蛋白质合成技术制备，例如固相合成法、基因工程法、DNA重组法等。

本发明所述“修饰基团部分”，是指胰岛素衍生物结构中通过化学键连接到胰岛素部分的基团，其实例包括但不限于脂肪酸链、聚乙二醇链、烷基链等，优选为脂肪酸链。本发明的修饰基团部分可以通过商购获得，也可以根据修饰基团部分的结构，采用任何一种本领域公知的技术制备。

本发明所述“偶联反应”，是指将胰岛素部分和修饰基团部分通过化学键连接起来的化学反应。根据胰岛素部分和修饰基团部分中进行化学键连接的反应基团不同，本发明所使用的偶联反应的实例包括但不限于酯化反应、酰化反应、烷基化反应、还原反应等，优选为酰化反应。

本发明所述“二价或三价金属离子”，是指任何具有水溶性的二价或三价金属离子，包括但不限于Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Sr²⁺、Sn²⁺、Fe³⁺、Al³⁺。优选为Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺。

在本发明中，二价或三价金属离子的加入量以胰岛素部分的使用量为基准。本发明中所述的二价或三价金属离子的加入量是指二价或三价金属离子与胰岛素部分的摩尔比，该数值可在0.1-10:1的范围内，优选0.8-8:1，更优选0.8:1、2:1、4:1、8:1。

本发明所述“脱保护反应”，是指将胰岛素衍生物前体上的保护基团脱除掉的反应。脱保护反应是多肽/蛋白质合成中的常规反应，本领域技术人员可根据本领域公知常识选择保护基团、脱保护试剂和反应条件。

本发明所述“后处理”，是指在获得胰岛素衍生物粗品后，通过一个或多个本领域常用的处理步骤，例如萃取、洗涤、干燥、纯化等以得到胰岛素衍生物纯品。

现有技术中的等电点沉淀法是本领域技术人员所公知的用于沉淀分离蛋白质的方法。其原理是：在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零(即正负电荷相等)，蛋白质分子在溶液中没有因相同电荷产生的相互排斥作用，分子间更容易相互碰撞而产生沉淀。因此蛋白质在等电点时溶解度最小，容易沉淀。

但是，等电点沉淀法只是消除了蛋白质分子间的电荷排斥作用，并没有实际给予蛋白质分子相互聚集的力量。因此，仅仅使用等电点沉淀法，并不能有效地把溶液中所有蛋白质分子都沉淀出来，其溶解度还是相对较高，在离心后，仍然会有一大部分蛋白质溶解在上清液中，这直接导致了终产品收率的低下。

令人惊奇地，在制备过程中加入二价或三价金属离子，能显著地降低胰岛素分子的溶解度，使胰岛素分子从溶液中沉淀出来。在本发明中，在偶联反应结束后加入二价或三价金属离子，然后离心收集沉淀，残留在上清液中的产物损失量可以降低至对照例（未加金属离子）的7%以下，有些甚至可以降低至对照例的1%以下，或者根本检测不到上清液中有产物残留，这使得胰岛素衍生物的产品收率大大提高。在其他条件相同的情况下，产品收率可提高5倍左右。而且，在对胰岛素衍生物粗品进行纯化后可将金属离子去除，得到的胰岛素衍生物纯品中并不含有金属离子，不影响后续产品的使用，例如配制制剂等。

在目前的胰岛素制剂中，也存在一些制剂配方中含有二价锌离子的情况。制剂中含有二价锌离子可以使胰岛素分子形成六聚体复合物，但是这种六聚体复合物并不会从溶液中沉淀出来，制剂溶液仍然是澄清状态。由于胰岛素分子只有在单体或二聚体的形式下才能发挥降血糖作用，所以胰岛素制剂中含有二价锌离子的目的是为了延缓胰岛素的释放速度，延长作用时间，并不会降低胰岛素分子的溶解度，更不涉及胰岛素分子的制备。

附图说明

图1为本发明胰岛素衍生物制备方法的流程示意图。

具体实施方式

实施例1不加金属离子制备德谷胰岛素（对照例）。

原料Des(B30)-人胰岛素根据中国专利94193852.2实施例11中所述方法制备。

原料叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu根据中国专利200480021733.8实施例4中所述方法制备。

在10-15℃下将des(B30)人胰岛素(500mg，0.088mmol)加入至137.5ml的50mM/LNaHCO₃的乙腈/水混合溶液中(乙腈:水=1:1)，再加入3.0ml5%Na₂CO₃（W/V）水溶液调节溶液至澄清（pH=10-11）。另将叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu(111mg，0.176mmol)溶于5ml乙腈中，随后在10-15℃加入到上述des(B30)人胰岛素溶液中进行偶联反应。反应1小时。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品117.5mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体170.7mg。

将上述冻干产物在10-15℃溶于95%（V/V）三氟乙酸（15ml）中搅拌进行脱保护反应，反应1小时后，将反应液倒入至150ml甲基叔丁基醚中，通过离心收集沉淀，晾干，得德谷胰岛素粗产物122mg。

通过质谱测得分子量为6104.3，计算值为6103.97。

实施例2加入Zn²⁺离子制备德谷胰岛素（Zn²⁺与胰岛素摩尔比为0.8:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2mlZnCl₂水溶液（ZnCl₂浓度为4.8mg/mL，Zn²⁺与胰岛素摩尔比为0.8:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品566mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体12.0mg。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量为对照例的7%（12.0mg/170.7mg）。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物599mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出4.91倍（599mg/122mg）。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

实施例3加入Zn²⁺离子制备德谷胰岛素（Zn²⁺与胰岛素摩尔比为2:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2mlZnCl₂水溶液（ZnCl₂浓度为12mg/mL，Zn²⁺与胰岛素摩尔比为2:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品569mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体6.0mg。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量为对照例的3.5%（6.0mg/170.7mg）。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物602mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出4.93倍。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

实施例4加入Zn²⁺离子制备德谷胰岛素（Zn²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2mlZnCl₂水溶液（ZnCl₂浓度为24mg/mL，Zn²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品573mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体0.07mg。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量为对照例的0.04%（0.07mg/170.7mg）。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物606mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出4.97倍。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

将上述德谷胰岛素粗产物通过用C8-柱进行RP-HPLC纯化，冻干，得到德谷胰岛素纯品267mg，纯品收率为50%。通过HPLC评估的纯度为99.8%。锌在反应完成后通过层析纯化除去。按照此方法制备的德谷胰岛素纯品产率，比专利200480021733.8的实施例4（64mg，收率为12%）中的产率高出4.17倍（267mg/64mg=4.17）。

实施例5加入Zn²⁺离子制备德谷胰岛素（Zn²⁺与胰岛素摩尔比为8:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2mlZnCl₂水溶液（ZnCl₂浓度为48mg/mL，Zn²⁺与胰岛素摩尔比为8:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品608mg。将离心后的上清液进行色谱分析，检测不到上清液中有德谷胰岛素前体残留。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量降为基本为0。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物607mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出4.98倍。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

实施例6加入Co²⁺离子制备德谷胰岛素（Co²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2ml柠檬酸钴水溶液（二水柠檬酸钴的浓度为104.1mg/mL，Co²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品571mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体6.53mg。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量为对照例的3.8%（6.53mg/170.7mg）。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物604mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出4.95倍。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

实施例7加入Cu²⁺离子制备德谷胰岛素（Cu²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2mlCuCl₂水溶液（CuCl₂的浓度为23.7mg/mL，Cu²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品582mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体2.05mg。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量为对照例的1.2%（2.05mg/170.7mg）。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物611mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出5.01倍。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

实施例8加入Ni²⁺离子制备德谷胰岛素（Ni²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2mlNiCl₂水溶液（NiCl₂·6H₂O的浓度为41.8mg/mL，Ni²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品572mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体0.23mg。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量为对照例的0.13%（0.23mg/170.7mg）。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物605mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出4.96倍。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

实施例9加入Fe³⁺离子制备德谷胰岛素（Fe³⁺与胰岛素摩尔比为4:1）。

按照实施例1的方法将des(B30)人胰岛素和叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu进行偶联反应。

偶联反应结束后，将反应液用HCl将pH调节至6-7，再加入2mlFeCl₃水溶液（FeCl₃的浓度为28.6mg/mL，Fe³⁺与胰岛素摩尔比为4:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得德谷胰岛素前体粗品574mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留德谷胰岛素前体4.64mg。与对照例实施例1相比，残留在上清液中的德谷胰岛素前体的损失量为对照例的2.7%（4.64mg/170.7mg）。

将上述德谷胰岛素前体按照实施例1的方法进行脱保护反应，得德谷胰岛素粗产物606mg。与对照例实施例1相比，粗产物产量高出4.97倍。

根据实施例1的质谱方法确认产物为德谷胰岛素。

实施例10加入Zn²⁺离子制备地特胰岛素（Zn²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）。

原料Des(B30)-人胰岛素根据中国专利94193852.2实施例11中所述方法制备。

原料肉豆蔻酸N-羟基琥珀酰亚胺酯可以商购，也可以根据本领域技术人员所公知的方法，以肉豆蔻酸和N-羟基琥珀酰亚胺为原料制备获得。

在10-15℃下将des(B30)人胰岛素(500mg，0.088mmol)加入至137.5ml的50mM/LNaHCO₃的乙腈/水混合溶液中(乙腈:水=1:1)，再加入3.0mL5%Na₂CO₃（W/V）水溶液调节溶液至澄清（pH=10-11）。另将肉豆蔻酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(57mg，0.176mmol)溶于5ml乙腈中，随后在10-15℃加入到上述des(B30)人胰岛素溶液中进行偶联反应，反应1小时。

偶联反应结束后，将反应液等体积均分为两份。

其中一份用HCl将pH调节至6-7，离心收集沉淀，冻干，得地特胰岛素粗品66mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留地特胰岛素135.1mg。

另一份用HCl将pH调节至6-7，再加入1mlZnCl₂水溶液（ZnCl₂浓度为24mg/mL，Zn²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得地特胰岛素粗品263mg。将离心后的上清液进行色谱分析，检测不到上清液中有地特胰岛素残留。

与未加金属离子的方法相比，残留在上清液中的地特胰岛素的损失量降为基本为0，地特胰岛素粗产物产量高出3.98倍（263mg/66mg）。

通过质谱测得分子量为5915.6，计算值为5916.9。

将上述第二份地特胰岛素粗产物用C8-柱进行RP-HPLC纯化，冻干，得地特胰岛素纯品155mg，纯品收率为60%。通过HPLC评估的纯度为99.8%。锌在反应完成后通过层析纯化除去。

实施例11加入Zn²⁺离子制备A1位连接修饰基团的胰岛素衍生物（A1修饰胰岛素）。

Des(B30)-人胰岛素根据中国专利94193852.2实施例11中所述方法制备，然后根据本领域技术人员所公知的方法，对Des(B30)-人胰岛素的B29位氨基酸进行Boc保护。

原料肉豆蔻酸N-羟基琥珀酰亚胺酯可以商购，也可以根据本领域技术人员所公知的方法，以肉豆蔻酸和N-羟基琥珀酰亚胺为原料制备获得。

在10-15℃下将B29位被Boc保护的des(B30)人胰岛素(500mg，0.086mmol)加入至137.5ml的50mM/LNaHCO₃的乙腈/水混合溶液中(乙腈:水=1:1)，再加入3.0ml5%Na₂CO₃（W/V）水溶液调节溶液至澄清（pH=10-11）。另将肉豆蔻酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(56mg，0.172mmol)溶于5ml乙腈中，随后在10-15℃加入到上述胰岛素溶液中进行偶联反应，反应1小时。

偶联反应结束后，将反应液等体积均分为两份。

其中一份用HCl将pH调节至6-7，离心收集沉淀，冻干，得A1修饰胰岛素前体粗品71mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留A1修饰胰岛素前体119mg。

另一份用HCl将pH调节至6-7，再加入1mlZnCl₂水溶液（ZnCl₂浓度为24mg/mL，Zn²⁺与胰岛素摩尔比为4:1）沉淀，通过离心收集沉淀，冻干，得A1修饰胰岛素前体粗品262mg。将离心后的上清液进行色谱分析，通过外标法测得上清液中残留A1修饰胰岛素前体3.4mg。

与未加金属离子的方法相比，残留在上清液中的A1修饰胰岛素前体的损失量降为对照例的2.8%（3.4mg/119mg），A1修饰胰岛素前体粗产物的产量高出3.69倍（262mg/71mg）。

通过质谱测得分子量为6015.8，计算值为6016.9。

本实施例省略脱保护反应步骤，直接对A1修饰胰岛素前体进行后处理，得到A1修饰胰岛素前体的纯品：将上述第二份A1修饰胰岛素前体的粗产物用C8-柱进行RP-HPLC纯化，冻干，得A1修饰胰岛素前体纯品115mg，纯品收率为44.4%。通过HPLC评估的纯度为99.8%。锌在反应完成后通过层析纯化除去。

实施例1-11的制备方法所得产品的数据对比统计见下表1。

表1实施例1-11的产品数据对比统计：

Claims (10)

1.一种胰岛素衍生物的制备方法，所述方法包括在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应完成后，在反应液中加入二价或三价金属离子的步骤。

2.根据权利要求1所述的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分；

(2)将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应；

(3)在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近；

(4)在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子；

(5)收集步骤4获得的沉淀。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述步骤4获得的沉淀为胰岛素衍生物粗品。

4.根据权利要求2所述的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分，其中所述胰岛素部分和/或修饰基团部分带有一个或多个保护基团；

(2)将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应；

(3)在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近；

(4)在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子；

(5)收集步骤4获得的沉淀；

(6)对步骤5获得的沉淀进行脱保护反应，得到胰岛素衍生物粗品。

5.根据权利要求1-4中任一所述的制备方法，还进一步包括在得到胰岛素衍生物粗品后，对胰岛素衍生物粗品进行后处理，得到胰岛素衍生物纯品的步骤。

6.根据权利要求1-4中任一所述的制备方法，其中所述二价或三价金属离子选自Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Sr²⁺、Sn²⁺、Fe³⁺或Al³⁺。

7.根据权利要求1-4中任一所述的制备方法，其中所述二价或三价金属离子与胰岛素部分的摩尔比为0.1-10:1。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述二价或三价金属离子与胰岛素部分的摩尔比为0.8:1、2:1、4:1或8:1。

9.根据权利要求1-8中任一所述的制备方法，其中所述胰岛素衍生物选自B29酰化胰岛素及其类似物，或A1酰化胰岛素及其类似物。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中所述胰岛素衍生物选自德谷胰岛素或地特胰岛素。