CN105779574B - 抗稻瘟病基因Pi2的HRM检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗稻瘟病基因Pi2的HRM检测方法和应用，属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的基因特异性分子标记的开发和应用。本发明所提供结合HRM用于检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记引物，以及利用所述引物检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记方法在生产实践中中具有广阔的应用前景，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

Description

抗稻瘟病基因Pi2的HRM检测方法及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种结合高分辨率熔解曲线分析(High-Resolution Melting Curve Analysis,HRM)用于检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记引物，以及利用所述引物检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记方法。

背景技术

稻瘟病是由子囊菌(Magnapothe oryzae)引起的广发发生在世界各稻区的重要病害之一，目前主要通过选育抗病品种来预防病害。近年来，水稻抗稻瘟病基因的克隆取得了重要进展，稻瘟病抗性基因的分子标记的开发对于培育抗稻瘟病水稻品种具有重要意义。

到目前为止，至少有9个稻瘟病抗性基因(Pi2，Piz，Piz-t，Pi40，Pigm,Pi9,Pi26,Pi50，Pi2-2)己经被定位在水稻第6染色体短臂端的Pi2/9基因簇内，这些基因都被认为是稻瘟病广谱抗性基因，在稻瘟病抗性育种方面具有重要的应用价值(Jiang et al.2012),其中Pi9、Pi2以及Piz-t己经被成功克隆(Qu et al.2006,Zhou et al.2006)。Pi2基因源自哥伦比亚籼稻品种5173，目前己经被成功克隆(Zhou et al.2007；Zhou et al.2006)。Pi2抗谱也相当广，对从中国收集的792个稻瘟小种中的绝大部分表现抗性，只有7.55％的小种能侵染携带Pi2的亲本C101A51(Chen et al,2001)，此外，C101A51对来自13个国家的43个稻瘟病菌株中的36个表现抗性(Liu et al,2002)。Pi2属于NBS-LRR类基因，含有2个内含子，长度分别是3839bp和116bp，Pi2cDNA全长3332bp，包含117-bp 5'UTR和116-bp 3'UTR。Pi2编码产物包含1032个氨基酸，含有1个核苷酸结合位点(NBS)和3个富亮氨酸重复区(LRR)。；Pi2与Pi-zt的编码产物仅在3个LRRs区域有8个氨基酸的差异；而在这8突变氨基酸中，仅有1个位于xxLxLxx基序中(Zhou et al.,2006)。

高分辨率熔解曲线分析(High-Resolution Melting Curve Analysis,HRM)是由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一种单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism,SNP)以及突变研究的工具，这种检测方法因其操作简单快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。在植物育种上，HRM可用于突变扫描、基因分型、基于特定基因的种质资源鉴定以及功能标记开发等方面，对于SNP、InDel等多种标记的开发和利用具有重要的价值。

根据抗稻瘟病基因Pi2的序列，结合HRM开发与Pi2完全共分离的分子标记，并建立中高通量辅助选择体系，能够大大提高抗病育种选育的效率。

发明内容

Pi2、Pi9、Piz-t同为Piz位点上的复等位基因，已被成功克隆(国家水稻数据中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm,2012-6-20)，其编码区序列可从NCBI的DNA序列数据库Genbank中下载得到，收录号分别为DQ352453、DQ285630、DQ352040。此外，可从DNA序列数据库Genbank中查找获得测序品种日本晴(Nipponbare)和93-11与Pi2基因编码区相对应区域的基因组序列。

利用多序列比对软件工具DNAMAN，通过对这些序列比对分析，筛选到6个抗稻瘟病Pi2基因基因特异性单核苷酸多态性(SNP)位点(如图3)。这些特异性SNP位点分别位于Pi2的第787位、第788位、第789位和第792位密码子(GC

A

TC TCA GAT

T，加粗表示Pi2基因基因特异性SNP)。

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用分子标记快速、准确检测抗稻瘟病基因Pi2的方法，本发明提供一种结合高分辨率熔解曲线分析(High-Resolution MeltingCurve Analysis,HRM)用于检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记引物，所述引物根据Pi2基因序列的基因特异性单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)设计，可以结合HRM用于Pi2基因的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及抗病品种选育的效率。

本发明提供如下解决方案：

一种结合HRM用于检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记引物，其上、下游序列分为：

Pi2-HRMF：5'-TAGGTGTGACAACAAACGGGTC-3'(SEQ ID NO:1)；

Pi2-HRMR：5'-AATCCCAGATTCCAACCTGCAC-3'(SEQ ID NO:2)；

上述引物根据Pi2基因序列的基因特异性SNP设计，其基因特异性SNP分别位于Pi2的第787位、第788位、第789位和第792位密码子(GC

A

TC TCA GAT

T，加粗表示Pi2基因基因特异性SNP)。

一种结合HRM检测水稻抗稻瘟病Pi2的方法：利用上述引物扩增待测水稻抗稻瘟病材料的基因组DNA，取扩增产物用HRM仪器LightScanner96进行高分辨率熔解曲线采集分析，若上述待测材料的高分辨率熔解曲线与阳性对照——水稻抗稻瘟病品种“华占”的溶解曲线一致(如图1)，则待测水稻抗稻瘟病材料含有抗稻瘟病基因Pi2；

上述扩增产物的核苷酸序列如下(抗稻瘟病基因Pi2基因特异性SNP突出显示)：

5’taggtgtgacaacaaacgggtcgacaaaggaaaaatgtaagatactttatgcagccattgagaagctctcttccctccaatctctccatgtggatgctgc

a

tctcagat

tggaacacttgagtgcctagattctatttcatctcctcctcccctactgaggacactcgtgttggatggaattcttgaggagatgcctaactggattgagcagctcactcacctgaagaagatctacttattgaggagcaaactaaaggaaggtaaaaccatgctgatacttggggcactgcccaacctcatggtccttcatctttatcggaatgcttaccttggggagaagctagtattcaaaacaggagcattcccaaatcttagaacactttggatttatgaattggatcagctaagagagatcagatttgaggacggcagctcacccctgttggaaaagatagaaataggcgagtgcaggttggaatctgggatt-3’(SEQ ID NO:3)；

上述的水稻抗稻瘟病品种“华占”(已公开，申请公告号：CNA004577E)，是以引自马来西亚的SCO2-S6为基础材料，经过反复测交与系统选育而成的恢复系；经广东省农业科学院朱小源研究员鉴定，“华占”含有抗稻瘟病基因Pi2。本发明的阳性对照材料“华占”为朱小源研究员馈赠。

一种抗稻瘟病水稻材料分子标记辅助选择方法：以含有抗稻瘟病基因Pi2的水稻材料为亲本，与其他水稻品种杂交，提取杂交后代个体基因组DNA，以引物对Pi2-HRMF和Pi2-HRMR进行PCR扩增，其扩增产物的高分辨率溶解曲线与阳性对照“华占”的溶解曲线不一致，其熔解峰峰型却为“双驼峰”(如图2)的对应杂交后代个体即含有杂合型的水稻抗稻瘟病基因Pi2。含有杂合型Pi2水稻材料的不同个体，其高分辨率熔解曲线相一致。

上述引物对Pi2-HRMF和Pi2-HRMR优选对水稻苗期所提取的DNA进行分子标记鉴定，检测是否携带“纯合型/杂合型”抗稻瘟病基因Pi2。鉴于HRM检测对PCR要求较低，可通过简单破碎“一管法”快速制备PCR模板，提高分子标记的检测效率。简单破碎“一管法”抽提水稻材料的总DNA优选过程如下：取2-4cm叶片，直接加提取液(10mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、0.15M KCl)研磨，沸水浴10min后，静置分层取上清(1μL)即可做PCR扩增的DNA模板。

本发明还提供了一种基于HRM技术的水稻Pi2基因检测的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含引物对：正向引物：TAGGTGTGACAACAAACGGGTC(SEQ ID NO:1)；和反向引物：AATCCCAGATTCCAACCTGCAC(SEQ ID NO:2)，用于检测水稻材料中是否含有Pi2基因。

更具体的，本发明所提供的试剂盒进一步包含PCR试剂和荧光染料。

本发明还提供了一种试剂盒的使用方法，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：提取待测样本DNA；配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂盒和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；和对PCR产物进行HRM分析扫描。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的分子标记几乎不出现假阳性：传统的PCR扩增结合限制性内切酶的检测方法以电泳条带的“有无”来判读，往往假阳性较高。因为在酶切之前，如果PCR产物不进行纯化则容易导致限制性内切酶活性降低，导致无法切开而造成假阳性；如果PCR产物进行纯化则容易导致回收扩增片段的量极低甚至无，影响酶切后电泳结果的判读而造成假阳性。本发明提供的分子标记在检测上极具简便性和灵敏性，添加有饱和荧光染料的PCR产物直接进行高分辨率熔解曲线采集，达到“零损失”，并且PCR体系成分的存在不影响荧光信号采集，因此高分辨率熔解曲线检测结果几乎不出现假阳性。

(2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量：目前，高分辨率熔解曲线分析方法是仅次于DNA芯片的中高通量SNP检测方法，10min内即可一次性采集96个PCR产物样品的高分辨率熔解，明显比传统的酶切电泳检测方法要简便快捷；并且该分子标记的PCR体系仅需10μl，是普通PCR体系的一半，因此即使需要0.04元/体系的饱和荧光染料，其成本也并不高于普通PCR，特别适用于大规模分子辅助选择育种的生产实践中。

(3)本发明提供的分子标记能够显著地减少PCR模板制备的人力成本和时间成本：在实际应用中，传统的普通PCR结合限制性内切酶的SNP检测方法对PCR模板纯度的要求很高，往往需要使用CTAB等费时费力的提取方法，以避免蛋白质、RNA等杂质残留。本发明的分子标记对PCR模板要求不高，通过简单破碎“一管法”得到的提取液即可作为PCR模板，大大提高了分子检测的简便性。

因此，本发明所提供结合HRM用于检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记引物，以及利用所述引物检测抗稻瘟病基因Pi2的分子标记方法在生产实践中中具有广阔的应用前景，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

附图说明

图1.水稻抗稻瘟病品种“华占”的高分辨率熔解曲线及熔解峰。

图2.抗稻瘟病基因Pi2两种基因型的高分辨率熔解曲线及熔解峰(灰色曲线代表“华占”含有的纯合型Pi2基因高分辨率熔解曲线及熔解峰，红色曲线代表“华占”杂交后代个体含有的杂合型Pi2基因高分辨率熔解曲线及熔解峰)。

图3.Pi2等位基因编码区序列的比对(示Pi2基因特异性SNP)。

图4.Pi2特异性分子标记引物扩增产物测序分析结果(A.以“华占”为模板的扩增产物测序分析结果，含有纯合型的Pi2基因特异性SNP；B.以日本晴为模板的扩增产物测序分析结果，无Pi2基因特异性SNP；C.以“华占”杂交后代材料为模板的扩增产物测序分析结果，含有杂合型Pi2基因特异性SNP)。

图5.Pi2特异性分子标记引物扩增产物的HRM检测结果(蓝色曲线与橙色曲线分别代表“华占”及其杂交后代材料扩增产物的特征性高分辨率熔解曲线及溶解峰，与图2相一致；灰色曲线代表日本晴扩增产物的高分辨率熔解曲线及熔解峰，其扩增产物片段局部GC含量较低而导致熔解温度Tm值低于“华占”扩增产物，故高分辨率熔解曲线及熔解峰表现为水平左移而有所区别)。

图6.Pi2基因及其等位基因扩增产物的高分辨率熔解曲线多态性(蓝色曲线和淡蓝色曲线分别表示“华占”及其杂交后代材料呈特征性的高分辨率熔解曲线及熔解峰，作为抗稻瘟病Pi2基因存在的阳性对照；其余颜色曲线则表示41份普通水稻材料扩增产物的分辨率熔解曲线及熔解峰，不同水稻材料间丰富的SNP造成了高分辨率熔解曲线的多态性)。

具体实施方式

下面结合实施列及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。例如，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd edition)》(Sambrook，J.，Russell,David W.，2001，Cold Spring Harbor)，《Plant Propagation byTissue Culture》(Edwin F.George,Michael A.Hall,Geert-Jan De Klerk,2008,Springer)。

实施例1：Pi2等位基因编码区序列的比对及特异性单碱基多态性(SNP)分析

Pi2、Pi9、Piz-t同为Piz位点上的复等位基因，已被成功克隆(国家水稻数据中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm,2012-6-20)，其编码区序列可从NCBI的DNA序列数据库Genbank中下载得到，收录号分别为DQ352453、DQ285630、DQ352040。此外，可从DNA序列数据库Genbank中查找获得测序品种日本晴(Nipponbare)和93-11与Pi2基因编码区相对应区域的基因组序列。

利用多序列比对软件工具DNAMAN，通过对这些序列比对分析，筛选到6个抗稻瘟病Pi2基因基因特异性单核苷酸多态性(SNP)位点(如图3)。这些特异性SNP位点分别位于Pi2的第787位、第788位、第789位和第792位密码子(GC

A

TC TCA GAT

T，加粗表示Pi2基因基因特异性SNP)。

实施例2：Pi2功能特异性分子标记引物设计与HRM检测

(1)引物设计

根据HRM引物设计原则，在Pi2特异性SNP的上游-100bp至-78bp处，及下游372bp至394bp处设计一对基因特异性分子标记引物，引物对碱基序列如下：

Pi2-HRMF：5'-TAGGTGTGACAACAAACGGGTC-3'(SEQ ID NO:1)；

Pi2-HRMR：5'-AATCCCAGATT CCAACCTGCAC-3'(SEQ ID NO:2)；

通过这上述引物对含有纯合型Pi2基因的水稻恢复系“华占”、含有杂合型Pi2基因的“华占”杂交后代材料(广东农业科学院朱小源研究员馈赠)以及测序品种日本晴(Nipponbare)的DNA模板进行PCR扩增，然后对扩增产物进行测序(华大科技)。

PCR扩增反应体系如下：

10×PCR Buffer(Mg2+plus):2μL

dNTPs(2.5mM each):0.4μL

Pi2-HRMF(10μM)：0.4μL

Pi2-HRMR(10μM)：0.4μL

TakaRa TaqTM(5U/μL):0.1μL

DNA模板(20-50ng/μL)：1μL

ddH2O:补足至20μL。

PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃2分钟。

测序分析结果(如图4)验证：分子标记引物对Pi2-HRMF和Pi2-HRMR特异性高，并且现有水稻材料DNA序列的Pi2基因特异性SNP与实施例1的分析结果相吻合。因此，水稻恢复系“华占”可作为纯合型抗稻瘟病Pi2基因的供体品种，而“华占”杂交后代材料可作为杂合型抗稻瘟病Pi2基因的阳性对照材料。

(2)HRM检测

通过Pi2功能特异性分子标记引物对Pi2-HRMF和Pi2-HRMR对“华占”、日本晴和“华占”杂交后代材料进行HRM检测的方法优选为：利用分子标记引物对Pi2-HRMF和Pi2-HRMR对“华占”、日本晴和“华占”杂交后代材料的DNA模板进行PCR扩增，扩增产物通过HRM仪器LightScanner96采集高分辨率熔解曲线(如图5)，比较验证，分别得到与纯合型/杂合型抗稻瘟病Pi2基因呈特征性峰型的高分辨率熔解曲线(图1、图2、图5)。

PCR扩增反应体系如下：

10×PCR Buffer(Mg2+plus):1μL

dNTPs(2.5mM each):0.1μL

Pi2-HRMF(10μM)：0.1μL

Pi2-HRMR(10μM)：0.1μL

20×EvaGreen：0.1μL

TakaRa TaqTM(5U/μL):0.1μL

DNA模板(2-3ng/μL)：1μL

ddH2O:补足至10μL。

为了防止体系蒸发，在PCR扩增前需滴加15μL-20μL矿物油覆盖。

PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃10秒，40个循环；72℃2分钟；95℃1分钟；12℃1分钟后转移至4℃冰箱保存。

PCR结束后，产物全部转移至白底黑框的96孔PCR板。为了方便后续校正96孔板的孔间温度差异，每个孔加入1μL温度内参(Internal Temperature Controls)并补加15μL-20μL矿物油覆盖后，即可进行高分辨率熔解曲线采集及分析。

所述的温度内参碱基序列如下：

InTemF：5＇-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3＇(SEQID NO:4)；

InTemR：5＇-AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCACGAT-3＇(SEQID NO:5)；

上述互补的寡聚核苷酸InTemF和InTemR合成后，1OD的量用800μLddH2O溶解，然后反应体系如下：

饱和NaCl：1μL

InTemF：1μL

InTemR：1μL

ddH2O:补足至10μL。

在95℃条件下变性3分钟后，自然冷却至室温复性，即可作为温度内参。

实施例3：供体材料中抗病基因与普通材料中等位基因间的多态性分析

以稻瘟病基因Pi2供体材料“华占”及其杂交后代材料和41份普通水稻材料的基因组DNA为模板，依据实施例2“HRM检测”方法，比较验证分子标记引物对Pi2-HRMF和Pi2-HRMR扩增产物的高分辨率熔解曲线及熔解峰(如图6)，分析表明“华占”及其杂交后代材料其扩增产物的呈特征性高分辨率熔解曲线及熔解峰区别于41份普通水稻材料。可见，试验结果与设计分析相吻合，说明这对结合HRM用于检测抗稻瘟病Pi2基因的分子标记引物可以可靠地检测抗稻瘟病基因Pi2的存在，以及存在Pi2的基因型。

所述的41份普通水稻材料的具体编号及名称为：1.丝苗B、2.II-32B、3.T98B、4.美香占、5.黄华占、6.广占63S、7.9311、8.明恢63、9.宜恢65、10.湛恢15、11.桂99、12.R9918、13.R5814、14.R1128、15.湘丰10B、16.荣丰B、17.丰源B、18.天丰B、19.粤丰B、20.安丰B、21.IR麻壳B、22.协青早B、23.回珍B、24.泰丰B、25.金23B、26.粳稻B、27.粳保2、28.Rosement、29.金稻312R、30.地谷B、31.炳1B、32.全丰B、33.广抗13B、34.岳4B、35.武运粳、36.Y58S、37.杨明B、38.矮B、39.唐引B、40.R998、41、五丰B。以上材料，其中稻瘟病基因Pi2供体材料“华占”及其杂交后代材料由广东农业科学院朱小源研究院馈赠，其余水稻材料均由深圳市作物分子设计育种研究院提供。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市作物分子设计育种研究院

深圳兴旺生物种业有限公司

湖南旺华生物农业科技有限公司

兴旺投资有限公司

<120> 抗稻瘟病基因Pi2的HRM检测方法及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

taggtgtgac aacaaacggg tc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aatcccagat tccaacctgc ac 22

<210> 3

<211> 494

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

taggtgtgac aacaaacggg tcgacaaagg aaaaatgtaa gatactttat gcagccattg 60

agaagctctc ttccctccaa tctctccatg tggatgctgc aggaatctca gatggtggaa 120

cacttgagtg cctagattct atttcatctc ctcctcccct actgaggaca ctcgtgttgg 180

atggaattct tgaggagatg cctaactgga ttgagcagct cactcacctg aagaagatct 240

acttattgag gagcaaacta aaggaaggta aaaccatgct gatacttggg gcactgccca 300

acctcatggt ccttcatctt tatcggaatg cttaccttgg ggagaagcta gtattcaaaa 360

caggagcatt cccaaatctt agaacacttt ggatttatga attggatcag ctaagagaga 420

tcagatttga ggacggcagc tcacccctgt tggaaaagat agaaataggc gagtgcaggt 480

tggaatctgg gatt 494

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atcgtgattt ctatagttat ctaagtagtt ggcattaata atttcatttt 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aaaatgaaat tattaatgcc aactacttag ataactatag aaatcacgat 50

Claims (9)

1.一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的HRM检测方法，其特征在于所述HRM检测体系包含一对检测引物，所述检测引物的序列是：正向引物：TAGGTGTGACAACAAACGGGTC；和反向引物：AATCCCAGATTCCAACCTGCAC。

2.权利要求1所述的HRM检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

a)提取待测样本DNA；

b)配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；和

c)对PCR产物进行HRM分析扫描。

3.权利要求2所述的HRM检测方法，其中所述的提取待测样本DNA的方法是：取样，直接加提取液研磨，沸水浴10min后，静置分层取上清即为待测样本DNA，其中所述的提取液包含10mM Tris-HCl、0.5mM EDTA和0.15M KCl。

4.权利要求2所述的HRM检测方法，其中所述的PCR反应体系包含1μLPCR模板，0.5UrTaq DNA聚合酶，1×PCR缓冲液，250μM dNTP，0.1μM正向和反向引物和0.1μL 20×EvaGreen荧光染料。

5.权利要求2所述的HRM检测方法，其中所述的PCR扩增条件是：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃10s，40个循环；72℃2min，紧接着95℃变性1min，12℃复性1min。

6.一种基于HRM技术的用于水稻抗稻瘟病基因Pi2检测的PCR试剂盒，其特征在于所述PCR试剂盒包含一对检测引物，所述检测引物的序列是：正向引物：

TAGGTGTGACAACAAACGGGTC；和反向引物：AATCCCAGATTCCAACCTGCAC。

7.权利要求6所述的试剂盒，其中所述的试剂盒还包含PCR试剂和荧光染料。

8.权利要求6-7之任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于所述使用方法包括如下步骤：

a)提取待测样本DNA；

b)配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；和

c)对PCR产物进行HRM分析扫描。

9.权利要求6-7之任一所述的试剂盒在检测水稻抗稻瘟病基因Pi2中的应用。

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