CN111803631A - 一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，属于碳基材料技术领域。包括以下步骤：将生物质材料置于液体媒介中，并于140～180℃，反应2～6h，即得高效抗菌特性碳纳米点；其中，所述生物质材料为天然的具有抗菌特性的生物质材料；本发明还提供一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法制备的碳纳米点在抗革兰氏阳性细菌中的应用。本发明提供制备方法，其基于廉价的生物质为前驱体，用水热法合成一种碳纳米点，制备方法简单，易得，且合成的碳纳米点具有高效光动力性能，尤其对金黄色葡萄球菌有高达99.5％以上的灭活效率。

Description

一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于碳基材料技术领域，具体涉及一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法及其应用。

背景技术

细菌性传染病对人类健康造成了严重的挑战，自上世纪90年代以来，革兰氏阳性球菌在医院感染病原体中比例显著上升，并成为当今院内感染中最重要的病原体。革兰氏阳性细菌在世界范围内引起严重的感染，每年折磨着数百万人。此外，手术部位感染主要由革兰氏阳性菌引起，占医院感染的25％。同时，肿瘤内某些革兰氏阳性菌可明显增强化疗耐药，降低化疗药物疗效，促进肿瘤生长和转移。考虑到革兰氏阳性菌的巨大威胁，因此迫切需要开发对革兰氏阳性菌具有高度选择的抗菌剂，实现准确高效的抗菌。另一方面，随着抗生素滥用现象不断加剧，临床细菌耐药问题日趋严重。因此也非常有比较要开发新型的抗菌手段对细菌进行灭活。光动力疗法(PDT)是利用光动力效应进行治疗的一种新技术。在特定波长的激光照射下使光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的活性氧进而能够对周围细菌进行灭活。光动力抗菌疗法是基于光动力疗法原理的一种抗感染治疗的新方法，对于细菌、真菌和病毒引起的感染,特别是对于耐药菌感染均显示很好的疗效。

碳纳米点是近些年新兴的一种零维碳基材料，由于其原料丰富易得，制备方法简便，并具有良好的发光特性，生物相容性好而受到广泛的研究，能够应用于发光器件，医药生物等领域，尤其在医药生物领域，通过一定的方法合成制备的碳纳米点具有特殊性质(入疏水性和光敏性)，可以利用相应的性质进行抗菌研究，得到具有特殊性质的抗菌材料。而现有采用光动力试剂合成碳纳米点，其价格高，难以普及使用，且合成方法复杂，为此，开发具有高效光动力的碳点，对开发新型的抗菌剂具有极大促进作用。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供了一种具有高效抗菌特性碳纳米点制备方法，其基于廉价的生物质为前驱体，用水热法合成一种碳纳米点，制备方法简单，易得，且合成的碳纳米点具有高效光动力性能，能够选择性高效灭活革兰氏阳性细菌。

本发明第一个目的是提供一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：

将生物质材料置于有机液体媒介中，并于140～180℃，反应2～6h，即得高效抗菌特性碳纳米点；

其中，所述生物质材料为天然的具有抗菌特性的生物质材料。

优选的，所述生物质材料为紫苏、金银花、艾叶、鱼腥草中的一种或多种。

优选的，所述有机液体媒介为无水乙醇，二氯甲烷、N-N二甲基甲酰胺中的一种或多种。

优选的，所述生物质材料置于所述液体媒介中的质量浓度为0.04～0.16g/ml。

优选的，所述生物质材料在使用前应在干燥箱中60℃烘干。

优选的，反应结束后，将反应溶液在8000r/min，离心5min取上清液，然后分别用离心后的溶液用0.22um滤膜过滤，将过滤后上清溶液置于在50℃真空干燥得到碳纳米点粉末。

本发明第二个目的提供一种上述所述的具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法制备的碳纳米点在抗革兰氏阳性细菌中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种具有高效抗菌特性碳纳米点制备方法，其基于廉价的生物质为前驱体，用水热法合成一种碳纳米点，制备方法简单，易得，且合成的碳纳米点具有高效光动力性能，尤其对金黄色葡萄球菌有高达99.5％以上的灭活效率。

本发明制备的碳纳米点对大肠杆菌的杀菌率也只仅有30％，而对革兰氏阳性菌的灭菌效率可达99.9％，表明本发明提供的碳点对革兰氏阴性菌的杀菌效果远低于革兰氏阳性菌，表现出明显的选择性杀灭革兰氏阳性菌效应。

附图说明

图1是实施例1制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的TEM图。

图2为实施例2制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的TEM图。

图3为实施例3制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的TEM图。

图4为实施例4制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的TEM图。

图5为实施例1制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的抑菌效果图，其中，图a为空白对照组，图b为紫苏碳点处理细菌后，培养平板的剩余菌落数。

图6是实施例2制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的抑菌效果图，其中，图a为空白对照组，图b为金银花碳点处理细菌后，培养平板的剩余菌落数。

图7是实施例3制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的抑菌效果图，其中，图a为空白对照组，图b为艾叶碳点处理细菌后，培养平板的剩余菌落数。

图8是实施例4制备得到的具有高效抗菌特性碳纳米点的抑菌效果图，其中，图a为空白对照组，图b为鱼腥草碳点处理细菌后，培养平板的剩余菌落数。

图9金黄色葡萄球菌在无光和660nm光照下随时间增长过程中吸光度的变化。

图10实施案例1中紫苏碳点对大肠杆菌在无光和660nm光照条件下的抗菌计数结果统计。

图11实施案例1中紫苏碳点(浓度为0.50mg/ml)对大肠杆菌的抗菌结果，其中图a为无光照空白对照组；图b为660nm光照下处理组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

需要说明的是，下述各实施例中采用试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到；所述实验方法中如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：

选取前驱体：紫苏，在干燥箱中60℃烘干2h，彻底去除水分。然后称取2g紫苏，放入3个反应釜中；然后称量25ml无水乙醇，放入上述反应釜中，设置条件140℃，反应6h，即得高效抗菌特性碳纳米点，图1为该碳点的透射电镜(TEM)图。

实施例2

一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：

选取前驱体：金银花，在干燥箱中60℃烘干2h，彻底去除水分。然后称取4g金银花，放入反应釜中；然后称量50ml二氯甲烷，放入上述反应釜中，设置条件180℃，反应2h，即得高效抗菌特性碳纳米点，该碳点的透射电镜图谱如图2所示。

实施例3

一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：

选取前驱体：艾叶，在干燥箱中60℃烘干2h，彻底去除水分。然后称取2g艾叶，放入反应釜中；然后称量50ml N-N二甲基甲酰胺，放入上述反应釜中，设置条件160℃，反应4h，即得高效抗菌特性碳纳米点，图3为艾叶为前驱体制备的碳点透射电镜图。

实施例4

一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：

选取前驱体：鱼腥草，在干燥箱中60℃烘干2h，彻底去除水分。然后称取4g鱼腥草，放入反应釜中；然后称量25ml无水乙醇与二氯甲烷混合液，放入上述反应釜中。设置条件150℃，反应4h，即得高效抗菌特性碳纳米点；其透射电镜图谱为图4；其中，无水乙醇与二氯甲烷的体积比为2:1。

碳点纯化：将上述实施例1～4反应溶液分别在8000r/min，离心5min取上清液；然后分别用离心后的溶液用0.22um滤膜过滤。最后将过滤后溶液置于在50℃真空干燥箱烘干，分别得到上述实施例1～4所制备的高效抗菌特性碳纳米点粉末。

为了说明上述实施案例提供的具有高效抗菌特性碳纳米点的抗菌效果，对实施例1～4提供的具有高效抗菌特性碳纳米点进行抗菌性能测试，其具体抗菌测试步骤如下：

(1)细菌培养：选取革兰氏阳性细菌的代表-金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌的代表-大肠杆菌为测试菌种。将金黄色葡萄球菌单菌落置于20ml新鲜LB培养基中，在37℃下，培养10小时，然后取1ml溶液加入20ml新鲜LB培养基中，继续培养3小时，达到菌浓度为10⁸cfu/ml，离心去掉上清液备用；类似地，将大肠杆菌单菌落于20ml培养基中，然后在37℃下培养13小时，再取1ml上述细菌悬液，加入20ml新鲜LB培养基中，继续37℃培养2.5小时，达到浓度为10⁸cfu/ml，离心去掉上清液备用；

(2)对实施例1～4分别提供的碳纳米点分别配置浓度为0mg/ml、0.50mg/ml的水溶液，其中0mg/ml为空白对照组；

(3)将细菌分别于上述溶液均匀混合，用660nm的激光照射溶液5min，然后采用平板计数法，将碳纳米点-细菌混合溶液在平板稀释涂布；

(4)将平板置于烘箱中20h后，计算菌落，具体抗菌效果见图5～11所示。

从图5～8可知，通过抑菌实验结果可证实，以上所实施案例1～4制备的碳纳米点，在浓度为0.50mg/ml，660nm光照5min的条件下，抑菌效果明显，具体的结果如下：

在实施1中以紫苏为前驱体，制备的紫苏抗菌碳点与金黄色葡萄球菌，在660nm光照下共同孵育5min，然后通过稀释平板涂布法，24h后统计了处理前后的细菌菌落总数。由图5a和5b可知，空白组中细菌铺满整个平板，而紫苏碳点处理后，平板上细菌数量显著降低，仅为个位数，经过计算，杀菌率大于99.9％，这一结果清晰的表明实施案例1中的抗菌碳点可以有效的灭活金黄色葡萄球菌。

同样的，在实施案例2，3和4中，分别以金银花，艾叶和鱼腥草为前驱体制备的碳点与金黄色葡萄球菌进行孵育，然后加以660nm的光照，时间为5min，平板稀释后的统计结果分别呈现在图6，图7和图8中，结果与实施案例1类似，所有的空白对照组中，细菌均占满平板，而实验组中的细菌含量则明显的降低，剩余量分别为0cfu/ml，6cfu/ml和11cfu/ml，杀菌率均保持在99.5％以上。

为了排除660nm光照对细菌生长的影响，以正常环境光作为对照组，以660nm光照5min为光照处理组，然后每隔一段时间测试了细菌在450nm的吸光度，结果如图9所示，在起初的时间，两组中细菌初始浓度较小，相对应的吸光度较低且处于同一水平。随着时间推移，空白组的细菌处于正常增殖的阶段，细菌数量不断增加，因此相应的吸光度也不断的增加。在光照处理组中可以看出，光照组与空白组无明显差异，在长达9h的时间内，细菌也一直处于正常的生长和增长过程中，表明660nm的光照，不会影响细菌的生长状态，这一结果说明实施案例1-4中的碳点对金黄色葡萄球菌有高达99.5％以上的灭活效率数据是真实有效的。

以上结果反映出实施案例中所制备的抗菌碳点能够有效的灭活金黄色葡萄球菌。进而的，我们以实施案例1中的紫苏碳点对革兰氏阴性菌的代表-大肠杆菌进行同样的处理，测试结果如下，由图10可以看出，抗菌碳点在光照条件下，当碳点浓度不断增加时，细菌含量没有明显降低，实验菌落计数图像如图11所示。即使在浓度为0.50mg/ml时，对大肠杆菌的杀菌率也只仅有30％，而此时同样浓度和同样处理时间，对革兰氏阳性菌的灭菌效率可达99.9％，这一结果表明该碳点对革兰氏阴性菌的杀菌效果远低于革兰氏阳性菌，表现出明显的选择性杀灭革兰氏阳性菌效应。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将生物质材料置于有机液体媒介中，并于140～180℃，反应2-6h，即得高效抗菌特性碳纳米点；

其中，所述生物质材料为天然的具有抗菌特性的生物质材料。

2.根据权利要求1所述的具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，其特征在于，所述生物质材料为紫苏、金银花、艾叶、鱼腥草中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，其特征在于，所述有机液体媒介为无水乙醇，二氯甲烷、N-N二甲基甲酰胺中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，其特征在于，所述生物质材料置于所述液体媒介中的质量浓度为0.04～0.16g/ml。

5.根据权利要求1所述的具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，其特征在于，所述生物质材料在使用前应在干燥箱中60℃烘干。

6.根据权利要求1所述的具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法，其特征在于，反应结束后，将反应溶液在8000r/min，离心5min取上清液，然后分别用离心后的溶液用0.22um滤膜过滤，将过滤后溶液在50℃真空干燥得到碳纳米点粉末。

7.一种权利要求1～6任一所述的具有高效抗菌特性碳纳米点的制备方法制备的碳纳米点在抗革兰氏阳性细菌中的应用。

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