CN105772054A - 去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂及其制备和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂及其制备和应用方法,所述催化剂是以钛酸四丁酯为Ti源、以氨水为N源、以氢氟酸为F源,先采用溶胶凝胶法制备得到N,F‑TiO2凝胶,然后将石英玻璃片插入陈化后的所述N,F‑TiO2凝胶中、在所述N,F‑TiO2凝胶中停滞、从所述N,F‑TiO2凝胶中抽出、并且进行烘烤和煅烧,制备得到N,F‑TiO2催化薄膜。本发明的有益效果在于,通过紫外光和所述N,F‑TiO2催化薄膜的共同作用,可以同时实现抗性细菌和抗性基因的完全去除,为水环境中抗性细菌和抗性基因的去除提供了一种高效、无二次污染的光催化氧化技术。
Description
技术领域
本发明涉及一种催化剂,尤其涉及一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂及其制备和应用方法。
背景技术
污水处理厂是现在公认的抗性细菌及抗性基因的贮备库,而抗性细菌和抗性基因都具有严重的危害,致使抗生素类医疗药物在临床医疗及动物疾病防治方面失效,成为人类健康的一大挑战,因此,从源头上去除水中抗性细菌和抗性基因显的尤为重要。
目前,研究者用光催化氧化技术对微生物的去除进行了研究,最常用的催化剂为TiO2催化剂,TiO2催化剂因其具有化学稳定性高、廉价易得、安全无毒等特点,使其成为一种性能优越、应用前景被十分看好的功能材料,在污水处理、灭菌消毒、有机污染物降解方面有广泛的应用,但是,TiO2同时也存在反应效率不高、太阳能利用率低等缺陷,使其光催化活性受到限制。
近年来,人们主要通过表面修饰等方法改善TiO2的光催化活性,主要集中于采用非金属元素如N元素对TiO2进行掺杂改性,也有采用过渡金属如Fe元素对TiO2进行掺杂改性,还有采用非金属元素和过渡金属同时掺杂TiO2产生的协同作用来共同提高TiO2的光催化性能,但是这些方法制备得到的TiO2均为粉末状,在处理污水时,不仅会悬浮在水溶液的表面,而且处理完难以从水溶液中分离,致使TiO2在水溶液中的去除效果不佳,尤其是对水中抗性细菌和抗性基因的去除效果仍是空白,因此,急需开发一种去除水中抗性细菌和抗性基因的高效能的光催化剂。
鉴于上述缺陷,本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。
发明内容
为解决上述问题,本发明采用的技术方案在于,提供一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将5-15mL的乙酸加入60-90mL的无水乙醇中,然后加入20-30mL的钛酸四丁酯,反应10-20min后,再加入10-15mL的HF,得到溶液A;
(2)将10-15mL的氨水加入20-30mL的无水乙醇中后,用HNO3调节pH至2,得到溶液B;
(3)将所述溶液B加入到所述溶液A中,搅拌40-80min,形成N,F-TiO2凝胶,陈化22-26h;
(4)将石英玻璃片插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中,停滞20-40s后,将所述石英玻璃片抽出,得到负载在所述石英玻璃片上的N,F-TiO2催化薄膜;
(5)将所述N,F-TiO2催化薄膜分别进行烘烤和煅烧,得到稳定、厚度均匀的所述N,F-TiO2催化薄膜。
进一步,所述步骤(1)中加入所述钛酸四丁酯的同时加入2-3滴浓硝酸。
进一步,所述步骤(1)中HF的浓度为0.12mol/L,所述乙酸、钛酸四丁酯、HF需逐滴加入,并对所述步骤(1)进行搅拌。
进一步,所述步骤(2)中氨水的浓度为0.12mol/L、HNO3的浓度为0.1mol/L,所述氨水需逐滴加入,并对所述步骤(2)进行搅拌。
进一步,所述步骤(4)中的石英玻璃片插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶、在所述N,F-TiO2凝胶中停滞、从所述N,F-TiO2凝胶中抽出的时间均为20-40s。
进一步,所述石英玻璃片插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中、在所述N,F-TiO2凝胶中停滞、从所述N,F-TiO2凝胶中抽出、并对所述N,F-TiO2催化薄膜进行烘烤的步骤重复2-4次。
进一步,所述步骤(5)中的烘烤温度为90-110℃,烘烤时间为15-30min;煅烧温度为430-470℃,煅烧时间为15-30min。
同时,本发明提供一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法制成的催化剂。
另外,本发明提供一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的应用方法,将所述N,F-TiO2催化薄膜置于菌液中,将所述菌液在紫外光下光照。
进一步,所述紫外光的波长为254nm。
与现有技术比较本发明的有益效果在于:
1、加入所述钛酸四丁酯时需逐滴加入,既可以使所述钛酸四丁酯充分水解,又能避免导致副产物甚至沉淀的产生;所述HF逐滴加入可以放缓水解反应的速度,避免溶液中所述HF因局部浓度过高对产物造成破坏;
2、所述N,F-TiO2催化薄膜经过烘烤和煅烧,可以得到稳定、厚度均匀的所述N,F-TiO2催化薄膜;
3、利用溶胶凝胶法以石英玻璃片为基底合成了具有较高催化活性的锐钛矿N,F-TiO2催化薄膜,既解决了粉末态的TiO2在水溶液中悬浮的问题,又解决了粉末态的TiO2难以在水溶液中分离的难题;
4、制备得到的N,F-TiO2催化薄膜在处理完菌液时,抽出即可,不仅操作简单方面,而且所述的N,F-TiO2催化薄膜还可以重复利用,进一步提高了能源的利用率;
5、在紫外光和所述N,F-TiO2催化薄膜的共同作用下,可以同时实现抗性细菌和抗性基因的完全去除,为水环境中抗性细菌和抗性基因的去除提供了一种高效、无二次污染的光催化氧化技术。
附图说明
图1为本发明合成的N,F-TiO2催化薄膜的FESEM图像;
图2为本发明合成的N,F-TiO2催化薄膜的XRD图谱;
图3为本发明合成的N,F-TiO2催化薄膜的XPS图谱:(a)Ti2p,(b)O1s,(c)F1s,(d)全扫;
图4为本发明合成的N,F-TiO2催化薄膜的UV-visDRS图谱;
图5为本发明中紫外条件下,N,F-TiO2催化薄膜对MRSA和P.aeruginosa的去除效果图;
图6为本发明中黑暗条件下,N,F-TiO2催化薄膜对MRSA和P.aeruginosa的去除效果图;
图7为本发明中紫外条件下,MRSA和P.aeruginosa的去除效果图;
图8为本发明中紫外条件下,N,F-TiO2催化薄膜对mecA和ampC的去除效果图;
图9为本发明中黑暗条件下,N,F-TiO2催化薄膜对mecA和ampC的去除效果图;
图10为本发明中紫外条件下,mecA和ampC的去除效果图。
具体实施方式
以下结合附图,对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
实施例一
(1)用移液管移取60mL的无水乙醇至干净的烧杯a中,逐滴加入5mL的乙酸,然后用移液管移取20mL钛酸四丁酯逐滴加入所述烧杯a中,同时滴入2-3滴浓硝酸,反应10min后,向所述烧杯a中逐滴加入10mL0.12mol/L的HF,期间需对所述烧杯a进行不间断的搅拌,得到溶液A;
(2)用移液管移取20mL的无水乙醇至干净的小烧杯b,然后用移液管移取10mL0.12mol/L的氨水逐滴加入到所述烧杯b中,用0.1mol/L的HNO3调节pH至2,期间需对所述烧杯b进行不间断的搅拌,得到溶液B;
(3)将所述溶液B加入到所述溶液A中,搅拌40min,形成N,F-TiO2凝胶,陈化22h;
(4)将石英玻璃片以均匀的速率插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中,插入时间20s,在所述N,F-TiO2凝胶中停滞20s后,将所述石英玻璃片以均匀的速率从所述N,F-TiO2凝胶中抽出,抽出时间20s,得到负载在所述石英玻璃片上的N,F-TiO2催化薄膜,将所述N,F-TiO2催化薄膜在90℃的烘箱中烘烤15min;
(5)所述步骤(4)再重复1次,将得到的所述N,F-TiO2催化薄膜在430℃的马弗炉中煅烧15min后,得到稳定、厚度均匀的所述N,F-TiO2催化薄膜。
其中,加入所述钛酸四丁酯时需逐滴加入,既可以使所述钛酸四丁酯充分水解,又能避免导致副产物甚至沉淀的产生;所述HF也需逐滴加入,可以放缓所述钛酸四丁酯水解反应的速度,避免溶液中所述HF因局部浓度过高对产物造成破坏。
上述使用的所述石英玻璃片在使用前分别用自来水、超纯水冲洗,然后在乙醇中浸泡,最后置于烘箱中烘干待用。
实施例二
如上所述的一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂,本实施例与其不同在于,制备所述N,F-TiO2催化薄膜的具体步骤如下:
(1)用移液管移取80mL的无水乙醇至干净的烧杯a中,逐滴加入15mL的乙酸,然后用移液管移取25mL钛酸四丁酯逐滴加入所述烧杯a中,同时滴入2-3滴浓硝酸,反应15min后,向所述烧杯a中逐滴加入15mL0.12mol/L的HF,期间需对所述烧杯a进行不间断的搅拌,得到溶液A;
(2)用移液管移取30mL的无水乙醇至干净的小烧杯b,然后用移液管移取15mL0.12mol/L的氨水逐滴加入到所述烧杯b中,用0.1mol/L的HNO3调节pH至2,期间需对所述烧杯b进行不间断的搅拌,得到溶液B;
(3)将所述溶液B加入到所述溶液A中,搅拌80min,形成N,F-TiO2凝胶,陈化24h;
(4)将石英玻璃片以均匀的速率插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中,插入时间20s,在所述N,F-TiO2凝胶中停滞40s后,将所述石英玻璃片以均匀的速率从所述N,F-TiO2凝胶中抽出,抽出时间20s,得到负载在所述石英玻璃片上的N,F-TiO2催化薄膜,将所述N,F-TiO2催化薄膜在110℃的烘箱中烘烤20min;
(5)所述步骤(4)再重复2次,将得到的所述N,F-TiO2催化薄膜在470℃的马弗炉中煅烧30min后,得到稳定、厚度均匀的所述N,F-TiO2催化薄膜。
实施例三
如上所述的一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂,本实施例与其不同在于,制备所述N,F-TiO2催化薄膜的具体步骤如下:
(1)用移液管移取90mL的无水乙醇至干净的烧杯a中,逐滴加入15mL的乙酸,然后用移液管移取30mL钛酸四丁酯逐滴加入所述烧杯a中,同时滴入2-3滴浓硝酸,反应20min后,向所述烧杯a中逐滴加入15mL0.12mol/L的HF,期间需对所述烧杯a进行不间断的搅拌,得到溶液A;
(2)用移液管移取25mL的无水乙醇至干净的小烧杯b,然后用移液管移取15mL0.12mol/L的氨水逐滴加入到所述烧杯b中,用0.1mol/L的HNO3调节pH至2,期间需对所述烧杯b进行不间断的搅拌,得到溶液B;
(3)将所述溶液B加入到所述溶液A中,搅拌80min,形成N,F-TiO2凝胶,陈化26h;
(4)将石英玻璃片以均匀的速率插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中,插入时间40s,在所述N,F-TiO2凝胶中停滞40s后,将所述石英玻璃片以均匀的速率从所述N,F-TiO2凝胶中抽出,抽出时间40s,得到负载在所述石英玻璃片上的N,F-TiO2催化薄膜,将所述N,F-TiO2催化薄膜在110℃的烘箱中烘烤30min;
(5)所述步骤(4)再重复3次,将得到的所述N,F-TiO2催化薄膜在470℃的马弗炉中煅烧25min后,得到稳定、厚度均匀的所述N,F-TiO2催化薄膜。
实施例四
如上所述的一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂,本实施例与其不同在于,制备所述N,F-TiO2催化薄膜的具体步骤如下:
(1)用移液管移取75mL的无水乙醇至干净的烧杯a中,逐滴加入10mL的乙酸,然后用移液管移取25mL钛酸四丁酯逐滴加入所述烧杯a中,同时滴入2-3滴浓硝酸,反应15min后,向所述烧杯a中逐滴加入12.5mL0.12mol/L的HF,期间需对所述烧杯a进行不间断的搅拌,得到溶液A;
(2)用移液管移取25mL的无水乙醇至干净的小烧杯b,然后用移液管移取12.5mL0.12mol/L的氨水逐滴加入到所述烧杯b中,用0.1mol/L的HNO3调节pH至2,期间需对所述烧杯b进行不间断的搅拌,得到溶液B;
(3)将所述溶液B加入到所述溶液A中,搅拌60min,形成N,F-TiO2凝胶,陈化24h;
(4)将石英玻璃片以均匀的速率插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中,插入时间30s,在所述N,F-TiO2凝胶中停滞30s后,将所述石英玻璃片以均匀的速率从所述N,F-TiO2凝胶中抽出,抽出时间30s,得到负载在所述石英玻璃片上的N,F-TiO2催化薄膜,将所述N,F-TiO2催化薄膜在100℃的烘箱中烘烤25min;
(5)所述步骤(4)再重复2次,将得到的所述N,F-TiO2催化薄膜在450℃的马弗炉中煅烧20min后,得到稳定、厚度均匀的所述N,F-TiO2催化薄膜。
通过实施例一到实施例四的制备方法都可以制备得到去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂,所述催化剂为N,F-TiO2催化薄膜,本发明制备得到的所述N,F-TiO2催化薄膜既解决了粉末态的TiO2在水溶液中悬浮的问题,又解决了粉末态的TiO2难以在水溶液中分离的难题;同时制备得到的N,F-TiO2催化薄膜在处理完菌液时,抽出即可,不仅操作简单方面,而且所述的N,F-TiO2催化薄膜还可以重复利用,进一步提高了能源的利用率。
以下将优选实施例四制备得到的N,F-TiO2催化薄膜进行测试,具体为将实施例四中所述步骤(5)制备得到的所述N,F-TiO2催化薄膜分别进行FESEM、XRD、XPS、UV-visDRS测试,测试结果参阅图1、图2、图3和图4所示,其分别为本发明合成的N,F-TiO2催化薄膜的FESEM图像、XRD图谱、XPS、图谱以及UV-visDRS图谱。
如图1所示,其是以场发射扫描电子显微镜对合成的N,F-TiO2催化薄膜进行电镜扫描,由SEM图像可以看出,TiO2颗粒为粒径小于300nm的小球,这种结构意味着所述N,F-TiO2催化薄膜具有较大的表面积,具有很好的光催化效能。
如图2所示,其为合成的N,F-TiO2催化薄膜的XRD图谱,从XRD图谱上可以看出,位于图2中2θ=25.25(101)处凸起的尖峰表明所合成的所述N,F-TiO2催化薄膜为锐钛矿晶型的TiO2,相对于其它晶型的TiO2如金红石晶型等而言,锐钛矿晶型的所述TiO2具有最高的催化效能,而且,图2中所有的衍射峰证明合成的所述N,F-TiO2催化薄膜为四方晶型的TiO2,XRD衍射图谱表明没有杂质相被检出,所合成的所述N,F-TiO2催化薄膜纯度很高。
如图3所示,其为合成的N,F-TiO2催化薄膜的XPS图谱:(a)Ti2p,(b)O1s,(c)F1s,(d)全扫。由全扫图谱(图3d)可知,合成的所述N,F-TiO2催化薄膜中含有Ti、O、F;图3a显示了Ti2p的XPS图谱,图中Ti2p峰狭窄且强说明钛元素是以Ti4+的形式存在;图3c显示了F1s的XPS图谱,图中F1s峰狭窄且强说明氟元素以F-的形式存在;由图3b显示了O1s的XPS图谱,图中O1s峰是非对称的,说明至少有两种状态的氧存在于所述N,F-TiO2催化薄膜表面。通过XPS分峰发现有两种状态的氧存在,位于结合能为530eV处的峰(峰1)是二氧化钛晶格中的氧元素的作用,位于结合能为532eV处的峰(峰2)主要是表面羟基氧元素的作用,表面羟基被光诱导产生的空穴攻击后可以产生具有很高氧化能力的表面羟基自由基,在光催化反应中起到至关重要的作用。
如图4所示,其为合成的N,F-TiO2催化薄膜的UV-visDRS图谱,UV-visDRS显示合成的所述N,F-TiO2催化薄膜带隙吸收位于418nm,说明带隙能为2.97eV,比普通TiO2粉末带隙能窄,表明合成的所述N,F-TiO2催化薄膜吸收光谱出现红移现象,在吸收可见光时比普通的TiO2粉末更有效。
结合图1、图2、图3、图4得知,利用溶胶凝胶法以石英玻璃片为基底不仅合成了具有较高催化活性的锐钛矿的所述N,F-TiO2催化薄膜,而且所合成的所述N,F-TiO2催化薄膜纯度很高。
实施例五
如实施例四所述,本实施例与其不同在于,一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的应用方法,是将所述步骤(5)制备得到的所述N,F-TiO2催化薄膜置于菌液中,然后将所述菌液在254nm的紫外光下分别光照0、30、60、120、240、480min,测定每个取样时间点对应的的所述菌液中的抗性细菌的数量。
实施例五中,所述菌液的准备过程如下,本实施例选用了两种纯种抗性细菌,分别为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(简称MRSA),携有mecA抗性基因;绿脓杆菌(简称P.aeruginosa),携有ampC抗性基因,所述P.aeruginosa菌液的准备过程同所述MRSA菌液的准备过程,其中,所述MRSA菌液的准备过程如下:
(1)依据KWIK-STIKTM用户指南,在无菌室中对所述MRSA进行复苏,复苏后取3mL培养至对数增殖期的所述MRSA悬浮液或适量的固态培养基上的所述MRSA菌斑至新的灭菌生长培养基进行传代接种,传代接种两次后,将培养至对数增殖期的所述MRSA菌液贮存于30%的甘油LB培养基中并保存在-80℃下;
(2)将所述步骤(1)得到的-80℃下保存的所述MRSA菌液溶解后,取1.5mL的所述MRSA菌液至100mL的脑心浸液培养基中,然后将所述脑心浸液培养基置于恒温震荡培养箱中,在37℃下培养至对数增殖期,所获得的所述MRSA菌液在5000g下离心10min,弃去上清液并加入30mL的PBS缓冲液(137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.76nMKH2PO4,pH=7.4)涡旋振荡使所述MRSA菌液混匀,继续在5000g下离心10min,弃去上清液并加入30mL的PBS缓冲液,涡旋振荡使所述MRSA菌液混匀,并用PBS缓冲液将所述MRSA菌液的吸光度调节为1,得到所述MRSA菌液。
抗性细菌的去除:取50mL本实施例中所述步骤(2)获得的所述MRSA菌液加到灭菌试管中,将所述N,F-TiO2催化薄膜置于所述MRSA菌液中,然后放入光化学反应仪外围的固定装置(中心部位配有300/800W低压汞灯用于产生紫外光)中进行催化氧化,实施过程对所述MRSA菌液不断进行搅拌,防止因所述MRSA菌液沉降对所述MRSA抗性细菌的去除效果造成影响,实验过程中,分别在光照时间为0、30、60、120、240、480min下取样,测定不同取样时间点对应的所述MRSA菌液的吸光度,然后依据MRSA抗性细菌标准曲线计算所述MRSA抗性细菌的数量,设定平行三组,排除实验偶然误差,以保证准确度;所述P.aeruginosa菌液中抗性细菌的去除以及测试抗性细菌数量的操作过程同所述MRSA菌液中抗性细菌的去除以及测试抗性细菌数量的操作过程,其中,需用分光辐射仪测定所述紫外光的强度,并根据所述紫外光的强度和催化氧化的反应时间来确定紫外通量。
实施例五中,在紫外条件下,所述N,F-TiO2催化薄膜对所述PBS介质中所述MRSA和所述P.aeruginosa细菌的去除效果如图5所示,从图5上可以看出,6mJ/cm2紫外光通量下,所述N,F-TiO2催化薄膜使所述PBS介质中的所述MRSA细菌和所述P.aeruginosa细菌分别下降4.51和4.71个数量级;12mJ/cm2紫外光通量下,所述N,F-TiO2催化薄膜使所述PBS介质中的所述MRSA细菌和所述P.aeruginosa细菌分别下降5.76和5.66个数量级,基本实现了抗性细菌的完全去除,说明所述N,F-TiO2催化薄膜在所述紫外光的作用可以有效的去除抗性细菌。
空白对照实验:
对照实验1:分别取50mL本实施例中所述步骤(2)获得的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液加到灭菌试管中,将所述N,F-TiO2催化薄膜分别置于所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液中,然后放于黑暗条件下,实施过程需对所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液不断进行搅拌,分别在0、30、60、120、240、480min下取样,分别测定不同取样时间点对应的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液的吸光度,然后依据所述MRSA抗性细菌标准曲线和P.aeruginosa抗性细菌标准曲线分别计算所述MRSA抗性细菌和所述P.aeruginosa抗性细菌的数量,设定平行三组,排除实验偶然误差,以保证准确度。
对照实验1中,在黑暗条件下,所述N,F-TiO2催化薄膜对所述PBS介质中的所述MRSA细菌和所述P.aeruginosa细菌去除效果如图6所示,从图6上可以看出,黑暗条件下反应时间480min时,所述N,F-TiO2催化薄膜对所述PBS介质中的所述MRSA细菌和所述P.aeruginosa细菌去除低于0.2个数量级,抗性细菌几乎没有被去除,说明在黑暗条件下,所述N,F-TiO2催化薄膜对抗性细菌的去除效果可以被忽略。
对照实验2:分别取50mL本实施例中所述步骤(2)获得的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液加到灭菌试管中,然后分别放入光化学反应仪外围的固定装置(中心部位配有300/800W低压汞灯用于产生紫外光)中进行催化氧化,实施过程需对所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液不断进行搅拌,分别测定不同取样时间点对应的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液的吸光度,然后依据MRSA抗性细菌标准曲线和P.aeruginosa抗性细菌标准曲线分别计算所述MRSA抗性细菌和所述P.aeruginosa抗性细菌的数量,设定平行三组,排除实验偶然误差,以保证准确度。
对照实验2中,在无所述N,F-TiO2催化薄膜的条件下,进行紫外光照,所述PBS介质中的所述MRSA细菌和所述P.aeruginosa细菌的去除效果如图7所示,从图7上可以看出,在紫外条件下,6mJ/cm2紫外通量下,所述PBS介质中的所述MRSA细菌和所述P.aeruginosa细菌分别下降0.93和0.90个数量级;12mJ/cm2紫外通量下,所述PBS介质中的所述MRSA细菌和所述P.aeruginosa细菌分别下降2.53和2.28个数量级,说明在紫外条件下对抗性细菌的去除效果有一定的影响。
结合对照实验1和对照实验2,本实施例中的实验说明,在紫外光和所述N,F-TiO2催化薄膜联合作用下,可以有效的提高抗性细菌的去除效果。
其中,抗性细菌标准曲线的制定及计算抗性细菌数量的过程如下:所述P.aeruginosa抗性细菌标准曲线制定及抗性细菌数量测定的步骤同所述MRSA抗性细菌标准曲线制定及抗性细菌数量测定的步骤,其中所述MRSA抗性细菌标准曲线制定及抗性细菌数量测定的具体步骤如下:
(1)将-80℃下保存的所述MRSA菌液溶解后,取1.5mL的所述MRSA菌液至100mL的脑心浸液培养基中,然后将所述脑心浸液培养基置于恒温震荡培养箱中,在37℃下培养至对数增殖期;
(2)所获得的所述MRSA菌液在5000g下离心10min,弃去上清液并加入30mL的PBS缓冲液(137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.76nMKH2PO4,pH=7.4)涡旋振荡使所述MRSA菌液混匀,继续在5000g下离心10min,弃去上清液;
(3)在所述步骤(2)中加入30mLPBS缓冲液及取的水样,涡旋震荡使所述MRSA菌液完全混匀;
(4)用PBS缓冲液分别对上述菌液进行10、102、103、104、105、106倍稀释,同时测定不同稀释倍数样品的吸光度;分别取100μL不同稀释倍数的样品涂布到事先加入对应抗生素的麦康凯琼脂培养板上,将所述培养板在35℃条件下倒置培养48h,每个样品平行设定三组,分别记录每个样品中的细菌总数;
(5)以吸光度为X轴,细菌总数为Y轴,建立吸光度与细菌总数的标准曲线,得到所述MRSA抗性细菌的标准曲线。
(6)将分别在0、30、60、120、240、480min紫外光照下取样测定得到所对应的所述MRSA菌液的吸光度带入所述MRSA抗性细菌的标准曲线,计算分别得到所述MRSA菌液中抗性细菌的数量。
实施例六
如实施例五所述,本实施例与其不同在于,一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的应用方法,是将所述N,F-TiO2催化薄膜置于菌液中,将所述菌液在254nm的紫外光下分别光照0、30、60、120、240、480min,提取每个取样时间点的所述菌液中的抗性基因,并分别测定每个取样时间点对应的所述抗性基因的数量,其中,所述菌液为所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液。
实施例六中,所述P.aeruginosa菌液中ampC抗性基因的提取步骤同所述MRSA菌液中的mecA抗性基因的提取步骤,根据使用者指南用E.Z.N.A.TMBacterialDNAKit试剂盒进行提取,其中,所述MRSA菌液中的mecA抗性基因提取步骤如下:
(1)分别取1.5mL在0、30、60、120、240、480min下光照得到的所述MRSA菌液,在室温下4000g离心10min;
(2)分别弃去所述步骤(1)获得的所述MRSA菌液中的上清液并在每一个样品中加入180μL的TE缓冲液和20μL50mg/mL的溶菌酶溶液,然后将所述的每一个样品分别置于30℃的水浴中温热10min;
(3)将所述步骤(2)获得的所述MRSA菌液分别在5000g下离心10min,弃去上清液并加入200μL的BufferBTL,涡旋震荡使所述MRSA细胞再悬浮,对于所述MRSA细菌,为了使细胞壁完全裂解需加入40mg的GlassPowder并在最大转速下涡旋震荡5min,静置一段时间使所述Glasspowder沉降,然后将上清液转移至1.5mL的离心管中;
(4)在所述步骤(3)中分别加入25μLProteinaseKsolution并涡旋震荡混匀,然后在55℃恒温水浴震荡箱中水浴1h使所述MRSA细菌完全裂解,以保证裂解效果;
(5)在所述步骤(4)中分别加入5μL的RNaseA,反复缓慢颠倒混匀,然后在室温下水浴30min;
(6)将所述步骤(5)获得的所述MRSA菌液分别在10000g下离心5min以固定不容碎片,然后将上清液取出分别转移至无菌离心管中;
(7)在所述步骤(6)中分别加入220μL的BufferBDL涡旋震荡或反复缓慢颠倒混匀,然后分别在65℃的水浴中加热10min;
(8)在所述步骤(7)中分别加入220μL的无水乙醇并在最大转速下涡旋震荡20s混匀;
(9)将六个吸附小柱分别放入2mL的收集管中,将所述步骤(8)获得的所述MRSA菌液分别转移到所述的吸附小柱中,在10000g离心1min,弃去收集管和滤出液;
(10)将所述步骤(9)获得的所述吸附小柱分别放入新的2mL的收集管中,分别加入500μL的BufferHB,在10000g离心1min,弃去所述收集管中的上清液;
(11)在所述步骤(10)中分别加入700μLDNAwashbuffer,在10000g离心1min,弃去所述收集管中的上清液,将此步骤重复操作2次;
(12)将所述步骤(11)的收集管在最大转速下离心2min,弃去所述收集管,将所述吸附小柱分别放入1.5mL去核酸的离心管中;
(13)在所述步骤(12)中分别加入100μL事先加热到65℃的ElutionBuffer,静置培养3-5min,分别在10000g下离心1min,将得到0、30、60、120、240、480min光照下对应的所述mecA抗性基因,并将所述mecA抗性基因保存于-20℃的环境中。
抗性基因标准曲线的制定及计算抗性基因数量的过程如下:所述ampC抗性基因标准曲线制定及抗性基因数量测定的步骤同所述mecA抗性基因标准曲线测定及抗性基因数量测定的步骤,其中所述mecA抗性基因标准曲线制定及抗性基因数量测定的步骤如下:
(1)所述mecA抗性基因标准曲线制定:用胶纯化试剂盒对PCR产物进行纯化并将纯化后的片段导入p-GEMT载体,然后通过热激转化至EscherichiacoliJM109感受态细胞;由蓝白斑筛选出白色阳性克隆子,重新进行培养,从所培养的菌中提取质粒DNA进行测序,用微量核酸蛋白质分析仪测定DNA含量及纯度,按10、102、103、104、105、106倍稀释,以拷贝数为横坐标,Ct值为纵坐标绘制所述mecA抗性基因的标准曲线,其中Ct值表示反应体系的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数;
(2)所述mecA抗性基因数量的测定:采用SYBRGreenPremixTaqII反应体系,利用7500Real-TimePCR对提取得到的所述mecA抗性基因进行实时荧光定量分析,所述PCR反应体系的体积为20μL,包括10μL荧光染料SYBRPremixExTaq、6.4μLdH2O、0.2μM0.4μL的引物、2μLmecA模板,其中设定的反应程序为依次为94℃下运行4min;94℃下运行45s;退火45s;72℃下运行1min;循环35次;72℃下反应6min,测定得到不同光照时间下对应的每个样品的拷贝数,然后带入所述mecA抗性基因的标准曲线得到所述mecA抗性基因的数量,其中,所述引物如表1所示:
表1.引物基本信息
实施例六中,在紫外条件下,所述N,F-TiO2催化薄膜对所述PBS介质中的所述mecA和所述ampC的去除效果如图8所示,从图8上可以看出,120mJ/cm2的紫外光通量可使所述mecA和所述ampC分别下降5.77和4.62个数量级,基本实现了抗性基因的完全去除,说明所述N,F-TiO2催化薄膜在所述紫外光的作用可以有效的去除抗性基因。
空白对照实验:
对照实验1:分别取50mL实施例五中所述步骤(2)获得的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液加到灭菌试管中,将所述N,F-TiO2催化薄膜分别置于所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液中,然后放于黑暗条件下,实施过程需对所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液不断进行搅拌,分别在0、30、60、120、240、480min下取样,并分别取1.5mL在不同时间点对应的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液,按照所述抗性基因提取步骤提取所述MRSA菌液中的mecA抗性基因和所述P.aeruginosa菌液中的ampC抗性基因,并测定不同光照时间点对应的所述MRSA菌液中的mecA抗性基因的数量和所述P.aeruginosa菌液中的ampC抗性基因的数量,设定平行三组,排除实验偶然误差,以保证准确度。
对照实验1中,在黑暗条件下,所述N,F-TiO2催化薄膜对所述PBS介质中的所述mecA和所述ampC去除效果如图9所示,从图9上可以看出,黑暗条件下反应时间480min时,所述N,F-TiO2催化薄膜对所述PBS介质中的所述mecA和所述ampC去除低于0.15个数量级,抗性基因几乎没有被去除,说明在黑暗条件下,所述N,F-TiO2催化薄膜对抗性细菌的去除效果可以被忽略。
对照实验2:分别取50mL实施例三中所述步骤(2)获得的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液加到灭菌试管中,然后分别放入光化学反应仪外围的固定装置(中心部位配有300/800W低压汞灯用于产生紫外光)中进行催化氧化,实施过程需对所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液不断进行搅拌,分别在0、30、60、120、240、480min下取样,并分别取1.5mL在不同时间点对应的所述MRSA菌液和所述P.aeruginosa菌液,按照所述抗性基因提取步骤提取所述MRSA菌液中的mecA抗性基因和所述P.aeruginosa菌液中的ampC抗性基因,并测定不同光照时间点对应的所述MRSA菌液中的mecA抗性基因的数量和所述P.aeruginosa菌液中的ampC抗性基因的数量,设定平行三组,排除实验偶然误差,以保证准确度。
对照实验2中,在无所述N,F-TiO2催化薄膜的条件下,进行紫外光照,所述PBS介质中的所述mecA和所述ampC的去除效果如图10所示,从图10上可以看出,在紫外条件下,60mJ/cm2紫外通量下,所述PBS介质中的所述mecA和所述ampC分别下降1.41和0.95个数量级;120mJ/cm2紫外通量下,所述PBS介质中的所述mecA和所述ampC分别下降2.30和1.40个数量级,说明在紫外条件下对抗性细菌的去除效果有一定的影响。
结合对照实验1和对照实验2,本实施例中的实验说明,在紫外光和所述N,F-TiO2催化薄膜联合作用下,可以有效的提高抗性基因的去除效果。
综合以上所述,在紫外光和所述N,F-TiO2催化薄膜的共同作用,可以同时实现抗性细菌和抗性基因的完全去除,为水环境中抗性细菌和抗性基因的去除提供了一种新颖、高效、无二次污染的光催化氧化技术。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将5-15mL的乙酸加入60-90mL的无水乙醇中,然后加入20-30mL的钛酸四丁酯,反应10-20min后,再加入10-15mL的HF,得到溶液A;
(2)将10-15mL的氨水加入20-30mL的无水乙醇中后,用HNO3调节pH至2,得到溶液B;
(3)将所述溶液B加入到所述溶液A中,搅拌40-80min,形成N,F-TiO2凝胶,陈化22-26h;
(4)将石英玻璃片插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中,停滞20-40s后,将所述石英玻璃片抽出,得到负载在所述石英玻璃片上的N,F-TiO2催化薄膜;
(5)将所述N,F-TiO2催化薄膜分别进行烘烤和煅烧,得到稳定、厚度均匀的所述N,F-TiO2催化薄膜。
2.根据权利要求1所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中加入所述钛酸四丁酯的同时加入2-3滴浓硝酸。
3.根据权利要求2所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中HF的浓度为0.12mol/L,所述乙酸、钛酸四丁酯、HF需逐滴加入,并对所述步骤(1)进行搅拌。
4.根据权利要求3所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中氨水的浓度为0.12mol/L、HNO3的浓度为0.1mol/L,所述氨水需逐滴加入,并对所述步骤(2)进行搅拌。
5.根据权利要求4所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中的石英玻璃片插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶、在所述N,F-TiO2凝胶中停滞、从所述N,F-TiO2凝胶中抽出的时间均为20-40s。
6.根据权利要求5所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,所述石英玻璃片插入陈化后的所述N,F-TiO2凝胶中、在所述N,F-TiO2凝胶中停滞、从所述N,F-TiO2凝胶中抽出、并对所述N,F-TiO2催化薄膜进行烘烤的步骤重复2-4次。
7.根据权利要求6所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中的烘烤温度为90-110℃,烘烤时间为15-30min;煅烧温度为430-470℃,煅烧时间为15-30min。
8.一种如权利要求1-7任一所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的制备方法制成的催化剂。
9.一种如权利要求8所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的应用方法,其特征在于,将所述N,F-TiO2催化薄膜置于菌液中,将所述菌液在紫外光下光照。
10.根据权利要求9所述的去除水中抗性细菌和抗性基因的催化剂的应用方法,其特征在于,所述紫外光的波长为254nm。
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